SIGffRid : Programme de recherche des sites de fixation des facteurs de transcription par approche comparative

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SIGffRid : Programme de recherche des sites de fixation des facteurs de transcription par approche comparative

Fabrice Touzain, Sophie Schbath, Isabelle Debled-Rennesson, Bertrand Aigle, Pierre Leblond, Gregory Kucherov

To cite this version:

Fabrice Touzain, Sophie Schbath, Isabelle Debled-Rennesson, Bertrand Aigle, Pierre Leblond, et al..

SIGffRid : Programme de recherche des sites de fixation des facteurs de transcription par approche

comparative. Journées Ouvertes Biologie Informatique Mathématiques - JOBIM’05, Guy Perrière,

Alain Guénoche et Christophe Geourjon, Jul 2005, Lyon, France. pp.417-425. �inria-00000191�

SIGffRid : Programme de recherche des sites de fixation des facteurs de transcription par approche comparative

F. Touzain ^a , S. Schbath ^b , I. Debled-Rennesson ^a , B. Aigle ^c , P. Leblond ^c , et G. Kucherov ^a

a Laboratoire Lorrain de Recherche en Informatique et ses Applications, Vandoeuvre-L` es-Nancy, France,

b Unit´ e Math´ ematique Informatique et G´ enome INRA, Jouy-en-Josas, France,

c Laboratoire de G´ en´ etique et de Microbiologie de l’Universit´ e Henri Poincar´ e, de Nancy, France.

email : touzain@loria.fr 23 aoˆ ut 2005

R´ esum´ e

Notre objectif est la recherche des sites de fixa- tion des sous-unit´ es σ de l’ARN polym´ erase dans des g´ enomes bact´ eriens, sites g´ en´ eralement compos´ es de deux « boˆıtes » dites -35 et -10 en r´ ef´ erence au point d’initiation de la transcription. En utilisant la g´ enomique comparative, nous souhaitons nous as- surer de la conservation de couples de boˆıtes sta- tistiquement int´ eressantes (programme R’MES [1]) li´ ee ` a la pr´ esence d’un motif r´ egulateur fonction- nel. Nous autorisons un espacement variable entre boˆıtes -35 et -10 conserv´ ees dans les s´ equences in- terg´ eniques amonts de g` enes suppos´ es orthologues

. Cette d´ emarche, g´ en´ eralisable ` a tout couple de bact´ eries proches, permet de pr´ edire les sites de fixa- tion des facteurs de transcription (SFFT) qui leur sont communs. Un descriptif du fonctionnement du programme est pr´ esent´ e. Plusieurs r´ esultats promet-

1

Sont dits « orthologues » deux g` enes de bact´ eries diff´ erentes issus d’un g` ene d’une bact´ erie ancestrale com- mune.

teurs ressortent de son utilisation. Trois SFFT connus sont retrouv´ es ou confirm´ es, avec un grand nombre de nouveaux g` enes co-r´ egul´ es candidats pour cha- cun. Deux groupes de motifs ressemblent ` a divers SFFT r´ ef´ erenc´ es, sugg´ erant certaines hypoth` eses bio- logiques sur les r´ esultats connus. Au moins deux nou- veaux SFFT sont propos´ es, ` a la fois chez Strepto- myces coelicolor et Streptomyces avermitilis.

1 Introduction

De nombreux programmes ont ´ et´ e con¸cus

dans le but de d´ ecouvrir des SFFT. Certains

sont compar´ es dans un article r´ ecent [2] qui

montre la diversit´ e et le nombre des solutions

avanc´ ees pour la r´ esolution de ce probl` eme fon-

damental en bioinformatique, qu’un paragraphe

ne saurait r´ esumer. La plupart d’entre eux ne

peuvent pas utiliser d’espacement variable entre

deux mots (MEME [3]) ou font appel ` a des

m´ ethodes pour lesquelles le bruit de fond peut

interf´ erer avec le motif biologique (Bioprospector [4]). Il existe un programme permettant de fixer pr´ ecis´ ement les contraintes structurelles des mo- tifs recherch´ es : Smile [5]. N´ eanmoins, ` a vocation plus g´ en´ eraliste, il n’oriente pas ses comparaisons en fonction de donn´ ees phylog´ eniques et impose de fixer un quorum pour la repr´ esentation d’un motif dans les s´ equences d’int´ erˆ et.

