Identification, cibles et diversité de régulateurs expressionnels majeurs impliqués dans la production de biomasse chez le peuplier

Centre Val de Loire

UR Amélioration, Génétique et Physiologie Forestières 2163, avenue de la pomme de pin

F-45075 Orléans Cedex 2 www.orleans.inra.fr

Identification, cibles et diversité de régulateurs expressionnels majeurs impliqués dans la

production de biomasse chez le peuplier

Jorge V. ¹ , Leplé J.C. ¹ , Segura V. ¹ , Lesage-Descauses M.C. ¹ , El Malki R. ¹ , Ferrigno P. ¹ , Guérin V. ¹ , Boizot N. ¹ , Lakhal W. ¹ , Rogier O. ¹ , Faivre-Rampant P. ² , Le Paslier M.C. ³ , Pilate G., Bastien C., Déjardin A. ¹

1 INRA UR 0588 AGPF, Centre INRA Val de Loire, 2163 avenue de la Pomme de Pin, CS 40001 – Ardon 45075 Orléans; ² INRA UMR 1165 URGV, 2 rue Gaston Crémieux, 91057 Evry; ³ INRA US 1279 EPGV/CEA/CNG, 2 rue Gaston Crémieux, 91057 Evry.

Introduction

Le projet REGEX est une approche intégrée de génétique inverse (Fig. 1), conduisant à la production de nouvelles ressources biologiques visant à comprendre l’élaboration de la biomasse ligno-cellulosique chez les peupliers (Populus spp.). Il a pour objectifs : (1) de décrypter les réseaux de régulation génique sous-tendant la formation du bois en identifiant de façon dynamique différents régulateurs moléculaires (facteurs de transcription – FT, miRNA) et leurs cibles ADN ou ARNm, au niveau du tissu de bois ; et (2) de coupler des approches de génétique d’association permettant d’explorer la diversité présente au sein des populations naturelles de peuplier noir avec des approches de cartographie génétique en familles multiples permettant de valider les associations positives détectées.

Figure 1 REGEX, un projet intégrateur visant à comprendre l’élaboration de la biomasse ligno-cellulosique chez les peupliers. * Ressources acquises dans des projets connexes utilisées dans le projet REGEX.

Matériel et méthodes

• Chip-SEQ et RNA-SEQ petits ARN (sRNA)

• Génotypage

Résultats et discussion

• ChiP-SEQ

• RNA-SEQ sRNA

• Génotypage

Références

Faivre Rampant P., Zaina G., Scalabrin S., Jorge V., Segura V., Guerin V., Paulstephenraj P., Giacomello S., Bitton F., Aluome C., Le Paslier MC., Brunel D., Viger M., Payne A., Bastien C.,Taylor G., Morgante M. (2012) Development and validation of a 12K SNP chip genotyping array for association genetics in Populus nigra using genome‐wide resequencing data. Poster at the Final Conference Noveltree, Tree Breeding, Genomics and Evolutionary Biology: New synergies to tackle the impact of climate change in the 21 st century. 16-17 October 2012, Helsinki, Finland.

Novaes E., Osorio L., Drost D.R., Miles B.L., Boaventura-Novaes C.R.D., Benedict C., Dervinis C., Yu Q., Sykes R., Davis M., Martin T.A., Peter G.F., Kirst M. (2009) Quantitative genetic analysis of biomass and wood chemistry of Populus under different nitrogen levels. New Phytologist 182:878-890.

Yin T.Y., Zhang X.Y., Gunter L., Priya R., Sykes R., Davis M., Wullschleger S.D., Tuskan G.A. (2010) Differential detection of genetic loci underlying stem and root lignin content in Populus. Plos One 5.

Remerciements

Les résultats présentés ont été financés par l’INRA (AIP Bioressources 2011) et la Communauté Européenne dans le 7ème programme cadre (FP7/ 2007-2013, projets n° 211868 – NOVELTREE et n° 211917 - ENERGYPOPLAR), l’ANR (TreeForJoules n°2010-KBBE-00702) et la Région Centre (Projet 2008-2012 AMC2B).

