Evaluation de l’effet gastro-protecteur et antiulcérogène des polyphénols de la propolis

ةرازو يملعلا ثحبلا و يلاعلا ميلعتلا

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

تعهبج ىيحي نب قيدصلا دوحه –

لجيج -

Université Mohamed Seddik Ben Yahia -Jijel-

Mémoire de Fin d’Etudes

Pour l’obtention du Diplôme : de Master Académique en Biologie Option : Pharmacologie Expérimentale

Thème:

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire

تعيبطلا مولع تيلك و

ةبيحلا

نسق تيولخلا و تيئيزجلا بيجولويبلا

Réalisé par : Toumi Nassira Meledjem Houda Bernou Souad Membres du Jury :

Présidente : AZZOUZ Wassila

Examinateur : Pr. LAHOUEL Mesbah

Encadreur : KEBSA Wided

Années Universitaire : 2016- 2017

Evaluation de l’effet gastro-protecteur et anti-

ulcérogène des polyphénols de la propolis

Remerciements

Nous espérons que les quelques mots que nous nous apprêtons à écrire réussiront à retranscrire fidèlement nos sentiments.

Nous aimerions en tout premier lieu remercier " ALLAH ", le tout puissant, de nous avoir aidé à surmonter toutes les difficultés lors de nos études et qui nous avoir donné la patience,

la volonté et le courage afin d’arriver à la finalité de ce modeste travail.

Notre première pensée va tout naturellement à notre encadreur, M

KEBSA Wided qui nous a fait l’honneur de veiller et diriger ce travail. Nous avons beaucoup apprécié sa confiance et sa grande disponibilité, ses conseils pertinents et judicieux nous ont permis de mener à terme ce projet. Nous la prions d’accepter nos sincères remerciements, notre profond

respect et entiers dévouement.

Nous tenons à remercier l’ensemble des membres de jury qui nous ont fait l’honneur d’ accepter de juger notre travail.

Nous voudrons tout particulièrement remercier monsieur le professeur LAHOUEL Mesbah pour son aide et son encouragement. Merci monsieur.

Merci également à tout le personnel du laboratoire, en particulier Wided, Nassiha et Mekhter qui ont contribué à la réalisation de ce mémoire.

Nous remercions également tous les membres de laboratoire de toxicologie moléculaire pour leur convivialité spécialement Yahia et Wahiba pour ces aides et ces patiences durant

tout la période de la réalisation de notre travail dans le laboratoire.

Nous adressons nos vifs remerciements à nous collèges étudiants de notre promotion.

Enfin, que ceux et celles qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce modeste travail, soient assurés de nos profondes sympathies.

Un grand merci à tous

Introduction……….….

Synthèse bibliographique………....

1. Anatomie et rôle d’estomac………...

2. Histologie de l’épithélium gastrique……….…...

3. Sécrétion gastrique……….…..

3.1. Mécanisme de la sécrétion d’acide chlorhydrique………..……

3.2. Régulation physiologique de la sécrétion d’acide gastrique………..…….

4. Mécanismes de protection de la muqueuse gastrique……….……..

5. Ulcère gastroduodénal……….……....

5.1. Physiopathologie de l’ulcère gastroduodénal………..…………...

5.1.1. Ulcère gastroduodénal lié à l’infection à Helicobacter pylori………..…………...

5.1.2. Ulcère gastroduodénal lié aux anti-inflammatoire non stéroïdiens (AINS)………..……..

5.1.3. Ulcère gastroduodénal non lié aux AINS et Helicobacter pylori………..………

5.1.4. Ulcère gastroduodénal lié au syndrome de Zollinger-Elison………...……

5.2. Cause de l’ulcère gastroduodénal………..……….

5.2.1. Facteurs endogènes………..………

5.2.2. Facteurs exogènes………..………..

6. La propolis………...

6.1. Composition chimique ………..……….

6.2. La propolis en thérapeutique………...………...

6.3. Toxicité de la propolis………...………..

7. Les polyphénols ………...………..……...

7.1. Biosynthèse………..………...

7.2. Classification et structure chimique………..………..

7.3. Activité antioxydante et relation Structure-Activité………..……….

7.3.1. Le piégeage direct des ROS ………..………..

7.3.2. La chélation des ions métalliques………..………..

7.3.3. L'inhibition enzymatique……… …………...

Matériel et méthodes ………...

1. Etude phytochimique de la propolis………

1.1. Récolte de la propolis………..……

1.2. Préparation de l’extrait éthanolique de la propolis………..…...

1.3. Dosage des polyphénols totaux………...

1.4. Dosage des flavonoïdes ………...…...

2. Etude in vitro………...

2.1. Evaluation de l’effet anti-radicalaire de la propolis par le test au DPPH°………...

2.2. Mesure du pouvoir réducteur du peroxyde d’hydrogène (H2O2)……….…..

3. Etude in vivo……….…

3.1. Entretien et traitement des animaux ………...

1 2

3 4 5 5 7 8 10 10 11 11 12 12 13 13 14 16 17 17 18 19 19 19 20 20 21 21 22 23 23 23 23 24 24 24 25 25 25

3.3. Mesure des paramètres gastriques……….……...

3.3.1. Etude macroscopique et détermination de l’indice d’ulcère………

3.3.2. Mesure de pH et de l’acidité gastrique……….………

3.3.3. Mesure de la production de mucus gastrique……….…………...

3.4. Préparation de la fraction cytosolique……….………...

3.5. Dosages des protéines……….………

3.6. Dosages tissulaires ……….………....

3.6.1. Dosage du glutathion GSH……….……….…

3.6.2. Dosage du Malone-dialdéhyde (MDA) cytosolique……….………...

3.6.3. Mesure de l’activité enzymatique de la superoxyde dismutase (SOD)….………..

3.6.4. Mesure de l’activité enzymatique de la Catalase (CAT)……….………....

3.6.5. Mesure de l’activité enzymatique de glutathion peroxydase (Gpx)……….………...

3.6.6. Mesure de l’activité enzymatique de glutathion-s-transférase (GST)……….………

3.7. Etude histologique microscopique……….………....

3.8. Analyse statistique……….………...

Résultats et Discussion……….………...

1. Composition phyto-chimique de la propolis………....

2. Pouvoir anti-radicalaire de la propolis et de l’acide ascorbique in vitro….……….……

3. Effet gastro-protecteur de l’EEP contre l’ulcère gastrique induit par l’éthanol in vivo…………...

4. Mécanismes proposés de l’effet pro-oxydant de l’éthanol et gastro-protecteur de la propolis…..…

Conclusion………...

Références Bibliographiques………..………..

Annexe

26 26 26 27 27 27 27 27 28 28 29 29 30 31 31 32 33 35 38 57

58 61

Figure 1. Anatomie de l’estomac……….. …………

Figure 2. Composition cellulaire de l’épithélium gastrique ………...……….

Figure 3. Mécanisme de sécrétion d’acide chlorhydrique ………...………...

Figure 4. Régulation de la sécrétion acide gastrique ………...…...

Figure 5. Balance entre les facteurs protecteurs et agressifs (A) et (B) de l’ulcère gastroduodénal…..

Figure 6. Helicobacter Pylori : (A) dans le mucus et (B) en Microscopie électronique... …………...

Figure 7. Pathogénie des lésions ulcérées induites par les AINS………..

Figure 8. Propolis brut……….. …...……….

Figure 9. Teneur en polyphénols et en flavonoïdes dans l’extrait éthanolique de la propolis en mg EAG/g et mg EQ/g de propolis respectivement………..

