Interleukin-31 ELISA

Interleukin-31 ELISA

Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif d’interleukine-31 humaine (IL-31) dans le sérum, plasma humains

et les surnageants de culture cellulaire.

BE53301

12x8

2-8°C

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H

INFORMATIONS SUR LE PRODUIT ET MANUEL

1. BUT DE TEST 2

2. SOMMAIRE 2

3. PRINCIPE DU TEST 3

4. REACTIFS FOURNIS 4

5. INSTRUCTIONS DE STOCKAGE 5

6. COLLECTE DES ECHANTILLONS 5

7. MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNIS 5

8. PRECAUTIONS D’EMPLOI 6

9. PREPARATION DES REACTIFS 7

10. PROTOCOLE DE TEST 9

11. CALCUL DES RESULTATS 11

12. LIMITES 12

13. PERFORMANCE DU TEST 13

14. INFORMATION DE COMMANDES 15 15. RESUME PREPARATION DES REACTIFS 16

16. RESUME DU PROTOCOLE 17

1. But du Test

L'IL-31 humaine ELISA est un test immuno-enzymatique pour la détection quantitative de l'IL-31 humaine.

L'IL-31 humaine ELISA est destinée à une utilisation diagnostique in vitro. Ne pas utiliser dans les procédures thérapeutiques.

2. Sommaire

Veuillez se référer à la version anglaise:

IL-31 is a 24kD and 164 AA α-helical protein with a four-helix bundle structure, preferentially produced by CD 4+ type 2 helper T cells (Th2). IL-31 is closely related to the IL-6 type cytokines such as oncostatin M (OSM), Leukemia inhibitory factor (LIF) and cardiotrophin 1(CT-1).

IL-31 signals via binding to a heterodimeric complex that is composed of IL-31 receptor A (IL-31RA) that is highly homologous with the gp 30-like receptor and oncostatin M receptor subunits. These receptor subunits are expressed in activated monocytes, in epithelial cells, and keratinocytes respectively. On target cells IL- 31 binding can induce activation of the JAK/STAT, AKT and MAPK signaling pathways. Due to the ubiquitous expression of its receptor complex, IL-31 has numerous physiological roles including regulation of hematopoiesis and immune response.

When overexpressed in transgenic mice, IL-31 induces severe pruritus resembling eczema in humans.

Serum IL-31 was previously found overexpressed in adults with atopic dermatitis (AD).Serum measurement of IL-31 in paediatric atopic dermatitis revealed that elevated levels correlate with severity scoring. Activated effector T cells are recruited to the skin by chemokines and cell adhesion molecules. These components in the local microenvironment prolong T cell survival and contribute to the chronicity of these diseases.

IL-31 is associated with the promotion of allergic and chronic inflammatory conditions such as dermatitis, pruritus, airway hypersensititvity and inflammatory bowel disease.

Etalon ou Echantillon

3. Principe du Test

Un anticorps revêtu anti-IL-31 humaine est adsorbé sur des micropuits.

Figure 1

L’IL-31 humaine présente dans l'échantillon ou l’étalon se lie aux anticorps adsorbés dans les puits.

Figure 2

Après l'incubation des composants biologiques non liés sont retirés lors d'une étape de lavage et un un anticorps monoclonal anti-IL-31 conjugué biotine est ajouté et se lie à l'IL-31 capturé par le premier anticorps.

Figure 3

Après l'incubation l’anticorps IL-31 anti-humaine non lié biotine conjugué est retiré au cours d'une étape de lavage. Streptavidine- HRP est ajoutée et se lie à l’anticorps IL-31 anti-humaine biotine conjugué.

Figure 4

Etalon ou Echantillon Conjugué Biotine

Streptavidine-HRP-

Anticorps Coaté

Micropuits Coaté

Deuxième Incubation

Troisième Incubation Première Incubation

Après l'incubation la streptavidine-HRP non consolidée est enlevée au cours d'une étape de lavage, et la solution substrat réactive à la HRP est ajoutée aux puits.

Figure 3

Un produit coloré est formé en proportion de la quantité d'IL-31 présente dans l'échantillon. La réaction est arrêtée par addition d'acide et l'absorbance est mesurée à 450 nm. Une courbe étalon est préparée à partir de sept dilutions d’étalon IL-31 et la

concentration de l'échantillon IL-31 déterminée.

