Evaluation de l'effet des polyphénols de la propolis contre la toxicité pulmonaire et rénale du méthotrexate

(1)

ةرازو يولعلا ثحبلا و يلبعلا نيلعتلا

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

_

Mémoire De Fin D’études

Pour L’obtention Du Diplôme de Master II en Biologie Option : Pharmacologie Expérimentale

Intitulé

Université Mohamed Seddik Ben Yahia - Jijel

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département de Biologie Moléculaire et Cellulaire

تعهبج ىيحي نب قيدصلا دوحه لجيج -

تعيبطلا مىلع تيلك و

ةبيحلا

نسق تيىلخلا و تيئيسجلا بيجىلىيبلا

Réalisé par :

BENBEKHMA Hassiba.

BENBEKHMA Wissam.

BOUKARI Amira.

Membres du Jury : Président : AZZOUZ W.

Examinateur : Dr. KEBIECHE M.

Encadreur : KEBSA W.

Année Universitaire : 2015- 2016

(2)

Nous espérons que les quelques mots que nous nous apprêtons à écrire réussiront à retranscrire ﬁdèlement nos sentiments.

En premier lieu, nous remercions Dieu, le tout puissant, de nous avoir aidé à surmonter toutes les difficultés lors de nos études et qui nous avoir donné la patience, la volonté et le

courage afin d’arriver à la finalité de ce modeste travail.

Nous sommes très reconnaissantes pour nos parents, que nous admirons, et qui voulaient tout le temps que nous poussons nos études jusqu’au bout avec un soutien incontestable,

Merci pour tout…

Notre profonde gratitude s'adresse à notre encadreur M

^me

KEBSA Wided pour sa patience, sa disponibilité et ses conseils judicieux, nous la prions d’accepter nos sincères

remerciements, notre profond respect et entiers dévouement.

Nous tenons à remercier l’ensemble des membres du jury qui nous ont fait l’honneur en acceptant de juger notre travail.

Nous remercions sincèrement tous les enseignants qui ont contribué à notre formation durant nos cinq ans d’étude.

Nous voudrons tout particulièrement remercier monsieur le professeur LAHOUEL Mesbah pour son aide et son encouragement, la pharmacologie était un domaine passionnant

pour nous. Nous avons appris auprès de vous à l’aimer. Nous avons découvert avec vous la propolis, sujet de notre étude. Pour tout cela nous vous remercions.

Merci également à tout le personnel du laboratoire, en particulier Houria, Ratiba, Wided, Asma, Nassiha et Mekhtar qui ont contribué à la réalisation de ce mémoire.

Merci également aux personnes que nous avons eu de la chance de côtoyer durant cette année : les doctorantes CHOUIT Zineb et BOUDRAA Soumia.

Nous adressons nos vifs remerciements à nos collègues étudiantes de notre promotion.

Notre grand hommage revient précisément à nos familles, tout Simplement de nous avoir donné jour après jour autant d’amour, de soutien et d'encouragement. Nous ne pourrons pas bien sûre

finir sans remercier nos sœurs, nos frères. Merci à tous.

Hassiba & Amira & Wissam

REMERCIEMENTS

S

(3)

Liste des abréviations ... i

Liste des figures ... ii

Liste des tableaux ... iii

Introduction ... 1

Synthèse bibliographique

Chapitre I : Le Méthotrexate ... 5

1. Présentation de la molécule ... 5

2. Données pharmacocinétiques. ... 6

3. Mécanisme d’action ... 8

Chapitre II : Toxicité pulmonaire et rénale du Méthotrexate ... 9

1. Toxicité pulmonaire du méthotrexate ... 9

1.1. Rappel anatomopathologique des poumons ... 9

1.2. Mécanismes de toxicité pulmonaire ... 10

2. Toxicité rénale du méthotrexate ... 12

2.1. Rappel anatomopathologique des reins ... 12

2.2. Mécanismes de la toxicité rénale ... 14

Chapitre III : Les acteurs du stress oxydant cellulaire ... 15

1. Stress oxydant et espèces réactives de l’oxygène ... 15

2. Sources des espèces réactives de l’oxygène ... 16

3. Mécanismes cellulaires de défense contre les ROS ... 18

3.1. Les antioxydants enzymatiques ... 18

3.2. Les antioxydants non-enzymatiques ... 19

4. Potentialités toxiques des espèces radicalaires ... 19

4.1. Oxydation des protéines ... 19

4.2. Péroxydation lipidique ... 20

4.3. Dommages de l’ADN Chapitre IV. La propolis comme source de polyphénols ... .20

1. La propolis ... .20

1.1. Historique et définition ... .21

1.2. Composition chimique ... .21

1.3. Propriétés physicochimiques ... .22

1.4. La propolis en thérapeutique ... .22

1.5. Toxicité de la propolis ... .22

2. Les polyphénols ……….23

2.1. Définition ... .23

2.2. Biosynthèse ... .23

2.3. Classification ... .24

(4)

2.4.1. Le piégeage direct des ROS ... .27

2.4.2. La chélation des ions métalliques ... 28

2.4.3. L'inhibition enzymatique ... 28

2.5. Relation Structure -Activité antioxydante ... 29

Matériels et Méthodes ...

32

1. Etude phytochimique de la propolis ... 32

1.1. Récolte de la propolis ... 32

1.2. Préparation des extraits éthanoliques de la propolis ... 32

1.3. Dosage des polyphénols totaux (TP) ... 32

1.4. Dosage des flavonoïdes totaux (TF) ... 33

1.5. Etude des propriétés anti-radicalaires par le test au DPPH° (2,2-Diphenyl-picrylhydrazyl) ... 33

1.6. L’étude de povoir réducteur du peroxyde d’hydrogène………...34

2. Etude in vivo ... 34

2.1. Entretien des animaux ... 34

2.2. Traitement des animaux ... 34

2.3. Sacrifice des animaux et prélèvement du foie ... 35

2.4. Le prélèvement du sang ... 35

2.5. Paramètres sériques ... 35

2.6. Les paramètres hématologiques………...37

2.7. Dosages tissulaires ………..37

2.7.1. Préparation de la fraction cytosoliques ... 37

2.7.2. Dosage du glutathion hépatique GSH ... 37

2.7.3. Dosage du MDA cytosolique ... 38

2.7.4. Evaluation de l’activité des enzymes antioxydantes ... 38

2.7.4.1. Mesure de l’activité enzymatique de la Catalase (CAT) ... 38

2.7.4.2. Mesure de l’activité de la glutathion-S transférase (GST) cytosolique ... 39

2.7.4.3. Mesure de l’activité de la glutathion peroxydase (GPx)………....39

2.8. Etude histologique …………. ... 40

2.9. Traitement des résultats ... 40

Résultats et discussion ... 42

1. Etude phytochimique………42

1.1. Rendement de l’extraction………...42

1.2. Teneur en polyphénols et en flavonoïdes ... 42

1.3. Effet anti-radicalaire des extraits de propolis contre le radical libre DPPH° ... 45

1.4. Evaluation du pouvoir réducteur du peroxyde d’hydrogène ... 47

2. Etude in vivo ... 48

2.1. Observation du comportement des souris après traitement ... 48

2.2. Evolution pondérale des animaux sous l’effet des différents traitements ... 49

2.3. Influence du MTX sur les paramètres biochimiques ………. 51

2.4. Influence du MTX sur les paramètres hématologiques………...62

(5)

2.6. Influence du MTX sur la fonction rénale………...59

2.7. Mécanisme d’action proposé de l’effet prooxydant du méthotrexate et de l’effet antioxydant des .polyphénols de la propolis ... 65

2.8. Etude histologique ... 67

Conclusion ... 72

Références ... 75 Annexe

(6)

AA: Acide Arachidonique.

ADN : Acide Desoxyribonucléique.

ADA: Adenosine deaminase.

