République Algérienne Démocratique et Populaire ةرازو
نيلعتلا يلبعلا ثحبلاو يولعلا
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique تعهبج
دوحه قيدصلا نب يحي لجيج -
Université Mohammed – Seddik Ben yahia – Jijel Faculté des sciences de la nature et de la vie
Département:Biologie Moléculaire et Cellulaire
تيلك مىلع تعيبطلا ةبيحلاو
نــــسق : تيىلخلا و تـــــيئيسجلا بيـــجىلىيبلا
Mémoire de fin d'études
En vue de l'obtention de diplôme : Master Académique en Biologie Option: Pharmacologie Expérimentale
Thème
Jury de soutenance : Président: Mme Bouhafs L.
Examinateur : Mme Kebsa W.
Encadreur: Dr.Derai E.
Présenté par :
Djaaboub Rachida Fedsi Amina Himrouche Sarah
Session : 03 Juillet 2017 numéro d’ordre :………
Evaluation de l’effet antioxydant du picolinate de chrome sur l’insulinorésistance induite par le
fructose chez le rat Wistar albinos
Nous tenons tout d’abord à remercier Dieu ALLAH le tout, puissant, qui nous a donné la force, le courage, la volonté, et la patience d’accomplir ce modeste travail.
Notre reconnaissance et profonde gratitude vont à notre encadreur Melle Derai Elhadjela (Université de Jijel) qu’elle a l’honneur d’avoir guidé et assister tout au
long de ce travail ; nous la remercie pour tous ses conseils, sa disponibilité, son Sérieux dans le travail.
Nous remercions aussi notre examinateur Mme. Kebsa Widad d’avoir accepté de juger le contenu du présent mémoire.
Nous tenons à exprimer nos grandes considérations à Mme. Bouhafs Leila, pour avoir accepté de prendre part au jury de soutenance, tout le plaisir est pour nous ; nous la remercions pour sa
grande gentillesse et sa disponibilité.
Des chaleureux remerciements pour le professeur Lahouel Mesbah, directeur de laboratoire de toxicologie moléculaire, et son ingénieur Mr Yahia (université de Jijel).
Nous remercions particulièrement Mme Bouhafs Leila pour son aide et ses compétences techniques, sa très grande disponibilité, et sa gentillesse.
Nous remercions aussi tous les collègues et l’équipe qui nous accompagne
dans le laboratoire de toxicologie moléculaire, pour leurs remarques et conseils, mais aussi pour l’ambiance amicale et studieuse qu’ils ont su créer, en particulier Melle Chbout Zineb et Mme
Khalfallah Amina (université de Jijel).
Nous ne serions bien sûr jamais arrivées là sans l’aide et le soutien de nos familles ; à nos parents et à nos frères et sueurs. Merci d’avoir soutenues dans cette voie, merci de votre présence, de vos encouragements, de vos conseils, de vos attentions constantes, merci pour tout. Nous espérons vous
rendre le bonheur que vous nous apportez.
Liste des tableaux ...iii
Introduction ... 1
PREMIERE PARTIE: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre I : L’insulino-résistance et stress oxydatif 1. L’insuline ... 3
1.1. Structure de l’insuline ... 3
1.2. Récepteur de l’insuline ... 3
1.3. Signalisation de l’insuline ... 4
1.4. Voies de signalisation de l’insuline ... 4
1.4.1. Action de l’insuline sur le transport du glucose ... 5
1.4.2. Action de l’insuline sur le métabolisme glucidique ... 6
1.4.3. Action de l’insuline sur le métabolisme lipidique ... 6
1.4.4. Autres actions ... 6
2. Insulino-résistance ... 7
2.1.Définition ... …………...7
2.2 Les altérations de l’insulinorésistance ... ………7
2.2.1 Au niveau musculaire squelettique ... ………7
2.2.2 Au niveau hépatique. ... ………7
2.2.3 Au niveau du tissu adipeux ... ………8
3 Régime riche en fructose et l’insulinorésistance ... ………9
3.1 Définition fructose ... 9
3.2 Métabolisme de fructose ... 9
3.3 La relation fructose,insulinorésistance et stress oxydant... 10
3.3.1 Fructoses et insulinorésistance ... 10
3.3.2 Fructose et stress oxydant ... 11
3.3.2.1Définition de stress oxydants ... 11
3.3.2.2 Stress oxydant induit par fructose ... 12
1. Généralités sur le chrome ... 15
1.1. Sources, besoins et apport alimentaire ... 15
1.3. pharmacocénitique du chrome ... 16
2. Action du chrome sur la réduction de l’insulinorésistance... 16
2.1. Action du chrome sur la signalisation de l’insuline ... 16
2.2. Action du chrome via la chromoduline ... 17
2.3. Action de chrome dans le métabolisme des lipides ... 17
3. Chrome et stress oxydant... 19
DEUXIEME PARTIE: ETUDES EXPERIMENTALE Matériel et méthodes 1. Matériel biologique et conditions d’élevage ... 20
2. Produits utilisés ... 20
3. Traitement des animaux ... 20
4. Prélèvementdes échantillons ... 20
4.1. Prélèvement sanguin... 20
4.2 Prélèvement des organes ... 21
5. Dosage des paramètres biochimiques ... 23
5.1 La glycémie ... 23
5.2 L’insuline ... 23
5.3 Indice HOMA-IR ... 24
5.4 Le glycogène. ... 24
5.6 le bilan lipidique ... 25
5.6.1 Le cholestérol total ... 25
5.6.2 Les triglycérides ... 25
5.7. Bilan rénal ... 26
5.7.1. Dosage de la créatinine ... 26
5.7.2 La clairance ... 26
5.7.3 Dosage de La gamma-glutamyl transférase (ᵞ -GT) ... 26
5.8 Bilan cardiaque ... 27
5.8.1. Dosage de la créatinine kinase CK ... 27
5.8.2 Dosage de la lactate déshydrogénase (LDH) ... 28
5.9. Dosage de l’aspartate aminotransférase (ASAT / TGO) ... 28
6. Dosage des paramètres du stress oxydatif ... 29
6.1. Dosage du malonyldialdéhyde (MDA) ... 29
6.2. Dosage du glutathion réduit (GSH) ... 23
6.3 Dosage de l’activité des enzymes antioxydants ... 30
6.3.1 Préparation de la fraction cytosolique ... 30
6.3.2. Dosage de l’activité de la catalase cytosolique ... 31
6. 3. 3. Mesure de l’activité de la glutathion peroxydase ... 31
6.3.4. Mesure de l’activité du superoxyde dismutase (SOD) ... 32
6.3. 4. Dosage des protéines tissulaires ... 33
7. Analyses statistiques ... ….33
1. Résultats et discussion 1. Effet du traitement sur l’evolution du poids corporel, la consommation alimentaire et hydrique…..34
1.1 Influence du traitement sur l’evolution du poids corporel………..34
1.2Evaluation de la consommation alimentaire et hydrique ... 35
2.evaluation du traitement sur le métabolisme glucidique……….37
2.1 Variation de la glycémie à jeun chez les rats ... 37
2.2 Evaluation de la tolérance au glucose (HGPO) ... 38
2.3 Variation de l’insulinémie chez les rats ... 40
2.4 Evaluation de l’insulinorésistance ... 41
2.5 Effet de picolinate de chrome sur le taux de glycogène dans le foie ... 42
3. L’effet de picolinate de chrome sur le profil lipidique ... 43
4. Effet de la supplémentation du picolinate de chrome sur le bilan hépatique ... 45
