Soutenu le 28/09/ 2020
Devant les membres de jury :
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Président : Mdm.IlIAS.F (M.C.A) C.U.B.B.A.T Examinateur : Mr.BENNABI.F (M.C.A) C.U.B.B.A.T Encadrant : Mr.MOUEDDEN.R (M.A.A) C.U.B.B.A.T
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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieure et de la Recherche Scientifique Centre Universitaire Belhadj Bouchaib d’Ain-Temouchent
Département de la Science de la nature et la vie
Mémoire
Pour l’obtention du Diplôme de Master en sciences biologiques Option : Microbiologie appliquée
Présenté par : Mlle. BENABI Farah Mlle. BENABI Menel
Isolement et Caractérisation des Souches de Lactobacillus
Isolées à Partir du Fromage de Chèvre
Remerciements
Pendant la période de notre recherche, nous avons eu le soutien de plusieurs personnes, qui directement ou indirectement ont contribué afin qu’aujourd’hui, nous pouvons terminer l’élaboration du présent travail.
Nous tenons à remercier Dieu qui avec son pouvoir nous a aidé à vaincre ce défi.
Nous remercions nos parents pour leur aide, compréhension, soutien et leurs encouragements et la patience pour la réalisation de ce travail.
Nous remercions Mr MOUEDDEN pour avoir accepté de diriger ce travail, pour ses nombreux conseils qui ont contribué à la réalisation de ce travail. On vous exprime notre
sincère reconnaissance.
Nous remercions les membres de jury d’avoir acceptés d’évaluer ce travail et plus précisément :
Nous remercions Mdm ILIAS d’avoir accepté d’être membres de ce jury et d’avoir accepté de présider ce jury et pour l’intérêt porté à ce travail. On vous remercie infiniment.
Nous adressions un remerciement particulier à Mr BENNABI qui à accepter d’examiner ce travail, pour son soutien et sa disponibilité. Nous leur exprimons nos sincères remerciements.
Nous remercions tous l’équipe du laboratoire de microbiologie du centre universitaire d’Ain temouchent pour nous avoir apportés tous l’aide possible, qui nous ont permis de bénéficier de toutes ses compétences en acceptant de nous aider avec toute gentillesse.
Nos remerciements pour tous les enseignants du département de biologie de l’université d’Ain Témouchent pour leur soutien constant et leurs encouragements.
Enfin nous exprimons un remerciement particulier à toutes les personnes qui nous ont aidés de près ou de loin, encouragé, soutenu tout ou long de toutes ces années, qu’elles se
reconnaissent.
Dédicace
Après avoir remercié dieu le tout puissant qui m’as aidé d’accomplir mes études ; nous tenons à dédié ce modeste travail :
En premier lieu à nos chers parents qui nous ont toujours soutenue et sollicité durant notre années d’étude, que dieu les gardes pour nous.
A notre cher frère A notre grand-mère
A toute notre famille A tous qu’on aime
A tous ce qui ont nous apportées d’aide de près ou de loin
Menel et farah
Résumé
Au cours de notre travail, Les souches de Lactobacilles ont été testées et identifier pour leurs propriétés probiotiques isolées à partir du fromage de chèvre.
L’identification phénotypique, selon le profil morphologique et biochimique, a conduit à 10 souches appartenant au genre Lactobacillus. L’identification par API CH 50 a abouti à différentes espèces réparties comme suit : L. fermentum et l.plantarum, Lactobacillus spp.
Le pouvoir probiotiques des souches de lactobacilles a été examiné, in vitro, afin d’évaluer Leur intérêt et déterminer si une souche spécifique sélectionnée serait convient comme probiotiques. Pour ce faire, nous nous sommes intéressés à l’étude de leur habilité à survivre dans les conditions gastriques et intestinales simulées, leur capacité d’hydrophobicité aux cellules de l’hôte, congrégation avec les agents pathogènes et l’auto agrégation et leur activité antibactérienne. Leur aspect sécuritaire a été, également, examiné par la résistance aux antibiotiques.
À la fin, la plupart des souches, à haut profil probiotiques, caractérisées par un fort pourcentage d’auto agrégation, Co-agrégation et hydrophobicité, ont été sélectionnées. Ainsi qu’un taux élevés de résistance aux conditions gastriques et intestinales. En outre, l’étude de leur aspect sécuritaire a révélé qu’elles étaient dépourvues de résistance acquise vis-à-vis des Antibiotiques testés ; ce qui renforce leur choix en tant que probiotiques « surs » pour une Éventuelle utilisation.
Abstract
During our work, Lactobacillus strains were tested and identified for their probiotic properties isolated from goat cheese.
Their phenotypic identification, according to the morphological and biochemical profile, led to 10 strains belonging to the genus Lactobacillus. Identification by API CH 50 resulted in different species distributed as follows: L. fermentum and L. plantarum, Lactobacillus spp The probiotic potency of the lactobacilli strains was examined, in vitro, to assess Their interest and whether a specific strain selected would be suitable as probiotics. To do this, we were interested in the study of their ability to survive under simulated gastric and intestinal conditions, their capacity for hydrophobicity to host cells, congregation with pathogens and self-aggregation and their activity. antibacterial. Their safety aspect has also been examined by antibiotic resistance.
At the end, the strains with a high probiotic profile, characterized by a high percentage of self- aggregation, co-aggregation and hydrophobicity, was selected. As well as a high rate of resistance to gastric and intestinal conditions. In addition, the study of their security aspect revealed that they were devoid of acquired resistance vis-à-vis the
Antibiotics tested; which reinforces their choice as “safe” probiotics for a possible use.
صخلملا
للاخ
،انلمع مت رابتخا تلالاس Lactobacillus ديدحتو
اهصئاصخ ةيويحلا
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Lactobacillus.
ىدأ ديدحتلا ةطساوب API CH 50 ىلإ
عاونأ ةفلتخم ةعزوم ىلع وحنلا يلاتلا : L. fermentum و
L. plantarum و
Lactobacillus spp
مت صحف ةيلعاف تانئاكلا ةيحلا ةيرهجملا تلالاسل
تايصعلا ةينبللا
يف ربتخملا همييقتل مهمامتها امو
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ةراتخم ةبسانم كيتويبوربلل .
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اهتردقو ىلع ةمواقم ءاملا ايلاخلل ةفيضملا
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يتاذلا اهطاشنو . داضم ميثارجلل . امك
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ةيناكمإ مادختسلاا .
Abréviation ATB : Antibiotique
BSH : Biles Salts Hydrolase DO: Densité optique
EPS: Exopolysaccharide
FAO: Food and Agriculture Organization h : heure
H2O2 : Peroxyde d’hydrogène L: Lactobacillus
LB: Lactobacille MH: Mueller Hinton
MRS: De Man, Rogosa et Sharpe O2 : Oxygène
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
PBS : Phosphate buffered saline (tampon salin phosphaté) pH : potentiel d’Hydrogène
rpm: rotation par minute (Vitesse de rotation) SNG : surnageant
sp : espèce non précisée UFC : Unité formant colonie
Liste des tableaux
Tableau 1 : Comparaison de composition du lait de vache, de chèvre et de brebis.
Tableau 2 : Micro-organismes considérés comme des probiotiques.
Tableau 3: Habilité des souches de lactobacilles à survivre dans les conditions gastriques simulées.
Tableau 4 : Habilité des souches de lactobacilles à survivre dans les conditions Intestinales.
Tableau 5 : Activité antibactériennes des isolats de lactobacilles.
Tableau 6 : Activité antibactérienne des lactobacilles contre des bactéries pathogènes Indicatrices.
Tableau 7 : Profils de fermentation des sucres.
Listes des figures
Figure 1 : Structure du lactose et le résultat de son hydrolyse.
Figure 2 : La chèvre a : Arabia, b : Makatia, c : M’zab, d : Kabyle.