ALAT : Alanine amino transférase.

ASAT : Aspartate amino transférase.

ATP : Adénosine 5'-Triphosphate.

BSA: Bovine Sérum Albumine CAT : Catalase.

CAPE : Ester Phénithylique de L’acide Caféique.

CDNB : 1-chlore-2.4-dinitrobenzene.

COX : Cyclooxygénase.

CO2 : Dioxyde de carbone.

DAMPA : Acide 2,4-Diamino-N10- Méthylptéroïque.

DFG : Debit de Filtration Glomérulaire.

DHFR : Dihydrofolate-réductase.

DO : Densité Optique.

DPPH : 2.2. Diphenyl-Picrylhydrazyl.

DTNB : Acide 5,5’- Dinitrobenzoique.

EAG : Equivalent Acide Gallique.

EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid.

EEP : Extrait Ethanolique de Propolis.

EMT: Epithelial-to-Mesenchymal Transition.

FPGS: Folyl-Polyglutamate Synthétase.

GAR: Glycinamideribonucléotide.

GPx: Glutathion Peroxydase.

GR : Glutathion Réductase.

GSH : Glutathion.

GSSG : Glutathion Oxydé.

GST : Glutathion- S- Transférase.

H

2

O

2

: Peroxyde d’hydrogène.

IL-1 : Interlukine-1.

IL-1beta : Interleukine-1beta.

IL-6 : Interlukine-6.

IL-8 : Interleukine-8.

IP : Intrapéritoniale.

LDH : Lactate Deshydrogénase.

LDL : lipoprotéine de densité légère.

LPO : peroxydation lipidique.

MAPK: Mitogen-Activated Protein kinases.

MDA : Malondialdéhyde.

MMP : Métalloprotéinase Matricielle.

MPO: Myeloperoxydase . MTX: Methotréxate.

NADPH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate.

NF-

K

B / Kb: Facteur Nucléaire KAPPA B.

NO: Monoxyde d’azote.

NO∙: Monooxyde d’azote.

NOX : NADPH oxydase.

OH

^•

: Radical hydroxyl.

ONOO

^-

: Peroxynitrite.

O

₂^•-

: Anion superoxyde.

PAL : Phosphatase Alcaline.

QUE : Quercétine.

ROOH : Hydroperoxyde organique.

ROO

^•

: Radical Peroxyl.

RO

^•

: Radicaux oxyl.

ROS : Espèces Réactifs d’oxygène.

RFC : Transporteurs de Folate Réduit.

SOD : Superoxyde Dismutase.

TBA : Acide Thioberbiturique.

TEP : Tétraetoxypropane.

TGF-β1: Tumoral Growth Factor-β1 TNB: Acide Thionitrobenzoique.

7-OH-MTX: 7-Hydroxy-Methotréxate.

(7)

Liste des figures

Figure 1. La Structure chimique du méthotrexate………. ……5

Figure 2. Le métabolisme hépatique du méthotrexate (A) avec la formation du métabolite (B) portant un –OH en 7………7

Figure 3. Le mode d’action du méthotrexate après pénétration cellulaire………...8

Figure 4. Anatomie des poumons………...9

Figure 5. Processus de transition Mésenchymateux………...12

Figure 6. Anatomie des reins………...……….13

Figure 7. Processus de formation des ROS………...16

Figure 8. Les voies de biosynthèse des polyphénols………24

Figure 9. Biosynthèse des flavonoïdes……….…………26

Figure 10. Les structures chimiques des acides phénoliques………27

Figure 11. Piégeage des espèces réactives oxygénées par les flavonoïdes……...28

Figure12. Sites de chélation des ions métalliques par les flavonoïdes………...……..28

Figure 13. Éléments essentiels pour l’activité antioxydante des flavonoïdes……..….29

Figure 14. Flavonoïdes et leurs sites proposés pour la chélation des ions métalliques……….29

Figure15.Forme radicalaire et réduite du DPPH°………33

Figure 16. Teneur en polyphénols dans les échantillons de propolis en mg équivalent acide gallique/g de propolis (mg EAG/g)……….……….43

Figure 17. Teneur en flavonoïdes dans les échantillons de propolis en mg équivalent quercétine/g de propolis (mgEQ/g)………44

Figure 18. Pourcentage de réduction du DPPH de EEP1 et EEP2 ………...45

Figure 19. Variations des taux du GSH cytosolique pulmonaire après administration

(8)

Liste des figures d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (50mg/kg) ou avec la quercétine (50mg/kg)………...52 Figure 20. Variations des taux du MDA cytosolique pulmonaire après administration d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (50mg/kg) ou avec la quercétine (50mg/kg)………...54 Figure 21. Variations de l’activité enzymatique de la catalase pulmonaire après

administration d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (50mg/kg) ou avec la quercétine (50mg/kg)………....55

Figure 22. Variations de l’activité enzymatique de la GST pulmonaire après

administration d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (50mg/kg) ou avec la quercétine (50mg/kg)………..…57 Figure 23. Variations de l’activité enzymatique de la Gpx pulmonaire après

administration d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (50mg/kg) ou avec la quercétine (50mg/kg)………...58 Figure 24.Variations des taux du GSH cytosolique rénale après administration d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (100mg/kg) ou avec la quercétine (50mg/kg)………...…..59 Figure 25.variations des taux du MDA cytosolique rénale après administration d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (50mg/kg) ou avec la quercétine

(50mg/kg)……….………..60 Figure 26. Variations de l’activité enzymatique de la catalase rénale rénaleaprès administration d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (100mg/kg) ou avec la quercétine

(50mg/kg)…………...62

Figure 27. Variations de l’activité enzymatique de la GST rénale après administration

d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (50mg/kg) ou

avec la quercétine (50mg/kg)……….63

Figure 28. Variations de l’activité enzymatique de la GPx rénale après administration

(9)

Liste des figures d’une dose unique du MTX seule (20mg/kg), en association avec l’EEP (50mg/kg) ou avec la quercétine (50mg/kg)……….…..…..64 Figure 29. Coupe histologique de poumon issu des souris témoins (X100)…………67

Figure 30. Coupe histologique de poumon issu des souris traitées par le MTX (20mg/kg/ IP) (A) Dommages épithéliales alvéolaires (triangles blancs), fibrose

interstitielle (cercle rouge). (B) infiltration des neutrophiles (flèche blanc) (X100)….68

Figure 31. Coupe histologique de poumon issu des souris traitées par le MTX associé avec l’EEP (50mg/kg/orale) (X100)………..68

Figure 32. Coupe histologique de poumon issu des souris traitées par le MTX associé avec la QUE (50mg/kg/orale) (X100)………...68

Figure 33. Coupe histologique de rein issu des souris témoins (X100)………...69

Figure 34. Coupe histologique de poumon issu des souris traitées par le MTX (20mg/kg/IP). Des congestions glomérulaires (étoile blanche), un gonflement des cellules tubulaires (flèche rouge), une dilatation tubulaire (flèche noire) (X100)…...69 Figure 35. Coupe histologique de rein issu des souris traitées par le MTX associé avec l’EEP (50mg/kg/orale) (X100)………..70

Figure 36. Coupe histologique de rein issu des souris traitées par le MTX associé avec

la QUE (50mg/kg/orale) (X100)………70

(10)

Tableau 1.

Composition de la propolis brute……

………...

Tableau 2.

Principales classes de composés phénoliques………..

Tableau 3.

Rendement d’extraction de l’extrait éthanolique de la propolis Algérienne et

Jordanienne.

………

Tableau 4.

Teneur en polyphénols dans les échantillons de propolis en mg équivalent acide gallique/g de propolis (mg EAG/g). ……….

Tableau 5. Teneur en flavonoïdes dans les échantillons de propolis en mg équivalent

quercétine/g de propolis (mg EQ/g). ………..………

Tableau 6. Pourcentage de réduction du DPPH° de l’EEP1 et EEP2 et IC50 ………..