5. Effet de la supplémentation du picolinate de chrome sur le bilan rénal ... 47
6. Effet de la supplémentation du picolinate de chrome sur le bilan cardiaque ... 49
7. Effet de la supplémentation du picolinate de chrome sur les paramètres de stress oxydatif .... 51
7.1 Peroxydation lipidique de Malondialdéhyde MDA ... 51
7.2 Le taux du GSH ... 53
7.3 L’activité de la glutathion peroxydase ... 56
Conclusion……….64 Références bibliographiques ... 65 Annexes
Liste des figures
Figure 1 : Molécule d’insuline humaine ... 2
Figure 2 : Le récepteur de l’insuline ... 3
Figure 3 : Principales voies de signalisation par l’insuline: voies PI3 kinase et MAP kinase ... 4
Figure4:Mécanismes moléculaires responsables de l’insulinorésistance... 7
Figure 5 : métabolisme de fructose ... 8
Figure 6 : La résistance à l’insuline diminue l’activité de l’AMPK, augmente L’effet délétère du métabolisme du fructose, entraînant une déplétion en ATP ... 9
Figure 7 : Schéma des différentes formes des ROS ... 10
Figure 8 : Relation entre excès de Fructose l’insulinorésistance et stress oxydant ... 11
Figure 9: Stress oxydant et insulinorésistance : les bases moléculaires impliquées ... 12
Figure 10 : Modes d’action du chrome ... 15
Figure11:Mécanismes proposé pour l'activation de l'activité kinase du récepteur de l'insuline par la chromoduline, en réponse à une stimulation par l'insuline ... 16
Figure 12 : Protocole expérimental ... 20
Figure 13 : Variation du poids corporelle chez les groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) pendant 6 semaines ... 31
Figure 14 : La variation de la consommation journalière de nourriture et d’eau chez les groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) ... 32
Figure 15 : Variation de la glycémie à jeûne (mg/dl) chez les rats groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) ... 34
Figure 16 : Evolution de la tolérance au glucose chez les groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) ... 35
Figure 17 : Variation de l’insulinémie chez les trois groupes (T, Fr et Fr+Cr) ... 36
Figure 18 : Variation de indice HOMA chez les trois groupes (T, Fr et Fr+Cr) ... 37
Figure 19 : Variation du taux de glycogène chez les trois groupes (T, Fr et Fr+Cr) ... 38
Figure 20 : Variation de la concentration sérique des paramètres lipidiques des groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) après 6 semaines d’expérimentation ... 40
Figure 21 : Variation de l’activité de TGO et TGP des groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) après 6 semaines d’expérimentation ... 41
Figure 22 : Effet de picolinate de chrome sur la peroxydation lipidique de l’ MDA chez groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) ... 46
Figure 23 : Effet de picolinate de chrome sur le taux de GSH chez groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) ... 48
Figure 24 : Effet de picolinate de chrome sur l’activité enzymatique de GPx chez groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) ... 50.
Figure 25 : Effet de picolinate de chrome sur l’activité enzymatique de la catalase chez les groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) ... 53
Figure 26: Effet de picolinate de chrome sur l’activité enzymatique de la Superoxyde Dismutase chez les groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) ... 56
Liste des tableaux
Tableau 01 : Variation de la concentration sérique et urinaire des paramètres rénaux des
groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) après 6 semaines d’expérimentation ... 48 Tableau02 : Variation de la concentration sérique des paramètres cardiaques des groupes (T), (Fr) et (Fr+Cr) après 6 semaines d’expérimentation ... 49
Liste des abréviations
Akt : Sérine-thréonine kinase ANC : Apport nutritionnel conseillé AMP: Adénosine-5-monophosphate Cr : Chrome
Cu : Cuivre CAT : Catalase
CRP : Protéine C-Réactive
EAO : Espèces Activées de l’Oxygène ERA : Espèces Réactives Activées
ERK : Extracellular signal-regulated kinase ERO : Espèces Réactives de l’Oxygène FK : FructoKinase
GPx : Glutathion Peroxydase GSH : Glutathion Réduit GTF: Glucose Tolerance Factor GluT4: Glucose Transporter
GRB-2: Growth factor Receptor-Bound Protein- 2
HFCS: High fructose corn syrup HDL: Lactate déshydrogénase
HMGCoA réductase : Hydroxyméthylglutaryl- Coenzyme A réductase
IGF-1R: Récepteur à l’Insulin-like Growth Factor1
IRS: Insulin Receptor Substrate IL-6: Interlukine-6
LMWCr: Low-Molecular-Weight-Chromium- binding substance
LDL: Lipoprotéine de basse densité (Low Density Lipoprotein)
LPL : Lipoprotéine Lipase LHS: lipase hormono-sensible
MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase NO: Monoxyde d’azote
NO°: l’Oxyde nitrique OHº: l’Hydroxyle
PDK1: Phosphoinositide Dependent Kinase-1 PKB: Protein Kinas B
PKC: Protein Kinase C
PI3K: Phosphadil Inositol-3-Kinase PtdIns : Phosphatidil inositol
Ras : Protéine intermédiaire de la cascade de phosphorylation
ROS: Reactifs Oxygen species SHP-2: Src Homology Phosphate-2 SOD: Superoxyde Dismutase
TBARS : Substances Réactives de l'Acide ThioBarbiturique
TNF- α : Facteur de nécrose tumorale alpha TUG: Tether containing a UBX domain for GLUT4
TMB: Tetra methyl benzidine VLDL:Very Low Density Lipoprotein
8-OH-dG: la 8-O-Hydroxy-2’-déoxyGuanosine
1
Le diabète est une maladie endocrinienne ubiquitaire qui touche environ 9 % de la population mondiale (King et al., 1998).On distingue plusieurs types du diabète dont les types 1 et 2 sont les plus répondues. Le diabète de type 1 est lié à une carence de la sécrétion d’insuline, et apparaît généralement chez l’enfant et l’adolescent. Son traitement repose sur l’insulinothérapie. D’autre part, le diabète de type 2 représente 85 à 90 % de la population diabétique, résulte de troubles de l’insulinosécrétion associés à une insulinorésistance, apparaît en général vers la quarantaine (Sy et al., 2008)
L’insulinorésistance est un état qui se caractérise par une réponse biologique diminuée des tissus périphériques à la sécrétion d’insuline. Bien que l’effet de l’insuline sur les cellules cibles soit multiple, le terme d’insulinorésistance se réfère presque exclusivement à l’effet de l’insuline sur le maintien de l’homéostasie du glucose (Del Prato, 1999).Au début, cette résistance est compensée par un hyperinsulinisme, ce qui permet de préserver la tolérance au glucose.