Conclusions et perspectives

Le projet REGEX a permis la mise au point de la technique ChiP-SEQ sur des cellules de jeune xylème de peuplier et d’identifier plus de 500 cibles de régulation potentielles. Il a permis également de mettre en évidence des différences d’accumulation de micro ARN entre bois de tension et bois opposé ainsi que des micro ARN non encore identifiés et/ou spécifiques d’un génotype donné. Enfin, il a permis d’acquérir des données de génotypage qui permettront d’établir des cartes génétiques denses et représentatives afin de cartographier des QTL non seulement pour les propriétés chimiques du bois mais aussi pour d’autres caractères d’intérêt.

Cet ensemble de données permettra d’identifier les gènes et les réseaux de régulation impliqués dans la variation des propriétés du bois.

Figure 4 Distribution sur le génome de référence P. trichocarpa : (i) des 1231 gènes et séquences candidates liés aux propriétés du bois (lignes vertes); (ii) des SNP génotypés dans ces gènes et séquences (546 SNP; en bleu, les SNP issus de re-séquençage NGS; en rouge, les SNP issus de re-séquençage Sanger). Les chromosomes 6, 8 et 10 comportent plus de SNP car ce sont des régions candidates pour le contrôle de la variation des propriétés du bois (QTL; Yin et al. 2010;

Novaes et al. 2009).

 Sur les 10 500 SNP génotypés, 88% sont lisibles, 7 611 se sont avérés polymorphes dans une population d’association et 75% à 93% d’entre eux ségrègent dans les populations de cartographie.

 Parmi les gènes candidats sélectionnés pour la conception de la puce, 1231 gènes et séquences candidates correspondent à des candidats pour la qualité du bois (Fig. 4). Toutefois, les contraintes techniques de génotypage n’ont permis de génotyper que 546 SNP dans 336 de ces gènes.

 Une première analyse de ségrégation sur une colonne du plan de croisement factoriel a permis de construire une carte génétique (Fig. 5). L’ordre des marqueurs est relativement bien conservé par rapport à la séquence du génome.

SNP_IGA_6_1612188

SNP_IGA_6_1685524 SNP_IGA_6_1683632

SNP_IGA_6_2729130 SNP_IGA_6_3164945 SNP_IGA_6_3207933

SNP_IGA_6_3094502

SNP_IGA_6_3905408

SNP_IGA_6_3959964 SNP_IGA_6_3968884

SNP_IGA_6_5026370

SNP_IGA_6_4971952

SNP_IGA_6_5988422 SNP_IGA_6_6522688

SNP_IGA_6_8561645 SNP_IGA_6_8572670 SNP_IGA_6_8584547 SNP_IGA_6_8581184 SNP_IGA_6_8553437 SNP_IGA_6_8569423 SNP_IGA_6_8574948 SNP_IGA_6_8622786 SNP_IGA_6_8509352 SNP_IGA_6_8511156 SNP_IGA_6_8565486 SNP_IGA_6_8641935 SNP_IGA_6_8645895 SNP_IGA_6_9418053 SNP_IGA_6_9294347 SNP_IGA_6_8970859 SNP_IGA_6_9549782