Figure 4

4. Réactifs Fournis

1 pochette en aluminium contenant une Plaque de Microtitration recouverte d'anticorps polyclonaux anti- IL-31 humaine.

1 flacon (140 µL) de Conjugué Biotine anticorps monoclonaux anti-IL-31 humaine 1 flacon (150 µL) de Streptavidine-HRP

2 flacons d’Étalon IL-31 humaine liophilisé, 500 pg/mL après reconstitution 1 flacon (12 mL) Diluant pour Échantillons

1 flacon (15 mL) Diluant pour Conjugué 1 flacon (5 mL) Diluant pour Etalon

1 flacon (5 mL) Tampon pour Essai Concentré 20x (PBS avec 1% Tween 20 et 10% BSA)

1 bouteille (50 mL) de Tampon de Lavage Concentré 20x (PBS avec 1% du Tween 20)

1 flacon (15 mL) de Solution Substrat (tétraméthyle-benzidine) 1 flacon (15 mL) de Solution d’Arrêt (1M acide phosphorique) 6 Couvre-Plaques Adhésifs

Substrat Réagi Substrat

Quatrième Incubation

5. Instructions de Stockage – ELISA Kit

Conserver les réactifs du kit entre 2°C et 8°C.

Immédiatement après l'utilisation, les réactifs doivent être conservés au frais (2-8°C). Pour les dates de péremption du kit et des réactifs veuillez consulter les étiquettes.

Le délai de péremption du kit ne peut être garanti que si les composants sont conservés correctement et si, en cas d'utilisation répétée d'un composant, le réactif n'a pas été contaminé lors d'une première utilisation.

6. Collecte des Echantillons et Instructions de Stockage

Surnageants de culture cellulaire, sérum et plasma (EDTA, citrate, héparine) ont été testés avec ce kit.

D’autres échantillons biologiques sont applicables dans ce test. Séparer le sérum ou le plasma des coagulants ou érythrocytes dès que possible après coagulation ou séparation.

Les échantillons contenant un précipité visible doivent être clarifiés avant leur emploi. Ne pas utiliser de spécimens hémolytiques ou lipémiques.

Les échantillons doivent être aliquotés et doivent être conservés congelés à -20°C pour éviter la perte de substances bioactives. Si les échantillons doivent être dosés dans les 24 heures, ils peuvent être conservés entre 2°C et 8°C (pour la stabilité des échantillons se référer à 13.5).

Éviter les cycles répétés de congélation / décongélation. Avant le test, l'échantillon congelé doit être amené lentement à température ambiante et mélangé doucement.

7. Materiel Requis Mais Non Fournis

- Pipettes graduées de 5 mL et 10 mL

- Micropipettes à canaux de 5 µL à 1000 µL ajustables avec embouts plastiques - Micropipettes à canaux de 50 µL à 300 µL ajustables avec embouts plastiques - Réservoir pour micropipettes à canaux

- Bêcher, éprouvettes, verres de mesure nécessaires pour la préparation des réactifs

- Appareil pour l’ajout de solution de lavage (bouteille de lavage multicanaux ou système de lavage automatique)

- Agitateur pour microplaques

- Lecteur de barrettes de microplaque capable de lire à 450 nm (620 nm comme longueur d’onde de référence)

- Eau distillée ou désionisée dans un récipient en verre

- Calculateur statistique avec programme pour réaliser l’analyse de régression linéaire

8. Precautions d’Emploi

- Tout réactif doit être considéré comme potentiellement dangereux. Pour cela il est recommandé que ce produit ne soit utilisé que par des personnes ayant une qualification de laboratoire et qu´il soit utilisé en suivant les codes de bonne conduite du laboratoire. Une tenue correspondante comme blouse de travail, lunettes protectrices et gants de travail doit être portée. Evitez tous contacts des réactifs avec la peau ou les yeux. En cas de contact, rincez immédiatement avec de l’eau. Veuillez consulter tous les conseils spécifiques dans les fiches de donnés de sécurité et/ou les règles de sécurité.

- Les réactifs sont réservés exclusivement au diagnostique et non pas au thérapeutique.

- Evitez de mélanger et d’échanger les réactifs de lots différents et de provenances différentes.

- Evitez l’utilisation des réactifs périmés (voir étiquette).