Tableau 7. Le pourcentage de piégeage de H

₂

O

₂

... 44 Tableau 8. Evolution pondérale des poids corporels, des poumons et des reins chez les

souris traitées par le MTX seule (20mg/kg), en association avec la propolis (50 mg/kg) ou en association avec la quercétine (50mg/kg). ... 44 Tableau 9. Variations des concentrations des paramètres sériques : AST, ALT, PAL, Urée, Créatinine, LDH et les protéines sériques chez les souris traitées par le MTX seule

(20mg/kg), en association avec la propolis (50 mg/kg) ou en association avec la quercétine (50mg/kg) ... 46 Tableau 10. Variations des taux des paramètres hématologiques chez les lots témoin, MTX seul (20mg/kg), EEP+MTX (50 mg/kg), QUE+MTX (50mg/kg). ... 47

21 25

42

43 43 45 47

49

50

51

(11)

Introduction

2

La santé fait partie des préoccupations majeures de l’homme qui continue toujours à chercher le meilleur pour l’entretenir. Ces dernières années, ses recherches ont connu un développement considérable dans le domaine pharmacologique et notamment les médicaments anticancéreux qui présentent une fenêtre thérapeutique étroite.

Le méthotrexate (MTX) est un anticancéreux de la famille des antifolates utilisé depuis de nombreuses années pour le traitement des tumeurs solides et des hémopathies malignes ; des leucémies lymphoïdes aiguës, des lymphomes non hodgkiniens, des choriocarcinomes, du cancer du sein et lors de la transplantation de la moelle. Il est également indiqué à faibles doses dans des cas graves de psoriasis ou de polyarthrite rhumatoïde.

Il agit en faux substrat, inhibe de manière compétitive l’activité de la dihydrofolate réductase (DHFR), enzyme-clé du métabolisme des folates et induit un déficit en bases puriques et pyrimidiques, aboutissant à un défaut de synthèse de l’ADN et un blocage du cycle cellulaire en phase S. Sa pharmacologie et son élimination rénale sont bien décrites et permettent d’appréhender la gestion d’une toxicité parfois très sévère notamment après utilisation à fortes doses (Lussiez, 2010; Ahmed et al.,2015 ; kawami et al., 2015).

Les manifestations indésirables principales du méthotrexate sont multiples, à savoir : la toxicité hépatique, les infiltrats pulmonaires et pneumonie interstitielle, l’obstruction intrarénale avec risque d'insuffisance rénale aiguë et de nécrose tubulaire rénale et neurotoxicité. La toxicité hématopoïétique se manifeste sous forme d’anémie, neutropénie, thrombopénie avec risque accru d'ecchymoses.Ces effets secondaires ont une fréquence élevée variant de 37,1% à 96%.

Même si toutes les précautions d’usage sont respectées, l’insuffisance rénale aiguë (IRA) par nécrose tubulaire aiguë reste une complication rare redoutable du MTX à forte dose. Cette toxicité est liée à la précipitation tubulaire du MTX et de ses métabolites mais pourrait également résulter d’un effet toxique directe du MTX sur le tubule et d’une vasoconstriction de l’artériole afférente. Le dépistage précoce de l’IRA est essentiel et nécessite une stricte surveillance de la fonction rénale les jours suivant la perfusion du MTX (Lussiez, 2010;

Ahmed

et al.,2015 ; kawami et al., 2015). Des pneumopathies immunoallergiques pouvant

évolué vers la fibrose pulmonaire peuvent être observées et nécessitent une corticothérapie

(Combe et Flipo, 2008).

(12)

Introduction

3

Cette toxicité du méthotrexate est liée à l’induction d’un état du stress oxydatif suite à la production excessive des espèces réactives d’oxygènes (ROS) dans les cellules (Öktem et al., 2006), pour cette raison, les travaux

in vitro montrent que les polyphénols sont capables de

réduire ce problème, grâce à leur puissante capacité antioxydante à piéger ces radicaux libres mais aussi en formant avec les ions du fer et du cuivre des complexes inertes (Nkhili, 2009).

La propolis ; substance résineuse, gommeuse et balsamique, de consistance visqueuse, recueillie par les abeilles sur certaines parties de végétaux principalementles conifères (écorce des pins, sapins, épicéas) et les bourgeons de plusieurs espèces d'aulnes, de saules, de bouleaux, de prunier, de frênes, de chênes et d'ormes, de peupliers ; est très riche en polyphénols. Ses activités thérapeutiques sont liées directement à sa composition qui dépend de plusieurs conditions, essentiellement de la zone géographique et botanique ainsi que la saison de la récolte (Silva-Carvalho., 2015).

Cette étude vise à évaluer:



l’effet de l’origine géographique de deux échantillons de propolis

Algérienne et Jordanienne

sur leurs compositions chimiques, leurs teneurs en polyphénols et en flavonoïdes et leurs l’activité antioxydantes.



l’effet des polyphénols de la propolis administrés par voie orale à la dose de 50

mg/kg contre la toxicité pulmonaire, rénale et hématologique induite par le MTX en

comparaison avec la quercétine ; flavonoïde de référence, à la même dose. Et cela via

l’évaluation des paramètres du stress oxydatif dans le tissu pulmonaire et rénal, des

paramètres sériques et la visualisation des changements tissulaires sur coupes

histologiques.

(13)

Notre étude expérimentale a été réalisée au niveau de laboratoire de pharmacologie, département de biologie moléculaire et cellulaire à l’université de Jijel. Elle est consacrée pour l’évaluation de l’effet des polyphénols de la propolis contre la toxicité pulmonaire et rénale du méthotrexate.

Partie 1. Etude phytochimique de la propolis 1.1. Récolte de la propolis

L’échantillon de la propolis est récolté pendant la période du printemps, au moi d’avril 2016 à partir des ruches de la coopérative apicole de

Kaous (Jijel) et cela par grattage et raclage des

cadres et des parois de la ruche. Le deuxième échantillon de propolis provient de la

Jordanie

(Amman).

1.2. Préparation de l’extrait éthanolique de la propolis

L’extraction des polyphénols de la propolis est réalisée selon le protocole décrit par Bruneton (1992). Les échantillons de la propolis coupés en petits morceaux sont soumis à une extraction par macération dans l’éthanol 96% (20g de la propolis pour 100 ml de l’éthanol) sous agitation et à l’abri de la lumière pendant 7 jours. Après filtration sur papier Wattman N° 4, le filtrat est évaporé à sec en utilisant un évaporateur rotatif (évaporateur E100, Heidolph) à 45°C.

Après évaporation, le résidu obtenu est pesé pour calculer le rendement d’extraction et ceci selon la formule suivante:

Rendement d’extraction en (%) = (E

1

/ E

0

) ×100.

Avec : E

₁

masse de l’extrait obtenu(g), E

₀

masse de la prise d’essai (g)

1.3. Dosage des polyphénols totaux (TP)

Le dosage des polyphénols totaux par la méthode utilisant le réactif de Folin-ciocalteu a été

décrit par Singleton et Rossi (1965). L’interaction entre le Folin-ciocalteu qui est un acide de

couleur jaune et les résidus phénoliques conduit a la formation d’un complexe coloré en bleu

dont l’intensité de la coloration est proportionnelle avec la concentration des polyphénols dans

l’extrait. A500μl de l’extrait dilué en 1/100

^ème

, 2,25 ml d’eau distillée et 250μl du réactif Folin-

ciocalteu (5%) sont ajoutés. Après 5mn de repos, 2ml de Na

₂

CO

₃

(bicarbonate de sodium)

(7,5%) sont additionnés, puis le mélange est incubé pendant 60mn à température ambiante et à

l’abri de la lumière. Ensuite, la densité optique (DO) est lue à 760nm en utilisant un

spectrophotomètre de type ultraspec 100 pro.

