Evaluation d'un traitement à base d'extrait brut de la propolis sur une infection septicémique à Staohvlococcus aureus du rat

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République Algérienne Démocratique et Populaire

MiniStère de l'Enseignement Supèrieur et de la Recherche Scientifique Université de Jijel

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie Molécul ~ ~ ~~1 ~ --:C:t;:,·Î~l.J ~I ~.jl_w..11

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Mémoire De Fin D'études Pour L'obtention Du Diplôme Master 2 en Biologie

Option : Pharmacologie Expérimentale Intitulé

Evaluation d'un traitement à base d'extrait brut de la propolis sur une infection septicémique à

Staohvlococcus aureus du rat

Membres de Jury : Présenté par :

Président: Dr. ALYANE Mohammed Mene : ALIOUA Nabila Examinateur : Mr. BOUDJERDA M'¹¹e : AT AMNA Fatiha

Mr. KHENNOUF Tarek Encadreur : Mme. ROULA Sagia

Année Universitaire 2012/2013

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tout puissant, [e

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cfe nous avoir cfonné

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courage et

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vo[onté pour mener ce travai[

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:Nous acfressons nos sincères remerciements

à

notre promoteur

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<.R.,OVL}l. Sagia, qui par

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patience,

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6ienvei[[ante attention et tous [es conseifs avisés qu'e[[e nous a constamment procfigués, conseifs qui nous manqueront pas cfe nous soutenir et cfe nous écfairer tout au [ong cfe notre future carrière. !Nous tenant

à

[ui exprimer toute notre reconnaissance et nos sincères remerciements.

!Nous tenons

à

remercier sincèrement notre maître et présicfent cfe jury {])r. }l.L <'f}l.:NE

?,10/ïammecf

à

['immense lîonneur cf' avoir accepté cfe présicfer

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jury.

!Nous remercions 9vlr. ŒOV(])JP,<J?..,(])Jl et 9vlr. 1(JFE1f<.NOVP pour avoir accepté cfe consacrer cf u temps, e:(aminé et juger ce travai( et cf' apporter tous feurs soins cfans [' éva[uation cfe ce travail

!Nous remercions infiniment {])r. 9vl}l.IZ}l. 9vlolîammecf; responsa6[e cfe fa6oratoire cf' ana[yse

à

I'lîôpita[ cfe Jije[ pour nous avoir 6ien accuei[[i cfans son [a6oratoire.

!Nous acfressons ['expression cfe notre profoncfe gratitucfe au {])r. ŒOV(])JP,?,1Jl.Jl.

}l.6cfe[k.gcfer et 9vlr ŒP:J{<RJ pour feurs aicfes, encouragements et consei[s cfurant [a réa[isation cfe ce cfe travail

!Nous remercions égafement toute ['équipe cfu [a6oratoire cfe plîarmacofogie et micro6iofogie cfe I'université cfe Jy ' el

CE.nfin nous adressons nos remerciements à touts ce14_qui ont contri6ué cfe près ou tfe [oin

Je te dédie ce travai{fe de fin tf' étude

}l ma très clière mère, Saùfa, que je ne cesse de remercier pour tout ce

qu 'e{[e m'a donné. P.{[e m'a supporté 9 mois dans son ventre et a fait de moi I'fzomme

que je suis aujourtf'fzui Que ©ieu

{a

récompense pour tous ces 6ienfaits.

Spéciafement

à

mon père :Mafzmoud

à

qui je dois énonnément, qui a

cru

en

moi et qui m'a donné Ces moyens tf' a{[er aussi Coin.

}l mes frères, :Messaoutf, <Wafüf, et}l6-Œ{macfjûf et mes sœurs Iman,

}l mes sœurs Iman, }l6ma, Zafiira et ma cfiére petite sœur Pari.da.

}l mes amis Jfouda, Zine6, !Nacfjet, <R.gftia, et Patifza.

;i tous étudiants de :Master II Pfiarmacofogie <Ewérimentafe L:M(}) et particu{ièrement

à

ma cfière amie "Patifia" qui m'accompaené durant

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réafuation de ce mémoire.

P.nfin,je dédie ce mémoire

à ce~qui

m'aiment et surtout

ce~que

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Jaime.

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Sommaire

Introduction générale... 01

1. Analyse bibliographique Chapitre I: La septicémie 1. Introduction. . . 02

2. La septicémie... 02

2.1. Défmition.. . . 02

2.2.Portes d'entrées... 02

2.3.Stades cliniques... 03

2.4.Classification... ... 04

2.5. Complications... 04

2.6. Physiopathologie... 05

2. 7. Stress et inflammation... 05

2.8.Diagnostic de septicémie... 05

2.9.Traitement de septicémie... 06

Chapitre II: Les staphylocoques 1. Introduction... 07

2. Le genre staphylocoque... 07

2.1. Habitat... 07

2.2. Classification... 08

2.3. Caractères bactériologiques... 08

2.4. Structure antigénique... 09

3. Les staphylocoques coagulase-positifs... 09

3 .1. Défm itio n de la coagulase. . . 10

3.2. Epidémiologie... 10

3.3. Pouvoir pathogène... 10

3.4. Facteurs de virulences... 11

3.5. Diagnostic bactériologique... 12

Chapitre III: La propolis 1. Introduction... 13

2. Définition... 13

3. Origine de la propolis... 13

4. Récolte de la propolis... 14

5. Propriétés physiques... 15

6. Composition chimique... 15

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8. Propriétés pharmacologiques... 17

8.1. Activité antimicrobienne.. ... ... ... ... ... ... ... . ... ... . ... ... . . . ... ... . ... 17

8 .1. Activité anti-oxydante . . . 18

8.3. Activité anticancéreuse... 18

8 .4. Activité anti-inflammatoire. . . 19

8.5. Propriétés digestives . . . .. . . .. 19

8.6. Autres propriétés . . . ... 19

9. Toxicité et interactions de la propolis... 19

II. Matériel et méthode 1. Matériel végétal. . . .. 20

1.1. Récolte de la propolis... 20

1.2. préparation de l'extrait brut de la propolis... 20

2. Etude bactériologique... 20

2.1. La souche bactérienne et son origine... 20

2.2. Repiquage de S. aureus. ... . ... ... . ... ... . ... .. ... ... ... . .. . ... .... ... ... ... ... .. 20

2.3. Identification de la souche S.aureus.......................... 21

2.3.1. Coloration de Gram... 21

2.3.2. Test catalase... ... .... ... ... ... ... . . ... ... . ... ... . ... . ... ... ... ... ... .... 21

2.3.3. Test coagulase... 22

2.4. La sensibilité de S. aureus vis-à-vis des antibiotiques... 22

2.4.1. Technique de ]'antibiogramme... 22

3. Etude in vivo. . . 23

3.1. Entretien des animaux... 23

3.2. Induction de la pathologie expérimentale... 23

3.2.1. Préparation de l'inoculum. .. . . ... 23

3.2.2. Inoculation... 24

3.3. Suivie clinique... 24

3.4. Prélèvements et analyses... 24

3.4.1. Prélèvement du sang... 24

3.4.1.1. Enrichissement sur BHIB... 25

3.4.1.2. Test CRP... 25

3.4.1.3. Test FNS. ... ... ... . ... ... . .. ... ... ... ... ... . ... .... ... . . . ... ... ... 25

3.4.2. Collecte des urines... 26

3.5. Traitement... 26

3.5.3. Traitement par l'association propolis- antibiotique... 26

3.7. Dissection et prélèvement d'organes... 26

3.8. Examen anatomopathologique. ... . ... ... ... ... . ... ... . ... .... ... . ... .... ... ... . ... .... 27

3.9. Evaluation de la peroxydation lipidique... 28

3.9.1. Dosage de MDA cytosolique... .. 28

3.1 O. Analyse statistique... 29

III. Résultat et discussion 1. Résultats d'isolement et purification de S. aureus... ... .... ... . ... . ... . ... . . ... ... .... 30