Figure 3 : Classification des bactéries lactiques.
Figure 4 : Représentation schématique des principales voies de fermentation des hexoses chez les bactéries lactiques.
Figure 5 : Concentration en bactéries le long du tube digestif.
Tableau 6 : Activité antibactérienne des lactobacilles contre des bactéries pathogènes Indicatrices.
Figure 7 : (A) Structure chimique des acides biliaires, (B) la réaction catalysée par l’enzyme BHS.
Figure 8 : Schéma explicatif des différentes étapes d’isolement les souches lactiques.
Figure 9 : Schéma illustrant les différentes étapes de l’étude de l’habilité des bactéries Lactiques à survivre dans les conditions gastriques simulées.
Figure 10 : Schéma illustrant les différentes étapes de l’étude de l’habilité des bactéries Lactiques à survivre dans les conditions intestinales simulées.
Figure 11 : Schéma illustrant les différentes étapes de l’étude de l’activité antibactérienne des lactobacilles.
Figure 12 : Schéma illustrant la sensibilité des souches aux différents antibiotiques Figure 13 : Aspect macroscopique des colonies.
Figure 14 : Observation microscopique des colonies après coloration de gram Gx100.
Figure 15 : Habilité des lactobacilles à survivre dans les conditions gastriques.
Figure 16 : Habilité des souches des lactobacilles à survivre dans les conditions intestinales.
Figure 17 : Activité antibactérienne de surnagent avant neutralisation contre des pathogènes.
Figure 18 : L’autoagrégation des isolats.
Figure 19 : Pourcentage d’autoagrégation des isolats.
Figure 20 : % de coagrégation des isolats.
Figure 21 : % d’hydrophobicité des isolats.
Figure 22 :Exemple de profil fermentaire des bactéries lactique.
SOMMAIRE
Résumé Abréviation Liste des tableaux Listes des figures
INTRODUCTION GENERALE ………..………… 1
Partie I : Synthèse bibliographique I). le lait ……….….. 3
I.1. Le lait : une matière première pour la production du fromage ……….…….. 3
I.2. Aspects généraux relatifs à la composition du lait ……….……. 3
I.2.1. La fraction protéique du lait……….…….. 4
I.2.2.Les glucides du lait……….……. 4
I.2.3.La matière grasse laitière……….………… 5
I.2.4.Vitamines et matière minérales……….5
I.3. La microflore du fromage……… 4
I.3.1. La microflore utiles ou d’intérêts technologiques……….. 6
I.3.1.1.La flore lactique……… 6
I.3.1.2. Levures et moisissures……….……… 6
I.3.2.Micro-organismes d’altération...…… 7
I.4. Les races caprines algériennes………...7
I.5.Procédés généraux de fabrication de fromage ………... 8
II).Les bactéries lactiques………..11
II.1. Définition des bactéries lactiques ……….11
II.2. Morphologie des bactéries lactiques………..12
II.3.Taxonomie des bactéries lactiques………..12
II.4.Genre lactobacilles………..13
II.5. Propriétés technologiques……….…..14
II.5.1.Capacité acidifiante………..14
II.5.1.1. Voies métaboliques……….14
II.5.2. Capacité texturante………..15
II.5.3.Capacité aromatisante………16
II.5.3.1.Métabolismes de l’acide citrique……….…..16
II.5.4. Effet sur la santé………...17
III. Microflore intestinale et probiotiques III. 1. Physiologie et tractus digestif et microbiote intestinale………...18
III.2. Historique et définition des probiotiques……….…..19
III. 3. Microorganismes à activité probiotique……….…...20
III.4. Critères de selection des probiotiques………21
III.4.1. Résistance aux conditions gastriques……….……....21
III.4.2. Résistance aux conditions intestinales……… 22
III.4.3. Adhésion aux cellules épithéliales de l’hôte………... 23
III.4.4. La capacité de coagrégation……… 23
III.4.5. L’hydrophobicité……….. .. 24
III.4.5. Activité antibactérienne………... 25
III.4.6. L’antibiorésistance………....26
III.4.7. Activité hémolytique……….…26
III.5. Rôle des probiotiques……….27
Partie II : Matériel et méthodes I). Provenance des souches I.1 Prélèvement et collection des échantillons ... 30
I.2 Isolement des bactéries lactiques... 30
I.3 Purification des bactéries lactiques... 30
I.4 Conservation des souches ……….…. 30
I.5 Identification des isolats... 30
I.5.1 Critères morphologiques ... 30
I.5.1.1 Examen macroscopique... 30
I.5.1.2 Examen microscopique ………... 31
A. État frais... 31
B. Coloration de Gram ... 31
I.5.2 Critères physiologiques et biochimiques ……….….. 31
I.5.2.1 Recherche de la catalase... 31
I.5.2.2 Croissance à différentes températures ………... 31
I.5.2.3 Profil de fermentation des sucres ……….……… 31
- Galerie API 50 ……… 31
II).Evaluation des aptitudes probiotiques in vitro ………... 34
1-Habilité à survivre dans les conditions gastriques simulées ……….………… 34
2-Habilité à survire dans les conditions intestinales simulées ……….…… 35
3-Activité antibactérienne ……….…... 37
4-L’auto- agrégation des isolats ……….….. 38
5-Co- agrégation des entre les isolats et les souches pathogènes………... 39
6-Pourcentage d’hydrophobicité des isolats ………. ……….…. 39
7-Résistance aux antibiotiques ……….40
Partie III : Résultats et discussions I).Provenance des souches ………... 42
1 Isolement et purification... 42
2 Identification des lactobacilles... 42
2.1 Etude des caractères morphologiques... 42
- L'aspect macro et microscopique……….…… 42
2.2 Etude des caractères biochimiques ………. . 42
- Recherche de la catalase... 42
- Croissance à différentes températures ………...43
- Résultats de l'API 50...43
II).Evaluation des aptitudes probiotiques in vitro………... 44
1-Habilité à survivre dans les conditions gastriques simulées ……… 44
2-Habilité à survire dans les conditions intestinales simulées ……….46
3-Activité antibactérienne ………49
4-L’auto- agrégation des isolats ………. 51
5-Co- agrégation des entre les isolats et les souches pathogènes………. 52
6-Pourcentage d’hydrophobicité des isolats ………...54
7-Résistance aux antibiotiques ……….56
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ………... 58
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ………..…...….. 61
ANNEXE………….………………... 69
1 Introduction
Les bactéries lactiques (LAB) sont un groupe hétérogène de bactéries gram-positives qui sont des habitants naturels du tractus gastro-intestinal humain, Ils sont supposés être des espèces non pathogènes extrêmement avantageuses pour l'homme actuellement en cours d'évaluation comme pouvant être des microorganismes probiotiques (Fidji, 2014).
Les LAB ont été utilisés pour des milliers d’années dans des fermentations alimentaires spontanées dans les produits laitiers comme le fromage, le yaourt et le kéfir (Bintsis et Papademas, 2002).
Les bactéries lactiques natives proviennent du lait cru et leur population change tout au long de la période de maturation avec un rôle important dans le contrôle des
microorganismes pathogènes et aussi les propriétés nutritionnelles et sensorielles des fromages traditionnels (Caridi et al. 2003 ; Cetinkaya et Soyutemiz 2006).
Les LAB sont les microorganismes les plus courants appliqués comme probiotiques (Rivera-Espinoza et Gallardo-Navarro, 2010). Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte et peuvent être utilisés comme une alternative possible à les traitements conventionnels pour de nombreuses maladies intestinales (Nagpal et al, 2012). Cependat, les Produits laitiers fermentés traditionnels comme le yaourt, sont les principales sources d'isolement de microorganismes probiotiques potentiels (Ambadoyiannis et al. 2005).