(14)

La teneur en composés phénoliques dans l’extrait est déterminée en se référant à la courbe d’étalonnage obtenue avec l’acide gallique (400μg / ml, 200μg/ ml, 100 μg/ ml et 50 μg/ml). Les résultats sont exprimés en milligramme équivalent d’acide gallique par gramme de propolis.

1.4. Dosage des flavonoïdes totaux (TF)

Selon Dewanto et

al.

(2002), le dosage des flavonoïdes se fait par la méthode colorimétrique basée sur la formation d'un complexe jaune entre les flavonoïdes et le chlorure d'aluminium. 250 μl de l’extrait dilué en 1/1000

^ème

sont mélangés avec 75μl de NaNO

₂

(5%). Après un repos de 6mn, 150 μl d’AlCl3 (2%) et 500 μl de NaOH (1M) sont ajoutés, le volume est complété par 2,5 ml d’eau distillée, ensuite la DO est lu à 510 nm.

La teneur en flavonoïdes totaux est exprimée en milligramme équivalent de la quercétine par gramme de l’extrait, en utilisant une courbe d’étalonnage de la quercétine (20μg/ml -50μg/ml - 100μg/ml -200μg/ml). Tous les dosages sont réalisés 3 fois.

1.5. Etude des propriétés anti-radicalaires par le test au DPPH° (2.2. Diphenyl- picrylhydrazyl)

L’effet scavenger ou la capacité de piégeage des radicaux libres des extraits éthanoliques est déterminé en utilisant la méthode au DPPH° comme elle est décrite par Ancerewicz et al (1998).

Une méthode rapide, simple et peu coûteuse a la capacité de mesurer l’activité antioxydante des extraits en utilisant le radical libre stable (DPPH°).

Le principe de cette méthode est basé sur la capacité des extraits à réduire le radical DPPH°, le DPPH° est réduit (DPPH-H) et change sa couleur du violet vers le jaune quand il réagit avec un composé antioxydant qui peut donner les protons hydrogènes, ce changement de couleur se traduit par une décroissance de l’absorbance en fonction du temps à 515nm. Les deux formes radicalaire(1) et réduite (2) du DPPH sont représentées dans la figure 15.

Figure15. Forme radicalaire (1) et réduite (2) du DPPH°.

Pour réaliser ce test, la cuve de mesure contient : 1,5 ml de la solution éthanolique du DPPH°

(100μM) et 15μl de l’extrait à tester. La mesure de la DO s’effectue chaque 30 seconde pendant

(15)

5 mn à 515nm à l’aide d’un spectrophotomètre (Ultrospec 100 pro). L’effet piégeur est déterminé en pourcentage de réduction en prenant le 100% du control (DPPH° seul) selon la relation suivante:

% de réduction= [A

_C

-A

_E

/A

_C

] ×100.

A

_C

: absorbance du contrôle après 5mn. A

_E

: absorbance de l’essai après 5mn.

1.6. Evaluation de Pouvoir réducteur du peroxyde d’hydrogène

Le peroxyde d'hydrogène est un dérivé non-radicalaire d'oxygène et considéré comme toxique pour les cellules car il permet la formation des radicaux hydroxyles à l'intérieur de la cellule. Le piégeage du peroxyde d'hydrogène (H

2

O

2

) a été déterminé par la méthode décrite par Ruch et

al.

(1989). Une solution de H

2

O

2

(10 mM) a été préparée dans un tampon phosphate (pH=7,4). Le mélange réactionnel est composé de 10 mM de H

2

O

2

et de différentes

concentrations d'échantillon dans un volume total de 1ml. Les valeurs de l’absorbance ont été

mesurées à 0 min et après 60 min à 240nm. L'acide ascorbique et l’acide gallique ont été utilisés comme standard. Le pourcentage de piégeage de H

2

O

2

par l’extrait a été calculé selon la formule suivante :

L’activité de piégeage des radicaux libres:

H

2

O

2

(%) = [{Ao - A1/ Ao}] × 100.

Ao : absorption de H

2

O

2

. A1 : absorbance de H

2

O

2

en présence de l'extrait.

Partie 2. Etude in vivo 2.1. Entretien des animaux

L’étude a été menée sur 16 souris Albinos wistar (mâles et femelles) (provenant de l’institut Pasteur, Alger, Algérie), chacune pèse approximativement 40 g. Les animaux ont été divisés en 4 groupes de 4 souris, conservés dans des conditions standards de gestion avec une température de 20-25 C°, hygrométrie de 60 % et un cycle jour- nuit 12h/12h, avec disponibilité d’alimentation et d’eau.

2.2.Traitement des animaux

Pour la réalisation de notre travail consacré à l’étude

in vivo de l’effet des polyphénols de la

propolis contre la toxicité rénale et pulmonaire induite par le méthotrexate, nous avons choisi la

propolis de kaous.

(16)

L’extrait éthanolique de la propolis, la quercétine et le méthotrexate (méthotrexate ‘’Ebewe’’ 50 mg solution pour injection IP, IM, IV…) sont administrés aux souris comme suit :

Le premier lot : les souris reçoivent 1 ml d’eau distillé par voie orale pendant 8 jours, et une dose unique de l’eau physiologique par voie intrapéritoniale (IP) au 6

^ème

jour (Asvadi

et al.,

2011 avec modification).

Le deuxième lot : les souris reçoivent 1 ml d’eau distillé par voie orale pendant 8 jours, et une dose unique de 20 mg/kg du méthotexate par voie (IP) au 6

^ème

jour (Asvadi et al., 2011 avec modification).

Le troisième lot : les souris reçoivent 1 ml de l’EPP (50 mg/kg) par voie orale pendant 8 jours, associés à une dose unique de 20 mg/kg du méthotexate par voie (IP) au 6 ème jour (Asvadi

et al., 2011 avec modification).

Le quatrième lot : les souris reçoivent 1 ml de la quercétine (50 mg/kg) par voie orale pendant 8 jours, associés à une dose unique de 20 mg/kg du méthotexate par voie (IP) au 6 ème jour (Asvadi et al., 2011 avec modification).

2.3.Prélèvement du sang

Le prélèvement du sang a été réalisé juste avant le sacrifice pour le but d’évaluer la toxicité, en mesurant les variations des paramètres sériques et hématologiques chez les différents lots.

Le sang est prélevé à partir du sinus-orbital au niveau de l’œil des souris et par ponctuation cardiaque.

2.4. Sacrifice des animaux et prélèvement du poumon et du rein

Au 8

^ème

jour après le début de traitement, les souris ont été sacrifiées, chaque poumon et chaque rein a été prélevé et divisé en deux fractions : la première a été plongée dans le formole (10%) pour la fixation des tissus, et la deuxième fraction a été met dans la glace en attendant leur potérisation pour l’obtention des fractions cytosoliques.

2.5. Paramètres sériques

L’évaluation des variations du taux des paramètres sériques a été réalisée à l’aide d’un automate (PHD Diam S 2300+) en utilisant des kits (Biomaghreb pour le dosage de la PAL, Spinreact pour les dosages LDH, AST et ALT, Biuret pour le dosage des protéines).

2.5.1. Les transaminases (AST/ ALT)

(17)

Les transaminases catalysent à travers des réactions réversibles le transfert d’un groupe aminé à partir d’un acide alpha- aminé (l’acide glutamique) à un acide alphacétonique (l’acide oxaloacétique et l’acide pyruvique). Cette activité est proportionnelle aux taux des oxalates formés, et mesurée par une réaction avec le 2, 4-Dinitrophenylhydrazine (DNPH) dans une solution alcaline. L’absorbance est mesurée à 505 nm (Murray, 1984 ; Reitman et al., 1957).