1.1. Aspect macroscopique... 30

1.2. Aspect microscopique... 30

1.3. La coagulase... ... 31

1. 4. Test catalase. . . 31

2. Résistance et sensibilité aux antibiotiques... 32

3. l'état général des animaux... 32

3.1. Variation du poids des rats... 33

3 .2. Variation de la température chez les rats infectés. . . 34

4. Résultats des tests bactériologiques... 34

4.1. Résultats d'enrichissement sur BHIB. ... .. ... . ... ... . .... ... ... .... ... .. .. ... .. .... 35

4.1.1. Isolement du germe à partir du sang et son identification... 35

4.1.2. Résultat de !'antibiogramme des souches isolé des rats infectés... 35

4.2. Bactériurie et leucocyturie... 35

5. Résultats du test hématologique...... 36

6. Dissection... 38

7. Résultats de l'analyse histologique... 39

8. Evaluation du traitement... 39

8.1. Evaluation de la diminution de la température... 39

8.2. Variation du poids corporal après traitement... 41

8.3. Evaluation basé sur le résultat du test hématologique... 41

8.4. Evaluation basé sur les tests bactériologiques... 44

8.5. Evaluation basé sur l'étude histologique... 44

8.6. Evaluation de la peroxydation lipidique... 45

Conclusion . . . ... 48

Références bibliographiques... 49

BHIB : CAPE:

CA-SFM : COX:

CRP : EEP:

EDTA: FL-O·: FNS : IFN-y:

IL: LPS: Mc Farland : MDA: MH:

NF-KappaB : NK:

NOS : PTSAgs:

PLP2a:

PNN:

ROS : SARM : SDMV : SIRS : TEP : TSST-1: UFC:

Liste des abréviations

Brain Heart Infusion Broth Caffeic Acid Phenethyl Ester

Comité de l 'Antibiogramme de la Société Française Cyclo-Oxygénases

C-Reactive Protein

Extrait Ethanolique de la Propolis Acide Ethylène Diamine Tétracétique Radical Flavonoxy

Formule Numération Sanguine Interféron y

Interleukine

Lipo-Poly-Sacharides Mac Farland

Malon-Di-Aldéhyde Mueller Hinton

Nuclear transcription Factor Kappa B Natural Killer cells

Nitric Oxide Synthase PyrogenToxin Superantigen Protéine de Liaison à la Pénicilline Polynucléaires Neutrophiles Reactive Oxygen Species

Staphylococcus aureus R ésistants à la Méticilline Syndrome de Défaillance Multi-Viscérale

Systemic Inflammatory Response Syndrome 1,1,3,3-Tétra-Ethoxy-Propane

Taxie Shock Syndrome Toxine 1 Unité Formant de Colonie

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Introduction générale

Introduction

Les maladies infectieuses, provoquées par les virus, les bactéries et les eucaryotes parasites, constituent un problème de santé publique qui se présente, depuis ces dernières décennies, avec une ampleur et des caractéristiques nouvelles (Appit, 2004).

La septicémie est l'une de ces infections qui présente non seulement une maladie simple mais plutôt un syndrome hétérogène résultant des interactions hôte-pathogène (Christla et Tattevin, 2007).

Staphylococcus aureus est le principal agent pathogène responsable des infections hospitalières et communautaires et en particulier les infections systémiques (Nhan et al., 2012).

Par ailleurs, !'antibiothérapie reste la partie la plus importante du traitement des infections graves, mais l'évolution de la résistance aux antibiotiques chez les pathogènes présente un obstacle vis-à-vis ce traitement (Bapcoc, 2008).

La propolis est certainement un produit à ne pas négliger vue son importance comme matière première qui croit de jour en jour surtout dans le domaine de la médecine en raison de ces effets biologiques et pharmacologiques. Plusieurs études ont montré son activité antibactérienne vis-à vis des souches Gram positif et Gram négatif (Grange et Davey, 1990; Rojas Hemandez et al., 1993).

L'objectif de ce travail est d'évaluer l'activité antibactérienne de l'extrait brut de la propolis de la région de Kaous contre une infection septicémique à S.aureus. Pour cela nous avons provoquer une septicémie par S.aureus à des rats Wistar albinos, puis nous avons évaluer l'efficacité du traitement par la propolis en le comparant au traitement par un antibiotique de choix, et de voir l'effet de leur association avec le même antibiotique.

Dans le but de remplir les objectif précédemment cités, nous avons réparti notre travail en deux grandes parties; la première sera consacrée à synthétiser des connaissances bibliographiques sur la septicémie, les Staphylocoques et la propolis. La deuxième partie sera consacrée à l'étude expérimentale.

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1 • La septicémie ^{1 •}

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l. Analyse bibliographique

1. Introduction

Les maladies infectieuses ont longtemps représentées la principale cause de mortalité dans le monde. Elles regroupent un ensemble de maladies causées par l'invasion de tissus stériles par des microorganismes pathogènes bactériens, parasitaires, fongiques, ou viraux (Chest, 1992;

Appit, 2004; Khiati, 2006). Ces infections s'étendent des infections superficielles de la peau (infections localisées) qui se présentent sous forme de foyers suppurés plus ou moins volumineux et pouvant revétir différentes formes anatomiques (abcès, phlegmon, adeno- phlegmon, empyème, infections de séreuses), à des infections systémiques sévères comme la septicémie (Margairaz, 1975; Appit, 2004).

2. La septicémie 2.1. Défmition

La septicémie est définie comme "toute infection générale conditionnée par des décharges massives répétées, dans le sang, de bactéries pathogènes et de leurs poisons". Issue d'un foyer, appréciable ou non, cette migration de germes, continue, engendre des signes généraux graves tenant à de multiples embolies microbiennes à l'action des toxines bactériennes, et aux effets nocifs des produits de désintégration cellulaire, tous symptômes laissant au 2ème plan le foyer infectieux initial (Gastinel et Reilly, 1948).

Par contre, la bactériémie est un passage transitoire de germes, généralement peu nombreux dans la circulation sanguine (Margairaz, 1975).

2.2. Portes d'entrées

La septicémie peut se développer à partir d'une infection respiratoire (pneumonie), une infection digestive (gastrite, entérite) ou encore une infection urinaire (cela arrive parfois avec les sondes) ou génitale. Elle peut aussi être d'origine cutanée (blessure mal soignée, un furoncle ou encore un panaris), ou l'entrée du germe dans la circulation sanguine suite à l'implantation d'un cathéter veineux, d'une sonde ou d'une prothèse (Jacob et al., 1999; Schechter et al., 1999;

Antier et al., 2004; Vincenot, 2008). Les principaux micro-organismes et leurs portes d'entrée sont représentés dans le tableau 01.

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J. Ana{yse bibliographique

Tableau 01: Principaux micro-organismes el leurs portes d'entrée (Christla et Tattevin, 2007).