- N’exposez pas les réactifs à la lumière pendant le stockage ou l’incubation.

- Ne pas pipeter avec la bouche.

- Ne pas manger, boire ou fumer dans les zones de manipulation de réactifs et d’échantillons.

- Evitez le contact de la peau et des muqueuses avec les réactifs.

- Pendant le travail avec les réactifs, utilisez des gants appropriés.

- Evitez le contact de substrats avec des métaux/oxydant.

- Evitez de gicler des liquides et la formation d’Aérosols.

- A fin d’éviter des contaminations avec microbes ou contaminations de réactifs et d’échantillons qui pourraient rendre le test sans valeur, veuillez utiliser des pointes de pipettes jetables.

- Utilisez des tubes appropriés pour dispenser le conjugué et le substrat.

- Toute exposition aux acides inactive le conjugué.

- Pour la préparation des réactifs, utilisez de l’eau distillée ou désionisée.

- La solution de substrat doit être amenée à température ambiante avant usage.

- Décontaminez et éliminez les échantillons et tous matériaux contaminés comme s’ils contenaient des germes de maladies infectieuses. La méthode préférée de décontamination est par l’autoclave pour au moins une heure à 121.5°C.

- Traitez les déchets liquides non-acides tel que des déchets neutralisés par l’hypochlorite de sodium (concentration finale d’hypochlorite: 1.0%). Après 30 minutes la décontamination effective est atteinte.

Les déchets liquides contenant de l’acide doivent être neutralisés avant la décontamination.

9. Préparation des Réactifs

Amener les Tampons Concentrés à température ambiante et les diluer avant de commencer le test. Si des cristaux se sont formés, chauffer doucement ces derniers jusqu'à fin de les dissoudre et d’atteindre la dissolution totale des cristaux.

9.1. Tampon de Lavage (1x)

Verser tout le contenu (50 mL) du concentré de Tampon de Lavage (20x) dans un cylindre gradué propre de 1000 mL. Remplir au volume final à 1000 mL avec de l'eau distillée ou désionisée dans un alambic en verre. Mélanger doucement pour éviter la formation de mousse.

Transférer tout dans une bouteille de lavage et conserver à une température comprise entre 2°C et 25°C.

Noter que le Tampon de Lavage (1x) reste stable pendant 30 jours.

Le Tampon de Lavage (1x) peut être préparé selon le tableau suivant:

Nombre de Barrettes Tampon de Lavage Concentré (20x) (mL) Eau Distillée (mL)

1 - 6 25 475

1 - 12 50 950

9.2. Tampon pour Essai (1x)

Ajouter le contenu entier (5 mL) du Tampon pour Essai Concentré (20x) dans un cylindre gradué propre de 100 mL. Remplir au volume final de 100 mL avec d'eau distillée ou déionisée. Mélanger doucement pour éviter la formation de mousse.

Stocker le tout entre 2°C et 8°C. Noter que le Tampon pour Essai (1x) reste stable pendant 30 jours.

Le Tampon pour Essai (1x) peut être préparé selon le tableau suivant:

Nombre de Barrettes Tampon de Lavage Concentré (20x) (mL) Eau Distillée (mL)

1 - 6 2.5 47.5

1 - 12 5.0 95.0

9.3. Préparation du Conjugué Biotine

Noter que le Conjugué Biotine doit être utilisé dans les 30 minutes qui suivent la dilution.

La solution de Conjugué Biotine concentré doit être diluée au 1:100 avec le Diluant pour Conjugué dans un tube à essais en plastique propre.

Le Conjugué Biotine peut être préparé selon le tableau suivant :

Nombre de Barrettes Conjugué Biotione (mL) Diluant pour Conjugué (mL)

1 - 6 0.06 5.94

1 - 12 0.12 11.88

9.4. Streptavidine-HRP

Noter que la Streptavidine-HRP doit être utilisée dans les 30 minutes qui suivent la dilution.

La Streptavidine-HRP doit être diluée au 1:200 avec le Tampon pour Essai dans un tube à essais en plastique propre.

Le Streptavidine-HRP peut être préparé selon le tableau suivant :

Nombre de Barrettes Streptavidine-HRP (mL) Tampon pour Essai (mL)

1 - 6 0.03 5.97

1 - 12 0.06 11.94

9.5. Étalon IL-31 Humaine

Reconstituer Étalon IL-31 humaine en ajoutant du Diluant pour Etalon.