Dans le cadre de la recherche de SFFT dans des g´ enomes bact´ eriens, nous avons cibl´ e nos compa- raisons et permis un espacement variable entre boˆıtes -35 et -10 potentielles, d´ efinies en nous appuyant sur des statistiques rigoureuses. Telles sont quelques-unes des am´ eliorations apport´ ees par le programme SIGffRid (SIGma Factor (bin- ding site) Finder using R’mes to select Input Data). D´ ecrit ci-apr` es, il s’appuie sur l’analyse simultan´ ee de couples de s´ equences extraits de deux g´ enomes de bact´ eries phylog´ en´ etiquement proches, et l’utilisation du programme R’MES [1].

2 Donn´ ees initiales

Le programme principal n´ ecessite plusieurs types de donn´ ees :

- la s´ equence totale du g´ enome qui nous int´ eresse (chromosome et plasmide(s)),

- toutes les s´ equences amonts de g` enes, fu- sionn´ ees si elles se chevauchent et sont de mˆ eme orientation (nous consid´ erons les deux brins d’ADN distinctement), pour chaque bact´ erie (Fig 1),

- les mots statistiquement sur-, ou sur- et sous- repr´ esent´ es chez la bact´ erie d’int´ erˆ et (sorties de R’MES modifi´ ees),

- les probabilit´ es de transition d’un mod` ele de Markov d’ordre 3 ajust´ e sur l’ensemble du g´ enome pour chaque bact´ erie,

- des fichiers comportant chacun deux s´ equences interg´ eniques amonts de g` enes orthologues (une par bact´ erie).

Des scripts ont ´ et´ e r´ ealis´ es pour obtenir ces donn´ ees ` a partir de fichiers embl, genbank et des sorties standard de R’MES. Plusieurs crit` eres biologiques sont pris en consid´ eration (donn´ ees pouvant ´ evoluer en fonction des connaissances que nous avons des SFFT) :

- longueurs minimale et maximale de l’espace- ment entre boˆıtes -35 et -10 tous facteurs sigma confondus (10 et 25 respectivement par d´ efaut),

- variabilit´ e de cet espacement pour un facteur sigma et une bact´ erie donn´ es (1 par d´ efaut), - variabilit´ e de cet espacement pour un fac-

teur sigma donn´ e entre deux bact´ eries phy- log´ en´ etiquement proches (1 par d´ efaut).

s. amont 3: −350 +10

gène 1 gène 2

gène 3 séquences amonts fusionnées retenues

s. amont 1 s. amont 2

Fig. 1 – D´ efinition des s´ equences amonts utilis´ ees

3 Approche

Les techniques d´ ecrites supposent plusieurs hypoth` eses biologiques :

- les SFFT sont localis´ es en amont des g` enes, - des g` enes orthologues de bact´ eries phy-

log´ en´ etiquement proches ont de bonnes

chances d’avoir conserv´ e le mˆ eme type de

r´ egulation transcriptionnelle,

- la conservation de la structure de l’ADN recon- nue par une sous-unit´ e σ de l’ARN polym´ erase se traduit par une conservation de portions de s´ equences nucl´ eotidiques (souvent nomm´ ees boˆıtes -35 et -10 en r´ ef´ erence ` a leur position ap- proximative par rapport au site d’initiation de la transcription).

La premi` ere ´ etape consiste ` a d´ eterminer les boˆıtes ` a rechercher. Nous s´ electionnons les mots donn´ es par R’MES [1]

(http ://www-mig.jouy.inra.fr/ssb/rmes)

comme statistiquement sur-repr´ esent´ es sur l’ensemble du g´ enome de la bact´ erie d’int´ erˆ et.

L’´ etude des boˆıtes -35 et -10 connues chez Streptomyces coelicolor a en effet montr´ e que les mots correspondants, ou des sous-mots de taille raisonnable les composant, pr´ esentaient un score d’exceptionnalit´ e positif et tr` es ´ elev´ e dans la sortie de R’MES.

Intuitivement, si nous consid´ erons un motif de SFFT, nous devrions avoir un faible nombre d’occurrences pour chaque boˆıte sur la totalit´ e d’un g´ enome comparativement aux autres mots.