2.5.2. Les protéines totales

Le taux des protéines est mesuré selon la méthode colorimétrique décrite par Gornall

et al.

(1949).Dans une solution alcaline, les liaisons peptidiques des protéines réagissent avec le cuivre (Cu

²⁺

) pour former un complexe coloré dont l’absorbance, proportionnelle à la concentration en protéines dans le spécimen, est mesurée à 550nm. Le réactif Biuret contient du sodium, potassium, tartrate, qui complexe les ions cuivriques et maintient leur solubilité en solution alcaline.

2.5.3. La phosphatase alcaline (PAL)

Le principe de ce dosage repose sur la détermination cinétique de l’activité de la phosphatase alcaline (PAL) selon la méthode recommandée par la société allemande de chimie clinique (DGKG).

On fait agir la phosphatase alcaline (PAL) sur un substrat, le nitro-4-phénylphosphate disodique (PNPP), en milieu alcalin. La réaction d’hydrolyse catalysée par la PAL libère alors du nitro-4- phénol (PNP). Le nitro-4-phénol formé est jaune en milieu alcalin. L’intensité de la coloration après 30min de contact entre l’enzyme et son substrat, à 37°C est mesurée à 405nm (Haussamen

et al., 1977).

Le nitro-4-phénylphosphate disodique+H

₂

O → nitro-4-phénol+phosphate 2.5.4. Dosage de l’urée

Le dosage de l’urée a été réalisé par la méthode enzymatique colorimétrique selon la fiche technique du Kit Spinréact (Espagne) (Kaplan, 1984).

Principe : l’uréase hydrolyse l’urée en ammonium (NH4+) et en dioxyde de carbone (CO2). Les ions ammonium formés réagissent avec le salicylate et l’hypochlorite en présence du nitroprussiate, pour former un indophénol vert selon les réactions ci-dessous :

Urée + H2O

^Uréase

(NH4+)2 + CO2

(18)

NH4+ + Salicylate + NaClO

Nitroprussiate

Indophénol

L’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration de l’urée dans l’échantillon (Kaplan, 1984).

2.5.5. Dosage de la créatinine

La détermination du taux de la créatinine sérique est mesuré par la méthode de Jaffe à travers la formation d’un produit coloré en présence d’un pigment alcalin. La lecture de la DO est effectuée à la longueur d’onde 492nm, à l’aide d’un spectrophotomètre (Bonsnes et Tausky, 1945). Le taux de la créatinine sérique est exprimé en mmol/l.

2.5.6. Lactate déshydrogénase (LDH)

Le lactate déshydrogénase est une enzyme cytoplasmique qui catalyse la réduction du pyruvate par le NADH, selon la réaction suivante :

Pyruvate + NADH+H

⁺

L- lactate + NAD

⁺

La diminution de la concentration du NADH, mesurée par photométrie est proportionnel à la concentration de LDH présente dans l’échantillon.

2.6. Les paramètres hématologiques :

Les paramètres hématologiques ont été réalisés en utilisant un coulteur de type Math M edco,PH

développement .

2.7.Dosages tissulaires

2.7.1. Préparation de la fraction cytosolique

Pour la préparation de la fraction cytosolique, nous avons utilisé la méthode décrite par Iqbal et

al (2003). 2g de poumon et de rein sont coupés et homogénéisés avec 3ml du tampon phosphate

(0,1 M , ph=7,4) à l’aide d’un broyeur de DOUNCE. L’ homogénat de chaque organe est ensuite centrifugé à 2000 rpm pendant 15 mn à 4 ° C pour séparer les débris cellulaires, le surnageant obtenu est centrifugé à 9600rpm à 4 ° C pendant 30mn. Le surnageant ainsi obtenu est utilisé comme source d’enzymes.

2.7.2. Dosage du glutathion (GSH) pulmonaire et rénale

Le dosage du GSH est fondé sur la méthode colorimétrique d’Ellman (1959) utilisant le réactif

DTNB (acide 5,5’- Dinitrobenzoique). Le principe de la réaction est basé sur l’oxydation du

(19)

GSH par le DTNB, ce qui entraine la libération de l’acide thionitrobenzoique (TNB) qui présente une absorbance à 412 nm dans un pH alcalin, selon la réaction suivante:

GSH + DTNB →GSTNB + TNB

50µl du surnageant de chaque organe que ce soit poumon ou rein sont dilués dans 10ml de tampon phosphate (0,1 M , pH= 8) . 20µl du DTNB (0,01M) sont ajoutés à 3ml du mélange de dilution. Après 15min d’incubation, la lecture de la DO est effectuée à 412 nm contre un blanc préparé dans les mêmes conditions avec le TCA (5%).

Le taux du GSH est déduit à partir d’une gamme étalon de glutathion préparé dans les mêmes conditions que le dosage, et les concentrations sont exprimés en millimoles de glutathion par gramme de poumon ou de rein.

2.7.3. Dosage du MDA cytosolique

Le dosage du malondialdehyde est réalisé selon la méthode décrite par Okhawa

et al. (1979). Le

MDA réagit avec deux molécules de TBA (acide thiobarbiturique) dans un milieu acide (pH= 2 ou 3) et à chaud 100° C pour donner un pigment rose absorbant à 530 nm et extractible par les solvants organiques.

0,5ml de l’homogénat, 0,5 ml de TCA (20%) et 1ml de TBA (0 ,67%) sont mélangés, ensuite ce mélange est chauffé à 100 °C pendant 15 mn, refroidi puis additionné de 4 ml de n-butanol. Le mélange est centrifugé pendant 15mn à 3000rpm.

Le taux d’MDA est déduit à partir d’une gamme étalon préparée dans les mêmes conditions en utilisant une solution du tétraetoxypropane (TEP) qui donne le MDA après son hydrolyse.

2.7.4. Evaluation de l’activité des enzymes antioxydantes.

2.7.4.1.Mesure de l’activité enzymatique de la catalase (CAT).

L’activité de la catalase a été déterminée selon la méthode décrite par Clairbone (1985). Le principe est basé sur la disparition du peroxyde d’hydrogène (H

2

O

₂

) en présence de la source enzymatique à 25° C. un mélange constitué de 1ml du tampon phosphate (KH

₂

PO

₄

0,1M, pH=7,2), 0,950 ml du peroxyde d’hydrogène (0,019M) et 0,025 ml de la source enzymatique est préparé. L’absorbance est mesurée à 240 nm chaque minute pendant 2mn. L’activité enzymatique est exprimée en UI /g de protéine selon la relation suivante :

UI /g de protéine= (2,3033/T. logA

1

/A

2

) g de protéine.

(20)

Sachant que : A

1

: absorbance au temps 0mn.

A

₂

: absorbance au temps 1mn.

T : intervalle de temps en mn.

2.7.4.2. Mesure de l’activité de la glutathion. S transférase (GST) cytosolique

L’activité de la GST a été déterminée selon la méthode colorimétrique de Habig

et al.

(1974).

L’interaction entre le GSH et le CDNB (1-chlore-2.4-dinitrobenzene) catalysée par la GST, conduit à la formation de dinitrophényle thioether (GS-DNB). Le taux du complexe formé réflète la quantité du GST active présente (1µmol de GS-DNB/mn1pour unité de GST active), qui peut être mesurée par le spectrophotomètre à 340 nm.

Après incubation du mélange réactionel contenant 1700µl du tampon phosphate (0,1M, pH=6,5) et 100µl du CDNB (20mM), À 37°C pendant 10 min, la réaction est démarrée par l’addition de 100µl de l’homogénat dilué à 1/100 et de 100µl de glutathion (20mM).

La densité optique est lue chaque minute pendant 5min à 340nm. Le calcule de l’activité de la GST se fait selon la relation suivante :

Enzyme (UI/ml) = [(∆A

340

/ min test- ∆A

340

/ min blanc) / (vt) (fd)]/ [(9,6) (ve)].