Le volume de reconstitution est indiqué sur l’étiquette de flacon de l’étalon. Agiter et mélanger avec précaution pour assurer une solubilisation homogène complète (concentration d’étalon reconstitué =

500 pg/mL). Laisser reconstituer l’étalon pendant 10-30 min. Bien mélanger avant de préparer les dilutions.

Apres utilisation le surplus d´étalon ne doit pas être gardé et doit être éliminé.

9.5.1.

Etiqueter les 6 tubes, un pour chaque point d’étalon.

S2, S3, S4, S5, S6, S7.

Puis préparer séries de dilutions 1:2 pour la courbe d’étalonnage de manière suivante:

Pipeter 150 µL de Diluant pour Etalon dans les tubes S2-S7.

Pipeter 150 µL d’étalon reconstitué (qui sert comme l’étalon le plus haut S1, concentration de l’étalon 1 = 500 pg/mL) dans le premier tube marqué S2 et agiter (concentration d’étalon 2 = 250 pg/mL).

Pipeter 150 µL de cette dilution dans le deuxième tube marqué S3, et mélanger soigneusement avant le transfert suivant. Répéter des séries de dilutions 4 fois pour créer les dilutions d’étalon pour la courbe d´étalonnage (voir Figure 7).

Diluant pour Etalon sert comme contrôle vide Figure 7

Transférer 150 µL

IL-31 Humaine Etalon Reconstitué

S2 S3 S4 - S7

Diluant pour Etalon 150 µL

Eliminer 150 µL

10. Protocole de Test

a. Déterminer le nombre de barrettes de micropuits nécessaires pour tester le nombre souhaité d'échantillons plus les barrettes nécessaires aux blancs et aux étalons. Chaque échantillon, étalon et blanc doit être testé en double. Retirer les barrettes de microtitration inutiles du support et les stocker à 2°C-8°C dans une pochette hermétiquement refermée, avec le dessiccatif fourni.

b. Laver deux fois les barrettes de puits avec environ 400 µL de Tampon de Lavage pour chaque puits et en aspirant à fond le contenu des puits entre les lavages. Laisser le Tampon de Lavage dans les puits pendant 10-15 secondes avant l´aspiration. Veiller à ne pas rayer la surface des puits de microtitration.

Après le dernier lavage, vider les barrettes de puits et les tapoter sur un tampon absorbant ou une serviette en papier pour éliminer l'excès de Tampon de Lavage. Utiliser les barrettes de micropuits immédiatement après le lavage ou les placer renversées sur un papier absorbant pendant

15 minutes au maximum. Ne pas laisser sécher les puits.

c. Ajouter 50 µL de Diluant pour Echantillon en double dans tous les puits.

d. Ajouter 50 µL de chaque Dilution d’Etalon préparée en double dans le puits d’étalon correspondant (voir Tableau 1)

e. Ajouter 50 µL de chaque échantillon en double dans les puits d’échantillon (voir Tableau 1) f. Ajouter 50 µL de Diluant pour Etalon en double dans les puits de blanc.

Tableau 1

Exemple d’arrangement d'échantillons, d’étalons et de blancs dans les barrettes de puits de microtitration.

1 2 3 4

A Étalon 1

(500 pg/mL) Étalon 1

(500 pg/mL) Échantillon 1 Échantillon 1

B Étalon 2

(250 pg/mL) Étalon 2

(250 pg/mL) Échantillon 2 Échantillon 2

C Étalon 3

(125 pg/mL) Étalon 3

(125 pg/mL) Échantillon 3 Échantillon 3

D Étalon 4

(62.5 pg/mL) Étalon 4

(62.5 pg/mL) Échantillon 4 Échantillon 4

E Étalon 5

(31.3 pg/mL) Étalon 5

(31.3 pg/mL) Échantillon 5 Échantillon 5

F Étalon 6

(15.6 pg/mL) Étalon 6

(15.6 pg/mL) Échantillon 6 Échantillon 6

G Étalon 7

(7.8 pg/mL) Étalon 7

(7.8 pg/mL) Échantillon 7 Échantillon 7

H Blanc Blanc Échantillon 8 Échantillon 8

g. Recouvrir avec un couvre-plaque et incuber à température ambiante (18-25°C) pendant 2 heures, si possible sur un agitateur rotateur réglé à 400 tr/min. (Agitant est absolument nécessaire pour une performance optimale du test.)