En effet, si une prot´ eine se fixe sur les bases correspondant ` a ce motif, il est fort possible qu’elle puisse interagir avec chacune de ses composantes. Celles-ci devraient donc avoir une influence n´ egative sur la disponibilit´ e de cette prot´ eine, donc sur le processus de transcrip- tion qui lui est associ´ e. N´ eanmoins, les boˆıtes des SFFT devraient ˆ etre significativement sur-repr´ esent´ ees par rapport ` a leur nombre attendu si nous tenons compte des probabilit´ es des sous-mots les composant. En revanche, la sous-repr´ esentation de ces derniers explique le plus souvent le faible nombre d’occurrences observ´ ees d’une boˆıte sur la totalit´ e du g´ enome.

Nous nous appuyons sur les relations d’ortho- logies issues de la base de donn´ ees MBGD [6],

et regroupons les paires de s´ equences amonts de g` enes orthologues via les familles d´ efinies dans celle-ci, pour diminuer le nombre de s´ equences traˆıt´ ees simultan´ ement. Ces familles ne sont que de grandes cat´ egories de g` enes permettant de scinder les paires de s´ equences amonts d’orthologues en sous-groupes, sinon coh´ erents du point de vue de la r´ egulation, au moins lo- giques par rapport aux fonctions suppos´ ees des g` enes. Elles permettent de limiter la m´ emoire n´ ecessaire au programme qui traˆıtera successi- vement chaque groupe de g` enes. Via des scripts perl additionnels, nous r´ ecup´ erons les s´ equences interg´ eniques amonts correspondant ` a des g` enes orthologues probables group´ es par paires (une s´ equence interg´ enique par bact´ erie pour chaque relation d’orthologie, des positions -350 -au mieux- ` a +10 par rapport au site d’initiation de la traduction et d’une taille minimale de 30 nucl´ eotides). Nous y recherchons alors les couples de mots int´ eressants conserv´ es avec un espacement compatible avec la fixation d’un facteur de transcription (Fig 2). Pour chaque paire de s´ equences amonts d’orthologues, nous obtenons donc une liste de candidats en tant que SFFT.

Ces r´ esultats interm´ ediaires sont alors group´ es (et dupliqu´ es si besoin) par similarit´ es de dou- blet de trinucl´ eotides (un pour chaque boˆıte) et d’espacement (avec une variation de 1 autoris´ ee) (Fig 3).

A partir de cette ´ etape, nous allons traˆıter les s´ equences de chaque bact´ erie s´ epar´ ement, ceci afin de pouvoir mettre ` a jour des motifs proches mais ayant ´ evolu´ e diff´ eremment pour chaque bact´ erie.

Un tri des s´ equences concern´ ees est r´ ealis´ e

de concert avec l’extension du motif qui leur

est commun et l’´ evaluation du motif consen-

(...)

mots donnés par R’MES trinucléotides communs bactérie 1

bactérie 2 séq. 1 séq. 1

séq. n séq. n séq. 3 séq. 3

séq. 9 séq. 9

SS1 SS2

Fig. 3 – Conservation des mots int´ eressants dans un ensemble de paires de s´ equences interg´ eniques amonts d’orthologues

SS1

− si n < 4 ARRET

t g c a

(...)

Bernouilli MM3

(...)

AGAAT 19−20 GTT

ENSEMBLE INTERESSANT

− si majoritairement dans les séquences amonts (Tr > 3,84)

− sinon

n autres séquences bactérie 1

t1 t2

t1’ t2

trinucléotides communs

− sinon

Fig. 4 – Extension des trinucl´ eotides communs, tri des s´ equences

Séquence 1 Séquence 2

GGAA GGAA

GTT GTT

D (10)

12 30

40 22

10 <= ESPACE <= 25

Même espacement entre GAAT et GTT dans les deux séquences.

D va permettre l'accès aux mots présentant un espacement proche dans les deux séquences

(D, D-1 et D+1, dans le cas d'une variabilité de ±1).

D (10)

Fig. 2 – Conservation des mots int´ eressants dans les s´ equences interg´ eniques amonts d’une paire d’orthologues

sus r´ esultant. Cette extension de motif s’ap- puie sur un mod` ele probabiliste (Fig 4). Elle se poursuit r´ ecursivement tant qu’aucun mo- tif int´ eressant n’a ´ et´ e mis en exergue et que le nombre de s´ equences est suffisant. Nous d´ ecrivons pr´ ecis´ ement dans le paragraphe sui- vant les techniques utilis´ ees.