Parmi les bactéries présentes dans les fromages, les souches de Lactobacilles sont très importantes car elles sont reconnues pour leur activité probiotiques ainsi que leur capacité de fermentation (Mirzaei et Barzgari, 2012 ; Hashemi, 2014)
Pour que les micro-organismes probiotiques puissent conférer leurs effets bénéfiques, ils devraient pouvoir passer par le tractus GI, survivre aux conditions acides de l'estomac et résister à la bile sels. Ils doivent également adhérer à la muqueuse intestinale et coloniser au moins transitoirement le côlon (Saxami et al, 2012), l'activité antagoniste contre les agents pathogènes et la survie dans les sucs gastriques. Adhérence du probiotiques à la muqueuse intestinale est considérée comme importante pour de nombreux des effets probiotiques sur la santé (Ouwehand et al. 1999).
L’objectif de ce travail de ce travail est d’isoler et identifier des souches de lactobacilles a partir du fromage de chèvre afin d’évaluer leur profil probiotique, in vitro, par la résistance aux conditions gastro-intestinales simulées, leur activité antibactérienne, l’étude de leur aspect sécuritaire par la résistance aux antibiotiques.
2
Synthèse
bibliographique
3 I.Le lait
I.1. Le lait : une matière première pour la production de fromage
Le fromage est obtenu par la coagulation du lait traité thermiquement (pasteurisation ou stérilisation) ou non (lait cru) (Kongo et al, 2016). Il peut être produit à l’échelle industrielle ou artisanale.
La consommation du lait cru et de ses dérivées suscite de nombreuses questions au sein de la population (Nero et al, 2019). En effet, le lait cru est défini « produit par la sécrétion de la glande mammaire d’animaux d’élevage et non chauffé à plus de 40°c, ni soumis à un traitement d’effet équivalent » (Diversiferm, 2014).
I.2. Aspects généraux relatifs à la composition du lait
La composition du lait varie d’une espèce à l’autre. Le lait de chèvre à une composition moyenne plus proche de celle du lait de vache que de celle du lait de brebis.
Le lait contient principalement de l’eau, des protéines, et des produits azotés non protéiques, du lactose et de la matière grasse (tableau 1). Les teneurs pour chaque composant varient selon l’espèce, la santé de l’animal, la saison, l’environnement, et la phase de lactation (Kongo et al, 2016 ; O ‘Sullivan et al, 2017 ; Renhe et al, 2019). Il contient également des vitamines et des minéraux, des éléments importants, notamment pour le bon développement du nouveau-né.
Tableau 1 : comparaison de composition du lait de vache, de chèvre et de brebis (Kongo et al, 2016 ; Martin et al, 2018 ; Renhe et al, 2019).
Composition
(g/100g) vache chèvre brebis
Matière sèche totale 12,7 12,5 19,1
lipide 3,7 3,8 7,5
caséines 2,6 2,6 4,3
Protéines du
lactosérum 0 ,6 0,4 1,1
lactose 4,8 4,1 5,4
cendres 0,7 0,8 1,1
La proportion de l’eau dans le lait varie de 81 à 91% selon l’espèce (FAO, 2019). L’eau possède différentes fonctions dans le lait, telles que l’hydratation du nouveau-nés, un rôle de solvant favorisant les interactions chimiques entre micro et macro nutriments, ou encore un rôle technologique pour l’aspect du produit transformé (Guetouache et al, 2014 ; Renhe et al, 2019). Le lait de chèvre est constitué à près de 90% d’eau et ne contient pas de pigments caroténoïdes, lui conférant la couleur blanc pale.
I.2.1. La fraction protéique du lait
Les caséines constituent environ 80% des protéines du lait (Jéronimo et al, 2016). En s’associant, la caséine forme des petits conglomérats avec le calcium et le phosphore, appelés micelles, qui vont ensuite se lier les uns aux autres et ainsi former le caillé du lait lors de la
4 fabrication du fromage, avec un rôle important dans leur structure et la stabilité, dont le but d’obtenir un taux protéique maximum, pour un rendement fromager maximum.
En dehors des caséines, le lait contient d’autres protéines, notamment les protéines du lactosérum. Parmi celles-ci figurent majoritairement l’alpha-lactalbumine et la bêta- lactoglobuline et, minoritairement, les immunoglobulines (IgG1, IgG2, IgA, IgM) et la lactoferrine (O’callaghan et al, 2019). Dont l’alpha-lactalbumine représente 50% des protéines du lactosérum et la bêta-lactoglobuline représente 20% (Renhe et al, 2019).
I.2.2. Les glucides du lait
Le lactose est le sucre majoritaire présent en plus grande quantité dans le lait synthétisé dans la mamelle (Jéronimo et al, 2016 ; Renhe et al, 2019). Selon l’espèce, le lactose est présent entre 4.8 et 7,0% (g/100g de lait) (Jéronimo et al, 2016 ; Panthi et al, 2017 ; Renhe et al, 2019).
Le lactose est le substrat de la fermentation par les bactéries lactiques, un phénomène nécessaire à l’obtention du yaourt ou du fromage (Guetouache et al, 2014 ; Hayaloglu, 2016). Son principal rôle donc est de servir de substrat aux bactéries lactiques dans la fabrication du fromage utilisant un caillage lactique. Il s’agit d’un disaccharide composé de D-glucose et D-galactose liés par une liaison beta (1-4) clivé par une enzyme la bêta- galactosidase. Ces deux nouveaux sucres vont ensuite être utilisés par ces mêmes bactéries pour former de l’acide lactique dont la conséquence est d’entrainer une diminution du pH du lait. L’acidité ainsi obtenu est responsable de la déminéralisation des micelles et va conduire à la formation du caillé. La quantité d’acide lactique produite dépend d’une part du type de bactéries utilisé et d’autre part de la quantité de lactose disponible.
Figure 1 : structure du lactose et le résultat de son hydrolyse (St Gelais, 2000).
5 I.2.3. La matière grasse laitière
La matière grasse est l’un des sources principales d’énergie dans le lait avec les glucides.
La quantité totale de lipides présente au sein du lait est d’environ 4% (g/100g de lait) (Kongo et al, 2016). Les lipides majoritairement présents dans les produits laitiers sont les acides gras, les triacylglycérols, la sphingomyéline, les glycolipides, les gangliosides, les gylcoprotéines membranaires et protéines appelés la membrane du globule gras du lait (Jeantet et al, 2018).
Cependant, lorsque les globules sont dégradés, soit par hydrolyse enzymatique (on parle alors de lipolyse), soit par oxydation, ils libèrent des acides gras et/ou d’autres composés (cétones /aldéhyde) qui donnent un mauvais gout au fromage (Meffe, 1994). Sa composition particulière en acides gars rend le lait de chèvre plus sujet à la lipolyse que le lait de vache.
I.2.4. vitamines et matière minérale
On retrouve dans le lait de nombreux minéraux comme le sodium, le potassium, le magnésium, et le calcium. On retrouve aussi des chlorures de potassium et de phosphore.
Leurs concentrations dans le lait de chèvre et dans celui de vache sont à peu prés équivalentes : 1,25 g/l pour le Ca et 0,95 g/l pour le P (Brule, 1987 ; Le jaouen, 1981).Les minéraux jouent un rôle important dans la composition des micelles de caséine, et donc dans la structure tridimensionnelle du fromage (Guetouache et al, 2014). Ces oligoéléments ont également des rôles technologiques.
Au niveau des vitamines, le lait de chèvre et celui de vache contiennent globalement des valeurs proches pour les vitamines A, B et C. le lait de chèvre contient, par contre, prés de trois fois de vitamine E, six fois moins de vit B12 et cinq fois moins de bit B9 que le lait de vache mais trois fois plus de vit b3 (Frantz et al, 2009).