Portes d'entrée Germes les plus probables

Cutané Staphylocoques, Streptocoque

Digestif Entérobactéries, anaerobies

Urinaire Escherichia coli

Cathéter Staphylocoque, Streptocoque, entérobactéries, Candida

Génital Clostridium, entérobactéries, anaérobies

2.3. Stades cliniques

Une conférence de consensus en 1992 a pour la première fois définie cliniquement quatre stades liés à l'intensité de l'inflammation induite: réaction inflammatoire systémique, septicémie, septicémie sévère et choc septique. La réaction inflammatoire systémique ( «Systemic Inflammatory Response Syndrome», SIRS) est définie par la présence au minimum deux des signes d'inflammation sélectionnés. Si la réaction inflammatoire systémique est causée par une infection, on parle de septicémie ou sepsis. Lorsqu'en plus il y a défaillance d'un ou plusieurs systèmes organiques, la septicémie est définie comme sévère. En présence d'une hypotension supplémentaire réfractaire, il s'agit d'un choc septique (Bone et al., 1992; Paulo et al., 2003).

Ces définitions sont régulièrement actualisées dont la dernière publication date de 2008 par Dellinger et al. (Tableau 02).

Tableau 02: Consensus international sur les définitions des états septiques (Dellinger et al., 2008).

Dénomination Définition

Syndrome de réponse - Fièvre ou hypothermie (température corporelle >38,3°C ou <36°C) inflammatoire -Tachycardie (fréquence cardiaque >90 battement/min)

systémique (SIRS) -Tachypnée (fréquence respiratoire >20/min) ou Pa02< 32mmHg (au moins deux - Leucocytes >12.10⁹/l ou <4.10⁹/l

critères) -Altération des fonctions supérieures - Temps de recoloration capillaire >2s - Lactatémie >2 mmol/L

-Glycémie >7,7 mmol/L

Septicémie (sepsis) - Réaction inflammatoire systémique et infection identifiée ou présumée, CRP> 6mg/l

Septicémie sévère - Sepsis avec lactates >4mmol/L ou

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/. Ana{yse bibliographique - Dysfonction d'organe (une seule suffit):

- respiratoire : Pa02/Fi02<300 - rénale : créatinine > 176µmol/L - coagulation : INR > 1,5

- hépatique : INR > 4, bilirubine >34µmol/L - thrombopénie : < 1 OO 000/mm³

- fonctions supérieures : CGS< 13

Choc septique -Septicémie sévère avec hypotension artérielle malgré un remplissage vasculaire optimal (20-40ml/kg)

Pa02 : pression partielle en oxygène ; PAS: pression artérielle systolique ; Fi02: fraction inspirée en oxygène; INR: international normalized ratio; CGS: coma Glasgow score.

2.4 Classification

En fonction de leur point de départ, la septicémie est classée en trois types majeurs:

2.4.1. Septicémie à point de départ thrombophlébitique

C'est une atteinte de l'endothélium veineux à partir d'une porte d'entrée cutanio-muqueues, elle est due à des germes pyogènes (staphylocoques, streptocoques ... ) qui evoluent sur un mode aigu. Le germe présent au niveau du caillot passe périodiquement dans le sang, (Appit, 2004;

Kembaum, 1988).

2.4.2. Septicémie d'origine lymphatique

C'est une infection moins aigue. Les germes gagnent les macrophages d'un ganglion drainant le territoire de la porte d'entrée, et s'y multiplient; c'est la période d'incubation de la maladie.

De là, les germes passeront dans le sang (Kembaum, 1988).

2.4.3. Septicémie à départ endocardique

C'est une atteinte de valves cardiaques avec formation de vésicules qui vont se rompre et essaimer les bactéries directement dans la circulation générale. Exemple : Rhumatisme cardiaque aigu. (Appit, 2004).

2.5. Complications

2.5.1. Le syndrome septicopyohémique

Il correspond à un état septicémique subaigu caractérisé par l'apparition successive de plusieurs foyers suppurés cliniquement décelables (Margairaz, 1975).

2.5.2. Le syndrome de défaillance multiviscérale (SDMV)

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/.Analyse bibliographique

Survenue simultanée ou successive d'au moins deux défaillances viscérales d'ordre respiratoire, circulatoire, hépatique, hématologique, rénal, digestif ou neurologique, associées à une élévation du débit cardiaque et du métabolisme (surtout du catabolisme) (Schaechter, 1999).

2.6. Physiopathologie

Après pénétration dans l'organisme d'un agent infectieux tel que les bactéries, certaines composantes de celle-ci comme les LPS (lipopolysacharides) ou endotoxines des bactéries à Gram (-), les composants de la paroi des bactéri.es à Gram ( +) (acide lipoteichoïque ), sont reconnues par des recepteurs (par exemple CD14 et récepteurs Toll-like) avant tout au niveau des leucocytes, induisant chez l'hôte une activation du système immunitaire qui va être responsable d'une réaction inflammatoire générale dénomée SRIS (Landmann et al.,1996;

Bégué,1999; Nauciel et Vildé, 2005).

2. 7. Stress et inflammation

Le stress oxydant résulte d'un déséquilibre entre oxydants (radicaux libres) et anti-oxydants en faveur des radicaux libres entrainant des dommages cellulaires (Ji, 2001). Dans des conditions physilologiques normales, l'anion 0_2- n'est produit qu'en faible quantité et les systèmes de défenses endogènes suffisent à neutraliser cette producrion. Il arrive que dans certaines situations particulières, comme par exemple dans des cas d'infection ou d'inflammation, les quantités produites des ROS par les polynucléaires neutrophiles activés soient supperieures à la capacité antioxydante de la cellule (Pasquier, 1995; Di Virgilio, 2004).

2.8. Diagnostic de la septicémie

Le diagnostic repose sur la mise en évidence, par hémoculture, de la présence du microbe dans le sang, le prélèvement doit se faire de façon aseptique, répétée (au moins 6 à 10 fois durant les 24 premières heures) au moment d'un frisson ou lors de l'élévation de la température, et en quantité suffisante (10 ml de sang chez l'adulte) (Khiati, 2006).

La recherche également de germe au niveau de la porte d'entrée, si elle est retrouvée et accessible, et au niveau des localisations secondaires éventuellement présentes (Khiati, 2006).

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/. Ana{yse bibliographique

2.9. Traitement d'une septicémie

Le traitement de la septicémie et de ces complications comprend deux volets essentiels dont le premier consiste à un traitement antimicrobien, le second a pour objectif de moduler l'immunité du patient (Raguin, 1995).

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J. Ana{yse bibliographique

1. Introduction

Dès la naissance, l'homme se trouve en contact avec des bactéries qui vont progressivement coloniser son revêtement cutanéo-muqueux. On estime que le nombre des bactéries de la flore commensale est dix fois plus élevé que le nombre de cellules d'un organisme humain (Nauciel et Vildé, 2005).

Pasteur a été découvert les Staphylocoques en 1879, dans des pus de furoncle et d'ostéomyélites. Les staphylocoques, qu'il venant de découvrir sont responsable d'un très grand nombre d'infections chez l'homme et l'animale (Berche et al., 1988 , Schaechter et al., 1999;

Polakowska et al., 2012). Ces infections sont des entités rares mais potentiellement sévères (Nhan et al., 2012) voire mortelles nécessitant la mise en route d'un traitement antibiotique par voie générale (Drugeon et al., 2012).