Figure 10. Pourcentage de réduction du radical libre DPPH⁰ par l’extrait éthanolique de la propolis……….……

Figure 11. Pourcentage de réduction de peroxyde d’hydrogène de l’EEP………

Figure 12. Macroscopie des estomacs des rats, (A): Témoin traités par le véhicule, (B): Traité par l’Ethanol seul (ETH), (C): prétraité par la propolis (EEP+ETH) et (D) : prétraité par la ranitidine (RAN+ETH)………...

Figure 13. Production de mucus gastrique chez les rats traités par l’ETH absolu (1ml) seul ou en prétraitement par l’EEP (50mg/kg/j) ou par la Ranitidine (50mg/kg/j) pendant 8jours……….. ………...

Figure 14. Variation des volumes du jus gastrique chez les rats traités par l’ETH absolu (1 ml) seul ou en prétraitement par l’EEP (50 mg/kg/j) ou par la Ranitidine (50 mg/kg/j) pendant 8jours………. ……….

Figure 15. Variations des taux du GSH cytosolique gastrique après une dose d’éthanol absolu seul (1 ml), ou en cas de prétraitement par l’EEP (50mg/kg/j) ou avec la Ranitidine (50mg/kg/j) pendant 8jours………...

Figure 16. Variations des taux du MDA cytosolique gastrique après traitement par l’éthanol absolu seul (1 ml), ou en cas de prétraitement par l’EEP (50 mg/kg/j) ou la Ranitidine (50 mg/kg/j) pendant 8jours………...

Figure 17. Variations de l’activité enzymatique de la SOD dans le tissu gastrique, après le traitement par l’ETH absolu (1ml) seul, et en cas de prétraitement par l’EEP (50mg/kg/j) ou la Ranitidine (50mg/kg/j) pendant 8jours………...

Figure 18. Variations de l’activité enzymatique de la CAT dans le tissu gastrique, après le traitement par l’ETH absolu (1ml) seul, et en cas de prétraitement par l’EEP (50mg/kg/j) ou la Ranitidine (50mg/kg/j) pendant 8jours……….…………..….

Figure 19. Variations de l’activité enzymatique de la GPx dans le tissu gastrique, après le traitement par l’ETH absolu (1ml) seul, ou en cas de prétraitement par l’EEP (50mg/kg/j) ou la Ranitidine (50mg/kg/j) pendant 8jours………...

3 5 6 7 10 11 12 16

34

35 37

39

41

42

45

47

48

49

51

d’éthanol absolu seule (1 ml), ou en cas de prétraitement par l’EEP (50mg/kg/j) ou la Ranitidine (50mg/kg/j) pendant 8jours……….

Figure 21. Analyse microscopique des estomacs des rats : (A) traité par le véhicule, (B) traités par l’éthanol seul, (C) prétraités par l’EEP et (D) prétraités par la Ranitidine (X40)………..………..

Figure 22. Représentation schématique des effets d’administration d’éthanol au niveau gastrique………...………

53

54

57

Tableau 2: Principales classes des polyphénols………...

Tableau 3 : Rendement d’extraction de l’extrait éthanolique de la propolis……….

Tableau 4 : Pourcentage de réduction du radical libre DPPH° de l’EEP et de l’acide

A ascorbique et IC50 ………...

Tableau 5 : Pourcentage de réduction de H2O2 par l’extrait éthanolique de la propolis et

IC50………....

Tableau 6. Indice d’ulcère et pourcentage de protection chez les rats traité par l’éthanol seul ou en cas de prétraitement par la ranitidine (50mg/kg)ou la propolis(50mg/kg) pendant

8jours………

Tableau 7: Variations de pH et de l’acidité totale chez les rats traités par l’ETH absolu (1ml) seul ou en prétraitement par l’EEP (50mg/kg/j) ou par la Ranitidine (50mg/kg/j) pendant

8jours………...

17 20 33 35

37

40

43

AINS : Anti-inflammatoire non stéroïdiens.

CAT : catalase.

DPPH : 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl.

DTNB : Acide 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoїque EDTA : Acide Ethylene Diamine Tetraacetique.

EEP : Extrait éthanolique de la propolis.

EGF: Epidermal Growth Factor.

IC

: concentration inhibitrice 50%.

GSH : Glutathion réduit.

GSSG: Glutathion oxydé.

GST: glutathion-S-transférase.

ETH: Ethanol.

H+/K+-ATPase: Hydrogen potassium ATPase.

H

O

: Peroxyde d’hydrogène.

HCl : Acide chlorhydrique.

HCO

: Bicarbonate.

Hp: Helicobacter pylori.

LDL : Lipoprotéines de densité légère.

MDA : Malone-dialdéhyde.

NO : Monoxyde d’azote

NOS : Nitriques oxydes synthase PG : Prostaglandine

PP : Polyphénols

SOD: Superoxyde dismutase . TBA : Acide thiobarbiturique TCA : Acide Trichloroacetique.

TNB: Acide thionitro-benzoique.

UGD : ulcère gastroduodénal.

Introduction

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L’ulcère gastroduodénal est une affection circonscrite, destructive et progressive qui atteint la muqueuse et la sous muqueuse de l’estomac et du duodénum. L’ulcère, qu’il soit gastrique ou duodénal, entraîne une perte de substance plus ou moins étendue de la paroi digestive qui atteint la couche musculaire. L’ulcère gastroduodénal est souvent provoqué par Helicobacter pylori (Hp). Le problème de l'infection à Hp réside sur ses associations à certaines maladies gastroduodénales dont l'ulcère, la gastrite chronique, les lymphomes et le cancer gastrique (Andoulo et al., 2013). Ainsi notre mode de vie et l’alimentation, le café, le tabac et l’alcool qui sont depuis longtemps considérés comme facteurs de risques. La consommation de boissons alcoolisées (éthanol, ou alcool éthylique) par habitude est responsable de nombreuses intoxications aiguës ou chroniques dont l'ulcère et le cancer gastrique (Gimenez, 2000).

Habituellement, le traitement médical de l’ulcère ne diffère pas, que celui-ci soit gastrique ou duodénal, il devrait atteindre 4 objectifs (MIB, 2008): Soulager la douleur, accélérer la cicatrisation, prévenir les complications et diminuer la fréquence des récidives. Cependant, la majorité de ces médicaments produisent des effets indésirables, tels que: l’hypersensibilité, arythmie, impuissance, gynécomastie et changements hématopoïétiques (Togola et al., 2014).

Par conséquent, la recherche de nouvelles substances antiulcéreuses est plus qu’indispensable.

La propolis est un produit apicole qui a été utilisé pour ses diverses propriétés biologiques vue sa richesse en polyphénols, en particulier comme source de médicaments alternatifs pour le traitement et la prévention des maladies dans différentes parties du monde (Ngenge et al., 2016).

Ces dernières années, un nombre remarquable d'études ont rapporté de nombreuses avancées réalisées dans les études chimiques et pharmacologiques des composés thérapeutiquement actifs obtenus à partir de la propolis. Selon nos recherches, aucune étude n’a été publiée sur l’effet gastro-protecteur de la propolis Algérienne. C’est pourquoi que nous nous sommes intéressés dans cette étude à l’évaluation de l’effet de polyphénols de la propolis algérienne contre l’ulcère gastrique induit par l’éthanol. Cette étude a pour but donc:

 Evaluation de l’état du stress oxydant cellulaire lors d’un ulcère gastrique induit par l’éthanol.

 Évaluation de l’effet de la propolis contre cet ulcère en comparant son effet à celui de la ranitidine.



Détermination des mécanismes d’actions responsables de l’activité antiulcéreuse de la

propolis.