Vt : volume total (en millilitre) de l’essai.

Fd : facteur de dilution.

9,6 : coefficient d’extinction millimolaire du glutathion-1-chloro-2,4- dinitrobenzène conjugué à 340nm.

Ve : volume (en millilitre) de l’enzyme utilisée.

Units/ mg de protéines = (units / ml enzymes) / (mg protéines / l enzymes).

2.7.4.3. Mesure de l’activité enzymatique de la glutathion peroxydase (Gpx).

L’activité de la GPx a été dosée comme décrit par Paglia

et al. (1967). La Gpx catalyse

l’oxydation du glutathion réduit (GSH) par le peroxyde d’hydrogène (H2O2), en présence de la glutathion réductase (GR) et de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH). Le glutathion oxydé (GSSG) est immédiatement reconverti en glutathion réduit, avec oxydation du NADPH en NADP+ qui est détecté par spectrophotométrie.

2GSH + H2O2 (Gpx) → GSSG + 2H2O

GSSG + NADPH + H+ (GR) → 2 GSH + NADP+

(21)

50 μl de l’échantillon sont mélangés au milieu réactionnel contenant 2.65 ml de tampon phosphate (pH= 7), de l’EDTA à 5 mM, 20 μl de NaNO

₃

à 0.12 M, 100 μl de glutathion réduit (GSH) à 150 mM, 20 μl de la glutathion réductase, et 100 μl de NADPH à 8 mM. Aprés une incubation de 15 à 30 minutes à 37 ºC, le mélange obtenu a ensuite été transféré dans la cuve du spectrophotomètre et mixé en inversion avec 100 μl du peroxyde d’hydrogène (H2O2) à 2mM.

L’activité enzymatique a été exprimée en U.l

^-1

en utilisant le coefficient d’extinction du NADPH à 340 nm de 6.22X10

⁻⁶

M

⁻¹

.cm

⁻¹

.

2. 8. Etude histologique

Afin de réaliser l’étude histologique, les fraguements du poumon et du foie sont coupés en tranches fines, pour cela un processus de déshydratation est réalisé. Dont les organes sont mis dans des bains successivement plus concentré d’éthanol puis l’éthanol absolu, les morceaux des reins et des poumons sont baignés dans du xylène pour éliminer l’alcool, ensuit tombés dans des bains de paraffine et laissés se solidifier à froid. Cette méthode permet d’obtenir des coupes d’organes aussi minces que 5µm. Après la réalisation des blocs, des coupes de 5µm d’épaisseur ont été préparé à l’aide du microtome.

Les coupes obtenus sont déparaffinées par le xylène puis réhydratées dans des bains d’éthanol successivement moins concentré, puis dans l’eau, ensuite colorées avec l’hématoxyline et l’éosine, afin de permettre la mise en évidence des noyaux( bleu pourpre) et du cytoplasme(

rouge).

Pour l’observation microscopique des coupes colorées, ces dernières sont montrées sur des lames de verre préalablement recouvertes de colle de gélatine pour en assurer l’adhérence, puis recouvertes d’une lamelle avant durcissement.

2.9. Traitement des résultats

Les résultats numériques et graphiques sont représentés sous forme de moyenne ± écartype. Nos résultats sont vérifiés par le test de

student

avec un seuil de signification supérieur à 95%

(p<0.05).

(p>0.05), effet non significatif ns.

(p<0.05), désigne effet significatif *.

(p<0.01), désigne effet très significatif ** (comparaison avec le témoin) ou

^##

(comparaison avec

le MTX).

(22)

Chapitre I. Le méthotrexate

Les antimétabolites sont des agents chimiothérapeutiques cytotoxiques dont les premiers ont été découverts voici plus de 50 ans. Les antimétabolites se définissent comme interférants avec la synthèse des constituants de l’ADN. Ce sont des analogues structuraux d’une part, des bases puriques et pyrimidiques et d’autre part, des coenzymes foliniques, car ces derniers interviennent dans de nombreuses étapes de la biosynthèse purique et pyrimidique (Ameli, 2011). Ils sont très efficaces contre plusieurs types de cancer y compris: la leucémie, les cancers colo-rectaux, cancer de sein et de la vessie (Molin et Coquerel, 2002). Le méthotrexate (MTX) est le chef de fil des antimétabolites couramment utilisés. Quel patient cancéreux n’a pas reçu ou ne recevra pas le méthotrexate dans l’évolution de sa maladie ? (Ameli, 2011).

1. Présentation de la molécule

Le méthotrexate (anciennement: améthoptérine) ou acide N-[4-[[(2,4-diamino-6-ptéridinyl) méthyl]méthylamino] benzoyl]-L-glutamique, est un agent de la classe des antifolates. Sa découverte date de 1948 et fait suite à la synthèse de l’acide folique (ou vitamine B9) en 1946, dont le méthotrexate est un analogue structural

(

Lussiez C, 2010; Kaneko et al., 2016; Fekry et al., 2016). Il est composé de trois portions: ptérinique, benzoïque et celle de l’acide glutamique (Figure 1). Ce médicament intervient dans le traitement de cancer du cou, de la tête, des glandes mammaires et de l’ostéosarcome. Egalement dans l’arthrite rhumatoïde, les maladies inflammatoires réfractaires et le psoriasis (Hayashi et al., 2008; Gautam et al., 2016; Kamran et al., 2016). A haute dose le MTX est utilisé pour traiter le lymphome non hodgkinien et la leucémie lymphoïde

(

Kaneko

et al., 2016). Mais comme tout agent anticancéreux; l’utilisation de ce

médicament est accompagnée de nombreux effets indésirables aiguës tels que les vomissements, les nausées, les diarrhées, l’inflammation de la muqueuse buccale, la baisse des globules blancs, rouges et des plaquettes, ainsi que la pneumonite aiguë. D’autres sont chroniques, principalement les cirrhoses hépatiques et les néphropathies (Ureyen et al., 2013; Liu et al., 2015).

Figure 1. Structure chimique du méthotrexate (David Dago N’Da, 2004).

(23)

2. Données pharmacocinétiques

2.1. Absorption : L’absorption du MTX administré par voie orale semble dépendre de la dose. Par cette voie, il devient partiellement inactif dans le tube digestif et le foie, ce qui signifie que sa biodisponibilité est faible. Les concentrations sériques maximales sont atteintes en une heure ou deux. En général, le MTX est complètement absorbé à la suite de l’administration parentérale et, après l’injection intramusculaire, les concentrations sériques maximales surviennent dans un délai de 30 à 60 minutes et la biodisponibilité est d’environ 90 % (Lussiez, 2010; Operacz et Przytocka, 2014; Eljamaly, 2014).

2.2. Distribution : Le MTX est une petite molécule (PM 454 Da) qui circule majoritairement sous forme liée à l’albumine (50-80 %) ou libre. Son volume de distribution est évalué à 0,76 l/kg avec une diffusion principalement dans l’espace extracellulaire mais avec la capacité de pénétrer les membranes cellulaires et, à haute dose, la barrière hématoméningée. Le MTX pénètre dans les cellules par l’intermédiaire des transporteurs de folates réduites, et se trouve ainsi en concurrence avec des folates réduits. À des concentrations sériques supérieures à 100 µmol, la diffusion passive devient une voie importante par laquelle des concentrations intracellulaires efficaces peuvent être obtenus, dans le sérum, environ 50 % du MTX est lié aux protéines. Le MTX administré par voie orale ou parentérale ne traverse pas la barrière hémato-céphalo-rachidienne aux doses thérapeutiques (Reutenauer

et al.,

2009; Jouybana

et al.,

2011; Operacz et Przytocka, 2014;

Eljamaly, 2014).