3.1 Algorithme

3.1.1 D´ efinition des mots recherch´ es

Vu les tailles de mots (¡8) et de g´ enomes (¿8 Mb) consid´ er´ ees, nous avons utilis´ e R’MES dans sa version approximation gaussienne du comptage particuli` erement adapt´ ee aux mots fr´ equents. Nous avons analys´ e conjointement les mots et leur compl´ ementaire invers´ e (option - fam). Les scores d’exceptionnalit´ e calcul´ es par R’MES correspondent aux transformations pro- bit des p-values approch´ ees, une p-value ´ etant la probabilit´ e qu’un mot soit observ´ e autant de fois dans une s´ equence al´ eatoire de mˆ eme composi- tion que le g´ enome analys´ e (mod` ele markovien d’ordre maximal). Ainsi, ces scores sont compa- rables ` a des variables de loi N (0, 1). Pour d´ ecider de l’ensemble des mots de fr´ equence exception-

nelle, nous avons d´ efini, pour chaque longueur h de mots, un seuil t inspir´ e du crit` ere de Bonfer- roni :

P( N (0, 1) ≥ t) = α

4 ^h , o u ` α

= 5.10 ⁻³ Cela nous a donc donn´ e un ensemble W de mots exceptionnels de longueur 3 ≤ h ≤ 7 sur l’alpha- bet A = { a, c, g, t } .

Ces mots sont recherch´ es dans chaque paire de s´ equences interg´ eniques amonts d’orthologues.

3.1.2 Propri´ et´ es des motifs retenus comme pou- vant ˆ etre des SFFT

Soient d min et d max les espacements minimaux et maximaux autoris´ es entre les boˆıtes -35 et -10 (donn´ ees biologiques).

Soient D la variation biologique d’espacement accept´ ee entre les SFFT des deux s´ equences amonts, et sp1 et sp2 deux espacements ∈ [d _min ..d _max ].

Soit un triplet C i = { w ¹ _i , w _i ² , { s ₁ i , s ₂ i }} corres- pondant aux mots w _i ¹ et w ² _i ∈ W dans les s´ equences amonts d’orthologues s _{1 i} et s _{2 i} . C _i est consid´ er´ e comme int´ eressant si w ¹ _i et w _i ² sont pr´ esents dans s _{1 i} et s _{2 i} avec des espacements sp1 et sp2 respectivement tels que sp2 = sp1 ± D.

Si p s

(w ¹ _i ), p s

(w ² _i ) sont les positions de w _i ¹ et w ² _i respectivement dans s _{1 i} et p _s

(w ¹ _i ), p _s

(w ² _i ) les positions de w ¹ _i et w ² _i respectivement dans s ₂ i , nous avons la relation suivante :

p _s

(w _i ¹ ) − p _s

(w ¹ _i ) = p _s

(w _i ² ) − p _s

(w ² _i ) ± D (1)

Cela nous permet de grouper les mots par espa-

cements proches. Nous ne gardons pour chaque

paire de s´ equences d’orthologues que les couples

C _i qui v´ erifient la relation (1), candidats poten-

tiels en tant que SFFT.

3.1.3 Extension de motifs et tri des s´ equences Apr` es cela, nous regroupons les r´ esultats in- term´ ediaires (ensemble des C i ) en fonction des trinucl´ eotides qui composent w ¹ _i et w ² _i .

Soient t1 et t2 deux trinucl´ eotides et d t 1− t 2 l’es- pace qui les s´ epare.

Soit e un entier.

Pour chaque triplet (t1, t2, d _{t 1− t 2} ) possible en consid´ erant l’ensemble des C i obtenus pour toutes les paires de s´ equences amonts d’ortho- logues, nous allons cr´ eer un ensemble C de tous les C i qui v´ erifient :

(t1 ⊂ w ¹ _i ) ∧ (t2 ⊂ w ² _i ) ∧ (d _{t 1− t 2} ∈ [e..e + D]) De chaque C , nous r´ ecup´ erons deux ensembles de s´ equences SS ₁ = s ₁ i ∈ C et SS ₂ = s ₂ i ∈ C , un pour chaque bact´ erie (Fig 3).