Synthèse Bibliographique

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1. Anatomie et rôles d’estomac

L’estomac est composé de 3 régions: le fundus, le corps et l’antre qui se distinguent par une composition cellulaire et fonctionnelle différentes (Helander, 1981). Sur le plan histologique, la paroi interne de l’estomac est constituée de différentes couches:

La muqueuse : est la première couche en contact avec le bol alimentaire. Elle est constituée par l’épithélium composé de cellules épithéliales et la lamina propria composée de tissu conjonctif lâche ainsi que d’une fine couche de muscle lisse la séparant de la sous-muqueuse. Elle est recouverte de mucus.

La sous-muqueuse : constituée d’une couche de tissu conjonctif fibreux et vascularisé assurant l’irrigation des cellules gastriques. La couche musculaire elle-même constituée de 3 couches de fibres :

- La couche musculaire oblique interne : elle est responsable du mouvement de brassage mécanique des aliments. Cette couche est spécifique à l’estomac et n’est présente dans aucun autre organe du système digestif. La paroi musculaire interne de l’antre est plus épaisse que celle du fundus assurant des contractions plus forcées.

- La couche musculaire circulaire qui est également plus forte au niveau de l’antre. Elle est concentrique à l’axe longitudinal de l’estomac.

- La couche musculaire longitudinale externe (la séreuse): elle est composée de plusieurs couches de tissu conjonctif en continuité avec le péritoine qui recouvre la totalité de la paroi externe l’estomac

.

Figure 1. Anatomie de l’estomac (Pascale, 2011).

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2 . Histologie de l’épithélium gastrique

Les glandes gastriques sont identifiées en fonction de leur localisation et sont enchâssées dans l’épithélium cylindrique sous forme d’invaginations tubulaires ou cryptes gastriques. Les unités antrales et fundiques sont très différentes sur le plan histologique. Les glandes fundiques constituent entre 70% et 80% du total des glandes présentes dans l’estomac et sont les plus complexes. Elles comprennent 5 types majeurs de cellules épithéliales matures (Figure 2) : les cellules à mucus (ou mucocytes), les cellules pariétales, les cellules principales, les cellules endocrines et les cellules régénératrices. Les glandes pyloriques, situées au niveau du pylore, ne présentent que 15% des glandes gastriques et sont essentiellement constituées de cellules endocrines, de cellules à mucus et de cellules régénératrices.

Les cellules à mucus (ou mucocytes): ces cellules sécrètent un mucus riche en glycoprotéines, les mucines. Le mucus joue un rôle dans la lubrification et la protection de la muqueuse contre l’autodigestion en formant un film protecteur neutralisant l’acidité et empêchant la pepsine d’entrer en contact direct avec la paroi gastrique (Allen et al., 2005). Les mucines joueraient également un rôle dans la défense antimicrobienne contre Helicobacter pylori (Kawakubo et al., 2004; Fukuda et al., 2006).

Les cellules pariétales qui produisent du l'acide chlorhydrique (HCl) nécessaire à la conversion du pepsinogène en pepsine, à l’absorption du fer et à maintenir l’environnement gastrique suffisamment acide pour assurer la dénaturation et digestion des protéines issues de l’alimentation. Le HCl limite également le développement de microorganismes au niveau gastrique et joue un rôle dans l’équilibre des populations cellulaires. Les cellules pariétales produisent également une protéine particulière : le facteur intrinsèque, qui se lie sous forme de complexe à la vitamine B12 et qui est indispensable à l’absorption intestinale de cette vitamine.

Les cellules principales qui sécrètent deux molécules nécessaires à la digestion gastrique, le pepsinogène, précurseur de la pepsine et une lipase gastrique. Le pepsinogène est une proenzyme, dénuée d’activité protéolytique et convertie en pepsine en présence d’acide. La pepsine est une protéase digestive assurant la dégradation des protéines en acides aminés (Dunn, 2001). La lipase est impliquée dans la dégradation des lipides en acides gras (Canaan et al., 1999).

Les cellules endocrines principalement situées au niveau de l’antre, responsables de la sécrétion

de gastrine, d’histamine, de somatostatine ainsi que d’autres hormones qui régulent les différents

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processus associés à la digestion. Les cellules régénératrices (ou cellules souches) présentes au niveau des glandes antrales et fundiques, sont impliquées dans les processus de réparation tissulaire, de régénération et auto-renouvellement de l’épithélium gastrique. Certains peptides et neuropeptides gastriques, en plus de leur rôle de régulateurs des fonctions gastriques, possèdent des propriétés de facteurs de croissance et interviennent à ce titre dans le processus de renouvellement des cellules épithéliales. C’est notamment le cas de la gastrine qui possède un effet prolifératif et de la somatostatine qui possède un effet antiprolifératif (Canaan et al., 1999).

Figure 2. Composition cellulaire de l’épithélium gastrique (Pascale, 2011).

3. Sécrétion gastrique

3.1. Mécanismes de la sécrétion d’acide chlorhydrique

La sécrétion de l’acide HCL est assurée par deux mécanismes associés sur la membrane du canalicule intracellulaire: d'une part la (H

, K

)-ATPase, d'autre part un canal Cl

.

Le transport de l'ion Cl

accompagnant l'ion H

dans la lumière gastrique est moins bien connu.

Certaines observations suggèrent que ce transport s'effectuerait à travers un canal spécifique

situé également sur la membrane apicale de la cellule pariétale et dont l'ouverture serait

commandée par une protéine kinase dépendante de l'AMP cyclique (Soumarmon et al., 1980 ;

Samuelson et Hinkle, 2003). Il s'agirait d'un système à voie unique (uniport) dont le

fonctionnement ne serait donc pas électriquement neutre, chaque Cl

transporté ajoutant une

charge négative sur la face luminale de la membrane. Contrairement à la (H

, K

)-ATPase qui

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représente pour le transport de H

un mécanisme énergétique capable de créer un important gradient de concentration, le canal Cl

de la membrane luminale n'est pas un transporteur actif.

Un tel système n'apparaît d'ailleurs pas nécessaire puisque la captation de l'ion Cl

au niveau de la membrane basolatérale est elle-même activée par le gradient de Na

créé par la (Na

, K

) ATPase. Ce même gradient de Na est sans doute aussi responsable de la sécrétion de NaCl accompagnant la sécrétion acide lorsque celle-ci est peu activée (entre les repas).

Figure 3. Mécanisme de sécrétion d’acide chlorhydrique (Wolosin et forte, 1984 ; Forte et zhu, 2010).

Le transport (électrogénique) du Cl

serait à l'origine de la différence de potentiel

transépithéliale déjà évoquée. Cette différence de potentiel qui peut atteindre 6o rn V à l'état

basal diminue jusqu'à - 30 rn V lorsque la sécrétion acide se met en route. Cette diminution est

due à la baisse de résistance transépithéliale résultant de l'augmentation de la surface sécrétoire

et à un effet de couplage électrique entre la sécrétion de H

et celle de Cl

. Ce couplage ne met

Pas directement en cause l'ion H dont le transport, nous l'avons vu, est réalisé par un échange

stoechiométrique électriquement neutre. Il correspond vraisemblablement à l'ouverture d'un autre

canal permettant le passage de l'ion K

, du cytosol vers la lumière gastrique (Wolosin et forte,

1984; Forte et zhu, 2010). Puisque K

est nécessaire au fonctionnement de la (H

, K

)-A TPase,

le transport de cet ion dans le compartiment luminal est en effet indispensable. Ainsi, la sécrétion

de HCI par la cellule pariétale gastrique serait le résultat de deux mécanismes distincts, mais

fonctionnellement couplés par un cycle K

(figure 3). Le proton transporté dans cette sécrétion

provient de l'eau cellulaire d'où il est extrait par l'ATP ase qui laisse en place l'ion OH

. Cet ion

est évacué au pôle basal de la cellule, sous forme de HCO

, après une carbonatation catalysée

par l'anhydrase carbonique, la sortie de l'ion bicarbonate étant couplée à l'entrée d'un ion Cl

. La

sécrétion de HCI étant approximativement isotonique, l'eau qui l'accompagne est

vraisemblablement drainée vers la lumière gastrique par simple effet osmotique.