Une augmentation de la concentration en insuline augmente la production des radicaux libres, induit un stress oxydant, et active les voies métaboliques génératrices d’ERO, ce qui en retour aggrave à la fois l’action et la sécrétion d’insuline, et, de ce fait, accélère l’installation du diabète de type 2 (Bloch-Damti ; Bashan, 2005).
Le traitement de cette maladie constitue une des plus grandes préoccupations scientifiques à travers le monde. Ces dernières années, les scientifiques se sont intéressés par l’étude de certains oligoéléments en raison de leur pouvoir thérapeutique en tant que traitement complémentaire afin de répondre aux besoins des patients.
Parmi les micronutriments également d’intérêt, le picolinate de chrome, oligoélément essentiel, largement décrit pour son rôle potentialisateur de l’insuline (Anderson, 1997a). Le mode d’action de ce dernier passe par une augmentation du nombre de récepteurs de l’insuline, une modification de la liaison insuline/récepteur, une augmentation de l’internalisation de l’insuline (Anderson, 1998) et une activation de la translocation des transporteurs du glucose (Roussel et Favier, 2009).
On plus que le picolinate de chrome a un rôle potentialisateur de l’insuline, récemment, il a été suggéré qu’il pouvait avoir aussi des propriétés antioxydantes. Il devrait, de ce fait, prendre une large part à la prévention nutritionnelle de l’étape prédiabétique (l’insulinorésistance) et le diabète de type 2. Jusqu’à présent aucune étude en Algérie a été faite sur le rôle du chrome trivalent dans le développement des maladies métaboliques (l’obésité, le diabète type 2 et le syndrome métabolique) et comment ce dernier peut empêcher l’évolution et la progression du diabète type 2.
2
Au vu de ces données, l’objectif de notre travail est d’évaluer expérimentalement l’action potentialisatrice et antioxydante du picolinate de chrome sur l’insulinorésistance provoquée par le fructose chez des rats de souche wistar par : l’étude de l’effet de ce dernier sur la fonction hépatique, rénale et cardiaque à travers la réalisation d’un bilan complet sérique et tissulaire.
3
Chapitre 1 :L’insulinorésistance 1. l’insuline
Le maintien de l’homéostasie glucidique est primordial au bon fonctionnement de l’organisme. Il est assuré par différents signaux endocriniens, métaboliques ou nerveux. À jeun, le glucagon, les glucocorticoïdes, les catécholamines et certaines hormones telles que l’hormone de croissance permet de maintenir l’homéostasie glucidique, grâce à leur action hyperglycémiant. Lors d’une prise alimentaire, le glucose est absorbé par le tractus digestif : une hyperglycémie est alors détectée dans la veine porte hépatique (Burcelin, 2000) et plusieurs mécanismes entrent en jeu pour rétablir rapidement une glycémie normale.
L’insuline est alors la principale hormone impliquée dans cette régulation.L’insuline est la seul hormone hypoglycémiante connue (Talbert et al., 2011). Elle produite par les cellules β des îlots de Langerhans du pancréas. L’insuline n’est pas qu’une hormone hypoglycémiante mais agit aussi en tant que facteur de croissance (Andreellier et al., 2006).
1.1. Structure de l’insuline
L’insuline est un polypeptide du poids moléculaire d’environ 6kDa, dont la structure primaire est très conservée entre les espèces. Il s’agit d’un hétérodimère composé de deux sous-unités, la chaîne A et la chaîne B, reliées entre elles par deux ponts disulfures. Chez l’homme, la chaîne A est formée de 21 acides aminés et la chaîne B en comporte 30. Un pont disulfure relie entre eux les acides aminés 6 et 11 de la chaîne A (Figure 1).
Figure 1: Structure primaire de l’insuline humaine (Magnan et Ktorza, 2005).
4 1.2. Récepteur à l’insuline
Le récepteur à l’insuline appartient à la superfamille des récepteurs aux facteurs de croissance à activité tyrosine kinase, dont fait partie le récepteur à l’insulin-likegrowth factor- 1 (IGF-1R). Il existe sous deux isoformes, A et B, qui diffèrent respectivement par l’absence ou la présence d’une séquence de 12 résidus suite à l’épissage alternatif d’un exon du gène codant le récepteur à l’insuline. Le récepteur est formé de deux chaînes α extracellulaires reliées par des ponts disulfures à deux chaînes β transmembranaires (Figure 2). Chaque chaîne α possède un domaine complet de liaison à l’hormone. La sous-unité β est constituée par un domaine transmembranaire hélicoïdal suivi d’un domaine juxtamembranaire contenant un domaine catalytique tyrosine kinase (Youngren, 2007 et Jensen, 2009).
Figure 2 : Le récepteur de l’insuline (Bowen, 2009).
1.3. Voies de signalisation de l’insuline
On distingue plusieurs voies de signalisation induites par l’insuline dont la voie de la PI3K et la voie de la mitogen-activated protein kinase (MAPK). La PI3K est le principal élément des actions métaboliques dépendantes de l’insuline. Leur L’activation entraîne la phosphorylation de Akt/PKB (protein kinase B) et PKC (protein kinase C) responsables de la transmission de la signalisation de l’insuline. La voie MAP kinase, elles jouent un rôle important dans de nombreux événements de signalisation intracellulaire, croissance et différenciation cellulaire (Steinberg, 2008). Après phosphorylation des IRS, les protéines GRB-2, SOS sont recrutées et agissent avec SHP-2 pour activer Ras, protéine intermédiaire de la cascade de phosphorylation permettant le recrutement d’ERK (Extracellular signal- regulated kinase) et la phosphorylation de facteurs de transcription activant ainsi l’expression de différents gènes (Rains, 2011 et Pirola, 2004) (Figure 3).