I.3. La microflore du fromage
La flore bactérienne présente au sein des fromages peut être originaire du lait de départ, ou provenir de l’ajout de ferments lactiques en cours de fabrication (Ozturkoglu-Budak et al, 2017 ; Pyz-Lukasik et al, 2018). Les microorganismes du lait cru sont souvent abordés sous l’angle technologique. En effet, Ils jouent un rôle non négligeable en transformation fromagère du lait cru et sont communément classés en microflore d’intérêt technologique, microflore d’altération, et microflore potentiellement pathogènes.
Les germes trouvent dans le lait un milieu propice à leur développement avec la présence d’eau, d’azote, de carbone et les sels minéraux. Ce développement et aussi favorisé par le caractère acide du lait. En effet, le lait de chèvre présente une légère acidité qui se mesure en potentiel hydrogène (pH 6,6 environ).
I.3.1. La microflore utile ou d’intérêt technologique I.3.1.1. La flore lactique
Au-delà des technologies fromagères, les bactéries lactiques sont impliquées dans un grand nombre de fermentations spontanées de produits alimentaire (Stiles et Holzapfel, 1997). Elles constituent un moyen biologique efficace pour la prévention des qualités hygiénique des aliments du fait de leur aptitude inhibitrice vis-à-vis des microorganismes nuisibles (Caridi et
6 al, 2003). Ce sont également des agents d’affinage des formages, par leurs aptitudes protéolytiques et lipolytiques (développement du gout, des arômes et de la texture). Ces bactéries lactiques sont constitués de lactocoques, leuconostoc, pédiocoques, treptocoques thermophiles, lactobacilles mésophiles et thermophiles, et entérocoques (Beuvier et Feutry, 2015).
I..3.1.2..Levures et moisissures
Les microorganismes situés à la surface des fromages sont les principaux agents d’affinage, Ils produisent en effet des composés biochimiques et organoleptiques ayant un impact sur la texture, la structure et la saveur du produit fini (Parente et al, 2017).
Deux types de champignons, et donc d’eucaryotes, sont également rencontrés dans les fromages : les levures et les moisissures. Candida, Trichosporon, Geotrichum, ou encore Pichia, figurent parmi les genres levuriens retrouvés dans le fromage. Concernant les moisissures, les genres Penicillium, Aspergillus, Mucor et Fusarium ont par exemple été observés (O’Sullivan et al, 2017). Les espèces Geotrichum candidum, Penicillium candidum, et Penicillium roqueforti font parties des principales dans les fromages à moisissures (Desmasures, 2014). Elles possèdent un rôle de dégradation des constituants du lait, permettant le développement d’arômes et de texture (Desmasures, 2014).
I.3.2. Micro-organismes d’altération et pathogéniques du lait et du fromage
Les micro-organismes responsables d’altérations sont issus du milieu et des conditions de Production et peuvent constituer un risque pour la santé du consommateur (Perin et al, 2019).
Leur présence réduit la durée de conservation et la stabilité du produit (O’Callaghan et al, 2019).
Ces altérations se traduisent par des défauts de goût, d’odeur, d’aspect et de texture (Beuvier et Feutry, 2005), il s’agit alors d’une altération de la qualité marchande. D’autres altérations peuvent avoir un impact sur la santé humaine, il s’agit Alors d’une altération de la qualité sur le plan sanitaire.
I.4. Les races caprines Algériennes I.4.1. race Arab
C'est la race la plus dominante. Elle se localise surtout dans les hauts plateaux, les zones steppiques et semi steppiques ; la taille atteint 50 -70cm, sa robe est polychrome et présente généralement du blanc associé à du noir et du marron foncé, elle est à poils longs de 12 à 15cm avec une tête pourvue de cornes et des longues oreilles et pendantes, pattes blanches au-dessus du genou, taches blanches à l’arrière des cuisses. La chèvre arabe à une production laitière moyenne de 1,5 L dans bonne alimentation (Boubekri, 2008).
7
Figure 2 : la chèvre a : Arabia, b : Makatia, c : M’zab, d : Kabyle (Benyoub, 2016).
I.4.2. race Kabyle
C'est une chèvre autochtone qui peuple les massifs montagneux de Kabylie et des Aurès.
Elle est robuste et massive, de petite taille, la tête est connue par ses longues oreilles tombantes surmontée de cornes, sa robe est à pelage long qui offre un poil pur, de couleur généralement brun foncé, parfois noir. Dite aussi «naine de Kabylie», elle est surtout appréciée pour sa viande qui est d’une très bonne qualité, ceci contrairement à sa production laitière qui est médiocre et Parfois très faible (Feliachi, 2008).
I.4.3. race Makatia
Cette race est localisée dans les hauts plateaux de la région nord de l’Algérie, se présente avec des caractères assez hétérogène, elle présente un corps allongé à dessus droit, robe variée de couleur grise, beige, blanche et brune à poils ras et fin, longueur entre 3-5 cm. La tête porte des cornes dirigées vers l’arrière, possède d’une barbiche et deux pendeloques (moins fréquentes) et de longues oreilles tombantes qui peuvent atteindre 16 cm. Elle est utilisée également pour la production de la viande et spécialement pour la peau et le cuir (AnGR , 2003).
I.4.4. race M’Zab
Dénommée aussi « la chèvre rouge des oasis ». Elle se retrouve surtout dans le sud, et se caractérise par une taille moyenne de 60 – 65cm, la tête est fine, portent des cornes rejetées en arrière, les oreilles sont longues et tombantes (15cm) (Hellal, 1986). La robe est de poils courts (3-7cm), et de trois couleurs : le chamois qui domine, le brun et le noir. Le chamois est le plus dominant, le noir forme une ligne régulière sur l'échine alors que le ventre est tacheté par le blanc, et noir. Cette race et très appréciée dans l’Est méditerranéen pour ses capacité
8 laitières et sa fertilité (Tedjani, 2010). Sa production laitière est bonne (2 -3 litre/jour) (Bey et Laloui, 2005).
I.5. Procédés généraux de fabrication de fromage I.5.1. Traitement du lait
Le traitement du lait constitue une étape importante du procédé de fabrication fromagère. Il est important de bien veiller à respecter la chaîne du froid après la traite afin de diminuer le risque de prolifération des espèces bactériennes potentiellement nocives pour le consommateur, mais aussi pour conserver la qualité du lait (Gassi et al., 2017), de maintenir une qualité uniforme et promouvoir la Sécurité alimentaire. Cependant, si le lait cru est refroidi à 4 - 12 °C, il peut être transformé dans les 48 h suivant la traite (Bachmann et al, 2011).
Cette étape peut se faire de plusieurs façons, dont le prétraitement le plus commun est la pasteurisation du lait. Ainsi, certains agents pathogènes retrouvés dans le lait cru tels que Salmonella, Escherichia coli 0157: H7 et Listeria monocytogenes peuvent facilement
Être éliminés par la pasteurisation (Pandey et al, 2003). Le lait cru peut subir aussi un traitement thermique appelé la thermisation (65 °C durant 15 secondes) (Johnson, 2011; Fox, Cogan, et al, 2017).
I.5.2. Coagulation du lait
La coagulation du lait est une étape cruciale pour la fabrication de fromage. Au cours de celle-ci, le lait passe de l’état liquide à l’état solide, par la formation d’un gel ou coagulum, appelé caillé (Gassi et al, 2017). La coagulation correspond à une déstabilisation des micelles de caséines qui floculent puis se soudent pour former un gel emprisonnant les éléments solubles du lait. Il existe deux techniques principales de Coagulation : la voie de l’acidification, également appelée voie lactique, et la voie enzymatique.