Page 7

3.2. Régulation physiologique de la sécrétion d’acide gastrique

La commande nerveuse de la sécrétion acide gastrique utilise l'innervation intrinsèque de la paroi gastrique qui est sensible à la distension provoquée par la présence des aliments. Le nerf pneumogastrique véhicule l'information d'un certain nombre de réflexes liés à la prise alimentaire et transmet aussi le signal déclenché, au niveau des noyaux bulbaires, par l'hypoglycémie caractérisant l'état de jeûne.

A côté de l'acétylcholine interviennent aussi certains neuropeptides comme le VIP (vasoactive intestinal peptide) et le GRP (gastrin-releasing peptide) sécrétés par les terminaisons nerveuses et agissant soit directement soit indirectement sur la cellule pariétale (P) (figure 4). La commande hormonale proprement dite fait en outre intervenir des peptides produits par les cellules endocrines de l'estomac et de l'intestin. Au niveau de l'estomac deux types de cellules jouent un rôle particulièrement important : la cellule G (à gastrine) localisée dans l'antre gastrique et la cellule D (à somatostatine) localisée à la fois dans l'antre et dans le fundus. La cellule G stimule la cellule pariétale. Elle-même stimulée par les acides aminés alimentaires et par les fibres vagales à GRP, elle est en revanche inhibée par les fibres nerveuses cholinergiques et par l'acidification de la lumière antrale résultant de la sécrétion de H+ (ce qui réalise un effet de rétroaction négative).

Figure 4. Régulation de la sécrétion acide gastrique (Sobhani et al., 1999).

Le signe + indique une stimulation, le signe -, une inhibition. Trait plein : mécanisme démontré. Trait pointillé : mécanisme probable.

La cellule D exerce un contrôle inhibiteur sur la cellule et sur la cellule pariétale. Ce contrôle

peut s'exercer par une sécrétion de somatostatine à proximité immédiate de ces cellules (voie

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paracrine) ou après transport de l'hormone par le sang, (voie endocrine). D'autres peptides d'origine extra-gastrique dont le VIP, le GIP (gastric inhibitory peptide), la CCK (cholécysto- kinine), l’EGF (epidermal growth factor) les enképhalines et, peut-être, la sécrétine (S), exercent également un contrôle négatif sur la cellule pariétale (Sobhani et al., 1999).

4. Mécanismes de protection de la muqueuse gastrique

Trois lignes de défenses sont incriminées dans le maintien de l’intégrité de la muqueuse dans l’environnement hostile (Sonnenberg et al., 1978; Pospai et al., 1997).

4.1. Barrière mucus- bicarbonates

Ce concept est ancien. Cette barrière s’oppose à la rétro- diffusion des protons H+ (SNFGE, 2006).

4.1.1. Le mucus

Le mucus est un gel adhérent, formé de glycoprotéines, qui recouvre l’épithélium de surface gastrique et duodénale (Eslam et al., 2016; Iwamoto et al., 2014). Il est capable, dans les conditions normales, de réduire par un facteur 10 la diffusion des ions H

(SNFGE, 2006).

Chez l’ulcéreux gastrique, le gel de mucus est structurellement plus faible, moins résistant à l’érosion aboutissant ainsi à une augmentation de sa perméabilité aux ions H+ Chez l’ulcéreux duodénal, la concentration d’acide sialique dans le mucus est augmentée de manière significative par rapport au sujet normal. Cette dégradation du mucus est corrélée avec le débit de pepsine et avec l’évolution de l’ulcère (Pospai et al., 1997).

4.1.2. La sécrétion de bicarbonates (HCO

)

La sécrétion se fait aussi bien au niveau de la muqueuse gastrique que duodénale. Au niveau duodénal, le mucus représente une zone d’échange entre les ions HCO3- sécrétés par la muqueuse et la quantité HCL résiduel non encore neutralisée (Isenberg, 1987).

Au cours de l’ulcère duodénal, la sécrétion bicarbonatée basale est diminuée au niveau proximal

mais non au niveau du duodénum distal, en réponse à l’acide et aux prostaglandines (Pospai et

al., 1997).

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4.2. Les cellules épithéliales

L’épithélium agit en tant qu’une barrière de surface. Il stoppe la rétrodiffusion d’ions H+. Cette barrière est renforcée par des médiateurs locaux, dont le plus connu étant l’Epidermal Growth Factor (EGF). Ce médiateur est sécrété par les glandes salivaires et il est présent dans l’estomac .L’EGF permet d’augmenter la résistance de l’épithélium gastrique contre l’acide (SNFGE, 2006).

Les cellules épithéliales ont des mécanismes intrinsèques pour résister contre le stress oxydant, phénomène impliqué dans la mort cellulaire. Cette barrière peut être affectée par le Processus inflammatoire ainsi que par différents agents : aspirine, alcool qui ouvre les jonctions intercellulaires (Bernades, 1990).

4.3. Le flux sanguin muqueux

Le flux sanguin est un facteur important dans la défense de la muqueuse (Pospai et al., 1997). Il assure l’épuration des éléments rétrodiffusés. Il existe un seuil de réduction de flux sanguin muqueux gastrique critique pour l’apparition des lésions induites par l’acide. Cette réduction du flux, surtout incriminée dans la genèse de l’ulcère gastrique, entraîne une altération des défenses muqueuses le déficit de l’apport d’oxygène et de nutriments, la formation de radicaux libres directement délétères. Par ailleurs, le système endogène NO est impliqué dans le mécanisme de la gastro- protection ainsi que les prostaglandines, les radicaux sulfhydriles, les facteurs de croissance, les piégeurs de ROL (SNFGE, 2006).Ainsi ce système endogène NO joue un rôle important dans la guérison de l’ulcère gastroduodénal en modulant le flux sanguin muqueux (Prucksunand, 2001).

4.4. Les prostaglandines (PG)

Les prostaglandines sont des métabolites de l’acide arachidonique. Elles sont synthétisées par la plupart des cellules et sont particulièrement abondantes dans le tube digestif. Les prostaglandines Inhibent la sécrétion acide gastrique et stimulent les mécanismes de défense. Au cours de l'UD, la concentration ou la biosynthèse des prostaglandines dans la muqueuse duodénale est normale ou abaissée, mais la capacité de libération des prostaglandines après charge acide est plus faible (Bonfils, 1990). De même, la sécrétion duodénale de bicarbonates stimulée par une perfusion locale d'acide est nettement plus faible que chez les sujets normaux (Dive, 1992).

Les prostaglandines du type E (PGE) ont un rôle protecteur important, car la PGE augmente la

production du bicarbonate et de la couche muqueuse (Lanas et chan, 2017).

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5. Ulcère gastroduodénal

Selon Labayle et ses collaborateurs (2001), l’ulcère, qu’il soit gastriques ou duodénal, est une perte de substance. Il se traduit par l’interruption de la muqueuse et de la musculeuse associée à des lésions vasculaires et à une hypertrophie nerveuse (Labayle et al., 2001) .