Extracellulaires
Cytoplasmique
5
Figure 3 : Principales voies de signalisation par l’insuline: voies PI3 kinase et MAP kinase (Capeau, 2003).
1.4. Implication de l’insuline dans le métabolisme 1.4.1. Action de l’insuline sur le transport du glucose
Les transporteurs du glucose GLUT4 ont un rôle central dans le contrôle de l’homéostasie glucidique. Leur translocation dépend en effet largement du rôle de l’insuline, bien que d’autres
« Pools » de GLUT 4 puissent être mobilisés par l’exercice musculaire (Pereira, 2004). Dans le cytoplasme, les vésicules contenant les GLUT4 sont maintenues dans la région périnucléaire par des protéines d’ancrage de type TUG (Tethercontaining a UBXdomain for GLUT4) (Bogan, 2003). Dans les tissus insulino-sensibles, l’insuline permet le recrutement dose-dépendant des GLUT4 d’un pool intracellullaire vers la membrane plasmique.
En condition basale, les GLUT1 assurent le transport du glucose nécessaire au fonctionnement cellulaire, 90 % des GLUT4 se trouvant dans le cytoplasme. En réponse à l’insuline, les GLUT4 sont recrutés et leur nombre à la surface de la membrane plasmique est augmenté. Le nombre de GLUT1 présents dans la membrane plasmique est quant à lui inchangé sous l’action de l’insuline (Stuart, 2009). Deux voies de signalisation à l’insuline entrent en jeu dans la translocation des GLUT4 vers la membrane plasmique : la première permet la levée du signal qui maintient les vésicules au niveau de leur site de rétention
6
cytoplasmique et la seconde permet la migration des vésicules le long des microfilment d’actine F, polymérisés en réponse à l’insuline (Ishiki, 2005).
1.4.2. Action de l’insuline sur le métabolisme glucidique
Le rôle de l’insuline sur le métabolisme du glucose s’exerce principalement dans le foie et le muscle squelettique. Dans la première, elle stimule l’utilisation et le stockage du glucose sous forme de lipides et de glycogène. Dans les hépatocytes, l’insuline est contrôlée négativement la voie de gluconéogenèse (Cano et al., 2006), en agissant directement sur son récepteur hépatique ou indirectement en diminuant la quantité d’acides gras libres dans la veine porte. Elle permet également l’augmentation de la lipogenèse à partir du glucose ainsi que la synthèse de glycogène par activation du glycogène synthase. Dans le muscle squelettique, l’insuline augmente l’expression de l’hexokinase II ce qui augmente la phosphorylation du glucose et diminue ainsi la quantité de glucose libre intracellulaire,.
(Saltiel et Khan, 2001).
1.4.3. Action de l’insuline sur le métabolisme lipidique
L’insuline agit sur le stockage, la mobilisation et l’utilisation des acides gras en activant la lipogenèse et en stimulant l’expression des enzymes de synthèse de lipides. Elle inhibe la captation des acides gras libres plasmatiques dans le muscle squelettique, le cœur et le foie. Dans les adipocytes, elle contrôle la sécrétion de la lipoprotéine lipase, qui active dans le sang la dégradation des triglycérides (TG) en acides gras et en glycérol (Saltiel et Khan, 2001).
1.4.4. Autres actions de l’insuline
En plus de ses actions sur le métabolisme lipidique et glucidique, l’insuline intervient dans le métabolisme des acides aminés (Proud, 2006). Elle stimule l'absorption des acides aminés dans les cellules, inhibe la dégradation des protéines et favorise leur synthèse (Saltiel et Kahn, 2001).
7 2- Insulinorésistance
2.1 Définition
Il est définie par une réduction de l’effet de l’insuline endogène ou exogène sur ses nombreux tissus cibles (Andreellier et al,. 2006). L’insulinorésistance se caractérise par la mise en place d’une hyperinsulinimie qui permet dans un premier temps d’assurer la tolérance au glucose. On parle parfois d’état « pré-diabétique », car l’insulino-résistance est longtemps silencieuse : son retard au diagnostic est estimé entre 5 et 7 ans (Henri, 2011).
2.2 les altérations de l’insulinorésistance 2.2.1 Au niveau musculaire squelettique
Sur le plan musculaire, l’insulinorésistance résulte d’un déficit de stockage du glucose sous forme de glycogène par la glycogène synthèse (Petersen et al,. 2002). L’entrée de glucose dans l’espace intracellulaire se fait en partie par les transporteurs GLUT (GLUT-1 à GLUT-7), mais dans le muscle squelettique, l’insuline induit un recrutement transmembranaire du transporteur GLUT-4 (Bryant et al,. 2002; Chang et al,. 2004; Saltiel et Khan., 2001). Il a été démontré chez les personnes en surpoids présentant une résistance à l’insuline, un défaut de localisation subcellulaire de GLUT-4 (Garvey et al,. 1998) et une déficience de l’action de translocation de l’insuline
(Defronzo, 1988, Shepherd et al,. 1999).
2.2.2 Au niveau hépatique
Au niveau hépatique, l’autorégulation entre les différents flux, de la glycolyse, de la néoglucogenèse, de la glycogénolyse ou de la glycogenèse, est altérée par l’insulinorésistance.
(Boden, 2004). L’insulinorésistance augmente la production hépatique de glucose en diminuant la capacité de l’insuline à inhiber la glycogénolyse et la néoglucogenèse (Leverve, 2009). De nombre de récepteurs à l’insuline présents sur la surface cellulaire serait diminué par une dégradation accrue des récepteurs à l’insuline associés à l’hormone. L’activation de tyrosine-phosphatases a également été proposée car elle serait responsable de la désactivation des récepteurs à l’insuline et des protéines IRS (Basciano et al., 2009).
L’insulinorésistance ayant une relation étroite avec la stéatose hépatique à la libération des acides gras libres par le tissu adipeux. Ces acides gras représentent les principaux substrats pour la synthèse hépatique des TG, ce qui explique l’association étroite entre le taux des TG et l’insulinémie (Oudi et al,. 2009).
8 2.2.3 Au niveau du tissu adipeux
La translocation du transporteur GLUT-4 décrite dans les cellules musculaires squelettiques responsable du transport du glucose dans le cytoplasme se retrouve également au niveau des adipocytes (Saltiel et Kahn, 2001). Une augmentation de l’expression des ARNm de GLUT4 est induite par l’insuline (Valverde et al., 1999 ; Hernandez et al.,2003).