2.3. Métabolisme : Après absorption, le MTX subit un métabolisme hépatique (Figure 2), et est

transformé en polyglutamates qui peuvent être reconvertis en MTX grâce à des enzymes

hydrolases. Ces polyglutamates sont des inhibiteurs de la dihydrofolate-réductase et de la

thymidylate-synthétase. De faibles quantités de polyglutamates de MTX peuvent demeurer dans les

tissus pendant de longues périodes. Une petite quantité du médicament peut être métabolisée en 7-

hydroxyméthotrexate (7-OH-MTX) par hydroxylation en C7 sous l’action de l’aldéhyde oxydase au

niveau du foie (Figure 2) (Mikkelsen et al., 2011). Ce métabolite représentant moins de 10% du

médicament excrété, il entre en compétition avec le MTX pour le transport intracellulaire et

l’excrétion rénale. L’autre principal métabolite du MTX, l’acide 2,4-diamino-N10-méthylptéroïque

(DAMPA), non toxique, représente moins de 5 % du médicament excrété dans les urines. Il est

formé par hydrolyse du MTX par des carboxypeptidases bactériennes après sécrétion biliaire du

MTX dans le tractus gastro-intestinal. Le MTX est également métabolisé au niveau intracellulaire,

notamment dans les cellules néoplasiques et les hépatocytes.

(24)

Dans la cellule, le MTX fixe un ou plusieurs résidus glutamates sous l'influence de la folyl- polyglutamate synthétase (FPGS) (jusqu’à 6 ou 7 résidus) sur le carboxyl en position gamma du méthotrexate, ce processus favorise l'inhibition de la synthèse de novo des purines (Hayashi

et al.,

2008; Mikkelsen et al., 2011; Eljamaly, 2014).

Figure 2. Métabolisme hépatique du méthotrexate (A) avec la formation du métabolite (B) portant un – OH en 7 (entouré sur la figure) (Lussiez, 2010).

2.4. Elimination : La demi-vie terminale du MTX est d’environ 3 à 10 heures dans le cas des patients traités par le MTX pour un psoriasis ou une polyarthrite rhumatoïde. Chez les patients recevant des doses élevées de MTX, la demi-vie terminale est de 8 à 15 heures (Jouyban

et al.,

2011; Operacz et Przytocka, 2014 ). L’excrétion du MTX se fait essentiellement par voie rénale.

Elle dépend de la dose et de la voie d’administration. 80 à 90 % d’une dose administrée par voie parentérale est excrétée inchangée dans les urines en moins de 24 heures. L’excrétion par la bile est limitée, ne correspondant qu’à 10 % ou moins de la dose administrée.

L’excrétion rénale se fait par filtration glomérulaire et sécrétion tubulaire active (Jouyban et

al., 2011; Kaneko et al., 2016). Le MTX et le 7-OH-MTX sont mieux éliminés en milieu alcalin, et

un pH < 7 peut contribuer à une précipitation de ces composés dans les urines, en partie

responsables de la néphrotoxicité. La vitesse de la clairance du MTX varie grandement et diminue

généralement aux doses élevées ce qui a été identifié comme l’un des principaux facteurs

responsables de sa toxicité. Certains ont émis l’hypothèse que la toxicité du MTX pour les tissus

normaux dépendrait d’avantage de la durée d’exposition au médicament que de la concentration

maximale atteinte (Eljamaly, 2014).

(25)

3. Mécanisme d’action

La principale cible pharmacologique de l'action du MTX est l'inhibition compétitive du dihydrofolate-réductase (DHFR), enzyme intracellulaire qui réduit le dihydrofolate en tétrahydrofolate en présence de NADPH qui sera oxydé en NADP+ (Kumar et al., 2014 ; Hess et Khasawneh, 2015), et intervient comme intermédiaires dans plusieurs voies biochimiques importantes, parmi lesquelles la biosynthèse à novo des purines et de la thymidylate (Fodor et al.,

2016; Gautam

et al., 2016 ), l'inhibition de DHFR conduit à épuiser les cellules en tétrahydrofolate et à arrêter la production de thymidylate( Hess et Khasawneh, 2015). Le manque de folates réduits, des purines et de la thymine dans les cellules qui prolifèrent activement, telles que celles des tumeurs, conduit à un blocage de l'ADN et de la synthèse de l'ARN, et éventuellement à la mort cellulaire (Dago N’Da, 2004) (Figure 3).

Figure 3. Mode d’action du méthotrexate après pénétration cellulaire.

Son action est directe sur la DHFR et, par suppression de la production de FH4, il agit de façon indirecte sur la thymidilate synthétase, en empêchant la formation de son substrat (Lussiez, 2010).MTX : méthotrexate , DHFR : dihydrofolate-réductase, FH2 :acide folique, FH4 : acide folinique , TMP: thymidine monophosphate, UMP :

uridine monophosphate.

(26)

Chapitre II. Toxicité pulmonaire et rénale du Méthotrexate 1. Toxicité pulmonaire du méthotréxate

1.1. Rappel anatomopathologique des poumons

Les poumons font partie des organes du système respiratoire, qui occupent la totalité de la cavité thoracique sauf sa partie centrale, le médiastin. Chaque poumon est divisé en lobes par des scissures; le poumon gauche en deux lobes (550g) et le poumon droit en trois lobes (650g) (Figure 4). La surface pulmonaire est recouverte d’une séreuse viscérale appelée plèvre viscérale, et la paroi thoracique est tapissée de la plèvre pariétale, constituée de feuillets produisant le liquide pleurale.

Figure 4. Anatomie des poumons (AFPIE, 2012).

Les poumons sont constitués principalement de tissu élastique et contiennent des conduits issus de l’arbre bronchique, dont les plus petits se terminent par des grappes d’alvéoles pulmonaires, où ont lieu les échanges gazeux sur une surface d’environ 80m

²

de parois alvéolaires.

Les poumons assurent la ventilation pulmonaire ; où l’air doit entrer et sortir de ces derniers pour

que les gaz présents dans les alvéoles pulmonaires soient renouvelés. Dans les poumons aussi

s’effectue la respiration externe par des échanges gazeux entre ces alvéoles et les capillaires

pulmonaires qui les entourent; et cela par diffusion simple à travers la membrane alvéolo-capillaire,

l’oxygène (O

2

) passant des alvéoles au sang et le gaz carbonique(CO

2

), du sang aux alvéoles

(Elaine, 2008).

(27)

Les poumons peuvent être atteints par: une inflammation (Bronchite pulmonaire aigüe ou chronique, Asthme), une infection bactérienne (alvéolite pulmonaire, abcès), par une tumeur bénigne (kyste) ou maligne (cancer bronchopulmonaire) (Larousse, 2003) et aussi par la fibrose pulmonaire; qui est une affection respiratoire chronique, irréversible caractérisée par un épaississement du tissu pulmonaire (Wilson et Wynn, 2009; Chow et

al., 2016). Les fibroses

pulmonaires ont parfois une cause connue : tels que l’action d’un toxique (médicament). Mais bien souvent, aucune cause n’est décelable; appelée fibrose idiopathique (Chow et al., 2016).

1. 2. Mécanismes de toxicité pulmonaire

De nombreuses études ont montré que le méthotrexate pouvait être toxique au niveau pulmonaire; sa toxicité a été rapportée pour la première fois durant le traitement de la leucémie de l’enfant en 1969 (Kawami

et al., 2015). Environ 1 % à 7 % des patients recevant un traitement MTX développera des effets secondaires pulmonaires doses- dépendants lors de l’utilisation à long

terme, comme l’insuffisance respiratoire aigüe ou subaigüe, toux improductive, dyspnée, des pneumopathies interstitielles, infectieuses ou immuno-allergiques. Des cas de fibroses pulmonaires ont été également rapportés et considérés comme la manifestation la plus dominante de la toxicité pulmonaire (Jakubovic et al., 2013; Kalemci et al., 2015; Kurt et al., 2015).