Parmi les principales formes d’ulcères peptiques, il faut citer l’ulcère gastrique et l’ulcère duodénal qui sont, tous les deux, des pathologies évolutives (Gimenez et al., 2000). L’ulcère duodénal est localisé dans la majorité des cas au niveau du bulbe duodénal. Il est favorisé par une augmentation de l’acidité. L’ulcère gastrique est préférentiellement localisé au niveau de la petite courbure gastrique (angulus). Il est favorisé par une diminution de la cycloprotection.

5.1. Physiopathologie

L’ulcère gastroduodénal résulte du déséquilibre entre l’agression chlorhydro-peptique de la sécrétion gastrique et les mécanismes de défenses (barrière muqueuse) en point précis de la muqueuse ( Figure 5) . La barrière muqueuse a une composante pré-épithéliale (mucus, sécrétion de bicarbonates et phospholipides), épithéliale (cellules de surface) et sous-épithéliale (flux sanguin muqueux). Les prostaglandines (Prostaglandines) synthétisées en permanence dans la muqueuse stimulent ces mécanismes de protection (Farzaei et al., 2015).

Figure 5. Balance entre les facteurs protecteurs et agressifs (A) et (B) de l’ulcère gastroduodénal

(Farzaei et al., 2015).

De multiples facteurs endogènes et exogènes modulent l’équilibre agression/ défense. Ces

facteurs étiologiques déterminent des entités pathologiques différentes par leur pathogénie, leur

histoire naturelle et leur traitement (Farzaei et al., 2015):

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5.1.1. Ulcère gastroduodénal lié à l’infection à Helicobacter pylori

L'Helicobacter pylori est un bacille gram négatif spiralé qui résiste à l’acidité gastrique grâce à une activité uréasique et qui colonise le mucus de la surface de la muqueuse gastrique, principalement au niveau de l'antre. L'acidité de l'estomac est très importante puisque le pH est environ de 2. La bactérie ne peut vivre que deux heures dans ce milieu. Grace à son activité uréasique qui correspond au fait que l'Hp possède une enzyme " l'uréase" en grande quantité, elle va pouvoir y rester beaucoup plus longtemps. Cette enzyme hydrolyse l’urée normalement présente dans l’estomac et libère ainsi de l’ammoniaque qui va tamponner l’acidité du milieu suffisamment longtemps pour permettre à la bactérie d’atteindre, à travers le mucus, les cellules de la muqueuse (Figure 6), là où le pH est voisin de la neutralité, c'est à dire 7. Il a été démontré que la grande mobilité de l'Hp et sa morphologie spiralée lui permettent de traverser le mucus beaucoup mieux que les autres bactéries (Bourienne et al., 2000).

Figure 6. Helicobacter Pylori : (A) dans le mucus et (B) en Microscopie électronique (Bourienne et al., 2000).

L’infection à l’Hp est contractée le plus souvent dans l’enfance par voie oro-orale ou oro-fécale.

En effet, l'Hp est retrouvé dans 70% des ulcères gastriques et dans plus de 90% des ulcères duodénaux, contre 30% dans la population générale (Lesur et al., 2005).

5.1.2. Ulcère gastroduodénal lié aux Anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)

Environ un tiers des ulcères compliqués sont attribuables à la prise d’AINS ou d’aspirine à faible

dose. Les propriétés thérapeutiques des AINS non sélectifs reposent sur l’inhibition des

cyclooxygénases (COX 1 et 2) qui sont des enzymes qui transforment l’acide arachidonique en

prostaglandines. L’inhibition de la synthèse des prostaglandines gastroduodénales altère les

mécanismes de défense de la muqueuse et favorise ainsi la survenue d’ulcères, le plus souvent

gastriques que duodénaux. L'inhibition des prostaglandines va entraîner tout d'abord une

diminution du flux sanguin muqueux. Il survient ensuite une adhésion des polynucléaires à la

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paroi qui entraînent des lésions endothéliales et accentuent la baisse du débit sanguin muqueux, favorisant ainsi le processus inflammatoire dans la muqueuse digestive (Figure 7).

L'inflammation est amplifiée par la production de TNF Alpha stimulée par les anti- inflammatoires dans les macrophages (Lesur et al., 2005).

Figure 7. Pathogénie des lésions ulcérées induites par les AINS. Les flèches indiquent les lésions initiales provoquées par l'inhibition des prostaglandines et les lésions provoquées par les polynucléaires

infiltrant la muqueuse et le TNF qu'ils produisent

(Lesur et al., 2005)

5.1.3. Ulcère gastroduodénal non lié aux AINS ou à Helicobacter pylori

Ils sont peu nombreux mais leur proportion est croissante du fait de la régression du nombre liés à l’Hp. Ils affectent des sujets atteints de morbidités lourdes notamment cardio-vasculaires, rénales, hépatiques ou pancréatiques. Ils sont liés à une altération des mécanismes de défense de la muqueuse gastroduodénale. Ces ulcères sont différents des ulcères de stress qui surviennent chez les malades hospitalisés en réanimation ayant une ou plusieurs défaillances viscérales et des ulcères de la maladie de Crohn qui ont des caractéristiques anatomopathologiques différentes (Minaire, 1992 ; Bourienne et al., 2000).

5.1.4. Ulcère gastroduodénal lié au Syndrome de Zollinger-Ellison

L’ulcère duodénal du syndrome de Zollinger-Ellison est exceptionnel. Il est lié à une

hypersécrétion d’acide induite par une sécrétion tumorale de gastrine (gastrinome) (Minaire,

1992).

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5. 2. Causes de l’ulcère gastroduodénal

Des facteurs endogènes et d’autres exogènes interviennent dans l’installation des ulcères gastroduodénaux :

5.2.1. Facteurs endogènes

5.2.1a. La sécrétion de la gastrine

Chez certains ulcéreux, l’hypersécrétion acide peut être rattachée à une hyperproduction de la gastrine : Soit par un processus tumoral ou gastrinome, c’est le syndrome de Zollinger- Ellison qui n’intéresse que 0,1% à 1% des ulcéreux duodénaux. Soit par hypergastrinémie non tumorale liée à une hyperplasie des cellules à gastrine.

Pour le reste de la population, l’hypersécrétion acide est d’origine vagale. Une accélération de la vidange gastrique pourrait contribuer à la genèse de la maladie (Minaire, 1992).

En dehors du syndrome de Zollinger-Elisson, plusieurs études ont montré qu’en fait, la gastrinémie basale n’est pas modifiée chez les ulcéreux duodénaux par rapport aux sujets normaux et ce avant la prise en compte du rôle d’Hp (Pospai et al., 1997).

5.2.1b. La sécrétion de la pepsine

La pepsine a une action mucolytique, sa production est corrélée à l’hypersécrétion acide.

Le débit de cette sécrétion augmente dans les ulcères en poussées et, il est normal dans la période de rémission de la maladie. La pepsine joue un rôle dans la perpétuation des lésions au niveau du cratère ulcéreux. Elle peut majorer l’effet délétère de l’acide (Pospai et al., 1997).

5.2.1c. La vidange gastrique

L’accélération de la vidange gastrique et le ralentissement de la vidange duodénale semblent caractériser la plupart des ulcères duodénaux. Ceci entraîne une augmentation de la charge acide duodénale qui risque un dépassement des possibilités de neutralisation de la sécrétion gastrique accrue (Minaire, 1992).

5.2.1d. Les radicaux libres oxygénés et le monoxyde d’azote

Les radicaux oxygénés libres (ROL) sont caractérisés par leur rôle dans l’agression et la mort

cellulaire (Mouiel et al., 1996). Au cours de la maladie ulcéreuse et pendant les périodes

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d’inflammation aigue, les leucocytes et les macrophages peuvent générer ces ROL (Pospai et al., 1997).