Soit min _SS le nombre de s´ equences distinctes minimal intervenant dans l’obtention d’un mo- tif de SFFT candidat. Nous ne gardons chaque ensemble SS ₁ ou SS ₂ que s’il pr´ esente au moins min SS s´ equences distinctes.

t1 est le trinucl´ eotide de gauche qui sera inclus dans la boˆıte -35 d’un ´ eventuel SFFT potentiel et

t2 est le trinucl´ eotide de droite qui sera inclus dans la boˆıte -10 du mˆ eme SFFT potentiel.

Pour chacun des ensembles SS ₁ et SS ₂ , les s´ equences sont tri´ ees par comptage et ´ evaluation statistique des lettres jouxtant t1 et t2. Notre crit` ere statistique s’appuie sur les probabilit´ es de transition d’un mod` ele de Markov d’ordre 3 ajust´ e pour chaque bact´ erie sur l’ensemble du g´ enome.

Soient les positions :

- 1 : imm´ ediatement ` a gauche de t1, - 2 : imm´ ediatement ` a droite de t1, - 3 : imm´ ediatement ` a gauche de t2, - 4 : imm´ ediatement ` a droite de t2.

Soient la position g ∈ { 1, 3 } et la position d ∈ { 2, 4 } .

Soit ∈ A , le nucl´ eotide dont nous consid´ erons la probabilit´ e d’obtention ` a une position donn´ ee.

Soit n le nombre de s´ equences concern´ ees.

Soit t le trinucl´ eotide ` a ´ etendre.

Soit j ∈ [1..2] fix´ e, l’indice permettant de pr´ eciser l’ensemble de s´ equences traˆıt´ e.

Pour l’extension d’une lettre de droite, posons : Y _i ^d () =

 



 

1 si la i` eme s´ equence de SS <sub>j</sub> poss` ede le nucl´ eotide en position d, 0 sinon.

Le nombre N ^d () de s´ equences poss´ edant le nucl´ eotide en position d, N ^d () = ⁿ _{i =1} Y _i ^d (), suit alors une loi binomiale B (n, N (t)/N (t)), o` u N ( · ) d´ esigne le comptage et t le t´ etranucl´ eotide form´ e de t suivi de . Nous pouvons ainsi calculer la significativit´ e p ^d () du nombre de s´ equences avec un en position d :

p ^d () = 1 −

x −1 y =0

C _n ^y ( N (t)

N (t) ) ^y (1 − N (t) N (t) ) ^{n − y} Pour l’extension d’une lettre de gauche, posons : Y _i ^g () =

 



 

1 si la i` eme s´ equence de SS <sub>j</sub> poss` ede le nucl´ eotide en position g, 0 sinon.

Le nombre N ^g () de s´ equences poss´ edant le nucl´ eotide en position g, N ^g () = ⁿ _{i =1} Y _i ^g (), suit alors une loi binomiale B (n, N (t)/N (t)), o` u N ( · ) d´ esigne le comptage et t le t´ etranucl´ eotide form´ e de t pr´ ec´ ed´ e de . Nous pouvons ainsi calculer la significativit´ e p ^g () du nombre de s´ equences avec un en position g :

p ^g () = 1 −

x −1 y =0

C _n ^y ( N (t)

N (t) ) ^y (1 − N(t)

N (t) ) ^{n − y}

Nous choisissons le nucl´ eotide k et la position i ∈ { 1, 2, 3, 4 } les plus significatifs (minimisation des probabilit´ es (p ^d (), p ^g ())) avec N ^{d | g} () ≥ 4.

Les s´ equences poss´ edant la lettre k ` a la posi- tion i sont regroup´ ees pour les ´ etapes suivantes (Fig 4). Un motif correspondant ` a cet ensemble de s´ equences est g´ en´ er´ e et ´ evalu´ e (cf. § 3.1.4).