Staphylococcus aureus est un agent pathogène majeur de l'homme, capable de produire de

nombreux facteurs de virulence (Nhan et al., 2012) qui impliqué dans 1 à 5% des infections communautaires et jusqu'à 30% des infections nosocomiales. (Porcheret et al., 2010; Unal et al., 2004; Fanny et al., 2008).

2. Le genre staphylocoque 2.1. Habitat

Les staphylocoques survivent et prolifèrent du fait de leur particulière résistance aux conditions hostiles de l'environnement, telle que la chaleur, la sècheresse, ou la salinité de l'eau (Breche et al., 1988).

Les staphylocoques sont très répandus dans la nature (aire, eau, sol), et habituellement retrouvés sur certains produits alimentaires comme les laitages (Avril et al., 1992; Mounier et Denis, 1987; Breche et al., 1988). Ces caractères ubiquitaires et saprophytique expliquent que ces germes soit aussi des commensaux occasionnels ou permanents de la peau et des muqueuse de l'homme et des animaux (Breche et al., 1988; Archer et Climo. 2001; Peacock et al., 2001;

Fanny et al., 2008).

Les staphylocoques, en particulier les espèces S. aureus et S. epidermidis font partie de la flore normale de nombreux individus, qui sont des« porteurs asymptomatiques» (Avril et al., 1992).

On peut également les isoler de la peau (S. épidermidis 85-100%) (Faucher et avril, 2002; Avril et al., 2003; Breche et al., 1988) et surtout des zones chaudes et humides (creux axillaire, périnée) (Nauciel et Vildé, 2005; Avril et al., 1992). Ils peuvent être trouvés particulièrement dans les fosses nasales antérieures (S. aureus 30 à 40%, S. épidermidis 30-100%) (Kluytmans et al., 1997). Le portage nasal de S.

aureus

(Wertheim et al., 2005) constitue une barrière de

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J. Analyse bibliographique

colonisation, empêchant l'adhésion d'autres souches. Cette barrière est altérée en cas d'antibiothérapie (Bogaert et al., 2004).

2.2. Classification

Le genre Staphylococcus appartient à la famille des Micrococcaceae (Peacock et al, 2001).

Il comprend 45 espèces et sous espèces dont dix sept ont été retrouvées chez l'homme, d'autres sont présentes chez les animaux ou dans les aliments (viandes, produits laitiers). Parmi les espèces retrouvés chez l'homme, trois espèces occupent une place privilégiée: S. aureus, S.

epidermidis et S. saprophyticus (Bes et Brun, 2002; Avril et al., 1992).

2.3. Caractères bactériologiques 2.3.1. Caractères morphologiques

Les staphylocoques apparaissent à l'examen microscopique comme des cocci à Gram positif, bactéries sphériques de 0,8 à 1 µm de diamètre, regroupés généralement en petits amas (grappe de raisin), ils sont immobiles, asporulés, habituellement acapsulé (Pasteur, 1877; Mylotte et al, 1987; Buckingham et al 2004; Bes et Brun, 2002; Fleurette, 1989; Sutra, 1998; Schaechter et al., 1999).

2.3.2. Caractères culturaux

Les staphylocoques sont aéro-anaérobies facultatifs, à métabolisme respiratoire et fermentaire, cultivant facilement en 24h sur milieux ordinaire. S. aureus peut être aussi isolé sur milieux sélectifs (milieu hypersalé de Chapman). Les colonies sont convexes, lisses (smooth) de l à 4 mm de diamètre. De nombreuses souches de S. aureus produisent un pigment jaune dorée ou citrin, non diffusible, et sont hémolytique sur gélose au sang. En milieu liquide, la culture est rapide et se traduit par l'apparition d'un bouillon trouble en quelques heures (Brun et Bes, 2000;

Avril et al., 1992; Fleurette, 1989; Berche et al., 1988).

2.3.3. Caractères physiologiques et biochimiques

Toutes les espèces du genre Staphylococcus sont catalase-positives et oxydase- négatives (Bes et Brun, 2002). Le tableau 03 indique les caractères biochimiques des espèces de Staphylocoques ayant un rôle potentiellement pathogène.

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!. Ana{yse bibliographique

Tableau 03: principale caractères biochimiques des espèces de Staphylocoques (Avril et al., 1992, Bes et Brun, 2002).

Caractère S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus

Coagulase

+ -

^-

DNase thermostable +

- -

Nitrate-réductase + + +

Phosphatase + +

-

D-mannitol (acidification) +

-

^-

Catalase + + +

Oxydase - -

-

2.4. Structure antigénique

Plusieurs substances de la paroi des staphylocoques jouent un rôle dans les réactions immunologiques (tableau 04).

Tableau 04: structure antigénique de la paroi des Staphylocoques.

Structure Rôles biologiques Références

antigénique

Peptidoglycane fièvre, activation du complément et du chimio- (Azele, 1989; Lowy, tactisme, thrombocytopénie, dermonécrose, et 1998)

induction des réponses immunitaires.

Acides Activation du complément, (Nauciel et Vildé, 2005;

teichoïques Induction de la sécrétion des cytokines Schaechter et al., 1999;

inflammatoires Kimbrell et al., 2008).

Polysaccharides Empêchement de l'activation de la voie alterne (Schaechter et al., 1999;

de surface du complément, protection contre la Avril et al., 1992).

phagocytose

Protéine A protège les staphylocoques de la phagocytose (Avril et al., 1992;

Silverman et Goodyear, 2006).

3. Les staphylocoques coagulase-positifs

Les staphylocoques coagulase-positifs dont le représentant principal est S. aureus, sont bien connus pour leur virulence (Bisognano, 2000).

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1. Analyse bibliographique

3.1. Définition de la coagulase

La coagulase (libre) est une protéine extracellulaire fabriquer par S. aureus, de poids moléculaire variable selon les souches (31 à 58 KDa) capable de coaguler en quelques heures le plasma humain ou de lapin (prélevé sur citrate, héparine, oxalate ou EDTA) (Azele, 1989;

Baggett et al., 2004; Jeljaszewicz et al., 1983; Avril et al., 1992).

La coagulase de S. aureus active la prothrombine sans clivage protéolytique (Cawdery et al., 1969; Carretto et al., 2005). Cette activation provoque la transformation du fibrinogène en fibrine (Peacock et al., 2002; McAdow et al., 2012) en formant un caillot visible résultant de l'activation des facteurs de coagulation du plasma et protégeant les staphylocoques de la phagocytose (Cawdery et al., 1969; Collignon, 1998; Carretto et al., 2005 ; Azele, 1989;

Fleurette, 1989).

3.2. Epidémiologie

S. aureus est le principal agent pathogène communautaire impliqué dans des infections nosocomiales et épidémique en milieux hospitalier (Kempf et al., 2007; Silverman et Goodyear, 2006).

Plusieurs facteurs de risque expliquent la fréquence et la gravité des infections à S. aureus: Le caractère ubiquitaire de la bactérie, la multirésistance de certaines souches aux antibiotiques (Vincenot, 2008), notamm.ent en milieu hospitalier (Prévost, 2004), présence de matériel étranger: cathéters veineux (Grossi, 2010), sondes urinaires (Bajolet et al, 2010) et prothèses (Ziza et al, 2006) ainsi qu'une diminution des défenses immunitaires des patients hospitalisés (Prévost, 2004).