SNP_IGA_6_10033651 SNP_IGA_6_10037192 SNP_IGA_6_10034389

SNP_IGA_6_10503593

SNP_IGA_6_9489319 SNP_IGA_6_9784302 SNP_IGA_6_9943549 SNP_IGA_6_10336902

SNP_IGA_6_10018101 SNP_IGA_6_10706271

SNP_IGA_6_11720399 SNP_IGA_6_13705361 SNP_IGA_6_13740536 SNP_IGA_6_14198623 SNP_IGA_6_14191272 SNP_IGA_6_14193846 SNP_IGA_6_14194007 SNP_IGA_6_14193274 SNP_IGA_6_14196391 SNP_IGA_6_14198427 SNP_IGA_6_13103419 SNP_IGA_6_13428184 SNP_IGA_6_13807130 SNP_IGA_6_13807034 SNP_IGA_6_13805824 SNP_IGA_6_13805877 SNP_IGA_6_17304700 SNP_IGA_6_17944670 SNP_IGA_6_18105253 SNP_IGA_6_13806917 SNP_IGA_6_13807646 SNP_IGA_6_16747075 SNP_IGA_6_18105558 SNP_IGA_6_18655209 SNP_IGA_6_19660411 SNP_IGA_6_19408625 SNP_IGA_6_18723139 SNP_IGA_6_18542159 SNP_IGA_6_18722413 SNP_IGA_6_18684047 SNP_IGA_6_18656623 SNP_IGA_6_19800479 SNP_IGA_6_20064722 SNP_IGA_6_20072226 SNP_IGA_6_20072103 SNP_IGA_6_20268069 SNP_IGA_6_20292656 SNP_IGA_6_20270682 SNP_IGA_6_20592912 SNP_IGA_6_21238699 SNP_IGA_6_21035548 SNP_IGA_6_20805869 SNP_IGA_6_20584098 SNP_IGA_6_20590831 SNP_IGA_6_20265758 SNP_IGA_6_20387700 SNP_IGA_6_20295257 SNP_IGA_6_20263644 SNP_IGA_6_20310375 SNP_IGA_6_20222928 SNP_IGA_6_20223103 SNP_IGA_6_21043225 SNP_IGA_6_21037618 SNP_IGA_6_21801099 SNP_IGA_6_22213728 SNP_IGA_6_22225068 SNP_IGA_6_22224737 SNP_IGA_6_22399710 SNP_IGA_6_23563048 SNP_IGA_6_23422452 SNP_IGA_6_23559939 SNP_IGA_6_22408566 SNP_IGA_6_22501863 LG_VI_5_SNP_324 SNP_IGA_6_22384097 SNP_IGA_6_22398788 SNP_IGA_6_23097260 SNP_IGA_6_23225895 SNP_IGA_6_23225474 SNP_IGA_6_23148689 SNP_IGA_6_23151937 SNP_IGA_6_22797788 SNP_IGA_6_22945711 SNP_IGA_6_22949762 SNP_IGA_6_23413039 SNP_IGA_6_23951100 SNP_IGA_6_24348687 SNP_IGA_6_25382776

SNP_IGA_6_25185449

SNP_IGA_6_25056904

SNP_IGA_6_25200983

LG6.rec (cM)

SNP_IGA_6_1612188 SNP_IGA_6_1683632 SNP_IGA_6_1685524

SNP_IGA_6_2729130 SNP_IGA_6_3094502 SNP_IGA_6_3164945 SNP_IGA_6_3207933

SNP_IGA_6_3905408 SNP_IGA_6_3959964 SNP_IGA_6_3968884

SNP_IGA_6_4971952 SNP_IGA_6_5026370

SNP_IGA_6_5988422

SNP_IGA_6_6522688

SNP_IGA_6_8509352 SNP_IGA_6_8511156 SNP_IGA_6_8553437 SNP_IGA_6_8561645 SNP_IGA_6_8565486 SNP_IGA_6_8569423 SNP_IGA_6_8572670 SNP_IGA_6_8574948 SNP_IGA_6_8581184 SNP_IGA_6_8584547 SNP_IGA_6_8622786 SNP_IGA_6_8641935 SNP_IGA_6_8645895 SNP_IGA_6_8970859 SNP_IGA_6_9294347 SNP_IGA_6_9418053 SNP_IGA_6_9489319 SNP_IGA_6_9549782 SNP_IGA_6_9784302 SNP_IGA_6_9943549 SNP_IGA_6_10018101 SNP_IGA_6_10033651 SNP_IGA_6_10034389 SNP_IGA_6_10037192 SNP_IGA_6_10336902 SNP_IGA_6_10503593 SNP_IGA_6_10706271

SNP_IGA_6_11720399

SNP_IGA_6_13103419 SNP_IGA_6_13428184 SNP_IGA_6_13705361 SNP_IGA_6_13740536 SNP_IGA_6_13805824 SNP_IGA_6_13805877 SNP_IGA_6_13806917 SNP_IGA_6_13807034 SNP_IGA_6_13807130 SNP_IGA_6_13807646 SNP_IGA_6_14191272 SNP_IGA_6_14193274 SNP_IGA_6_14193846 SNP_IGA_6_14194007 SNP_IGA_6_14196391 SNP_IGA_6_14198427 SNP_IGA_6_14198623