Les cellules de la muqueuse synthétisent du monoxyde d’azote (NO). Au cours des phénomènes inflammatoires associés à la maladie ulcéreuse gastroduodénal, le NO produit en quantité excessive grâce à le monoxyde d’azote synthétase inductible, peut avoir des effets cytotoxiques (Sherwood, 2000) et ce en s’associant de manière subtile et mal connue aux radicaux oxygénés libres et jouant ainsi un rôle important dans l’ulcérogénèse (Pospai et al., 1997).

5.2.1e. Le facteur génétique

Un facteur génétique a été décrit. En effet, des antécédents familiaux d’UGD chez un sujet augmentent ses risques de développer un ulcère. Il existe une prédominance masculine et le risque d’UGD se révèle plus élevé chez les personnes du groupe sanguin O que chez les sujets des groupes A, B et AB (Gimenez, 2000). Les personnes dont un des proches souffre ou souffert d’ulcère gastroduodénal ont trois fois plus de risques de développer un ulcère. Ainsi environ 20- 50% des patients ayant un ulcère duodénal ont des antécédents familiaux d'ulcère (Gimenez, 2000).

5.2.2. Facteurs exogènes

Le mode de vie, l’alcool, le café, le tabac et le stress sont depuis longtemps considérés comme facteurs de risques, de même que l’utilisation régulière d’aspirine ou de médicament anti- inflammatoires non stéroïdiens (AINS) (Gimenez, 2000).

La littérature montre une forte corrélation positive entre le tabagisme et l'incidence de la maladie ulcéreuse, la mortalité, les complications, les récidives et le retard dans les taux de guérison. Les fumeurs sont environ deux fois plus susceptibles de développer un ulcère que les non-fumeurs.

De nombreuses études ont révélé des conclusions contradictoires concernant le rôle des facteurs psychologiques dans l'ulcère gastroduodénal. Le rôle des facteurs psychologiques est loin d'être établie. Les patients atteints d'ulcère présentent généralement le même aspect psychologique que la population générale et la présence d'un plus grand degré de stress est difficile à confirmer (Bourienne et al., 2000).

L’alimentation aussi joue un rôle dans l’installation de l’ulcère gastroduodénal, aussi on a

découvert que les ulcères étaient plus fréquents chez les personnes dont le régime est pauvre en

fibres alimentaires. On ne connait pas l’effet curatif des fibres sur les ulcères déjà existants, mais

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il semble que les personnes qui consomment plus de fibres sont moins sujettes à en développer.

Il est toutefois préférable d’éviter certains aliments qui pourraient exacerber la douleur, lorsque

les symptômes de l’ulcère gastroduodénal se font sentir. Chez certaines personnes, l’alimentation

aggrave les symptômes : le café, le thé, le cola, les aliments gras comme le chocolat, certains

épices (le poivre noir, muscade, etc.) (Lesur et al., 2005).

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6. La propolis

La propolis désigne toute une série de substances résineuses, gommeuses et balsamiques, de consistance visqueuse, recueillies par les abeilles (Apis melífera) sur certaines parties de végétaux essentiellement les bourgeons et les écorces de certains arbres (Machado et al., 2016), substances qu’elles rapportent à la ruche et qu’elles modifient vraisemblablement en partie par l’apport de certaines de leurs propres sécrétions (cire et sécrétions salivaires principalement) (figure 8) (Gharbi, 2011).

.

Les abeilles l’utilisent à l’entrée de leur ruche pour en protéger l’accès c’est ce qui indique son étymologie Grecque « pro» signifie devant ou défense, et « polis » signifiant la cité, une autre étymologie Latin a également été avancé venant de l’adverbe « pro » qui veut dire dans le but et le verbe « polis » qui signifie enduire. Donc elle est employé par les abeilles pour sceller les trous et protéger l’entrer contre les intrus (Ferhoum, 2010).

La propolis est anciennement beaucoup moins connue que le miel. Ses propriétés médicinales étaient déjà mises à profil vraisemblablement plusieurs millénaires avant notre ère. Plus tard, les Perses, les Grec, les Romaines et même les Incas l’ont utilisé.

Les légionnaires Romain en possédait une petite quantité sur lui au moment des compagnes militaire. Au XI

siècle Avicenne note à son propos « la propolis a la qualité de faire éliminer les pointes de flèches et les épines, nettoie facilement et amollit fortement ».

Connues des Incas chez lesquels elle était utilisée dans le cadre des infections fébriles. En France ce n’est qu’au début du XVIII que le terme de propolis apparait dans les écrits d’Amboise. A la fin du XIX

siècle a l’occasion de la guerre de Boers en Afrique du Sud qu’elle connait son apogée d’utilisation grâce à ses propriété désinfection et cicatrisante.

A la fin de XXI siècle, un important marché de la propolis existe en Russie et en Allemagne,

c’était un remède populaire qui prétendait tous les maux.

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Son utilisation donc, s’est maintenue au fils des siècles et à nouveau redécouverte de façon relativement récente par de nombreux chercheurs (Ferhoum, 2010).

6.1. Composition chimique

Son composition est très complexe avec presque 150 constituants différents. Toutefois, elle peut fortement varier d’un type de propolis à un autre. Ainsi, elle contiendrait 50 à 55% de résines et de baumes, 20 à 35% de cires végétales ou de cire d’abeille, 5 à 10% d’huiles essentielles (anéthol et eugénol notamment), 5% de pollen et 5% d’autres substances diverses d’origine organique ou minérale (Blanc, 2010).

Les principales classes des composés chimiques présents dans la propolis sont les flavonoïdes, de composés phénoliques, d'acides aromatiques, d'acides organiques, de terpènes, d'huiles essentielles, de vitamines et d'oligo-éléments (Tableau 1).

Tableau 1. Composition chimique de la propolis (Blanc, 2010).

Classe des composés chimiques Exemples

Flavonoïdes Chrysine, la quercétine, pinocembrine.

Composés phénoliques et acides aromatiques

L’acide caféique, cinnamique et myristique.

Les acides organiques Acides benzoïques et l’acide salicylique.

Les huiles essentielles et terpènes Guianol, anéthol, géraniol.

Vitamines et oligo-éléments Zn, Cu, Al, vitamine A, B

, B

6.2. La propolis en thérapeutique

6.2.1. Propriétés anti-oxydantes et anti-radicalaires

Des extraits enrichis en flavonoïdes et en polyphénols issus de la propolis présentent des

propriétés anti-oxydantes très importantes par inhibition de la lipoperoxydation de l’acide

Linoléique (Ghedira et al., 2009). L’activité anti-radicalaire est mise en évidence vis-à-vis du

radical DPPH. C’est la fraction la plus concentrée en flavonoïdes qui réduit le mieux les radicaux

libres en protégeant les lipides et autres substances comme la vitamine C. C’est pour cette raison

qu’on recommande la prise de la propolis au même temps que l’acide ascorbique (Buratti et al.,

2007).

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6.2.2. Propriétés antiulcéreuses

L’action antiulcéreuse de la propolis a été largement discutée, mais grâce à de nombreuses études chimiques, son activité antiulcéreuse est aujourd’hui évidente (Nakamura et al., 2011;

Abd El-Hady et al., 2013).