h. Préparer du Conjugué-Biotine (voir Préparation du Conjugué-Biotine 9.3)

i. Retirer le couvre-plaque et vider les puits. Laver 6 fois les barrettes de puits de microtitration comme indiqué au point b de ce protocole. Utiliser les barrettes de micropuits immédiatement après le lavage.

j. Ajouter 100 µL Conjugué-Biotine dans tous les puits.

k. Recouvrir avec un couvre-plaque et incuber à température ambiante (18-25°C) pendant 2 heures, si possible sur un agitateur rotateur réglé à 400 tr/min(Agitant est absolument nécessaire pour une performance optimale du test.)

l. Préparer du Streptavidine-HRP (se reporter à la préparation des réactifs Streptavidine-HRP 9.4) m. Retirer le couvre-plaque et vider les puits. Laver 6 fois les barrettes de puits de microtitration comme

indiqué au point b de ce protocole. Utiliser les barrettes de micropuits immédiatement après le lavage.

n. Ajouter 100 µL de Streptavidine-HRP dilué dans tous les puits, y compris les puits de blanc.

o. Recouvrir avec un couvre-plaque et incuber à température ambiante (18-25°C) pendant 1 heure, si possible sur un agitateur rotateur réglé à 400 tr/min. (Agitant est absolument nécessaire pour une performance optimale du test.)

p. Retirer le couvre-plaque et vider les puits. Laver 6 fois les barrettes de puits de microtitration comme indiqué à point b de ce protocole. Procéder immédiatement à l'étape suivante.

q. Pipeter 100 µL de Solution de Substrat TMB dans chaque puits.

r. Incuber les puits de microtitration à température ambiante (18-25°C) pendant environ 30 minutes.

Éviter toute exposition directe à une source de lumière intense.

Le développement de couleur au niveau de la plaque doit être surveillé et la réaction du substrat stoppée (voir le point prochain) avant que les puits positifs ne soient plus correctement mesurables. La durée de l’incubation pour le développement de couleur doit être déterminée pour chaque essai individuellement.

Il est recommandé d’ajouter la solution d’arrêt quand une couleur bleu sombre se développe à la concentration la plus haute de la gamme étalon. Une autre alternative consiste à suivre le développement de la couleur par lecteur ELISA à 620 nm. La réaction du substrat doit être

arrêtée dès que la DO atteint 0.9 à 0.95.

s. Arrêter la réaction enzymatique en pipetant rapidement 100 µL de Solution d'Arrêt dans chaque puits. Il est important que la Solution d'Arrêt soit répandue rapidement et uniformément dans les puits pour inactiver complètement l'enzyme.

Les résultats doivent être lus immédiatement après l'ajout de la solution d'arrêt ou dans l'heure qui suit si les barrettes de microtitration sont conservées à l'obscurité entre 2°C et 8°C.

r. Lire l'absorbance de chaque puits sur un spectrophotomètre avec 450 nm comme longueur d'onde primaire (éventuellement 620 nm comme longueur d'onde de référence; 610-650 nm sont acceptables). Mesurer le blanc du lecteur de plaque conformément aux instructions du fabricant, en utilisant les puits de blanc. Déterminer l'absorbance des échantillons et des étalons.

11. CALCUL DES RESULTATS

- Calculer les valeurs absorbance moyennes pour chaque étalon et échantillons dosés en double.

Les doubles doivent se trouver dans les 20 pour cent de la moyenne.

- Créer une courbe étalon en reportant la moyenne de l’absorbance pour chaque concentration étalon en ordonnée, en fonction de leur concentration en l’IL-31 humaine sur l’abscisse. Relier les points du graphe pour obtenir une belle courbe (un ajustement de courbe 5-paramètre est recommandé).

- Pour déterminer la concentration en l’IL-31 humaine de chaque échantillon, tracer une ligne horizontale à partir du point de l’absorbance moyenne (sur l’ordonnée) jusqu’à la courbe étalon.

Tracer une ligne verticale à partir de l’intersection pour lire la concentration en l’IL-31 humaine correspondante.