- S’il est consid´ er´ e comme int´ eressant, le proces- sus d’extension se poursuit sans test sur R et T R (cf. § 3.1.4), pour trier les s´ equences et fa- ciliter leur comparaison visuelle (jusqu’` a ce que l’extension concerne moins de 4 s´ equences), et nous marquons cet ensemble de s´ equences pour son affichage ult´ erieur dans les r´ esultats (en en- registrant l’intervalle des indices de s´ equences int´ eressantes, la matrice d’´ evaluation et le mo- tif correspondant (cf. § 3.1.4)),

- Si le nombre de s´ equences concern´ ees devient trop faible (< min _SS ), le processus s’arrˆ ete, - Si le motif n’est pas int´ eressant, nous poursui- vons l’extension, en rempla¸cant :

- t1 par t1 = k.t1[1].t1[2], si i = 1, - t1 par t1 = t1[2].t1[3].k, si i = 2, - t2 par t2 = k.t2[1].t2[2], si i = 3, - t2 par t2 = t2[2].t2[3].k, si i = 4,

o` u . est l’op´ erateur de concat´ enation.

(d´ eplacement d’une lettre dans toutes les s´ equences concern´ ees)

Les autres s´ equences sont traˆıt´ ees distinctement suivant la mˆ eme d´ emarche.

3.1.4 G´ en´ eration d’un motif consensus et son

´

evaluation

A chaque ´ etape de regroupement, un motif g´ en´ erique est d´ eduit correspondant ` a deux mots avec un espacement variable. Il est construit en ajoutant au couple de tinucl´ eotides les lettres pr´ esentes dans 70% des s´ equences concern´ ees (par extension de ces derniers en s’appuyant sur

une double matrice position-sp´ ecifique) (Fig 5).

Ce motif est recherch´ e dans l’ensemble des s´ equences amonts fusionn´ ees pour chaque brin, et dans le g´ enome entier dans les deux sens. De ces comptages est d´ eduit un rapport R :

R = | motif s´ eq amonts |

| motif s´ eq totale 2 sens |

Ce rapport mesure la sp´ ecificit´ e du motif pour les s´ equences amonts. Il est g´ en´ eralement admis que les SFFT sont localis´ es en amont des g` enes. Pour tester la significativit´ e du rapport R, nous effec- tuons un test du rapport de vraisemblance [7]

dont la statistique de test T _R suit une loi χ ² { 1 } et est donn´ ee par :

T _R = 2

N ₁ log

N

L

N L

+ N ₂ log

N

L

N L

avec

L ₁ = l amont − (l _motif × nbseq), L ₂ = 2(l _genome − l _motif ), L = L ₁ + L ₂ , et N = N ₁ + N ₂ , o` u

l _amont est la somme des longueurs des nbseq s´ equences amonts de g` enes,

l genome la longueur totale du g´ enome complet et l _motif la longueur maximale pouvant ˆ etre prise par l’expression r´ eguli` ere correspondant au mo- tif d´ enombr´ e.

N ₁ est le nombre d’occurrences du motif dans les s´ equences amonts, et

N ₂ le nombre d’occurrences dans le g´ enome total et son compl´ ementaire invers´ e.

T _R conditionne la poursuite ou l’arrˆ et de l’exten- sion du motif consensus par tri des s´ equences.

Une s´ election des r´ esultats les plus int´ eressants est faite via les rapports R et T _R . La relation :

(R ≥ R _min ) ∧ (T _R ≥ T _{R min} )

doit ˆ etre v´ erifi´ ee,

avec R _min le seuil minimal de sp´ ecificit´ e (pour le moment empirique, fix´ e ` a 0.35, mais qui de- vrait ` a terme ˆ etre d´ eduit et adapt´ e pour chaque bact´ erie), et T _{R min} le quantile ` a 5% (α

) de la loi du χ ² .

3.1.5 Visualisation des r´ esultats

La figure 5 montre l’aspect d’un motif r´ esultat et l’ensemble des s´ equences ayant permis de le g´ en´ erer.

Ils sont compl´ et´ es par une recherche automa- tique du motif g´ en´ erique dans l’ensemble des s´ equences amonts de la bact´ erie concern´ ee, four- nissant ainsi les identifiants des g` enes, et les po- sitions des occurrences par rapport au d´ ebut de la traduction.

Les seuls travaux pour validation de ces r´ esultats sont donc d’ordre biologique : v´ erification de la coh´ erence des fonctions des g` enes li´ es par un mˆ eme motif de r´ egulation et exp´ eriences. Aucun post-traitement manuel des r´ esultats ne sera n´ ecessaire avant interpr´ etation dans la version finalis´ ee du programme.