3.3. Pouvoir pathogène

3.3.1. Pouvoir pathogène naturel

Chez l'homme S. aureus est responsable des:

./ Infections cutanées qui peuvent affecter par exemple les folliculites pilo-sébacés (folliculites, furoncles) ou les ongles (panaris). Les infections des muqueuses sont essentiellement des angines, des sinusites et des conjonctivites (Brun et Bes, 2000; Avril et al., 1992; Berche et al., 1988; Vincenot, 2008) .

./ Septicémies correspondent à la multiplication et la dissémination de S. aureus dans la circulation sanguine (Brun et Bes, 2000;Vincenot, 2008) .

./ Maladies liées à la production de toxines principalement:

/.Analyse bibliographique

• Le syndrome de la peau ébouillantée qui se traduit par un décollement bulleux des couches de l'épiderme lié à des toxines exfoliatines (Brun et Bes, 2000);

• Le syndrome du choc toxique (TSS) qui correspond à des dérèglements physiologique multiples (hyperthermie, hypotension artérielle, ... ) due à la « Toxic Shock Syndrome Toxine 1» (TSST-1) (Fanny Vincenot et al., 2008);

• Les intoxications alimentaires à S. aureus survient 3 à 6 heures après l'ingestion des entérotoxines (A et E), préformées dans l'aliment, résistant aux sucs digestifs et pour certaines à la chaleur (Brun et Bes, 2000; Vincenot, 2008).

3.3.2. Pouvoir pathogène expérimental

Il est nécessaire d'injecter 5.10⁶ UFC de S. aureus sous la peau pour produire une infection en peau saine chez l'homme; par contre 1 OO bactéries suffisent sur une peau comportant des lésions préexistantes (Avril et al., 1992).

3.4. Facteurs de virulences

La virulence de S. aureus est due à la sécrétion de multiples toxines et enzymes. Le tableau 05 représente les différents facteurs de virulence solubles de S. aureus (Brun, Bes, 2000; Sutra,

1998; DeLeo et al., 2009).

Tableau 05: facteurs de virulence solubles de S. aureus (Schaechter et al., 1999; Vincenot et al., 2008; Silverman et Goodyear, 2006).

Facteurs de virulences Syndromes cliniques associés

Leucocidine Attire et inhibe les leucocytes au site de l'infection (formation de pus).

Catalase Diminue probablement l'action destructrice des phagocytes.

Coagulase Provoque la prise en masse du plasma.

Hémolysine Peut favoriser la diffusion par destruction de la substance de base du tissu conjonctif.

~-lactamases Inactivent les pénicillines.

Exfoliatine Provoque le découlement de la peau dans le syndrome de Lyell.

Toxine du choc Impliquée dans le syndrome du choc toxique.

toxique

entérotoxines Responsables d'intoxications alimentaires (6 types connus).

l l

l. Analyse bibliographique

3.5. Diagnostic bactériologique

Le diagnostic bactériologique d'infection staphylococcique (S. aureus) est, aujourd'hui, quasi exclusivement direct, par mise en évidence de la bactérie à partir de prélèvements pertinents (Nuyttens et al., 2011) ou par hémoculture en cas de septicémie ou de bactériémie. L'étude de la sensibilité aux antibiotiques est indispensable pour mettre en œuvre un traitement approprié (Nauciel et Vildé, 2005).

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1. Analyse bibliographique

1. Introduction

Comme tous les produits de la ruche, la propolis existe depuis que l'abeille est apparue sur terre, il y a environ 125 millions d'années (Bankova et al., 2002; Burdock, 1998), leur usage remonte à plusieurs millénaires avant notre ère vraisemblablement à l'Egypte antique pour les embaumements des momies (De Almeida et Menezes, 2002), et de façon certaine aux Grec qui l'ont utilisée pour les suppurations (Antonio et al., 2005). Les romains quant à eux, l'ont donnée à tous les soldats pour soigner les blessures pendant leurs différentes invasions. Connu des Incas chez lesquels elle était utilisée dans le cadre des infections fébriles (Hegazi, 1997; Lavie, 1975).

A la fin de 21 ème siècle, un important marché de la propolis existe en Russie et en Allemagne, c'était un remède populaire qui prétendait soigner tous les maux (Debuyser, 1984).

2. Définition

La propolis, ou colle d'abeille, est une substance naturelle résineuse recueillie par les abeilles soit sur des bourgeons d'arbres tels que le peuplier, le chêne, l'aulne, etc., soit sur des conifères, amalgamée à une sécrétion salivaire des abeilles et des écorces de diverses espèces d'arbre (Gomez-Caravaca et al., 2006). Les abeilles l'utilisent à l'entrée de leur ruche pour en protéger l'accès, c'est ce qui indique son étymologie Grecque « Pro » signifiant devant ou défense, et

«Polis» signifiant la cité (Ghisalberti, 1997). Une autre étymologie Latine a également été avancée venant de l'adverbe «Pro» qui veut dire dans le but et le verbe «Polis» qui signifie enduire (Pierre et Y eves, 2005).

3. Origine de la propolis

Depuis les temps les plus anciens, les apiculteurs se sont aperçus que les abeilles récoltaient la résine des bourgeons de divers arbres et en particulier celle du peuplier. Cette ancienne hypothèse de l'origine externe de la propolis à été remise en question au début de siècle, et certains spécialistes estiment pour leur part que certaines variétés de propolis sont d'origine interne ou mixte (Debuyser, 1984).

3.1. Théorie de l'origine interne

D'après les chercheurs Allemands; la propolis est un résidu issu de la première phase de digestion du pollen dans un petit organe situé entre le jabot et l'intestin moyen appelé Je gésier à pollen. La propolis serait ensuite régurgitée par l'abeille. La présence d'enveloppe de grains de pollen et de soie d'abeilles appuyait cette théorie (Debuyser, 1984).

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/. Ana~se bibliographique

3.2. Théorie de l'origine externe

La propolis trouvée dans la ruche est en grande partie, constituée par les résines recueillies sur les bourgeons de certains arbres, il s'agit de peuplier surtout et aussi de châtaigniers, marronniers d'Inde, sapins, chêne, orme, frêne, prunier, bouleau, saule (Biri, 1989; Shigenori, 2008).

4. Récolte de la propolis

La récolte de la propolis s'effectue d'abord par les abeilles et ensuite par l'homme (Yves, 1981):

4.1. La récolte par les abeilles

La récolte de propolis est faite par un nombre relativement restreint d'abeilles ouvrières butineuses, qui se trouvent dans la dernière partie de leurs existences (Yves, 1981). Ces ouvrières sont certainement très spécialisées dans cette activité puisqu'elles ne semblent pratiquement effectuer aucun autre travail au sein de la colonie, leur rôle se limite au colmatage à l'intérieur de la ruche (Yves, 1981).

La récolte de la propolis par les abeilles s'effectue suivant quatre étapes:

• A l'aide de ces antennes, l'abeille repère un morceau de propolis, puis avec ses mandibules elle en détache un fragment en s'aidant parfois de ses pattes antérieurs;

• Le morceau de propolis modelé par les mandibules est pris avec les pattes antérieures;

• Celui-ci est alors transféré aux pattes du milieu;

Par un mouvement rapide la propolis est finalement déposée dans la corbeille des pattes postérieures, où elle est transportée jusqu'à la ruche (Debuyser, 1984;Yves, 1981).

4.2. La récolte par l'apiculteur

La propolis peut étre récoltée selon des techniques diverses :

• Raclage et grattage des cadres ou des parois de la ruche, de préférence par température assez basse. La propolis alors dure et friable se détache mieux (Lavie, 1975).