Dans un procédé artisanal, l’acidification s’obtient via l’ajout de ferments. Un produit caractéristique obtenu par cette voie est Le fromage frais. La voie enzymatique consiste en l’ajout de présure dans un lait peu acidifié.
o La Voie lactique
L’acidité est un facteur important dans la formation du caillé (Johnson, 2011; Fox,
Cogan, et al, 2017). L’acidification est obtenue par l’ajout de bactéries lactiques qui transforment l’acide lactique en lactate (Fox et McSweeney, 2017). Il y aura donc une diminution du pH du lait, ce qui provoque une solubilisation du phosphate de calcium, un élément important dans la stabilisation des micelles des caséines. Lorsque le pH atteint le point isoélectrique des caséines (pH=4,6), les sous-micelles s'associent par des liaisons électrostatiques et hydrophobes pour former un gel lactique qui emprisonne toute son eau.
Parmi les ferments le plus souvent utilisés :Les mésophiles qui comprennent, les Lactococcus ont la capacité de produire du glucose à partir de l’acide lactique, et sont considérés comme homofermentaires (Fröhlich-Wyder et al, 2017), et Les Leuconostoc spp,
9 Métabolisent le lactose en lactate, éthanol, et surtout CO2, dont les Bulles de gaz aboutissent à la formation des yeux dans les fromages (Fröhlich-Wyder et al, 2017), sont hétérofermentaires et présentent l’avantage de résister à des valeurs de pH faibles.
o La voie enzymatique
L’acidité observée parmi ce type de caillé est d’une valeur intermédiaire (5,50 < pH <
6,60) (Gassi et al, 2017). Celle-ci se compose d’un mélange de chymosine et de pepsine, deux enzymes sécrétées dans la caillette des jeunes ruminants (Moschopoulou, 2011; Horne et al, 2017; Jaros et al, 2017; Uniacke-Lowe et al, 2017). Ces deux enzymes possèdent une activité protéolytique permettant la coagulation du lait pour la production de fromage (Andrén, 2011; Horne et al. 2017).
I.5.3. Egouttage (évacuation du sérum)
Après avoir découpé le caillé formé, une réduction de la teneur en lactose peut avoir lieu afin de limiter la production d’acide lactique durant l’affinage, en soutirant une certaine proportion de sérum, et en diluant la phase soluble du caillé avec de l’eau (Düsterhöft et al, 2017; Farkye et al, 2017).
La synérèse est un phénomène biochimique et physico chimique suivant lequel un caillé Formé soit par voie enzymatique ou soit par voie lactique se contracte continuellement et
Expulse spontanément le lactosérum qui se sépare du caillé. L'égouttage va donc jouer un rôle sur l'accélération de la synérèse et sur la séparation du lactosérum du caillé. Lors de cette étape, la plus grande partie des éléments solubles sont éliminés dans le lactosérum.
I.5.4. Salage
Le sel, en plus d’avoir un rôle de conservateur alimentaire, impacte les saveurs ainsi que le régime alimentaire du consommateur (Dusterhoft et al, 2017; Guinee et al, 2017).
Le salage des fromages peut se faire de différentes manières : le sel est directement incorporé dans les grains de fromage avant la mise en moule. Pour certains types de fromages, le salage à sec se fait en saupoudrant et en frottant les surfaces du fromage avec du sel. Cette technique à sec évite de mouiller la surface et permet de la faire crouter. Une autre méthode de salage consiste à plonger les blocs de fromage dans un bac de saumure durant une période de temps
I.5.5. Affinage
Enfin, C'est durant la phase d’affinage se développer l’aspect, la texture, la composition, les saveurs et arômes du fromage final (Kongo et al, 2016; Mietton et al, 2018), il commence avec l’implantation de flores de surfaces, éventuellement ensemencées. La Durée de cette étape peut varier d’un jour à plusieurs mois, voire plusieurs années, en Fonction du type de fromage et de l’affinage désiré (Mietton et al, 2018). Pour les Fromages de type lactique, cette étape dure généralement entre une semaine et un mois (Institut de l'Élevage, 2008).
10 II. Les bactéries lactiques
II. 1. Définition des bactéries lactique
Les bactéries lactiques sont définies comme étant des cellules procaryotes, hétérotrophes et chimio-organotrophes c’est-t-à dire qui requiert des molécules organiques Complexes comme source d’énergie (Hassaine, 2013), elles sont ubiquitaires et fréquemment retrouvés libres dans l’environnement ou en association avec un hôte comme certains aliments tels que le lait et ses dérivés, la viande, les fruits et les légumes. Elles représentent aussi une partie de la microflore intestinale et génitale humaine et animale (Trias, 2008 ; Leroi, 2010).
Elles sont le plus souvent des bacilles ou des coques à Gram positif, immobiles, non sporulées, aéro-anaérobies facultatifs ou anaérobies stricts et catalase négatif (Settanni et Moschetti, 2010).
Il existe des bactéries lactiques mésophiles avec une température optimale de croissance comprise entre 20°c et 30°c, et les thermophiles, avec une température optimale de croissance comprise entre 30°c et 45°c. Elles se développent majoritairement à pH 4,0-4,5 et certaines sont encore actives à des valeurs de pH extrêmes comme 9,6 ou 3,2 (Jozala et al, 2005). Les bactéries lactiques se caractérisent par de faibles activités protéolytique et lipolytique et sont très exigeantes en acides aminés et en vitamine B (Caplice et Fitzgerald, 1999).
Une autre classification, basée sur la nature des produits du métabolisme bactérien obtenus à partir des glucides a subdivisé les bactéries lactiques en trois groupes (McLeod et al, 2008).
Elles peuvent produire soit de l’acide lactique exclusivement (bactéries homolactiques strictes), soit de l’acide lactique et de l’acide acétique (bactéries hétérolactiques facultatives), soit de l’acide lactique, de l’acide acétique ou de l’éthanol et du CO2 (bactéries
hétérolactiques strictes) (Vandamme et al, 1996).
Actuellement, dans l’industrie agroalimentaire, les bactéries lactiques occupent une place importante parmi les auxiliaires de fabrication. Depuis très longtemps, les bactéries lactiques sont consommées dans les produits fermentés (produits dérivés du lait, de la viande.et du poisson, le vin, la bière, le pain, les produits végétaux…). Elles sont devenues les principaux candidats probiotiques et bénéficient d’un statut GRAS (Generally Regarded As Safe) (Klaenhammer et al, 2005).Elles participent à l’inhibition de certains microorganismes pathogènes, en produisant plusieurs métabolites ayant une activité antimicrobienne (Dortu &
Thonart, 2009; Moraes et al, 2010).
La caractérisation moléculaire des bactéries nécessite plusieurs techniques qui sont:
l’homologie ADN-ADN, la détermination du pourcentage de base G+C de l’ADN
génomique, le séquençage du gène codant pour le ARN16S ribosomal, la caractérisation du plasmide (Staley et Krieg, 1987) et le séquençage partiel ou complet des protéines
cellulaires (Vandamme et al, 1996; Dicks et van Vuuren, 1987).
II.2. Morphologie des bactéries lactiques
L’étude morphologique des bactéries lactiques repose sur deux aspects : l’aspect macroscopique et l’aspect microscopique et qui est une étape préliminaire dans l’identification bactérienne
11
L’aspect macroscopique résulte de l’observation des colonies après culture sur milieux solides. Les colonies des bactéries lactiques peuvent être de formes circulaires, à contour régulier, à surface lisse, de couleur blanche avec un aspect laiteux et de diamètre compris entre 0,5 et 1,5 mm (Hassaine, 2013).
L’observation microscopique des bactéries lactiques se fait à l’aide d’un microscope à partir d’une suspension bactérienne de préférence jeune. On distingue deux formes majeures : coques (Cocci) de forme ovoïde de 0,5 à 2 μm de diamètre ou bacille (bâtonnets) plus ou moins allongées de 0,5 à 2 μm de diamètre et 1 à plus de 10μm de long) (Dellaglio et al, 1994). Leur mode d’association est très hétérogène (cellules isolées, paires, tétrades, amas irréguliers, longues ou courtes chaînettes) mais spécifique à chaque genre bactérien (Hassaine, 2013). Entre les deux formes on peut avoir une forme intérmédiaire applée cocobacille.