Toutes les ´ etapes, de la r´ ecup´ eration des ortho- logues et l’extraction des s´ equences, en passant par l’utilisation de R’MES jusqu’` a l’affichage des r´ esultats sont automatis´ ees en PERL.

4 Discussion

4.1 Point de vue informatique

Nombre d’id´ ees int´ eressantes pour la recherche des sites SFFT avaient ´ et´ e utilis´ ees isol´ ement : emploi de motifs composites [5, 4], de rela- tions d’orthologies pour cibler les comparaisons [8, 9], de statistiques pour post-traˆıtement des r´ esultats [5]. Elles n’avaient n´ eanmoins jamais

´ et´ e combin´ ees. Le programme pr´ esent´ e ici n’est pas exhaustif, puisqu’il n´ ecessite encore le re- groupement des g` enes des bact´ eries concern´ ees en grandes fonctions (16 dans le cas pr´ esent) du fait de la grande taille des g´ enomes utilis´ es.

Une ´ evolution prochaine devrait permettre le traˆıtement ` a partir de toutes les relations d’or- thologie disponibles entre deux bact´ eries, quelles que soient les tailles de leur g´ enomes. Ceci est rendu possible par une s´ election statistique ri- goureuse des mots recherch´ es.

D’autres caract´ eristiques propres ` a ce pro- gramme tiennent mieux compte de la nature des SFFT. Ainsi, des variations d’un mˆ eme SFFT peuvent exister dans deux bact´ eries phy- log´ en´ etiquement proches [10]. Nous les dis- tinguons par l’alignement des s´ equences de chaque bact´ erie s´ epar´ ement. Nous obtenons des variantes ´ eventuellement diff´ erentes d’un mˆ eme SFFT dans deux bact´ eries proches, les diff´ erences pouvant concerner aussi bien les boˆıtes que la longueur de l’espacement qui les s´ epare.

Une limitation actuelle du programme est le choix unique qu’il fait pour l’extension des boˆıtes d’un motif donn´ e. Il est possible qu’il ne d´ etecte pas certains motifs simplement parce que ceux-ci recoupent d’autres motifs dont les caract´ eristiques statistiques sont plus significa- tives.

4.2 Point de vue biologique

Nous avons utilis´ e des bact´ eries phy- log´ en´ etiquement proches de la famille des Actinomyc` etes, Streptomyces coelicolor et Streptomyces avermitilis. Outre leur int´ erˆ et

´ economique (les Actinomyc` etes sont res- ponsables de la production de plus de 70%

des antibiotiques connus), ces Streptomyces

nb seq 8, 26 in promot

g :0.12 0.25 0.25 0.50 GGA 0.00 0.00 0.50 0.25 0.62 0.62 0.25 0.25 GTT 0.75 0.25 0.12 0.12 t :0.25 0.12 0.00 0.00 GGA 0.00 0.75 0.00 0.12 0.12 0.25 0.12 0.12 GTT 0.12 0.38 0.12 0.00

cas subw1 gga subw2 gtt subsp 18 19 20

a :0.25 0.12 0.00 0.12 GGA 1.00 0.00 0.12 0.25 0.12 0.00 0.25 0.00 GTT 0.12 0.12 0.12 0.38

gcggcagccgGGAatgggcgggccggtcgttcgGTTgccgggttga SCO2634 −46 (SAV5412 −49) gcgtctcccgGGAatgccccaccccgcaagggtGTTgtgacgtacg SCO1997 −50 (SAV6234 −48) agtcggaacgGGAatctttaccgccgcccggacGTTgaccggatga SCO1421 −77 (SAV6925 −77) cggccgtgggGGAatcccggcacgtcgccgtccGTTgtcccgaacg SCO1304 −71 (SAV7049 −74) ggcccgtcccGGAatgaatccgcggtcccgccgGTTggaaccgtcg SCO2161 −61 (SAV6042 −61) tcccgcGGAataggtcactatggaccgtcGTTagcactcatc SCO3187 −51 (SAV3678 −52) gttccgctccGGAacgaccgccgcccgcgagacGTTtcccccgtgc SCO2260 −97 (SAV5937 −79) cgccggagcaGGAaccccggtgccatgctgggcGTTgttccatgcg SCO1517 −131 (SAV6836 −131)