• Utilisation de différents dispositifs: griUe moulée en matière plastique ou en métal. On pose cette grille comme couvre cadres. Les abeilles s'empressent d'obturer ces trous de propolis. Le moment idéal se situe après la récolte d'été, les abeilles se consacrent plus facilement à cette tâche, sachant l'hiver proche (Evangelist-Rodrigues et al., 2001; Krell, 1996). Ce procédé donne une propolis de meilleure qualité (Debuyser, 1984). Cette propolis brute doit être purifiée avant toute utilisation (Lavie, 1975).

1

/.Analyse bibliographique

5. Propriétés physiques

5.1. Caractéristiques organoleptiques

La propolis est une substance résineuse, d'aspect hétérogène qui présente les caractères suivants:

+

Couleur : Elle varie selon sa provenance, allant de jaune clair au brun très foncé, presque noire en passant par toutes les gammes des bruns (brun jaune, brun vert et brun rouge) (Lavie, 1975).

+

Saveur: Elle est souvent âcre et parfois amère (Makashvili, 1978; Metzner et al., 1997).

+

Odeur : D'odeur variable selon son origine, en général arôme agréable et douceâtre, mélangé à celui du miel, de la cire et d'autres produits (cannelle, vanille ... etc.) (Tosi et al., 2006).

5.2. Consistance

La propolis est une substance de consistance variable suivant la température : Elle est dure et friable à 15°C; molle et malléable à 30°C; et coulante et gluante entre 30°C et 60°C (Lavie, 1975; Krell, 1996). Le point de fusion est variable, il se situe vers 60 à 70°C en moyenne mais peut atteindrel00°C et plus (Krell, 1996).

5.3. Solubilité

Elle est insoluble dans l'eau à froid, selon Bankova, quelques composants sont solubles dans l'eau bouillante. Elle est partiellement soluble dans l'acétone, l'alcool (éthanol, méthanol), l'ammoniaque, benzene, et seul un mélange adéquat de différents solvants permettent de la dissoudre (Bankova et al., 2000; Evangelist, 2001)

5.4. Densité

Elle est de l'ordre de 1,2 en moyenne (Lavie, 1975).

6. Composition chimique

La composition chimique de la propolis a éveillé l'intérêt de nombreux chercheurs qui ont effectué plusieurs travaux sur des propolis de différents pays et ont trouvé que la composition chimique de la propolis varie selon l'origine botanique (Bankova et al.,2000; Negri et al.,2000;

Popova al., 2002), l'espèce d'abeille, le temps de la récolte et la zone géographique (Ghisalberti, 1979), mais elle présente tout de même qualitativement de nombreuses substances qui s'y retrouvent de façon constante et relativement stable (Justin, 1996 ).

La liste des principales classes des composés chimiques de la propolis est illustrée dans le tableau 06.

1

Tableau 06 : Composition moyenne de la propolis Composition en ordre Composants par groupes

Résines 45-55%

Flavonoïdes,

acides phénoliques et leurs esters Cire et acides gras 20-30%

Cire d'abeille et des plantes Huiles essentielles 10% : Produits volatiles

Pollen 5% : Protéines ( 6 acides aminés libres > 1 % ) arginine et proline jusqu'à 46% du totale

Autres composés 5%

minéraux 14 traces de minéraux, silice, fer et zinc sont les plus communs

7. Utilisation de la propolis 7.1. Par les abeilles

l. AnaOise bibliographique

Références

Bankova et al., 1987 Nagy, 1989

Omar, 1989 Papay, 1987

Tosi et al., 2006 Gabrys, 1986

Bankova et al., 1987 Cuellar, 1987

A l'intérieur de la ruche, la propolis sert de mastic de ciment ou de baume. Les abeilles l'emploient pour (Pierre et Y eves, 2005):

./ Assurer une meilleure isolation thermique;

./ Obturer les fissures ;

./ Réduire l'ouverture de trou de vol dans les régions à climat froid ;

./ Recouvrir les corps étrangers (souris, cétones, frelons ... etc.) qu'elles ne peuvent pas évacuer;

./ Réparer les rayons et renforcer les minces parois des alvéoles en l'incorporant à la cire que l'abeille sécrète;

./ Stériliser les alvéoles avant la ponte.

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7.2. Par l'homme

La propolis est largement utilisée dans plusieurs domaines tels que : 7.2.1. Cosmétique

1. Ana{yse bibliographique

La propolis et ses extraits ont été largement utilisés dans la dermatologie et la cosmétique (Lejeune et al., 1988). Ses effets sur la régénération et la rénovation des tissus ont été bien étudiés. Avec ses caractéristiques bactéricides et fongicides, elle offre de nombreux bénéfices dans diverses applications (Krell, 1996).

7 .2.2. Médecine

La propolis est utilisée dans divers traitements tels que: les problèmes cardiovasculaires, les soins dentaires, les ulcères, les infections des muqueuses et les lésions, le cancer, elle est utilisée aussi dans le soutien et l'amélioration du système immunitaire (Krell, 1996; Neumann, 1986).

7.2.3. Technologie alimentaire

La propolis peut être utilisée comme préservatif en matériel d'emballage de nourriture (Mizuno, 1987). Elle est aussi utilisée pour la prolongation de la vie d'entreposage en congélation des poissons (Yves, 1981).

8. Propriétés pharmacologiques

Elles sont connues dans la médecine populaire depuis l'antiquité, mais récemment, l'intérêt de la propolis est en développement considérable en raison de son large spectre de propriétés biologiques (antimicrobienne, antioxydant, anti-inflammatoire, anti-tumorale ... ). L'ensemble des recherches effectuées à ce jour permet de montrer que la présence des polyphénols est responsable de toutes les propriétés pharmacologiques de la propolis (Sulaiman et al., 2012).

8.1. Activité antimicrobienne 8.1.1. Activité antibactérienne

De nombreuses études ont démontré l'effet d'inhibition de la propolis sur les souches Gram (+),Gram(-) (Grange et Davey, 1990; Rojas Hemandez et al., 1993) et les bactéries anaérobies (Kedzia, 1986; Santos et al., 2002; Boyanova et al., 2006). Cet effet dépend de la souche étudiée, de l'origine de la propolis et du solvant utilisé (Ugur et Arslan, 2004).

La propolis est bactéricide, efficace pour les germes comme Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Streptococcus oygenes, Escherchia faecalis, Escherchia coli ... etc (Silici et al., 2007; Gülhan et al., 2008; Silici et Kutulka, 2005; Li- Chang Lu et al., 2005; Atac et

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J. Ana(yse bibliographique

qui semble avoir un effet anti-staphylococcique très important, mais aussi aux acides caféique, férulique, gallique et salicylique (Ghedira et al., 2009).

8.1.2. Activité antifongique

La propolis possède des propriétés antifongiques (Cizmaric et Trupl, 1976; Pepeljnak et al., 1982; Ota et a/.,2001; Ozcan et al., 2004). Elle a des effets antimycosiques, contre les germes appartenant au genre Candida et contre les levures. Elle s'est montrée efficace dans l'infection à la Giardia lamblia (oxyurose) comme la métronidazole (Ghedira et al., 2009).

8.1.3. Activité antivirale

Il y a peu d'étude qui ont été réalisée sur l'activité antivirale de la propolis (Marcucci, 1995).