En conditions physiologiques, l’insuline exerce un effet anti-lipolytique sur le tissu adipeux, mais dans le cas du insulinorésistace , où l’on observe une résistance à l’action de l’insuline, il se produit une augmentation de la libération d’acides gras libres dans le secteur plasmatique (Verges,2005) (Figure 4).Cependant, cette perte de sensibilité à l’insuline peut être réversible chez les sujets insulinorésistance après diminution de leur quantité de tissu adipeux à la suite d’exercices physiques ou d’une restriction calorique (Coker et al., 2009).
Figure 4 : Mécanismes moléculaires responsables de l’insulinorésistance (Andreelli et al ., 2006).
9 3 Régime riche en fructose et l’insulinorésistance 3.1 Définition du fructose
Le fructose est un monosaccharide de formule C6H12O6 (Rossi, 1998).est rapidement absorbé dans les intestins (Berneis et al., 2006). Elle être métabolisé dans le foie, où il est converti en glucose, glycogène, lactate et acides gras (Tran et al., 2012).Les sources naturelles de fructose libre sont les légumes et surtout les fruits. Certains étant plus riches (pomme, poire, raisin, banane, kiwi et pèche) que d’autres (orange, citron), Le fructose rajoute à l’alimentation, est fourni par les sirops de maïs (High fructose corn syrup-HFCS) ou d’autres céréales (Lecerf, 2009).
3.2 Métabolisme du fructose
Le fructose appelé aussi lévulose (Lecerf, 2009). Il est transportée au niveau de l’entérocyte (intestinal) par le transporteur GLUT5, à partir de l’intestin, il est dirigé vers le foie par la veine porte, il y est totalement métabolisé via une voie métabolique distincte de celle du glucose (Halimi et al., 2010).
Dans le foie le fructose est initialement dégradé en triosephosphate, pour être ensuite soit oxydé dans le cycle de Krebs, soit relâché dans la circulation sous forme de lactate, soit converti en glucose ou en glycogène, soit encore transformé en acides gras et en triglycérides(Le, 2008) (Figure 5). Ces réactions déroules grasse 3 enzymes spécifiques : la fructokinase (FK), l’aldolase type B et la triosekinase(Heinz et al .,1968).
10
Figure 5 : métabolisme de fructose (Touati et al., 2005).
3.3. La relation fructose, insulinorésistance et stress oxydant 3.1. Fructose et insulinorésistance
La consommation de fructose a considérablement augmenté ces dernières années, mais les données relevées sur les animaux et sur les humains révèlent de plus en plus souvent une incidence négative de la consommation élevée de fructose sur le poids, le métabolisme lipidique…..etc. (Berneis et al., 2006). Chez l’homme, une suralimentation avec des quantités importantes de fructose (200-300g/jour) entraîne une hypertriglycéridémie, un dépôt de graisses dans le foie et les muscles, et diminue la sensibilité hépatique à l’insuline (Tran et al., 2012).Donc la consommation chronique du fructose augmente l'activité lipogènique des enzymes ce qui favoriser la production hépatique des triglycérides et des particules de VLDL (VeryLowDensityLipoprotein) (Bantle, 2009). Ensuit augmente la résistance hépatique à l’insuline et une intolérance au glucose, de manière générale, en relation étroite avec le développement d’une résistance à l’insuline (Tran et al., 2012) (Figure 6).
plusieurs études montrent le développement d’une résistance à l’insuline après une suralimentation en fructose(Le, 2008).Récemment, une équipe de scientifiques de Lausanne a prouvé que chez les sujets sains, une alimentation riche en fructose (supérieure à 15٪) entraînait, au bout de six jours, une dyslipidémie et une résistance à l’insuline du foie et des tissus adipeux (Berneis et al., 2006).Une autre étude réalisées en 1955, avec des alimentations
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où 62٪ glucides démontré une tolérance au glucose chez les rats, ainsi qu’une élévation de la concentration plasmatiques des triglycérides et une diminution de la stimulation de l’insuline (Rossi, 1998).
Figure 6 : La résistance à l’insuline, qui diminue l’activité de l’AMPK, augmente encore cet effet délétère du métabolisme du fructose, entraînant une déplétion en ATP (Pariente, 2010).
3.2 Fructose et stress oxydant 3.2.1Définition de stress oxydants
Le stress oxydant est communément défini comme un déséquilibre entre les systèmes oxydants qui induite soit par une production excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) ou de l’azote (ERA) (Figure7), et les capacités anti-oxydantes d’un organisme, d’une cellule ou d’un compartiment cellulaire.
Dans l’état normale, Lorsque des ERO commencent à s’accumuler dans la cellule, ils peuvent être neutralisés par des molécules de défense anti-oxydantes présentes dans la cellule comme le glutathion, les vitamine E et C, la bilirubine, l’acide lipoïque, et des enzymes comme la catalase, la superoxyde dismutase, la glutathion peroxydase (Barouki , 2006) .
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Figure 7 : Schéma des différentes forme des ROS (Haleng et al., 2007).
3.3.2 Stress oxydant induit par fructose
De nombreux marqueurs du stress oxydant sont présents chez l’animal soumis à un régime très enrichi en fructose (Halimi et al., 2012). Les régimes riches en fructose, induisent un stress oxydatif, une dysfonction mitochondriale, une augmentation de l’apoptose, de l’endotoxinémie d’origine intestinale (liée à une augmentation de la perméabilité intestinale et à une pullulation favorisée par le fructose lui-même) activant les cellules de Küpffer, du TNF α (Pariente, 2010). Ensuit Les régimes riches en fructose seraient pro-oxydants, qu’il s’agisse d’effets directs ou de potentialisation d’un stress oxydant ou inflammatoire préexistant, par exemple à la suite d’une carence en magnésium (Busserolles et al., 2003). Une autre déviation du métabolisme du fructose, en cas de charge massive, est une déviation du métabolisme des nucléotides adényliques vers la production d’acide urique. Ensuit, l’acide urique est un antioxydant endogène en partie réabsorbé par le rein, mais il peut aussi favoriser l’hyperuricémie, la goutte et la lithiase urique (Lecerf, 2009) (Figure8). De manière générale, l’altération du métabolisme glucidique est associée à une augmentation des marqueurs de peroxydation et une diminution des concentrations des vitamines antioxydants, comme la diminution de l’activité du superoxyde dismutase (Schlienger et al., 2007).
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Il faut encore relever que l’administration des sucres simples, comme le fructose, représente un stress oxydatif pour l’organisme, accompagné d’une production importante de radicaux libres.