Boyanova et ses collaborateurs ont démontré que l’extrait éthanolique de la propolis (EEP) Bulgarienne, possède un effet inhibiteur (environ 90%) sur les souches d’Helicobacter pylori (Boyanova et al., 2003). Les travaux de Barros et al. (2007 et 2008) ont rapporté l’effet gastro- protecteur de la propolis. Ils ont décrit les propriétés anti-ulcérogènes des principaux acides phénoliques; attestant que les acides caféique, férulique, p-coumarique et cinnamique présentent une importantes activité antiulcéreuse.

6.2.3. Propriétés anti-inflammatoires

L’effet anti-inflammatoire de la propolis qui est dose-dépendant est largement décrit par plusieurs auteurs (Mirzoeva et Calder, 1996; Menezes et Almeida, 2002) Les extraits aqueux de la propolis présentent de meilleur effet anti-inflammatoire. Les flavonoïdes en sont responsables, en inhibant la synthèse de NO et de PG, inducteurs d’inflammation et en supprimant la production de cytokines inflammatoires par les monocytes/macrophages. Les composés terpéniques agiraient également dans l’action anti-inflammatoire (Gharbi, 2011).

6.3. Toxicité de la propolis

Les études en rapport avec la toxicité de la propolis sont rares. Ghisalberti (1979) signale qu’elle

n’est pas toxique pour les hommes et les animaux, si elle est consommée en quantités

raisonnables. Avrouet-Grand et al., (1994), ont reporté une DL

de 7340 mg/kg. Par contre,

Hrytsenko et al., (1977), ont reporté une DL

de 2050 mg/kg et une DL

de 2750 mg/kg. Cette

différence peut être expliquée par une différence au niveau de l’extraction de cette substance

(choix du solvant et pourcentage utilisé). L’administration orale de 200 à 1220 mg/kg/J d’extrait

éthanolique de propolis (EEP) pendant 7-10 jours, n’entraîne aucun effet nocif (Higashi et De

Castro 1995). De plus, l’extrait alcoolique de propolis incorporé dans l’eau potable (rat et souris)

et utilisé aux doses 1875 et 2470 et 4000 mg/kg/J pendant 30, 60 et 90 jours respectivement, ne

montre aucun effet toxique (Segueni, 2011).

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7. Les polyphénols

Les composés phénoliques ou les polyphénols (PP) sont des produits du métabolisme secondaire des plantes, largement distribués possédant plusieurs groupements phénoliques, avec ou non d’autres fonctions et comportant au moins 9000 structures connues différentes (Bahorun, 1997).

7.1. Biosynthèse

Les polyphénols sont synthétisés par de deux voies biosynthétiques :

- Celle de l’acide shikimique, qui conduit après transamination et désamination, aux acides cinnamiques et à leurs nombreux dérivés tels que les acides benzoïques ou les phénols simples (Knaggs, 2003).

- Celle issue de l’acétate, qui conduit à des polyβ-coesters (polyacétates) de longueur variable menant par cyclisation à des composés polycycliques tels que les dihydroxy-1,8 anthraquinones ou les naphtoquinones (Bruneton, 1999 ; Naczk, et Shahidi, 2004).

De plus la diversité structurale des composés poly-phénoliques due à cette double origine biosynthétique, est encore accrue par la possibilité d’une participation simultanée des deux voies dans l’élaboration de composés d’origine mixte, les flavonoïdes (Martin et Andriant-sitohaina, 2002).

7.2. Classification et structure chimique

Selon le nombre d’unités phénoliques présentes, on les classe en composés phénoliques simples et en polyphénols par abus, on les appelé indifféremment composés phénoliques ou polyphénols et comprennent essentiellement selon Boros et al., (2010): (Figure 9)

- Les phénols simples (C6) : un seul noyau phénol comme pour les acides phénoliques (C6-C1).

- Les flavonoïdes (C6-C3-C6) : 2 noyaux aromatiques reliés par un hétérocycle oxygéné.

- Les tanins hydrolysable et non-hydrolysable.

- Les stilbènes (C6-C2-C6).

- Les lignanes, les lignines et les coumestannes : 2 unités de phénylpropane.

- Autres phytoestrogènes.

- Les saponines (tri-terpenoides).

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- Les phytostérols et les phytosanols (Paraskevi et Moutsatsou, 2007). Bien qu’ils ne soient pas des polyphénols, on ajoute ordinairement à cette liste les isothiocyanates, qui dérivent de l’hydrolyse des glucosinolates (Dacosta, 2003).

²

7.3. Activité anti-oxydante et relation Structure-Activité

L’activité anti-oxydante des polyphénols résulte de plusieurs mécanismes d’actions, à savoir : 7.3.1. Le piégeage direct des ROS

Les flavonoïdes sont capables de piéger les radicaux libres en formant des radicaux flovoxyles moins réactifs, cette capacité peut être expliquée par leur propriété de donation d’un atome d’hydrogène à partir de leur groupement hydroxyle selon la réaction représentée ci-dessous : FLOH + Rº FLOº + RH (réaction de piégeage)

Cette réaction de piégeage donne une molécule stable (RH) et un radical flavoxyle (FLOº) ce dernier va subir un changement de structure par résonance ; redistribution de électrons impaires sur le noyau aromatique pour donner des molécules de faible réactivité par rapport

Aux Rº ; en outre les radicaux flavoxyles peuvent interagir entre eux pour former des composés

non réactifs.

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FLOº + Rº FLO –R (réaction de couplage radical-radical)

FLOº + FLOº FLO-OFL (réaction de couplage radical-radical) 7.3.2. La chélation des ions métalliques

Les ions métalliques sont nécessaires pour le fonctionnement des processus biochimiques et physiologiques cellulaires, mais dans certains cas et lorsque leur mécanisme d’action n’est pas bien contrôlé ces mêmes ions peuvent être à l’origine d’une peroxydation lipidique, un stress oxydatif, ou une blessure des tissus, à titre d’exemple Cu

est un stimulateur de la peroxydation des LDL (Tiqwari, 2001).

Grace à leur structure chimique spécifique, les flavonoïdes peuvent facilement chélater les ions métalliques en créant des composés complexes inactifs (Malesev et Kuntié, 2007).

La chélation des ions métalliques nécessite trois sites principaux :

 Site situé entre le groupe 3’OH et le groupe 4’OH du cycle B.

 Site situé entre le groupe 3OH et 4C=O de l’hétérocycle C.

 Site situé entre le groupe 5OH du cycle A et le groupe 4C=O de l’hétérocycle C.

7.3.4. L'inhibition enzymatique

Les enzymes qui peuvent être inhibés par les flavonoïdes sont la xanthine oxydase, la lipo- oxygénase, les cyclooxygénases, et les nitriques oxydes synthase (NOS) (Fiorucci, 2006). En outre, les flavonoïdes préviennent efficacement la peroxydation lipidique puisqu’ils peuvent réagir avec la plupart des radicaux libres susceptible d’arracher un hydrogène sur le groupement CH

situé entre les deux doubles liaisons des acides gras polyinsaturés (Milan, 2004). Ils sont donc de puissants inhibiteurs de l’oxydation des LDL (De Wahalley et al., 1990).

L’activité anti-radicalaire et anti-oxydante des flavonoïdes dépend fortement de:

- Nombre des groupements hydroxyles liés au cycle B (Sroka, 2005).

- La présence d’une double liaison en C2-C3 semble avoir une influence positive sur les caractéristiques anti-radicalaires des flavonoïdes (Huang et al., 2013).

- La glycosylation des flavonoïdes et le blocage de l’hydroxyle en C3 cause une diminution des caractéristiques anti-radicalaires (Huang et al., 2013).

- Une structure ortho-dihydroxy sur le cycle B des flavonoïdes améliore les caractéristiques anti-

radicalaires de ces composés (Sroka, 2005).