La propolis provenant du Brésil s'est montrée active contre le virus de la grippe (A et B en particulier). L'ester Phényléthylique de l'acide Caféique (CAPE) est un des plus puissants agents anti-intégrase du VIH. La propolis est également anti-herpétique (Ghedira et al., 2009).

8.2. Activité anti-oxydante

L'activité antioxydante de l'extrait de propolis est principalement attribuée à sa composition en flavonoïdes (Y ousef et Salama, 2009). Ces derniers possèdent une structure chimique idéale qui leur confère une capacité à piéger les radicaux libres, et ils sont considérés comme les antioxydants les plus efficaces in vitro même plus que les tocophérols et l'acide ascorbique (Blokhina et al., 2003).

8.3. Activité anticancéreuse

La propolis a un effet cytotoxique qui permet d'inhiber les cellules tumorales Hela avec une

Cl₅₀ de 7,45 µg/ml (Banskota, 2002). Ross (1990) a démontré l'effet cytotoxique du naphtalène dérivé de la propolis sur les cellules cancéreuses de l'ovaire des hamsters chinoises.

La propolis verte de Brésille a montrée in vitro une activité sur différentes cellules tumorales (Bassani-Silva et al., 2007; Bufalo et al., 2009b}, et les principaux mécanismes par lesquels la propolis affecte les cellules tumorales sont liés à l'inhibition de la croissance cellulaire et à l'apoptose (Sforcin, 2007; Sforcin et al., 2002a) ont démontré l'augmentation de l'activité cytotoxique des NK (natural killer cells) sur le lymphome murin traité par la propolis Brésilienne

10% pendant 3 jours.

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/. Anab'se bibliographique 8.4. Activité anti-inflammatoire

L'action anti-inflammatoire de la propolis a été rapporté par plusieurs chercheurs, en utilisant différents modèles expérimentaux (Khayyal et al., 1993; Miyataka et al., 1997; Hu et al., 2005;

Paulino et al., 2006). La Propolis inhibe de manière dose dépendante l'activité des cyclo- oxygénases (COX), enzymes intervenant dans la formation des prostaglandines impliquées dans l'inflammation (Borrelli et al., 2002).

8.5. Propriétés digestives

La propolis est inhibitrice des spasmes des voies digestives. Elle protège l'estomac contre des lésions induites par l'éthanol. L'extrait de propolis agirait en inhibant la lipoxygénase et protège la muqueuse gastrique du stress oxydatif. L'ester phényléthylique de l'acide caféique (CAPE) de Ja propolis atténue les symptômes de la colite induite par le peptidoglycane-polysaccharide bactérien en inhibant les NF-KappaB produites dans les macrophages, réduisant ainsi la production de cytokines pro-inflammatoires (Ghedira et al., 2009).

8.6. Autres propriétés

Beaucoup d'autres propriétés biologiques et pharmacologiques de propolis ont été décrites par divers auteurs, y compris la régénération des tissus, l'activité hepatoprotective, action immunomodulatrice (Marcucci, 1995; Sforcin, 2007; Orsatti et al., 2010a ), anti-carie (Ikino et al., 1991), et anesthésique (Paintz et Metzner, 1979).

9. Toxicité et interactions de la propolis

Les études en rapport avec la toxicité de la propolis sont rares, Ghisalberti annonce qu'elle n'est pas toxique pour l'homme et les animaux si elle est consommée en quantité raisonnable (Ghisalberti, 1997). Lorsqu'elle est administrée chez le rat par voie orale à une dose de 4 mg/kg/jours durant 15 jours, elle n'entraine aucun effet toxique (Decastro et Higashi, 1995). La propolis ne montre aucune interaction avec d'autres thérapeutiques (Burdock, 1998).

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1 II~ MATERIEL ¹

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1 ET METHODE ¹

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II Matériel et méthode

Cette étude a été réalisée au niveau de laboratoire de microbiologie de la faculté des sciences de la nature et de la vie à l'université de Jijel.

Le but de cette étude est de provoquer une infection septicémique chez des rats Wistar albinos par S. aureus, confirmer l'état infectieux par des tests bactériologiques et hématologiques, et évaluer l'efficacité du traitement à base d'extrait éthanolique de la propolis (EEP) par rapport à un antibiotique.

1. Matériel végétal

1.1. Récolte de la propolis

La propolis est récoltée au mois d'Avril 2005, elle est fournie par la coopérative apicole de la région de K.aous (Jijel). La récolte est effectuée par raclage et grattage de l'entrée des ruches. La propolis est stockée à l'abri de la lumière et de la chaleur dans des récipients bien fermés avant son utilisation pour garder ses principes actifs intacts.

1.2. Préparation de l'extrait brut de la propolis

L'échantillon de la propolis est découpé en petits morceaux puis lavé dans l'alcool pendant 2 heures pour éliminer les impuretés. Ensuite, lg de la propolis est plongé dans 10 ml d'éthanol 95%. La macération est réalisée à l'abri de la lumière et à la température ambiante pendant 15 jours avec agitation de temps en temps. Le macéra est filtré sur papier filtre et par la suite le filtra est évaporé au rotavapeur (Evaporator El OO Heidolph) à 79%. Le résidu est repris dans 10 ml de méthanol 70% et laissé à macération pendant une nuit. Après évaporation, l'extrait obtenu est appelé extrait brut de la propolis (extrait éthanolique de la propolis: EEP).

2. Etude bactériologique

2.1. La souche bactérienne et son origine

La souche utilisée dans notre travail est Staphylococcus aureus.

2.2. Repiquage d.e S. aureus

Cette technique est utilisée pour rendre les cellules bactériennes actives après la période de stockage (Delarras, 2008).

La réalisation du repiquage se fait en ensemençant en stries le contenu d'une anse de platine, sur le milieu solide gélose Chapman afin d'obtenir des colonies bien isolées après incubation dans l'étuve à 37°C pendant 18 heures.

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Il. Matériel et méthode

2.3. Identification de la souche S.aureus

L'identification de S. aureus a été faite selon la méthode conventionnelle décrite par Larpent et al. (1992) en effectuant la coloration de Gram, la recherche de la catalase, et la mise en évidence de la coagulase libre.

2.3.1. Coloration de Gram

La coloration de Gram est une coloration différentielle qui repose sur la perméabilité de la paroi bactérienne. Elle est effectuée à partir des colonies cultivées sur gélose Chapman présentant l'aspect caractéristique du Staphylocoque, pour confirmer la présence des cocci en diplocoques et en grappes de raisin (Joffin et Leyral, 2006).

Sur une lame porte objet propre, on a déposé quelques gouttes d'eau physiologique stérile, puis une colonie bactérienne est prélevée par une anse de platine stérile et déposée sur la lame, ensuite on a étalé l'échantillon en un frottis mince. Après séchage du frottis à l'air libre, deux à trois passages rapides dans la flamme du bec benzen sont effectués pour bien fixer le frottis. Ce dernier est recouvert avec le Violet de gentiane pendant une minute. La lame est rincée avec un jet d'eau faible, elle est ensuite traitée par la solution de Lugol pendant une minute puis rincée rapidement. La solution de décoloration, alcool, est versée sur la lame de manière à recouvrir entièrement le frottis; la lame est rincée immédiatement. On soumet par la suite le frottis à une contre coloration de 30 seconde à la Fuchsine. Après un rinçage, la lame est séchée avec du papier buvard. Le frottis est observé au microscope optique avec l'objectif à immersion (objectif xlOO).