- Si les instructions de ce protocole ont été suivies, échantillons ne ont pas été dilué et la concentration lue sur la courbe standard doit pas être multiplié par un facteur de dilution.

- Calcul des échantillons avec une concentration supérieure à l'étalon 1 peut entraîner des niveaux incorrects et faibles en l’IL-31 humaine. Ces échantillons requièrent une prédilution extérieure supplémentaire selon les valeurs attendues en IL-31 humaine avec le Diluant pour Échantillon (1x) afin de quantifier précisément les niveaux réels en IL-31 humaine.

- Nous recommandons de passer à chaque analyse un échantillon contrôle de concentration en IL-31 humaine connue. Si les valeurs obtenues pour le contrôle ne sont pas dans le domaine de concentration attendu, les résultats du test peuvent être non valides.

- Une courbe étalon représentative est montrée en figure 8. Cette courbe ne peut pas être utilisée pour lire les résultats des tests effectués au laboratoire. Il appartient à chaque laboratoire de préparer une courbe étalon pour chaque groupe de barrettes testées.

Figure 8

Courbe étalon représentative pour l’IL-31 humaine ELISA. L’IL-31 humaine a été dilué en étapes sérielles de 2 fois dans le Diluant pour Étalon. Ne pas utiliser cette courbe étalon pour calculer les résultats des tests.

Une courbe étalon doit être exécuté pour chaque groupe de barrettes dosés.

Human IL-31 ELISA

0.1 1.0 10.0

1 10 100 1000

OD (450 nm)

Données typiques utilisant l'IL-31 humaine ELISA Mesure de longueur d'onde: 450 nm

Longueur d'onde de référence: 620 nm Étalon Concentration

IL-31 humaine (pg/mL) D.O.

(450 nm) D.O. Moyenne

(450 nm) C.V.

(%)

1 500.0 1.830

1.905 1.868 2.0

2 250.0 1.072

1.047 1.059 1.2

3 125.0 0.624

0.631 0.627 0.6

4 62.5 0.385

0.376 0.380 1.3

5 31.3 0.269

0.258 0.263 2.2

6 15.6 0.157

0.160 0.159 1.1

7 7.8 0.122

0.121 0.121 0.2

Blanc 0 0.074

0.072 0.073 0.9

Les valeurs de DO de la courbe étalon peuvent varier en fonction des conditions de performance du test (par exemple l'opérateur, pipetage, technique de lavage ou effets de la température).

En outre la durée de conservation de la trousse peut altérer l'activité enzymatique et donc l'intensité des couleurs. Les valeurs mesurées sont toujours valables.

12. LIMITES

− Etablir une courbe étalon à chaque test puisque les conditions d’analyses peuvent varier d’une analyse à l’autre.

− Une contamination bactérienne ou fongique des échantillons à analyser ou réactifs, ou une contamination croisée entre les réactifs peuvent causer des résultats erronés.

− Il est préférable d’utiliser des embouts de pipettes, flacons et verrerie à usage unique. La verrerie réutilisable doit être lavée efficacement et bien rincée avant emploi.

− Un lavage mal effectué ou insuffisant lors de la procédure provoque de faux résultats positifs ou négatifs.

Bien égoutter les puits avant d’ajouter la solution de lavage, les remplir avec le tampon de lavage comme indiqué pour chaque cycle de lavage et ne pas laisser les puits découverts ou sécher trop longtemps.

13. Performance du Test 13.1. Sensibilité

La limite de détection du test IL-31 humaine, définie par la concentration de l’analyte ayant une absorption significativement supérieure à l’absorption du milieu de dilution (moyenne plus deux déviations standard) a été déterminée à 1 pg/mL (moyenne de 6 tests indépendants).

13.2. Reproductibilité 13.2.1.

La reproductibilité intra-essai a été évaluée dans trois analyses différentes. Chaque essai a été mené avec 6 doubles de 8 échantillons sériques contenant différentes concentrations en IL-31 humaine. Deux courbes étalon ont été tracées pour chaque microplaque. Les données ci-dessous montrent la concentration moyenne de l'IL-31 humaine et le coefficient de variation pour chaque échantillon (voir tableau 3). Le coefficient de variation intra-essai calculé est de 3.6%.