II.3. Taxonomie
La classification des bactéries lactiques est basée sur le pourcentage en base G+C de l’ADN génomique. La détermination du pourcentage G+C, est considérée comme la première méthode utilisée pour la taxonomie des procaryotes. Le contenu G+C des bactéries lactiques varie de 30 à 50% (Bolotin et al, 2001; Makarova et al, 2006; Makarova et Koonin, 2007;
Wegmann et al, 2007). Ce pourcentage peut être donc utilisé uniquement pour distinguer des souches au sein d’une même espèce (Marmur et Doty, 1962; Xu et al, 2000).
Les bactéries lactiques sont classées dans le phylum des Firmicutes, de la classe des Bacilli et de l’ordre des Lactobacillales renferment vingt qui sont répartis en six familles :
Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lactobacillaceae, Leuconostocaceae et Streptococcaceae (Figure) (Leveau et al, 1991; Axelsson, 2004).
Figure 3 : classification des bactéries lactiques (Vandamme et al, 1996 ; stiles et Hozlapfel, 1997 ; Axelsson, 2004).
12 II.4. Genre lactobacilles
Le genre Lactobacilles comprend plus de 200 espèces regroupées en 24 groupes phylogénétiques (sun et al, 2015 ; zhend et al, 2015). Les membres du genre Lactobacilles sont généralement asporulogènes, immobiles de forme Coccobacille à bâtonne s’organisant en chaîne. Leur température optimale de croissance se situe entre 30 et 40°C, pour un pH allant de 3 à 8 (Pot et al, 2014).
Les Lactobacilles ont la capacité de fermenter le glucose et différents hydrates de carbone mais les produits de fin de fermentation dépendent de la voie fermentaire de l’espèce L’acide lactique est prédominant, cependant dans certaines conditions, l’acétate, l’éthanol, ou le CO2
peuvent être formés (Hammes et al, 1992; Klein et al, 1998), Contribuant à leur activité antimicrobienne par inhibition de la croissance de certaines bactéries pathogènes. Ces espèces sont réparties en trois groupes métaboliques distincts : les Homofermentaires obligatoires, les hétérofermentaires facultatives et les Hétérofermentaires obligatoires (Bergey’s manual 2009).
Elles sont presque omniprésentes dans l'environnement (aliments fermentes, surface des plantes, sur le sol...). Chez l'homme, elles sont présentes dans des zones ou les glucides sont disponibles tels que le microbiote gastro-intestinal ou le vagin (walter, 2008), ainsi que les produits alimentaires riches en glucides (produits laitiers, produits céréaliers, bière, fruits...).
De nombreux lactobacilles sont considérés comme des probiotiques (Turpin et al. 2010), et présentent un profil d'innocuité élevé, sont reconnues pour leur statut ≪généralement considéré comme sur≫ (Lee et al, 2013).
II.5. Propriétés technologiques des bactéries lactiques
Les bactéries lactiques possèdent de nombreuses propriétés technologiques qui en font les premiers intervenants dans l’élaboration des aliments fermentés dans une grande variété de fermentations en industie agro-alimentaire (Stiles et Holzapfel, 1997).
En effet, ces bactéries participent à la transformation de produits animaux tels le lait et certains produits carnés ainsi qu’à l’élaboration de produits végétaux. Elles sont ainsi connues pour leurs rôles probiotiques (Bragger, 2002).
La fermentation est caractérisée à la fois par des modifications chimiques considérables de la matière première et par le fait que les agents conservateurs se forment au sein du produit grâce à l'action des microorganismes (Babacar, 2002).
II.5.1. Capacité acidifiante
Les bactéries lactiques sont utilisées en tant que ferments qui interviennent par fermentation des substrats, en transformant les glucides en acide lactique. Les changements physico-chimiques induits par l’acidification du lait exercent une influence majeure sur la texture et l’acceptabilité du produit fini (Lucey et Singh, 1997 ; Horne, 1999; Tranchant et al, 2001).
L’abaissement du pH lié à la production d’acide lactique au cours de la fermentation charge la texture et les propriétés organoleptiques du produit. A partir d’un pH inférieur ou égal à 4,6, lorsque le point isoélectrique de la caséine est atteint, les micelles de caséine
13 précipitent et entrainent les globules lipidiques. Ce phénomène est responsable de la formation du caillé dans les fromages, les laits fermentés, et les yaourts (Lucey, 2004).
Suivant les espèces, les sucres sont ensuite catabolisés selon deux voies différentes : soit la voie homofermentaire, soit la voie hétérofermentaire.
o Voies métaboliques
Stiles et Holzapfel, (1997), rapportent que les lactobacilles peuvent être classés en trois Groupes selon leur métabolisme fermentaire.
La voie homofermentaire emprunte la glycolyse dans sa totalité pour dégrader les hexoses (du glc-6-P jusqu’au pyruvate) qui conduit, en conditions optimales de croissance, à la production de 2 molécules de lactate et 2 molécules d’ATP par molécule de glucose. Ce métabolisme est qualifié d’homolactique lorsqu’au moins 90% du glucose consommé est converti en lactate. En conditions de croissance non optimales (limitation de carbone ou certains sucres, souches mutées), le métabolisme des bactéries homofermentaires peut se diversifier vers un métabolisme appelé mixte, avec production, en plus du lactate, de formiate, de CO2, d’acétate et d’éthanol (Cocaign- Bousquet et al, 1996). La fermentation hétérolactique facultative catabolise une molécule de glucose pour produire une molécule de lactate, une molécule de CO2, une molécule d’éthanol et une molécule d’acétate. Les hétérofermentaires obligatoires, qui fermentent les hexoses et les pentoses en acide lactique, acide acétique et/ou éthanol et CO2 (Thompson et Gentry-Weeks, 1994). La production de gaz à partir de la fermentation du glucose est un trait caractéristique de ces bactéries. Les principales espèces de ce groupe sont L. fermentum et L. brevis (Stiles et Holzapfel, 1997).
Le rendement énergétique est différent selon les deux voies homolactique et hétérolactique à savoir deux moles d’ATP par mole de glucose par la voie homofermentaire et une seule par la voie hétérofermentaire.
14 Figure 4 : Représentation schématique des principales voies de fermentation des hexoses
chez les bactéries lactiques (Makhloufi, 2012).
II.5.2. Capacité texturants (production d’exopolyscharides)
Certaines souches de bactéries lactiques ont la capacité de synthétiser des exopolysaccharides (EPS) qui jouent un rôle important dans la texture des produits transformés pour leurs propriétés épaississantes et gélifiantes (Welman et al, 2003 ; Ruas- Madiedo et al, 2002).
Elles permettent ainsi d’améliorer la texture (Ricciardi et Clement, 2000), de diminuer la synérèse et d’augmenter la viscosité et l’onctuosité du produit. Les EPS ont la capacité de retenir les molécules d’eau et de diminuer la séparation du lactosérum et des caséines coagulées du lait. Leur présence dans les yaourts améliore leur homogénéité (Desmazeaud, 1990). La majorité des études portant sur la production d’EPS par les bactéries lactiques portent sur les genres Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc et Pediococcus (Ruas et de Los Reyes, 2005;
Badel et al, 2011).
De plus, une couche d'EPS autour de la cellule influence significativement la diffusion de Différentes molécules aussi bien vers l'extérieur ou vers l'intérieur de la cellule. Ainsi, des agents antimicrobiens peuvent plus difficilement l'atteindre (Whitfield, 1988).
15 II.5.3. Capacité aromatisante
Les bactéries lactiques, en plus de leur pouvoir fondamental d'acidification et d'assainissement, sont aussi utilisées pour leur capacité à produire des composés aromatisants.