2.3.2. Test catalase 2.3.2.1. Principe

Le test de la catalase est un examen important pour identifier les microorganismes, en particulier les bactéries à Gram positif. Cette enzyme empêche la production d'H₂0₂ dont l'accumulation pourrait être léthale pour la bactérie. L'enzyme de la catalase peut convertir le peroxyde d'hydrogène en eau et en oxygène selon l'équation suivante:

Catalase

- - - • 2H20

+

02

2.3.2.2. Procédure

On a enlevé des colonies bactériennes de la gélose avec une anse de platine stérile en faisant très attention pour ne pas prendre de la gélose, puis placées sur une lame de verre propre. Ensuite par une pipette pasteur stérile, on a ajouté une goutte de peroxyde d'hydrogène (H₂0₂) sur les

II. Matériel et méthode

colonies bactériennes. Une réaction positive est indiquée par des bulles qui se produisent en 1 O secondes.

2.3.3. Test coagulase 2.3.3.1. Principe

S. aureus fabrique une exoenzyme (coagulase libre) capable de coaguler en quelques heures le plasma humain ou celui du lapin citraté, hépariné, ou oxalaté (Azele, 1989).

2.3.3.2. Réalisation du test

Dans un. tube à hémolyse qui contient 1 ml de sérum citraté on a introduit quelques colonies bactériennes prélevées soigneusement à partir d'une culture pure par l'anse de platine stérile, puis on a mélangé légèrement, le mélange est ensuite incubé à 3 7°C pendant 1 à 2 heures voir 24 heures. Le test est considéré comme positif lorsque un caillot moins compact visible avant la 24èmeheure.

2.4. La sensibilité de S. aureus vis-à-vis des antibiotiques

L'antibiogramme de S. aureus a été réalisé par la technique de diffusion en milieu gélosé, Mueller Hinton (MH), recommandée par le Comité de l 'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM) (Soussy, 2007).

2.4.1. Technique de l'antibiogramme

Deux colonies identiques de S. aureus sont raclées à l'aide d'une anse de platine et transvasées dans un tube contenant 5 ml d'eau physiologique stérile à 0,9%. Elles sont émulsionnées sur le bord du tube puis agitées pour bien homogénéiser jusqu'à l'obtention d'une suspension de trouble équivalente au standard Mc Farland 0,5 (~10⁸UFC/ml). Ensuite, la suspension est diluée au 1/10 en eau distillée stérile.

Le milieu MH, est coulé en boite de Pétri de 90 mm de diamètre sur une épaisseur de 4 mm.

Puis on a ensemencé par la technique d'inondation, la boite de MH par 1 ml de l'inoculum, puis on a aspiré le surplus. Les boites sont séchées pendant 15 minutes.

Huit disques d'antibiotiques (tableau 07) sont déposés par une pince stérile en respectant la distance entre eux (30 mm). Une foi appliqué, le disque ne doit pas être déplacé.

Les boites sont, ensuite, incubées à 37°C pendant 18 heures. La lecture est faite le lendemain en mesurant le diamètre de chaque zone d'inhibition en millimètre.

Les résultats sont comparés aux diamètres critiques indiqués dans le tableau de lecture, puis la bactérie est classée dans l'une des catégories: sensible, intermédiaire ou résistante.

1

II. Matériel et méthode

Cette technique est aussi réalisée après l'inoculation sur des germes isolés à partir des boites ensemencés par le sang et les urines, ainsi que les boites ensemencées par le fragment péritonéal enrichie sur le milieu BHffi (Brain Heart Infusion Broth).

Tableau 07: Les différents antibiotiques testés avec leurs charges

Antibiotiques Famille Charge (µg)

Céfazoline P-lactamine 30

Doxycycline Cycline 30

Lincomycine Macro li de 15

Ampicilline P-lactamine 10

Pénicilline P-lactamine 6

Kanamycine Aminoside 30

3. Etude in vivo

3.1. Entretien des animaux

L'étude a été réalisée sur dix rats Wistar albinos mâles, âgés de 7 semaines, pesant d'un poids moyen d'environ 212 g. Ils ont été fournis par l'institut Pasteur (Alger).

Les rats ont été gardés dans l'animalerie à température ambiante pour une période d'adaptation de deux semaines. Ils avaient libre accès à l'eau et à la nourriture (aliment UAR).

Les animaux sont repartis en cinq groupes (groupe 01, 02, 03, 04, 05). Par manque de rats, le nombre de ces derniers a été réduit à deux par groupe. Le tableau 08 montre la répartition de ces groupes.

Tableau 08: La répartition des groupes d'animaux Groupes d'animaux Nombre de rats Etat des rats

groupe 01 02 Témoin

groupe 02 02 Infecté par S. aureus

groupe 03 02 Infecté par S. aureus et traité par l 'EEP

groupe 04 02 Infecté par S. aureus et traité par l'antibiotique groupe 05 02 Infecté par S. aureus et traité par l'association de

l'EEP et l'antibiotique

3.2. Induction de la pathologie expérimentale 3.2.1. Préparation de l'inoculum

Pour provoquer l'infection chez les rats, on a préparé une suspension bactérienne en eau physiologique contenant 10⁸ UFC/ml de S. aureus. Pour cela, la concentration bactérienne de

1

II. Matériel et méthode

l'inoculum a été évaluée par la turbidité qui est ajustée à celle de l'étalon 0,5 Mc Farland sur un spectrophotomètre (shimadzu UV mini 1240) à une longueur d'onde de 625 nm, jusqu'à l'obtention d'une absorbance de 0,08 à 0,1.

3.2.2. Inoculation

On a injecté une dose de 0.1 ml d'inoculum contenant 10⁸ UFC/ml par voie intrapéritonéale chez le 2ème, 3ème, 4ème et 5ème lot. L'inoculation a été faite pendant 5 jours, une fois par jour et dans les mêmes conditions. A chaque injection, on a préparé un inoculum frais en eau physiologique stérile à partir d'une culture pure de 18 heures.

3.3. Suivie clinique

Le suivi clinique des rats a été effectué toute les quatre à six heures, de l'inoculation jusqu'à l'apparition des symptômes.

On a suivie:

+

Les changements comportementaux

+

L'aptitude au relever

• Le réflexe de succion

+

L'appétit

+ Le poids corporel

+

La température rectale a été mesuré trois fois par jours (matin, midi et soir) avant, après l'inoculation par un thermomètre électronique et au cours du traitement.

3.4. Prélèvements et analyses 3.4.1. Prélèvement du sang

Des prélèvements du sang ont été réalisés à tous les groupes de rats après l'inoculation, au cours et après le traitement sous la hotte microbiologique.

On a fait le prélèvement du sang à partir du sinus rétro-orbitale de l'œil du rat à l'aide d'un tube capillaire lors d'un pic thermique pour les rats infectés. Le sang a été immédiatement mis dans deux tubes à hémolyse: l'un contenant l'anticoagulant EDTA (Acide Ethylène Diamine Tétracycline) pour la réalisation du test FNS (Formule Numération Sanguine), l'autre sec pour la réalisation du test CRP (C Reactive Protein). Trois gouttes de sang ont été inoculées dans des tubes contenant le BHIB dans le but d'enrichir la souche avant l'ensemencement sur milieu solide. Nous avons réalisé deux prélèvements pour chaque rat à une heure d'intervalle pour augmenter la chance de cultiver le germe.