Tableau 3

La concentration moyenne de l'IL-31 humaine et le coefficient de variation pour chaque échantillon Échantillon Expérience Concentration Moyenne

IL-31 humaine (pg/mL) Coefficient de Variation (%)

1 1

2 3

600 585 589

2.6 1.5 0.6

2 1

2 3

283 272 277

3.2 1.7 3.2

3 1

2 3

137 131 134

4.8 1.7 1.5

4 1

2 3

49 52 54

6.3 1.9 4.3

5 1

2 3

239 234 246

5.8 3.3 4.5

6 1

2 3

108 109 106

5.3 2.7 4.9

7 1

2 3

41 44 47

7.5 3.3 2.0

8 1

2 3

23 23 24

7.6 2.8 2.8

13.2.2.

La reproductibilité inter-essai a été évaluée dans trois analyses indépendantes. Chaque essai a été mené avec 6 doubles de 8 échantillons sériques contenant différentes concentrations en IL-31 humaine. Deux courbes étalon ont été tracées pour chaque microplaque. Les données ci-dessous montrent la concentration moyenne de l'IL-31 humaine et le coefficient de variation calculés à partir de 18 déterminations pour chaque échantillon (voir tableau 4). Le coefficient de variation intra-essai calculé est de 2.9%.

Tableau 4

La concentration moyenne de l'IL-31 humaine et le coefficient de variation pour chaque échantillon Échantillon Concentration Moyenne

IL-31 Humaine (pg/mL) Coefficient de Variation (%)

1 591 1.4

2 277 1.8

3 134 2.2

4 52 4.6

5 240 2.6

6 108 1.4

7 44 6.8

8 23 2.5

13.3. Etudes de Récupération

Des échantillons enrichis ont été préparés en ajoutant trois différentes quantités en IL-31 humaine à des échantillons de sérum, plasma et surnageant de culture cellulaire. Les récupérations ont été déterminées avec 8 répétitions chacune. Le sérum non enrichi a été utilisé comme vide dans ces expériences.

Pour les donnés de récupération voir Tableau 5.

Tableau 5 Matrice des

échantillons Enrichissement

haut (%) Enrichissement

moyen (%) Enrichissement bas (%)

Sérum 106 106 86

Plasam (EDTA) 89 97 94

Plasma (Citrate) 107 109 106

Plasma (Héparine) 101 107 109

Surnageant de

culture cellulaire 115 115 123

13.4. Dilution Parallélisme

Les échantillons de sérum, plasma et surnageant de culture cellulaire à différents niveaux de l'IL-31 humaine ont été analysés à des dilutions en série (deux fois) avec 4 répétitions chacune.

Pour les donnés de récupération voir Tableau 6.

Tableau 6 Matrice des

échantillons Récupération des valeurs attendues Gamme (%) Moyenne (%)

Sérum 96-114 106

Plasma (EDTA) 87-111 101

Plasma (Citrate) 99-119 110

Plasma (Héparine) 97-107 104

13.5. Stabilité des Échantillons

13.5.1.

Des aliquots de sérum (enrichis ou non) ont été stockés à -20°C, décongelés jusqu’à 3 fois, et les taux en IL-31 humaine ont été dosés. Il n’y a pas eu de perte significative en IL-31 humaine en congelant et décongelant.

13.5.2.

Des aliquots d’un échantillon sérique (enrichi ou non) ont été stockés à -20°C, 2-8°C, température ambiante (TA) et à 37°C, puis les taux en IL-31 humaine ont été dosés après 24 h. Il n’y a pas eu de perte significative en immunoréactivité IL-31 humaine durant le stockage dans les conditions citées ci-dessus.

13.6. Spécificité

Le test détecte de l'IL-31 humaine non seulement le naturelle mais encore le recombinante.

La réactivité croisée et l’interférence des facteurs circulant dans le système immun a été évaluée en enrichissant ces protéines à des concentrations physiologiques pertinentes dans un échantillon de sérum positive d’IL-31 humaine. Il n’y a pas eu de réactivité croisée ou d’interférence détectable.

13.7. Valeurs Attendues

Un panel des échantillons de sérum choisis au hasard à partir de donneurs apparemment sains (hommes et femmes) a été testé pour l'IL-31 humaine.

On n'y avait pas des concentrations détectables d'IL-31 humaine.