Ce phénomène pourrait contribuer au développement d’une résistance à l’insuline (Le, 2008).finalement le régime riche en fructose induit un stress oxydant caractérisé par des taux élevés enTBARS, hydroperoxydes et carbonyles et faibles en NO au niveau du plasma et des tissus associés à une réduction de la défense antioxydante (SOD, CAT et GSH-Réd) (Mellouk et al., 2016).
Figure 8 : Relation entre excès de Fructose l’insulinorésistance et stress oxydant (Halimi et al ., 2012).
3.3 Insulinorésistance et stress oxydant
Le stress oxydant est également un facteur de l’apparition d’une insulinorésistance (Evans et al ., 2005). de manière générale, le stress oxydant participer à l’installation de l’insulinorésistance au cours de la phase prédiabétique (Barquissau et al., 2001). Car il provoque une anomalie de la signalisation intracellulaire avec une diminution de la sécrétion d’insuline et constitue un facteur d’insulinorésistance au niveau du muscle et des adipocytes
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en modifiant l’expression des transporteurs du glucose GLUT1 et GLUT4 (Schlienger et al., 2007).
En effet un stress oxydant entraîne une dérégulation des cytokines pro-inflammatoires telles que le « Tumor necrosis factor » (TNF-α), et un état d’insulinorésistance, qui peut participer à la pathogenèse des maladies cardiovasculaires (Bonnefont-Rousselot, 2013) (Figure 9).
Figure 9 : Stress oxydant et insulinorésistance : les bases moléculaires impliqués (Evans et al., 2005).
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Chapitre II : Le chrome 1 Généralités :
Le chrome est le 10ème élément le plus abondant dans le manteau terrestre (Huang et al., 2009). C'est un métal dur, d'une couleur blanc grisâtre. Son étymologie vient du grec « chroma »qui signifiant couleur, car les composés du chrome sont diversement colorés (Vaiopoulou et al., 2012). Le chrome de symbole Cr, de numéro atomique 24 et de masse atomique 52 (Viala, 1998).
, appartient au groupe VI-b de la classification périodique des éléments (Cervantes et al., 2004). Il peut se trouve sous plusieurs forme d’oxydation dont les plus répondus sont chrome trivalent (III) et le chrome hexavalent (VI).
Le Cr (VI) est toxique pour les humains, les animaux, les plantes et les microorganismes, il est associé au développement de divers troubles de santé chroniques, y compris les dommages des organes, la dermatite et l’insuffisance respiratoire(Krim, 2014).
D'autre part, le Cr (III) est relativement insoluble dans les systèmes aqueux, beaucoup moins toxique et même il est essentiel dans la nutrition humaine et animale (Xu et al., 2005). Il joue un rôle clé dans l’homéostasie glucidique via un effet potentialisateur de l’insuline (Roussel, 2009).
1.2 Les sources, besoins et apport alimentaires
De très nombreuses études ont fourni la preuve de l’efficacité de la suplémentation en chrome (III) dans le maintien de la régulation du métabolisme glucidique et lipidique, le contrôle de l’appétit, la réduction de la masse grasse et l’augmentation de la masse maigre (Zafra-Stone et al., 2007). De plus, le chrome trivalent a largement été utilisé au sein d’interventions diététiques afin d’améliorer la sensibilité à l’insuline et de limiter le gain de poids (Bagchi et al., 2007).Les aliments les plus riches en chrome sont la levure de bière, le foie, le jaune d’œuf, les épices et les noix. La plupart des aliments en contiennent moins de 10 µg/100 g. La biodisponibilité du chrome est très basse pour la viande, le lait et les légumes verts. Elle augmente pour les céréales, mais leur raffinage appauvrit considérablement sa teneur (Roussel et Hininger,2009).Des apports nutritionnels conseillés (ANC) de 50 à 70 µg/j pour l’adulte et de 125 µg/j à partir de 70 ans ont été proposés en France (CNERNA- CNRS,2001).Ces recommandations s’appuient sur l’absence de signes cliniques de carence pour un apport de 50 µg/j et sur l’absence de toxicité à 200 µg/j. Cependant, ces
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recommandations sont impossibles à atteindre pour un apport calorique de 2 500 kcal/j (Roussel et Hininger, 2009).
1.3 Pharmacocinétique du chrome
Le parcours du chrome dans l’organisme dépend de son état d’oxydation. Le taux d’absorption du chrome hexavalent est plus élevé que celui du chrome trivalent (Burdin ,2014).Cependant, ce premier est détruit et la majorité du chrome dans notre organisme est donc sous forme trivalente. L’absorption d’origine alimentaire est très faible, entre 0,5 et 2%
de la dose ingérée (Anderson et al., 1983). Une fois absorbé, le chrome est lié à la transferrine dans le sang et va se distribuer dans tout l’organisme : au niveau des os, du foie, de la rate, des poumons, des reins, des muscles et du tissu adipeux. Il peut être stocké pendant deux semaines dans les muscles et le tissu adipeux, et jusqu’à un an dans le foie et la rate.
Enfin, l’excrétion rénale est la voie principale (à 80%), suivie par l’élimination biliaire (à 10%). L’excrétion urinaire peut être amplifiée par l’apport de sucres d’absorption rapide, le stress ou l’exercice (Roussel et al., 2009).
2 Action du chrome sur la réduction de l’insulinorésistance 2.1Action du chrome sur la signalisation de l’insuline
Le chrome trivalent joue un rôle clé (Anderson, 2003 et Vincent 2000). Dans l’homéostasie glucidique via un effet potentialisateur de l’insuline. En présence de chrome, la quantité d’insuline requise pour l’utilisation cellulaire du glucose est beaucoup moins importante.
Il est actif biologiquement sous forme d'un complexe appelé « glucose tolerance factor (GTF)
». Il s'agit d'une structure moléculaire complexe qui contient deux molécules d'acide nicotinique par atome de Cr et trois acides aminés : la glycine, la cystéine et l'acide glutamique. Ce facteur joue le rôle de co-hormone de l'insuline et permet un transport vers les récepteurs cellulaires et la fixation de l'insuline sur les membranes par des ponts disulfures (Burdin, 2014). Le mode d’action du chrome passe par une augmentation du nombre de récepteurs de l’insuline, une modification de la liaison insuline/récepteur et une augmentation de l’internalisation de l’insuline (Anderson, 1998). Le chrome agit sur les réactions de phosphorylation/ déphosphorylation. La liaison de l’insuline à la sous-unité alpha du récepteur est induite par une cascade de réactions de phosphorylation dues à la tyrosine kinase qui est activée par le chrome (Roussel, 2009).
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Le chrome, parallèlement, inhibe la phosphotyrosine phosphatase qui, elle, inactive le récepteur de l’insuline (Roussel, 2009) (Figure 10).