En effet, le citrate est considéré comme le principal précurseur des composés aromatisants, tel l’acétoine, l’alpha-acétolactate, l’acétaldéhyde, le 2,3-butanediol et le diacétyle ce dernier étant le plus intéressant dans l’industrie laitière. (Hugenholtz, 1993).
Ces composés aromatiques contribuent d’une part, à l’élaboration de la flaveur de certains aliments issus de la fermentation lactiques et d’autre part, à l’élimination de concentrations trop élevées de pyruvate qui sont toxiques pour la cellule bactérienne (Collins, 1972).
Le métabolisme du citrate est parmi les principales voies métaboliques impliquées dans la formation des composés aromatiques (Yvon et Rijnen ,2001 ; Smit et al ,2005Ardo, 2006), il permet la formation de diacétyle, acétoine et acide acétique par l’intérmédiaire du pyruvate (Smit et al, 2005).
o Métabolisme de l’acide citrique
L’acide citrique constitue la seconde source carbonée du lait, présent à une concentration comprise entre 1,2 et 2,2 g/l (Desmazeaud, 1994).
Certaines bactéries lactiques appartenant aux genres lactobacillus, Oenococcus, leuconostoc, weissella ont la capacité de fermenter le citrate comme seule source de carbone (Kempler et Mekay, 1980 ; Cocaign-Bousquet et al, 1996).
Toutes les souches ne sont pas citrate positive .cette activité résulte en effet de la présence de gènes de transport du citrate, tel que le gène codant le citrate perméase, et de gènes du métabolisme du citrate, qui sont parfois portés par un plasmide. Le transport du citrate vers l’intérieur des cellules s’effectue par le biais d’une protéine inductible, la citrate perméase, qui assure l’accumulation du citrate dans le cytoplasme de la cellule sans le modifier chimiquement (Magni et al, 1996).
Le catabolisme de l’acide citrique peut être décomposé en deux étapes : son clivage avec formation de l’acide pyruvique et la dégradation de celui-ci à travers différentes voies métaboliques. Une fois à l’intérieur de la cellule, l’acide citrique est scindé en acide acétique et acide oxaloacétique, par la citrate lyase. L’oxaloacétate va ensuite être décarboxylé en pyruvate par l’oxaloacétate synthase.L’acide acétique ainsi formé peut être excrété ou orienté vers la synthèse d’acétyl-COA par l’acétate kinase ou sein des diverses voies cataboliques existantes pour la dégradation du pyruvate et l’acide oxaloacétique est lui converti en CO2 et acide pyruvique soit par une oxaloacétate décarboxylase, soit par une décarboxylation spontanée (Diviès et al, 1994). La formation de l’alpha-acétolactate est effectuée en 2 réactions distinctes catalysées par l’enzyme l’a-acétolactate synthase. Avec la thiamine pyrophosphate agissant à titre coenzyme, une molécule d’hydroxyéthyl-Tpp ou acétaldéhyde actif. Cet intermédiaire réagit ensuit avec une seconde molécule de pyruvate, assurant la formation d’a-acétolactate. Celui-ci est subséquemment décarboxylé en acétoine par l’a- acétolactate décarboxylase ou de façon oxydative en diacétyle. L’acétoine et le diacétyle produits peuvent par la suite être respectivement réduits en 2,3-butanediol ou acétoine par les réductases.
16 L’acétate, le formate, l’éthanol et le lactate sont également formés en quantité variée à partir du pyruvate via les enzymes pyruvate formate lyase, pyruvate déshydrogénase et lactate déshydrogénase (Hugenholtz, 1993).
II.5.4. Effet sur la santé (caractère probiotiques)
Beaucoup de travaux ont mis en évidence les bienfaits des probiotiques sur la santé humaine (Gibson et al, 1998; Amaraa et Shiblb, 2015; Bultosa, 2016; Zuppa et al, 2016).
Les principales propriétés recherchées chez les probiotiques sont la résistance aux acides gastriques et aux sels biliaires et l’activité immunomodulatrice (Gourbeyre et al, 2011).
Elles stimulent le système immunitaire par l’augmentation du nombre de phagocytes et de lymphocytes, premiers outils de défense contre tout agent exogène (Donnet-Hughes et al, 1999). Ils aident ainsi au développent du système immunitaire chez le nourrisson et l’améliorent chez les personnes fragiles et âgées (Hessle et al, 1999; Cross et al, 2001). De plus, par l’assimilation de certains composés alimentaires indigestes (fibres alimentaires, lactose chez certaines personnes, etc.), ils aident à l’amélioration du transit intestinal et à la régulation de la flore endogène (Vieira da Silva et al, 2016).
Le principal atout que représentent les bactéries lactiques pour l’industrie alimentaire, réside dans l’amélioration de la qualité des produits fermentés en y développant caractéristiques organoleptiques et en augmentant leur durée de conservation (Stiles, 1996).
Elles participent à l’inhibition de certains microorganismes pathogènes, en produisant plusieurs métabolites ayant une activité antimicrobienne (Dortu et Thonart, 2009; Moraes et al, 2010).
17 III. Microflore intestinale et probiotiques
III.1. Physiologie de tractus digestif et microbiote intestinale
Le TGI humain héberge une communauté bactérienne dense et complexe avec plus de 1000 espèces différentes par individu (Qin et al, 2010). Il comprend trois régions principales (estomac, intestin grêle et le colon) qui offrent des conditions très différentes pour la suivie des microorganismes (figure5).
Le microbiote intestinal comporte 1014 microorganismes vivant en symbiose avec l’hôte soit plus de 100 fois le nombre de cellules de l’organisme humain (Gill et al, 2006). Par son rôle et sa complexité On peut parler donc d’organe à part entière car cela représente 10 à 20 fois le nombre total de cellules de l’organisme (Backhed et al. 2005; Zocco et al. 2007). In utero, le tube digestif est stérile, les premières colonisations se font principalement par la flore vaginale, intestinale et cutanée de la mère lors de la naissance, ainsi que par l’environnement extérieur (O’hara et Shanahan, 2006), Sa composition va par la suite évoluer en fonction de L’environnement et de l’alimentation de l’hôte, pour se stabiliser vers l’âge de 2 ans.
Au sein du tube digestif ,deux catégories de bactéries ont été identifiées : La flore normale dite autochtone, endogène, saprophyte ou résidente comprend l’ensemble des espèces présentes de façon constante dans l’écosystème digestif et capables de s’y multiplier (Hagiage, 1994) ,et la flore de passage ou allochtone , exogène, transitoire correspond aux espèces bactériennes qui , traversent le tube digestif sans pouvoir le coloniser (Bäckhed et al, 2004) et qui peuvent être classées en 2 catégories selon leurs effets sur l’hôte plutôt bénéfiques ou nuisible (Salminen et al,1998).
Tout au long du tractus intestinal, le microbiote évolue en termes de quantité et de qualité en fonction de la région intestinale (Drasar, 1974). Le Nombre de bactéries augmente ainsi selon un gradient croissant de sens oral-aboral. La répartition des bactéries est en rapport notamment avec les nécessités de l’anaérobiose dont la teneur en oxygène diminue le long du TD, le pH, qui est progressivement neutralisé à la sortie de L’estomac, de la motricité digestive, qui diminue de l’intestin grêle au côlon, les sécrétions biliaires, la présence d’immunoglobulines, d’enzymes, , la sécrétion du mucus ainsi que des mouvements péristaltiques (Holzapfel et al, 1998 ; Tannock, 1999).
18 Figure 5 : concentration en bactéries le long du tube digestif (Le Lay, 2015)
Dans le premier compartiment, l’estomac, la prolifération microbienne est fortement réduite (103-105 ufc/g de contenu) par la présence d’oxygène apporté par la déglutition (29%
de la teneur en oxygène de l’air) ainsi que par la présence d’une forte acidité. Les espèces dominantes incluent entre autres les streptocoques et lactobacilles (Mackie et al, 1999).