Les niveaux élevés de l'IL-31 humaine dépendent du type de troubles immunologiques.

14. INFORMATION DE COMMANDES

Pour les commandes s'il vous plaît contacter:

Voir la dernière page.

Pour des renseignements techniques s'il vous plaît contacter:

e-mail: IBL@IBL-International.com www.IBL-International.com

15. Résumé: Préparation des Réactifs 15.1. Tampon de Lavage (1x)

Ajouter le Tampon de Lavage Concentré 20 x (50 mL) à 950 mL d’eau distillée.

Nombre de Barrettes Tampon de Lavage Concentré (mL) Eau Distillée (mL)

1-6 25 475

1-12 50 950

15.2. Tampon pour Essai (1x)

Ajouter le Tampon pour Essai Concentré 20x (5 mL) à 95 mL d’eau distillée.

Nombre de Barrettes Tampon de Lavage Concentré (mL) Eau Distillée (mL)

1-6 2.5 47.5

1-12 5.0 95.0

15.3. Conjugué Biotine

Etablir une dilution du Conjugué Biotine au 1:100 dans le Diluant pour Conjugué selon le tableau suivant:

Nombre de Barrettes Conjugué Biotine (mL) Diluant pour Conjugué (mL)

1-6 0.06 5.94

1-12 0.12 11.88

15.4. Streptavidine-HRP

Etablir une dilution du Streptavidine-HRP au 1:200 dans le Tampon pour Essai selon le tableau suivant:

Nombre de Barrettes Streptavidine-HRP (mL) Tampon pour Essai (1x) (mL)

1-6 0.03 5.97

1-12 0.06 11.94

15.5. Étalon IL-31 Humaine

Reconstituer l'étalon lyophilisé IL-31 humaine avec du Diluant pour Etalon. Le volume de reconstitution est indiqué sur l'étiquette du flacon étalon.

16. Résumé du Protocole de Test

1. Déterminer le nombre de barrettes nécessaires.

2. Laver les puits deux fois avec du Tampon de Lavage.

3. Ajouter 50 µL de Diluant pour Echantillon, en double, dans les puits blancs.

4. Ajouter 50 µL des Dilutions d’Etalon préparés, en double dans les puits d’étalon.

5. Ajouter 50 µL d’échantillons en double dans les puits prévus.

6. Ajouter 50 µL de Diluant pour Etalon, en double, dans les puits blancs.

7. Couvrir les barrettes et incuber 2 heures à température ambiante (18-25°C).

(Agitant est absolument nécessaire pour une performance optimale du test.) 8. Préparer le Conjugué Biotine.

9. Vider et laver les puits 6 fois avec du Tampon de Lavage 10. Ajouter 100 µL du Conjugué Biotine.

11. Couvrir les barrettes et incuber 1 heure à température ambiante (18-25°C).

(Agitant est absolument nécessaire pour une performance optimale du test.) 12. Préparer la Streptavidine-HRP.

13. Vider et laver les puits 6 fois avec du Tampon de Lavage.

14. Ajouter 100 µL Streptavidine-HRP diluée dans tous les puits.

15. Couvrir les barrettes et incuber 1 heure à température ambiante (18-25°C).

(Agitant est absolument nécessaire pour une performance optimale du test.) 16. Vider et laver les puits 6 fois avec du Tampon de Lavage.

17. Ajouter 100 µL de Solution Substrat TMB dans tous les puits.

18. Incuber les barrettes pour environ 30 minutes à température ambiante (18-25°C).

19. Ajouter 100 µL de Solution d’Arrêt dans tous les puits.

20. Ajuster le lecteur avec les puits blanc et mesurer l’intensité de couleur à 450 nm.

Attention :

Si les instructions de ce protocole ont été suivies, échantillons ne ont pas été dilué et la concentration lue sur la courbe standard doit pas être multiplié par un facteur de dilution.

IBL AFFILIATES WORLDWIDE

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N.–Cat.: / Αριθµός-Κατ.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή:

Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από:

No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων:

CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο

IVD

In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ∆ιάγνωση.

Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης.

Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell’uso. / ∆ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση.

Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l’abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου.

Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους:

Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός:

Caution! / Vorsicht! / Attention! / ¡Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή!

Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.

Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.

Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit.

Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.

Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.

Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.

Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ.