Hydrogènase. M écanisme catalytique des enzymes impliquées dans la réduction de H + et l'oxydation de H 2

M écanisme catalytique des enzymes impliquées dans la

réduction de H

et l'oxydation de H

Hydrogènase

Hydrogènase

Gram + Spirochètes Protéobacteries

Cyanobactéries

Flavobacteria

T hermotoga

A quifex

Bactéries vertes non sulfureuses

T hermus

Halobacteria M ethanosarcina M ethanobacterium

T hermococcus P yrodictium

T hermoplasma

Entamoebae Animaux

Champignons Plantes

Cilliés

Trichomonades

Microsporidies Diplomonades

Eubactéries Archaeobacteries Eucaryotes

Algues Bactéries vertes

sulfureuses

Hydrogénase à [Fe]

Hydrogenase à [NiFe]

Desulfovibrio/Desulfovibrio

Hydrogénases dans le monde Hydrogénases dans le monde

vivant

vivant

2H⁺

2e^-

H₂ Hydrogénase à [NiFe] Hydrogénase à [NiFe]

Hydrogénase à [FeFe]

Hydrogénase à [FeFe]

Deux types d’Hydrogénases

H₂

2e^- 2H⁺

Rousset et al. Proc. Natl. Acad. Sci.1998 Nicolet et al. Struct. Fold. Des. 1999

Fe Fe

CO CO

Fe Ni CO

CN

CN

CN CN

ADMT

Deux centres actifs

Hydrogénase à [NiFe]

Hydrogénase à [NiFe]

Hydrogénase à [FeFe]

Hydrogénase à [FeFe]

Centres fer-soufre

Centre (4Fe-4S)

Centre (4Fe-4S) Centre (3Fe-4S) Centre (3Fe-4S)

E’ = -300 mV

E’ = -300 mV E’ = +50 mVE’ = +50 mV

Cytochrome c3 Cytochrome c3

Partenaire physiologique

Partenaire physiologique

Ferrédoxine Ferrédoxine

Partenaire physiologique

Partenaire physiologique

NAD (P) NAD (P) ⁺⁺

Partenaire physiologique

Partenaire physiologique

Mesures d’activités Mesures d’activités

1) Consommation d’hydrogène 1) Consommation d’hydrogène

2) Production d’hydrogène 2) Production d’hydrogène

3) Réaction d’échange H

3) Réaction d’échange H⁺⁺/D/D⁺⁺

H H

2 H 2 H

+ 2 e + 2 e

H₂ H₂ H⁺

He^+- e^-

Hydrogenase à [NiFe] de

Hydrogenase à [NiFe] de DesulfovibrioDesulfovibrio

Consommation d’H Consommation d’H

H⁺ He^+- e^-

HH₂₂ H⁺

H⁺

e^- e^-

Production d’H Production d’H

Hydrogenase à [NiFe] de

Hydrogenase à [NiFe] de DesulfovibrioDesulfovibrio

H⁺ H⁺

e^- e^-

M éthylviologène M éthylviologène

Oxydé Réduit

Partenaire

Partenaire in vitro in vitro

Voltamétrie cyclique Voltamétrie cyclique

H₂

Enzyme Enzyme adsorbée adsorbée

Voltammogramme Voltammogramme

Consommation de H Consommation de H₂₂

Production de H Production de H₂₂

Voltamétrie cyclique Voltamétrie cyclique

H₂

OO₂₂, CO, CO

Injection d’inhibiteurs Injection d’inhibiteurs

Voltamétrie cyclique Voltamétrie cyclique

Injection Injection

d’Od’O₂₂

Injection de Injection de

COCO

k_i

k_in

k_out

Echange H

Echange H

/D /D

DD₂₂

D D

e e

Echange H

Echange H⁺⁺/D/D⁺⁺

Diffusion Diffusion Catalyse

Catalyse

H

HD

Pas d’accepteurs Pas d’accepteurs

d’électrons d’électrons

H

Echange H

Echange H

/D /D

Potentiel redox des centres Potentiel redox des centres

Fer-soufres Fer-soufres

Spectrométrie RPE Spectrométrie RPE

Signal 3Fe

Signal 3Fe Signal 4Fe Signal 4Fe

Potentiel redox du centre Potentiel redox du centre

NiFe NiFe

Spectrométrie RPE

Spectrométrie RPE Spectrométrie IR Spectrométrie IR

Potentiel redox du centre Potentiel redox du centre

NiFe NiFe

Ni-SI Ni-R

Mécanisme catalytique Mécanisme catalytique

Etats oxydés inactifs

De Lacey et al. Chem. Rev. 2007

Mécanisme catalytique Mécanisme catalytique

NiB NiA

Volbeda et al. JBIC 2005

Mécanisme catalytique Mécanisme catalytique

De Lacey et al. Chem. Rev. 2007

Activation Ni-A Activation Ni-A

Mécanisme catalytique Mécanisme catalytique

De Lacey et al. Chem. Rev. 2007

Activation Ni-B Activation Ni-B

Mécanisme catalytique Mécanisme catalytique

HH₂₂

Cycle catalytique Cycle catalytique

De Lacey et al. Chem. Rev. 2007

Mécanisme catalytique Mécanisme catalytique

De Lacey et al. Coord. Chem. Rev. 2005

Procédés biotechnologiques de production d’hydrogène

HDROGENASE

BioHydrogène

BioHydrogène

Chimie Biomimétique

Complexes à bases de Ni Complexes à bases de Ni

NiNi

FeFe

RuRu NiNi

Chimie Biomimétique

Complexes à base de Ni Complexes à base de Ni

Chimie Biomimétique

Complexes à base de Fe Complexes à base de Fe

L accase L accase

½ ½ O O

H H

O O

Hydrogénase Hydrogénase

H H

2H 2H

Cathode ^e-

V

Biopile

Alonso-Lomillo et al. Nano Lett. 2007

Biopile

covalent covalent

adsorption adsorption

control control

2.5 mA cm 2.5 mA cm^-2-2

Alonso-Lomillo et al. Nano Lett. 2007

Biopile

Production H Production H

Glycolyse Glycolyse

H H

H H

Fermentation Fermentation

Clostridium

Clostridium

H

1 tonne bois 1 tonne bois 500 Kg cellulose

500 Kg cellulose 120 m120 m³³/t, 240 m/t, 240 m³³/t, /t, 720 m

720 m³³/t/t

Production H

Production H

P680

Qa

PSII

O₂ + 4 H⁺ 2 H₂O

LHC

Pc

P700 cytb₆

cytf PSI LHC

PQ(H)₂

Hydrogenase

2 H⁺ H₂

FNR Fd

NADP⁺ NADPH₂

2e

2e

2e

H₂ H₂ H₂ Pour un flux de

Pour un flux de 17 GWh/ha/an

17 GWh/ha/an 600 000 m600 000 m³³/ha/an/ha/an 145 tep /ha/an 145 tep /ha/an

Production H

Production H

Photosynthèse Photosynthèse

H

Synechocystis Synechocystis Chlamydomonas Chlamydomonas

Production H

Production H

P680

Qa

PSII

O₂ ⁺

4 H⁺ 2 H₂O

LHC

Pc

P700 cytb₆

cytf PSI LHC

PQ(H)₂

Hydrogenase

2 H⁺ H₂

FNR Fd

NADP⁺ NADPH₂

Obstacle

Obstacle

HYLIOX HYLIOX

PNRB 2007 PNRB 2007

Ingénierie enzymatique de l’hydrogénase Ingénierie enzymatique de l’hydrogénase

pour une production d’hydrogène pour une production d’hydrogène

photosynthétique

photosynthétique

Conversion de Conversion de l’énergie solaire l’énergie solaire

en Hen H₂₂

H₂

Synechocystis Synechocystis

OBJECTIF

OBJECTIF

P680

Qa

PSII

O₂ ⁺

4 H⁺ 2 H₂O

LHC

Pc

P700 cytb₆

cytf PSI LHC

PQ(H)₂

Hydrogenase

2 H⁺ H₂

FNR Fd

NADP⁺ NADPH₂

2e

2e

2e

H₂ H₂ H₂

Verrou Verrou

Pour un flux de Pour un flux de

17 GWh/ha/an

17 GWh/ha/an 600 000 m600 000 m³³/ha/an/ha/an 145 tep /ha/an 145 tep /ha/an

Synechocystis Synechocystis

STRATEGIE STRATEGIE

Desulfovibrio Desulfovibrio

O₂

O₂

H₂ H₂ H⁺

H⁺ ee^{- -}

Tamis moléculaire Tamis moléculaire

Volbeda et al. Int. J. Hydrogen Energy, 2002 Volbeda et al. Int. J. Hydrogen Energy, 2002

Volbeda et al. Int. J. Hydrogen Energy, 2002 Volbeda et al. Int. J. Hydrogen Energy, 2002

NiNi FeFe

L eucine L eucine

Valine Valine

Tamis moléculaire

Tamis moléculaire

Volbeda et al. Int. J. Hydrogen Energy, 2002 Volbeda et al. Int. J. Hydrogen Energy, 2002

NiNi FeFe

Phenylalanine Phenylalanine Isoleucine Isoleucine

Tamis moléculaire

Tamis moléculaire

Leroux et al. PNAS, 2008 Leroux et al. PNAS, 2008

Impact sur la diffusion Impact sur la diffusion

des gaz des gaz

Substitutions LV en FI Substitutions LV en FI

Inhibition par le CO Inhibition par le CO

Substitutions LV en FI Substitutions LV en FI

Impact sur la sensibilité Impact sur la sensibilité

à l’O à l’O₂₂

Dementin et al. JACS, 2009 Dementin et al. JACS, 2009

Insertion de méthionines Insertion de méthionines

Leroux et al. PNAS, 2008 Leroux et al. PNAS, 2008

Impact sur la diffusion Impact sur la diffusion

des gaz des gaz

Inhibition par le CO Inhibition par le CO

Insertion de méthionines Insertion de méthionines

V74M

Impact sur la sensibilité Impact sur la sensibilité

à l’O à l’O₂₂

Dementin et al. soumis, 2009 Dementin et al. soumis, 2009

Insertion de methionines Insertion de methionines

Inactivation plus lente Inactivation plus lente

Activation plus rapide Activation plus rapide

Diffusion Diffusion

MetSMetSδδ

Rôle de la méthionine Rôle de la méthionine

Dementin et al. JACS, 2009 Dementin et al. JACS, 2009

Protonation facilité Protonation facilité

LBE- LBE- Victor M. Fernandez et Antonio De LaceyVictor M. Fernandez et Antonio De Lacey

Madrid

Madrid Partenaire associéPartenaire associé

BIP- BIP- Bruno Guigliarelli, Patrick Bertrand et Marc RoussetBruno Guigliarelli, Patrick Bertrand et Marc Rousset

Marseille

Marseille Partenaire 1-coordinateurPartenaire 1-coordinateur

LB3M- LB3M- Gilles Peltier et Gilles Peltier et Laurent CournacLaurent Cournac

Cadarache

Cadarache Partenaire 2Partenaire 2

LCCP- Juan Fontecilla et Anne VolbedaLCCP- Juan Fontecilla et Anne Volbeda

Grenoble

Grenoble Partenaire 3Partenaire 3

LCMBA- Serge Antonczak et Jérome GloebiowskiLCMBA- Serge Antonczak et Jérome Gloebiowski

Nice

Nice Partenaire 4Partenaire 4

GDR BioH

2977

Voies Biologiques et

Biomimétiques de Synthèse et d'Utilisation de l'Hydrogène

Directeur: Marc Rousset (CNRS)

Directeur Adj: Laurent Cournac (CEA)

44 équipes de recherche 44 équipes de recherche

19 Laboratoires 19 Laboratoires

Interdisciplinaire Interdisciplinaire

Cinq départements du CNRS:

Cinq départements du CNRS:

INSB, INC, INEE, INSU et INSTII INSB, INC, INEE, INSU et INSTII

Structure

Structure

Instituts de Recherche Instituts de Recherche

CNRS, CEA, INRA, IRD, INSA, INPT, BRGM CNRS, CEA, INRA, IRD, INSA, INPT, BRGM

Universités Universités

M arseille, M ontpellier, Toulouse, Nice, Grenoble, M arseille, M ontpellier, Toulouse, Nice, Grenoble,

Clermont-Ferrand, Nantes, Brest, Paris, Lille Clermont-Ferrand, Nantes, Brest, Paris, Lille

Composantes

Composantes

microbiologie, biologie moléculaire, microbiologie, biologie moléculaire,

biochimie, biochimie,

ingénierie métabolique, ingénierie métabolique,

cristallographie, cristallographie,

procédés, modelisation, procédés, modelisation,

informatique, informatique,

chimie et spectroscopie chimie et spectroscopie

Disciplines scientifiques

Disciplines scientifiques

66- - Système biologique de production d’HSystème biologique de production d’H₂₂ 11- Comparaison et sélection de souches - Comparaison et sélection de souches

microbiennes productrices d’hydrogène microbiennes productrices d’hydrogène

22- - Compréhension du rôle des hydrogénases Compréhension du rôle des hydrogénases dans le métabolisme énergétique

dans le métabolisme énergétique

33- - Etudes moléculaires et optimisation des Etudes moléculaires et optimisation des potentialités enzymatiques

potentialités enzymatiques

44- - Conception de nouveaux catalyseursConception de nouveaux catalyseurs 55- - Biocapteurs et biopilesBiocapteurs et biopiles

Objectifs scientifiques

Objectifs scientifiques

16 Projets en cours depuis 2005 16 Projets en cours depuis 2005

Programmes ANR Blanc (6), PNRB (5), Programmes ANR Blanc (6), PNRB (5),

Bioénergies (3), PAN-H (1), UE (1) Bioénergies (3), PAN-H (1), UE (1)

10 945 237 € 10 945 237 €

Projets en cours

Projets en cours

Potentiel redox Potentiel redox

A244 I207

T242 I265 V268

Q190 R185

W251

W257

V183 N225

T223 L246 S249

Q230 K225

W237 F232

(4Fe4S) médian (4Fe4S) médian

D. bacculatum D. bacculatum

(3Fe4S) médian (3Fe4S) médian

D. fructosovorans D. fructosovorans