SNP_IGA_6_16747075

SNP_IGA_6_17304700

SNP_IGA_6_17944670 SNP_IGA_6_18105253 SNP_IGA_6_18105558 SNP_IGA_6_18542159 SNP_IGA_6_18655209 SNP_IGA_6_18656623 SNP_IGA_6_18684047 SNP_IGA_6_18722413 SNP_IGA_6_18723139 SNP_IGA_6_19408625 SNP_IGA_6_19660411 SNP_IGA_6_19800479 SNP_IGA_6_20064722 SNP_IGA_6_20072103 SNP_IGA_6_20072226 SNP_IGA_6_20222928 SNP_IGA_6_20223103 SNP_IGA_6_20263644 SNP_IGA_6_20265758 SNP_IGA_6_20268069 SNP_IGA_6_20270682 SNP_IGA_6_20292656 SNP_IGA_6_20295257 SNP_IGA_6_20310375 SNP_IGA_6_20387700 SNP_IGA_6_20584098 SNP_IGA_6_20590831 SNP_IGA_6_20592912 SNP_IGA_6_20805869 SNP_IGA_6_21035548 SNP_IGA_6_21037618 SNP_IGA_6_21043225 SNP_IGA_6_21238699 SNP_IGA_6_21801099 SNP_IGA_6_22213728 SNP_IGA_6_22224737 SNP_IGA_6_22225068 SNP_IGA_6_22384097 SNP_IGA_6_22398788 SNP_IGA_6_22399710 SNP_IGA_6_22408566 SNP_IGA_6_22501863 SNP_IGA_6_22797788 SNP_IGA_6_22945711 SNP_IGA_6_22949762 SNP_IGA_6_23097260 SNP_IGA_6_23148689 SNP_IGA_6_23151937 SNP_IGA_6_23225474 SNP_IGA_6_23225895 SNP_IGA_6_23413039 SNP_IGA_6_23422452 SNP_IGA_6_23559939 SNP_IGA_6_23563048 SNP_IGA_6_23951100 SNP_IGA_6_24348687 SNP_IGA_6_25056904 SNP_IGA_6_25185449 SNP_IGA_6_25200983 SNP_IGA_6_25382776

Chromosome 6 (pb x 2.5 / 100 000)

Carte génétique Séquence

Figure 5 Carte génétique du chromosome 6 (à gauche) et position des marqueurs SNP utilisés sur la séquence (à droite).

 Dans l’échantillon ChIP-SEQ anti-MYB221, par rapport au témoin négatif, 725 pics ont été détectés sur le génome de référence P.

trichocarpa, se trouvant respectivement à proximité de 488, 284, 98 et 60 modèles de gène dans un intervalle de 5, 3, 1 et 0,5 kb.

 Les 98 gènes-cibles potentiels positionnés à moins d’1 kb d’un pic ChIP-SEQ ont été classés selon leur fonction cellulaire (Fig. 2).

Plus d’un quart correspondent à des gènes du métabolisme (notamment un gène CAD et un gène de laccase). Six FT sont également des cibles potentielles, dont MYB221 lui-même suggérant qu’il est régulateur de sa propre expression. Un quart des modèles de gènes correspondent à des protéines de fonction inconnue.

Figure 2 Classification fonctionnelle des 98 gènes-cibles potentiels de MYB221 – ces gènes sont positionnés à moins d’1 kb d’un pic d’enrichissement ChIP-SEQ.

Unknown function

Transcription

Protein synthesis and fate

Cell cycle and DNA processing Metabolism

Cell defense

Signal transduction

Cellular organisation and

trafficking

Transcription

Protein synthesis and fate

Cellular organisation and trafficking

Signal transduction

Cell cycle and DNA processing Metabolism

Unknown function

Cell defense

A

B

C

Figure 3 Identification de miRNA après séquençage NGS. A) un exemple de structure en boucle d’un pre-miRNA identifié (le miRNA coloré en rouge) B) les 1708 miRNA prédits présentent des tailles entre 20 et 22 nucléotides. C) clustering hiérarchique de l’accumulation de quelques miRNA identifiés dans les 4 banques de bois opposé (#9 et

#11) et bois tendu (#10 et #12) du clone 717-1B4.

 Nous avons identifié par NGS les micro ARN et autres petits ARN (sRNA) présents dans le bois de tension et le bois opposé de trois génotypes différents de peuplier.

 1708 miRNA et leur pre-miRNA sont prédits sur le génome de référence et se retrouvent dans les tailles attendues (Fig.3B).

 Certains miRNA présentent des

accumulations différentes en fonction du

tissus (bois opposé ou tendu) ou du génotype

considéré (Fig. 3C).