Figure 10 : Modes d’action du chrome (Roussel et al., 2009)
Via son action sur l’insuline, le chrome est, de plus, impliqué dans le métabolisme des hormones corticoïdes, en particulier en régulant le cortisol (hua et al., 2012).
2.2 Le chrome a un mécanisme intracellulaire via la chromoduline
Un oligopeptide de liaison du chrome, la chromoduline (aussi connue en anglais sous le nom de low-molecular-weight-chromium-binding substance ou LMWCr) assurerait une fonction d’auto-amplification du système insulinique (Cotte, 2011).La chromoduline possède un poids moléculaire d’environ 1500 Da et se compose de seulement quatre types d’acides aminés, à savoir la glycine, la cystéine, le glutamate et l'aspartate (pour un ratio respectif de 2:2:4:2), les groupements carboxylates constituant plus de la moitié du total des résidus d’acides aminés (Davies et al ., 1997). La chromoduline est stockée sous sa forme libre (apochromoduline) dans le cytosol (Yamamoto et al., 1984) et le noyau des cellules hépatiques (Clodfelder et al., 2001). Malgré son faible poids moléculaire, elle peut lier jusqu’à quatre ions Cr3+ et former un assemblage tétranucléaire qui va être stabilisé par les
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liaisons ioniques entre Cr3+ et groupements carboxylates de l’oligopeptide (Davies et al., 1997 ; Jacquamet et al., 2003).Une fois saturée en chrome, la chromoduline va pouvoir se lier au récepteur de l’insuline, renforçant ainsi son activité tyrosine kinase (Davies et al., 1997).
Une augmentation des concentrations plasmatiques d'insuline induit un flux de chrome depuis le sang jusqu’aux cellules insulinosensibles. Le transport du chrome semble être assuré par la protéine transferrine (Clodfelder et al ., 2001) (Figure 11).
Figure 11 : Mécanisme proposé pour l'activation de l'activité kinase du récepteur de l'insuline par la chromoduline, en réponse à une stimulation par l'insuline (Vincent, 2000) 2.3 Action du chrome sur le métabolisme des lipides
Comme cofacteur de l’insuline, le chrome intervient également dans le métabolisme lipidique. Le déficit en chrome est associé à une hypertriglycéridémie et une diminution du HDL cholestérol (Roussel, 2009).
De plus, un effet indépendant de l’hormone a été évoqué : il semble que le chrome inhibe l’enzyme hépatique hydroxyméthylglutaryl-Coenzyme A réductase (HMGCoA réductase), enzyme clé de la synthèse du cholestérol, d’où un effet hypolipémiant (Zima et al., 1998). Cet effet hypolipémies détermine le rôle clé du chrome dans la prévention des maladies cardiovasculaires et de l'athérosclérose (Burdin, 2014).
Un nombre important de données indiquent que le chrome pourrait jouer un rôle important dans la prévention de l’athérosclérose et des maladies cardiovasculaires en
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réduisant l’accumulation de plaques d’athérome dans les artères, en abaissant le cholésterol total, le LDL-cholestérol et le taux des triglycérides (Abraham et al., 1991 ;preuss et al.,2000 ;Vinson et al., 2002 ;thirunavukkrasu et al ., 2006).
Dans une étude récente, Cefalu et al., (2010) ont rapporté une baisse de la quantité de lipides myocellulaires, ainsi qu’une amélioration de la sensibilité à l’insuline, chez des sujets insulinorésistants recevant du Cr, et ont suggéré que le Cr pourrait modifier la sensibilité à l'insuline via une modulation du métabolisme des lipides dans les tissus périphériques.
3 Chrome et stress oxydant
En favorisant le développement de l'intolérance au glucose, le déficit en chrome entraîne des réactions de glycosylations et est associé à une production accrue de radicaux libres, responsables du vieillissement cellulaire (Preuss ,1997). La relation entre oligoéléments et stress oxydant est très complexe. Elle est médiée par l’hyperglycémie, la dyslipidémie et l’inflammation. Dans la réduction du stress oxydatif, le traitement au chrome inhibe la libération de cytokines pro-inflammatoires (Hua 2012). On plus le chrome inhibait la glycosylation des protéines et la peroxydation lipidique chez les érythrocytes exposés à des taux élevés de glucose (Jain et al ., 2007) . des études in vitro, il a également été démontré que la supplémentation en chrome a entraîné une diminution des cytokines proinflammatoires (TNF-alpha, IL-6, CRP), le stress oxydatif et les taux de lipides (Jain et al., 2007) . Hazane- Puch et son équipe ont utilisé un réseau d'ADNc pour étudier la modulation de l'expression des gènes par des complexes de chrome dans les kératinocytes humains (Hazane-Puch et al., 2010).Le tableau était composé principalement d'étiquettes de séquence représentant des gènes antioxydants et de réparation d'ADN. Une régulation positive des transcriptions de la glutathion synthetase. En outre, le chrome a inhibé l'oxydation par le peroxyde d'hydrogène des thiols et la peroxydation lipidique (Hazane-Puch et al., 2010).
Ainsi, Une supplémentation en chrome permet également d’empêcher la peroxydation des lipides in vitro, d’une façon dépendante de la concentration en chrome (Yang et al., 2006). Ces données suggèrent que le chrome a son importance dans le traitement ou la prophylaxie de l’insulinorésistance et des dyslipidémies liées à l’obésité, qui génèrent un stress oxydant, donc un rôle dans la prise en charge du syndrome métabolique (Benaraba, 2007).
20 1. Matériel biologique et conditions d’élevage
Les rats utilisés dans cette expérimentation sont des rats femelles adultes de souche Wistar albinos, pesant entre 140 et 194 g, fournis par l’Institut Pasteur 0111(Algérie). Les rats sont maintenus à l’animalerie de l’université de Jijel dans les conditions standard ; à une température ambiante de 20-25°C et une photopériode de 12h/12h. Avant le début des expérimentations les rats sont nourris ad libitum avec un régime standard.
2. Produits utilisés
Dans notre travail, nous avons utilisé le fructose (20%) sous forme cristallisé dissout dans l’eau potable pour induire une insulinorésistance et le picolinate de chrome ; un supplément alimentaire sous forme de comprimé nu 208.33mg/100g à été utilisé comme traitement.
3. Traitement des animaux
Les rats ont été répartis en 3 groupes :
Groupe 1: 6 rats soumis à un régime alimentaire normal (T).
Groupe 2 : 6 rats soumis à un régime riche en fructose (20%) dans l’eau potable pendant 6 semaines(Fr) (Cancelas et al., 2008)..