Matériel et Méthodes

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Notre étude expérimentale a été réalisée au niveau de laboratoire de toxicologie moléculaire et cellulaire, bloc de recherche de l’université de Jijel. Elle est consacrée à l’évaluation de l’effet anti-ulcérogène et gastro-protecteur des polyphénols de la propolis contre un ulcère induit par l’éthanol.

1. Etude phyto-chimique de la propolis

1.1. Récolte de la propolis

La propolis brute a été collectée en avril-mai 2016 de la Coopérative Apicole de Kaous, Jijel (Algérie) et ce par raclage et grattage des cadres de la ruche. Les échantillons ont été stockés à 4

° C afin de conserver intacts tous ses composants.

1.2. Préparation de l’extrait éthanolique de la propolis

L’extraction des polyphénols de la propolis a été réalisée selon le protocole décrit par Kebsa et al. (2007). La propolis a été couper en petits morceaux et lavée deux fois dans l’éthanol 96%

pendant 2 heures, à température ambiante pour éliminer les résidus insolubles, y compris les résidus végétaux et les insectes qui ont été séparés par filtration. Elle est ensuite soumise à une extraction par macération dans l’éthanol 96% (20g de la propolis pour 100 ml de l’éthanol) sous agitation et à l’abri de la lumière pendant 7 jours. Après filtration sur papier Wattman N° 4, le filtrat est évaporé à sec en utilisant un évaporateur rotatif (évaporateur E100, Heidolph) à 45°C.

Après évaporation, le résidu obtenu appelé extrait éthanolique de la propolis (EEP) est pesé pour calculer le rendement d’extraction selon la formule suivante:

Rendement d’extraction en (%) = (E

/ E

) ×100.

Avec : E

masse de l’extrait sec obtenu (g), E

masse de la prise d’essai de départ (g) 1.3. Dosage des polyphénols totaux

La teneur totale en composés phénoliques a été dosée par la méthode de (Singleton et Rossi,

1965) en utilisant le réactif Folin- Ciocalteu. Le Folin-ciocalteu qui est un acide de couleur

jaune réagit avec les résidus phénoliques et conduit à la formation d’un complexe coloré en bleu

dont l’intensité de la coloration est proportionnelle avec la concentration des polyphénols dans

l’extrait. Pour cela, 0,125 ml de l'extrait éthanolique est mixé avec 0,5 ml d'eau distillée et 0,125

ml de réactif Folin-Ciocalteu dilué à 50%. Après 6 min d'incubation, 1,25 ml de Na

C0

(7%) ont

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été ajouté et le volume final est ensuite ajusté avec de l'eau distillée à 3 ml. Après 90 min d'incubation à 25°C, l'absorbance a été lue à 760 nm.

La teneur en composés phénoliques dans l’extrait a été déterminée en se référant à la courbe d’étalonnage obtenue avec l’acide gallique (400μg / ml, 200μg/ ml, 100 μg/ ml et 50 μg/ml) (Annexe). Les résultats sont exprimés en milligramme équivalent d’acide gallique par gramme de propolis.

1.4. Dosage des flavonoïdes

La teneur en flavonoïdes a été mesurée selon la méthode de Dewanto et al., (2002). La technique est basée sur la formation d'un complexe jaune entre les flavonoïdes et le chlorure d'aluminium. Pour cela, 250 μl de l’extrait éthanolique dilué de manière appropriée est mixé avec 75μL de NaNO

(5%). après 6 min d’incubation à température ambiante, 150 μl de AlCl

à 10% et 500 μl de NaOH (1 M) ont été ajoutés. En utilisant l'eau distillée, le mélange a été ajusté à 2,5 ml et l'absorbance a été lue à 510 nm. La teneur en flavonoïdes totaux est exprimée en milligramme équivalent quercétine par gramme de l’extrait, en utilisant une courbe d’étalonnage de la quercétine (20μg/ml -50μg/ml -100μg/ml -200μg/ml) (Annexe).

2. Etude in vitro

2.1. Evaluation de l’effet anti-radicalaire de la propolis in vitro par le test au DPPHº La capacité de piégeage des radicaux libres a été mesurée par la méthode au 1,1-diphényl-2- picrylhydrazyle (DPPH) comme décrit par Hanato et al., (1988).

Le principe de cette méthode est basé sur la capacité des extraits de la propolis à réduire le radical DPPH°. Quand il réagit avec un composé antioxydant qui peut donner les protons hydrogènes. LE DPPH° est réduit (DPPH-H) et change de couleur du violet vers le jaune, ceci se traduit par une décroissance de l’absorbance en fonction du temps à 515nm.

1 ml de différentes concentrations d'EEP (200 μg / ml, 100 μg / ml, 50 μg / ml et 25 μg / ml) préparé dans l’éthanol ou d’acide ascorbique comme control positif a été ajoutée à 0,5 ml d'une solution éthanolique de DPPH° à 0,2 mmol/L. Le mélange a été agité et laissé à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. L'absorbance a été ensuite mesurée à 517 nm en utilisant un spectrophotomètre (Ultrospec 100 pro). Le pourcentage de réduction a été déterminé en prenant le 100% du control (DPPH° seul) selon la relation suivante:

% de réduction= [A

-A

/A

] ×100.

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A

: absorbance du contrôle après 5mn. A

: absorbance de l’essai après 30mn.

L'activité anti-radicalaire a été exprimée également sous forme d’IC

(μg/ml), la concentration nécessaire pour provoquer une réduction de 50% du radical DPPH°.

2.2. Mesure du pouvoir réducteur du peroxyde d’hydrogène (H

O

)

Le piégeage du peroxyde d'hydrogène (H

O

) a été déterminé par la méthode Ruch et al. (1989).

Pour ce dosage, 0.75 ml de l’H

O

(10 mM) préparée dans le tampon phosphate (0.1M, pH=7,4) est ajouté à 1 ml de l’EEP à déférentes concentrations. Après incubation 30 minutes à l’abri de la lumière et à température ambiante, l’absorbance a été mesurée à 240 nm contre un blanc préparé dans les mêmes conditions.

Le pouvoir réducteur du peroxyde d’hydrogène H

O

= [(A

-A

) / A

] x 100.

Où A

est l'absorbance du blanc, et A

est l'absorbance de l'échantillon. L'acide ascorbique et l’acide gallique ont été utilisés comme standard

3. Etude in vivo

3.1. Entretien et traitement des animaux

L’étude a été menée sur 20 rats Albinos wistar (Femelles) de poids moyen de 180g, provenant de l’Université de Batna, (Algérie). Les rats sont maintenus dans l’animalerie de l’Université de Jijel dans des conditions standards; une température ambiante de 22 ° C, une humidité relative de 60% et à un cycle de lumière/obscurité de 12/12h. Les rats sont placés dans des cages en plastique. Ils ont un accès libre à la nourriture et à l’eau. Pour l’étude in vivo, les animaux ont été répartis en 4 lots de 5 rats chacun:

Lot 1 (Témoin): Les rats reçoivent quotidiennement 1ml de l’eau distillée par voie orale pendant 8j.

Lot 2 (Ethanol): Les rats reçoivent quotidiennement 1ml de l’eau distillée par voie orale pendant 7jours, et 1ml de l’éthanol absolu par voie orale dans le huitième jour.

Lot 3 (Ranitidine+Ethanol): Les rats reçoivent quotidiennement 1ml de la ranitidine par voie

orale à la dose de (50mg/kg/j) (Adb El-Hady et al., 2013) pendant sept jours et 1ml de l’éthanol

absolu par voie orale le huitième jour.