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trinucléotides et espacement(s) utilisés pour le regroupement motif consensus et matrice dont il est issu

c :0.38 0.50 0.75 0.38 GGA 0.00 0.25 0.38 0.38 0.12 0.12 0.38 0.62 GTT 0.00 0.25 0.62 0.50

MOTIF ggaat\w{18,18}gttg, R: 0.78 (>= 0.35), Tr 36 (>= 3.84, alpha = 0.05)

Fig. 5 – Exemple de r´ esultat pour un motif pr´ esentent des g´ enomes de grande taille et un

nombre de facteurs sigma pr´ edits sans commune mesure (plus de 60), ce qui en fait des mod` eles de choix dans notre ´ etude. Notre programme a donc ´ et´ e ´ eprouv´ e sur ces deux bact´ eries.

Les fonctions des g` enes concern´ es par nos pr´ edictions peuvent ˆ etre employ´ ees comme premi` ere validation des r´ esultats. Seuls des tests biologiques seront ` a mˆ eme de les confirmer.

N´ eanmoins, des SFFT connus ont ´ et´ e re- trouv´ es (sigR [10], ggaat-n(18)-gtt, 30 SFFT r´ epertori´ es ; BldN [11], cgtaac-n(16)-cgttga, un seul SFFT r´ epertori´ e ; HrdB [12, 13, 14, 15, 16]) et de nombreux g` enes potentiellement co- r´ egul´ es sont propos´ es. Certains motifs identifi´ es via d’autres m´ ethodes de pr´ ediction, ont pu ˆ

etre retrouv´ es (tgtcagtgc-n(7)tagg, tgac-n(19)- tgac [8]). De nouveaux candidats sont en outre avanc´ es.

Seuls sont donn´ es les motifs connus jusqu’` a pr´ esent, le programme en fournit parfois des va- riations plus cibl´ ees ou plus g´ en´ eralistes. Il est

`

a noter qu’approximativement 30 des 65 fac- teurs sigma suppos´ es de Streptomyces coelicolor peuvent ˆ etre group´ es en trois grandes familles de facteurs sigma aux domaines de fixation sup- pos´ es aux boˆıtes -35 et -10 extrˆ emement proches (r´ egions 2.4 et 4.2). Bien qu’on ne puisse d´ eduire directement une conservation des boˆıtes -35 et -10 ` a partir de la conservation des domaines prot´ eiques 2.4 et 4.2 des facteurs sigma, il est fort possible que les boˆıtes reconnues soient proches pour une famille de facteurs sigma donn´ ee.

De nombreuses validations seront n´ ecessaires,

mais au vue des recoupements d´ ej` a observ´ es avec

des SFFT connus, l’approche paraˆıt tr` es promet-

teuse.

5 Conclusion

Les r´ esultats obtenus sont int´ eressants ` a plus d’un titre. D’une part parce qu’ils recoupent parfaitement la plupart des SFFT connus et pr´ ecis´ ement d´ efinis, d’autre part parce que cer- tains des autres motifs avanc´ es sont tr` es proches de ceux suppos´ es pour la r´ egulation de cer- tains g` enes (cas de HrdB [12, 13] par exemple).

En outre, d’autres motifs sp´ ecifiques des r´ egions amonts ont ´ et´ e mis ` a jour et pourraient aussi ˆ etre impliqu´ es dans des m´ ecanismes de r´ egulation.

Evidemment, ce programme ne dispense pas d’une v´ erification exp´ erimentale des r´ esultats, mais il apporte la r´ eponse la plus sp´ ecifique pour la pr´ ediction de SFFT.

Il n´ ecessite n´ eanmoins un minimum de six or- thologues co-r´ egul´ es pour la d´ eduction d’un mo- tif consensus de SFFT.

6 Remerciements

Nous souhaitions remercier tout parti- culi` erement M. Sylvain Blondeau pour sa contribution dans les investigations biologiques et l’automatisation des traˆıtements de fichiers dans le cadre de son stage de maˆıtrise, et M.

Laurent No´ e pour les ´ eclaircissements qu’il a pu apporter dans l’´ elaboration de certaines parties d’un sous-programme. Il est ` a noter que ces travaux n’auraient pu voir le jour sans les concours de l’ACI IMPBio (Informatique, Math´ ematiques et Physique pour la Biologie) et de la r´ egion Lorraine auxquelles nous exprimons toute notre reconnaissance.

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