Le temps de transit court retrouvé dans l’intestin grêle ainsi que la sécrétion et les sécrétions biliaires et pancréatiques (Salminen et al, 1998), ne permettent pas aux organismes de se multiplier suffisamment rapidement. Dans le duodénum et le jéjunum, la flore aéro- anaérobie facultative qui a survécu au passage gastrique va croître et constituer une flore dite de passage, non implantée. Les microorganismes sont peu nombreux et appartiennent aux genres Streptococcus, Lactobacillus.
Au niveau de l’iléon, une augmentation importante de la flore en nombre et en variété a été observée (Gorbach et al, 1967). En effet, dans l’iléon, le contenu dans la lumière est moins acide, l’oxygène se raréfie et les mouvements péristaltiques plus lents, favorisant ainsi une densité bactérienne plus élevée atteint 105-108 cellules par gramme de contenu luminal (Gorbach et al, 1967 Holzapfel et al, 1998). La flore retrouvée est plutôt de type anaérobie facultatif ou anaérobie stricte.
Le côlon est quant à lui le plus gros réservoir de bactéries qui héberge environ 1012 microorganismes par gramme de contenu .Ainsi au niveau colique, l’oxygène du sang diffuse facilement à travers la muqueuse intestinale mais certaines bactéries collées à la muqueuse consomment cet oxygène et permettent le maintien d’une atmosphère strictement anaérobie au niveau de la lumière intestinale (Bernier et al, 1988). Les mouvements péristaltiques sont lents et les aliments y ont un temps de séjour de 18 à 68 h (Mitsuoka, 1992).
2. Historique et définition des probiotiques
Certains micro-organismes, principalement les bactéries lactiques, sont utilisées depuis de nombreux siècles pour conserver les aliments, malgré une méconnaissance du processus impliqué qui n’a été découvert qu'au siècle dernier. Louis Pasteur a notamment pu mettre en évidence le processus de fermentation et a été l’un des premiers à soutenir l’idée que les micro-organismes sont importants pour le maintien de la santé. C’est cependant Elie
19 Metchnikoff (1845-1916), un scientifique russe travaillant à l'Institut Pasteur à Paris qui a attiré l’attention sur les effets bénéfiques de yogourts fermentés pour la santé. Son hypothèse était que des bactéries lactiques qui sont impliquées dans la fabrication des yogourts peuvent inhiber les microbes nuisibles présents dans l'intestin. Cette découverte peut être considérée comme la naissance du terme « microbes bénéfiques » qui a ultérieurement évolué vers le terme « probiotiques », dérivé du mot grec signifiant «pour la vie».
La définition du terme « probiotiques » a d'abord été proposée pour la première fois par Lilly et Stillwell en 1965 afin de décrire les substances sécrétées par un micro-organisme qui stimulent la croissance d'un autre organisme et améliorent l'équilibre de la flore intestinale (Lilly et Stillwell, 1965). Puis le terme de probiotique a été proposé en 1974 par Parker pour désigner les souches microbiennes utilisées en alimentation animale pour contrer les effets négatifs des antibiotiques et renforcer leur efficacité (Parker, 1974). La définition a ensuite évolué et Roy Fuller a redéfini en 1989 les probiotiques «comme des préparations microbiennes vivantes utilisées comme additif alimentaire et ayant une action bénéfique sur l’animal hôte en améliorant la digestion et l’hygiène intestinale.» (Fuller, 1989). Cette définition souligne l’importance de la notion de viabilité et élimine ainsi les composés inertes, sécrétés ou non par les bactéries, tels que les antibiotiques. Les définitions les plus récentes ont introduit le concept d’une action au niveau du microbiote intestinal et ont confirmé que les micro-organismes ingérés devaient être vivants (Salminen et al. 1998 ; Marteau et al.
2002).
Plus récemment selon la définition adoptée par le groupe d’experts formé par l’Organisation des Nations Unies (ONU) pour l’agriculture et l’alimentation et l’Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) (Rapport FAO/OMS, 2002), les probiotiques sont des « microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont consommés en quantités suffisantes, procurent un bénéfice pour la santé de l’hôte ».
Actuellement, les probiotiques sont commercialisées sous différents types de produits. Ils sont consommés sous forme de produits laitiers fermentés, d’aliments fermentés tels que les yaourts ou en tant que médicaments sous forme de suppléments alimentaire en culture contenant des cultures viables lyophilisées (Gupta et al. 2009). D’autres produits alimentaires incorporant des probiotiques sont également sur le marché tels que les préparations infantiles, des boissons lactées, des jus de fruits, des fromages. Ces produits contiennent une ou plusieurs souches probiotiques de genres et d’espèces différents (Fooks et Gibson, 2002).
Les preuves de l’efficacité thérapeutique des probiotiques datent du début du 20ième siècle.
Une étude de 1909 décrivait une amélioration chez les patients atteints d’arthrite auto-immune après une supplémentation avec des cultures vivantes de Streptococcus lacticus et Bacillus bulgaricus (Warden, 1909).
III.2. Les microorganismes à activité probiotiques
Parmi les genres bactériens les plus couramment utilisés aujourd’hui sur le marché international on retrouve des bactéries lactiques (BL) et plus particulièrement des bifidobactéries ou des lactobacilles (Forsythe et Bienenstock 2010; Bron, van Baarlen et al. 2011).
Quelque d’autres espèces peuvent être également utilisées comme des souches appartenant aux streptocoques, entérocoques ou encore des bactéries à Gram négatif comme Escherichia
20 coli, de même que des levures comme Saccharomyces boulardii, saccharomyces cerivicae, comme mentionner dans le tableau (2).
Tableau 2 : micro-organismes considérés comme des probiotiques (Hozalpfel et al. 1998) lactobacillus Bifidobactérium Autres bactéries lactiques Autres micro-organismes L.acidophilus
L.amylovirus L.brevis L.casei L.cellobius L.curvatus L.delkrueckii L.farciminis L.fermentum L.gallinarum L.gasseri L.johnsonii L.plantarum L.reuteri L.rhamnosus
B.adolescentis B.animalis B.bifidum B.breve B.infantis B.lactis B.longum B.thermophilum
Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Leuconostoc mesenteroides Lactococcus lactis
Pediococcus acidilactici Sporolactobacillus inulinus Streptococcus thermofillus Streptococcus diacetylactis Streptococcus intermedius
Bacillus spp Escherichia coli
Propionibacterium freudenreic Saccharomyces cerevicae Saccharomyces boulardii
III.4. Critères de sélection des souches probiotiques
Les probiotiques présentent des propriétés qui sont variables selon l’espèce ou la souche microbienne. Le choix des probiotiques dépend de ces propriétés et du type d’utilisation.
Selon le rapport de la FAO/OMS (2002), pour qu’un produit soit reconnu comme étant Probiotique, une évaluation du produit basée sur plusieurs critères doit être effectuée suivant
Les critères suivants :
o Résistance aux conditions gastriques
La sécrétion d’acide gastrique influence très fortement la colonisation par des microorganismes pathogènes ou non. Elle représente la première ligne de défense face aux divers éléments apportés par l’alimentation.
Chez les BL, la tolérance au stress acide est augmentée en phase de croissance exponentielle ou bien si la bactérie subit une phase d’adaptation à pH acide préalablement au choc acide.
La plupart des BL possèdent une adaptation naturelle à un pH acide. (Van de Guchte et al. 2002). Les bactéries lactiques produisent des acides organiques par fermentation des glucides (Makhloufi, 2011), ils produisent et accumulent dans leur environnement les composés acides qui rendent le milieu acide et défavorable à la croissance des autres bactéries