Bien que les raisons de la toxicité au niveau des poumons ne sont pas claires, plusieurs mécanismes

de la pathogénie des pneumopathies induits par le MTX ont été proposés y compris des réactions

d’hypersensibilité, la suppression immunitaire qui conduit à des infections virales ou bactériennes récurrentes. Egalement le MTX peut avoir un effet toxique direct sur les parois de l’épithélium alvéolaire, il induit également l’augmentation de l’apoptose et la fibrose du tissu pulmonaire (Jakubovic et al., 2013)..

Des études expérimentales récentes, ont montré que le MTX peut provoquer une toxicité

pulmonaire aigüe (liée à la production des radicaux libres oxygénés et à l’augmentation de la

sécrétion de cytokines tels que le TNF-alpha (facteur de nécrose tumorale) et l’interlukine-1 (IL-1),

l’interleukine-8 (IL-8) et la protéine chimiotactique monocytaire-1. Les doses toxiques du MTX,

augmentent la sécrétion excessive des cytokines pro-inflammatoires ainsi que le MDA

(Malondialdéhyde), principal marqueur de la péroxydation lipidique, qui conduit à des dommages

dans le tissu pulmonaire, ce qui explique l’intervention du stress oxydant dans la toxicité

pulmonaire du MTX. La production d’IL-1beta et de TNF-α augmente la toxicité pulmonaire en

provoquant une pneumonie par induction de la sécrétion d’IL-8 dans les voies aériennes. Le TNF-α

active non seulement les ROS mais également la caspase-3 induisant ainsi une apoptose excessive

qui conduit à des lésions tissulaires (Kurt et al., 2015).

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Les myeloperoxydases (MPO), enzymes sécrétées à partir des monocytes et des neutrophiles et activés en réponse à une augmentation du stress oxydatif. Ces enzymes mènent aux dommages du tissu pulmonaire en activant les métalloprotéinases matricielles (MMP) par l’intermédiaire du substrat qu’ils forment. Cette même expérience montre l’élévation des MPO après traitement avec le MTX conduisant à des toxicités pulmonaires (Kurt et al., 2015).

L’administration d’une manière systémique du MTX augmente l’adénosine, considéré comme puissant médiateur endogène impliqué dans la régulation des processus inflammatoires en contrôlant les fonctions des polymorphonucléaires neutrophiles, les macrophages ou encore les lymphocytes. Les concentrations élevées d’adénosine conduisent à l’augmentation des taux de cytokines telles que l’IL-1b et IL-13 impliqués dans l’activation des voies profibrotiques. Ces effets ont été bien corrélés avec l’augmentation de la concentration de myofibroblastes et de (pro)- collagène et soutiennent l’hypothèse que la production excessive d’adénosine pourrait contribuer au développement d’une fibrose pulmonaire (Schaller et al., 2010).

Une autre étude récente,

réalisée sur des rats wistar traités par le méthotrexate à (10 mg/kg/jour) pendant 3 jours a permet d’obtenir des résultats intéressants en ce qui concerne les variations des paramètres sériques révélant la toxicité pulmonaire chez le groupe d’animaux ayant reçus le MTX ; où les auteurs ont constatés une élévation significative des taux d’alanine aminotransférase (ASAT) et d’aspartate aminotransférase (ALAT), des enzymes oxydants à savoir les myeloperoxydases (MPO) et de monoxyde d’azote (NO). De plus, l’activité des enzymes antioxydantes: la glutathion peroxydase (GPx) et la superoxydedismutase (SOD) a été considérablement réduite. D’autre part en ce qui concerne les altérations histopathologiques, l’administration du MTX provoque une inflammation interstitielle lymphoïde, la fibrose interstitielle, l’hyperplasie de pneumocytes type 2 et l'infiltration d'éosinophiles dans le tissu pulmonaire (Kalemci et al., 2015).

Kim

et al, ont indiqués que l’exposition au MTX, conduit à l’activation de la voie de MAPK

(Mitogen-activatedprotein kinases) et la voie AKT. L’activation de ces deux voies peut alternativement activer les facteurs de transcription et le facteur nucléaire kB, qui sont cruciaux pour le règlage de processus inflammatoire. Les cellules inflammatoires qui subissent une infiltration tissulaire, sont reconnues par leur capacité à endommager l’ADN ; à travers l’activation du système oxydant enzymatique comme le MPO. Dans cette étude une augmentation du taux d’infiltration des cellules inflammatoires a été observée dans le tissu pulmonaire des rats traités par le MTX (Kim et al., 2009; Kalemci et al., 2015).

Ohbayashi et al (2014), ont effectués une étude in vitro ; sur cellules en culture et in vivo ; sur des

souris, en vue d’élucider l’intervention des cellules épithéliales alvéolaires dans l’induction de la

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fibrose pulmonaire

via

l’EMT (epithelial-to- mesenchymal transition). L’EMT est définie comme un changement morphologique des cellules épithéliales polarisées d’un phénotype épithélial à un phénotype mésenchymateux dans un processus caractérisé par la réduction des jonctions cellule- cellule, le réarrangement cytosquelettique, l’augmentation de la motilité cellulaire et la synthèse de la matrice extracellulaire. Durant ce processus, les cellules épithéliales perdent leur phénotype épithélial par diminution de l’expression de l’E-cadherine, et acquièrent des marqueurs mésenchymateux incluant le α-SMA (actine de muscle lisse α), la vimentine et la fibronectine (Figure 5). Les cellules épithéliales vont aussi secréter des métalloprotéinases matricielles (MMP).

L’analyse à la RT- PCR sur les cellules A549, montre que le MTX induit une augmentation significative des niveaux d’expression de l’ARN

m

de l’IL-6 et de TGF-β1; ce dernier est considéré comme molécule importante dans la régulation du processus de transition (EMT) et l’acquis des cellules épithéliales alvéolaires le phénotype mésenchymateux ainsi que dans la fibrogenèse pulmonaire. Cette régulation positive de l’expression des deux cytokines IL-6 et de TGF-β1 joue un rôle primordial dans le développement de la fibrose pulmonaire. D’après ces résultats les auteurs ont constatés que l’EMT est en partie une étape importante pour l’induction de la fibrose pulmonaire par le MTX (Ohbayashiet al., 2014).

Figure 5. Processus de transition EMT (Epithelial to Mesenchymal Ttransition) (Gout et Huot, 2008).

2. Toxicité rénale du Méthotrexate

2.1. Rappel anatomopathologique des reins

Ces petits organes rouges foncés en forme d’haricot sont logés contre la paroi abdominale

postérieure, en position rétropéritonéale. Un rein adulte mesure en moyenne 12cm de longueur,

6cm de largeur et 3 cm d’épaisseur. Sur une coupe frontale d’un rein, on distingue trois partie,

comme le montre la figure 6. La partie la plus externe, le cortex rénal, est de couleur pâle. La

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médula rénale, de couleur rouge brun, présente un grand nombre de régions à peu prés triangulaires appelées pyramides de Malpighi. En position latérale par apport au hile se trouve une cavité aplatie en forme d’entonnoir, le pelvis rénale, ou bassinet qui communique avec l’uretère responsable de transport de l’urine jusqu'à la vessie (Elaine, 2008).

Chaque rein contient plus d’un million de minuscule structure assurant la formation de l’urine ; les néphrons qui sont les unités structurelles et fonctionnelles des reins, chacun comprend un glomérule rénal, qui est un bouquet de capillaires, d’un tube contourné proximale, de l’anse de Henlé avec une partie grêle et une partie épaisse : la branche ascendante et le tube distal (Mc campbell et al., 2014).

Figure 6. (a) photographie d’une coupe frontale d’un rein. (b) représentation schématique d’un rein en coupe frontale montrant les principaux vaisseaux sanguins (Elaine, 2008).