Groupe 3 : 6 rats soumis à un régime riche en fructose (20%) dans l’eau potable et traité par une dose de 100 µg/kg/j de picolinate de chrome par gavage pendant 6 semaines (Fr+Cr) (Sahin et al., 2013).
La prise du poids est notée trois fois par semaine alors que le taux de consommation alimentaire et hydrique est évalué chaque jour. La glycémie à jeun est mesurée avant le début du traitement et chaque semaine pendant la période d’expérimentation.
Les urines sont collectées quotidiennement du 26éme au 34ème jour de l’expérimentation, sont recueillies et conservées à 4°C pour réaliser l’analyse de chimie des urines.
4. Prélèvement des échantillons 4.1. Prélèvement sanguin
Le sang est prélevé au niveau de l’œil par ponction dans le sinus retro-orbital sur des rats à jeun (18 heures). Le sang est mis dans des tubes secs, centrifugé à 3000 tours/minute pendant 10 minutes.Le sérum est recueilli dans des tubes Eppendorff, et conservé à -20°C en vue d’analyse des paramètres biochimiques sériques.
21 4.2. Prélèvement des organes
Après prélèvement sanguin, le foie, le cœur et les reins sont soigneusement prélevés, rincés dans une solution de chlorure de sodium, puis pesés.
Les tissus destinés aux dosages des protéines, de glycogène hépatique, du MDA, du glutathion réduit et les enzymes antioxydantes (la catalase, la superoxyde dismutase et la glutathion peroxydase) ont été maintenus immédiatement à -20°c. La figure 12 représente les différentes étapes du protocole expérimental suivi.
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18 rats femelles Albinos Wistar
Après une période d’adaptation les rats sont réparties en 3 lots
Témoin (T) Fructose (20%) (Fr) Fructose (20%)+chrome (n=6) (n=6) (100 µg/kg/j )(Fr+Cr)(n=6)
Mesure : du poids, consommation alimentaire et collection des urines
Sacrifice des animaux (Après 6 semaines du traitement)
Prélèvement et préparation du sang et des tissus
Analyse
Paramètres biochimiques Paramètres de stress
Figure 12 : Protocole expérimental
MDA GSH GPx CAT
SOD Dans le foie, le cœur et les reins
Glucose,
Insuline, Glycogène
Cholestérol, Triglycérides ASAT, ALAT LDH,
Créatine kinase Créatinine, ᵞ-GT
23 5. Dosage des paramètres biochimiques 5.1. La glycémie
La glycémie est mesurée à l’aide d’un lecteur glucomètre à bandelettes réactives (glucomètre Accu-Chek Go à bandelettes réactives) sur une goutte de sang prélevée à partir de l’extrémité caudale des animaux (sang veineux).
Généralement les glucomètres sont constitués d’une couche absorbante sur laquelle la goutte du sang est déposée, finement poreuse ou recouverte d’une membrane sur sa face interne, elle retient les globules rouges et ne laisse diffuser que le plasma vers les couches inférieures où se trouve le réactif essentiellement la glucose-oxydase (éventuellement l’héxokinase) associée à un chromogène. La coloration obtenue est mesurée par réflectométrie dans le lecteur de glycémie.
5.2 . Test de tolérance au glucose (HGPO)
Après 6 semaines, la nourriture et l’eau contenant le fructose sont enlevées et les animaux sont mis à jeûne pendant 18 h. Une solution de glucose de 4 g/kg dans 4 ml de l’eau distillé est gavée à l’aide d’une sonde intra gastrique provoquant ainsi chez les rats une hyperglycémie temporaire (N’doua et al., 2015)..
Les prélèvements sanguins sont effectués au niveau de la veine caudale à des temps réguliers :0, 30min, 60min, 90 min, 120min et 150 min. La glycémie est mesurée à l’aide d’un lecteur du glucose (glucomètre Accu-Chek Go à bandelettes réactives) (N’doua et al., 2015).
5.3 L’insuline
Le dosage de l’insuline a été réalisé selon la fiche technique (Menarini Diagnostics).Le kit insuline (Zenit) est un dosage immunoenzymatique direct en phase solide pour la détermination quantitative de l’insuline dans le sérum ou le plasma.
24
Le test Elisa insuline est basé sur la capture simultanée de l’insuline humaine de la part de deux anticorps monoclonaux, un immobilisé dans la microplaque, l’autre conjugué avec la peroxydase.
Après une période d’incubation déterminée, la séparation libre-lié s’obtient à travers un simple lavage de la phase solide. L’enzyme présente dans la partie liée catalyse la réaction entre le substrat (H2O2) et le substrat TMB, en développant une coloration bleue qui vire au jaune après ajout de la Solution d’arrêt (H2SO4). La concentration de l’insuline dans l’échantillon est calculée sur la base d’une série standard. L’intensité de la couleur développée est proportionnelle à la concentration d’insuline présente dans l’échantillon.
5.4 Indice HOMA-IR
L’indice HOMA-IR (Homeostasis Assessment InsulinResistance) est basé sur la glycémie et l’insulinémie à jeun (Douglas et al., 2012). Il est calculé selon la formule suivante :
(Ali et al., 2014).
5.5 Le glycogène
Le dosage du glycogène consiste en premier lieu à extraire le glycogène du foie puis dans un deuxième temps réaliser le dosage de l’échantillon obtenu par rapport à une gamme étalon.
1gramme de foie frais sont coupés en petits morceaux et bouillis ensuite dans 10 ml d’eau distillée pendant 2 minutes. Les fragments de foie sont égouttés à l’aide d’une passoire et broyés avec un mortier. 5ml d’eau distillée sont ajoutés au broyat et la suspension obtenue est bouillie pendant 5 minutes. Le bouillonnât est centrifugé à 5000 tours/minute pendant 5 minutes puis le filtrat est récupéré avec 3 gouttes d’HCl (pour précipiter les protéines) et est centrifugé à nouveau à 5000 tours/minute pendant 5 minutes. Le filtrat est traité par 4 fois de
son volume d’alcool 95% puis centrifugé, le filtrat final est repris avec 2 ml d’eau distillée.
Pour doser le glycogène, 3 ml d’eau distillée et une goutte de l’eau iodée sont ajoutés à 1 ml d’extrait de glycogène obtenu et la densité optique de la coloration brune acajou est lue à 470 nm.
La concentration du glycogène est déduite à partir d’une gamme étalon établie avec du glycogène pure comme standard(Annexe Fig.1) (Dedier, 1994).
HOMA-IR= [insuline à jeun (µIU/ml). glycémie à jeun (mmol/l)] / 22.5
