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Submitted on 1 Jan 1984
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MÉTHODE POUR L’ÉTUDE EN MICROSCOPIE IONIQUE ANALYTIQUE, PHOTONIQUE ET
ÉLECTRONIQUE D’UNE MÊME CELLULE
P. Mandon, F. Escaig, F. Vinzens
To cite this version:
P. Mandon, F. Escaig, F. Vinzens. MÉTHODE POUR L’ÉTUDE EN MICROSCOPIE IONIQUE AN- ALYTIQUE, PHOTONIQUE ET ÉLECTRONIQUE D’UNE MÊME CELLULE. Journal de Physique Colloques, 1984, 45 (C2), pp.C2-549-C2-552. �10.1051/jphyscol:19842125�. �jpa-00223794�
JOURNAL DE PHYSIQUE
Colloque C2, supplkment au n02, T o m e 45, fkvrier 1984 page C2-549
METHODE POUR L'ETUDE EN MICROSCOPIE IONIQUE ANALYTIQUE, PHOTONIQUE ET E L E C T R O N I Q U E D'UNE M ~ M E CELLULE
P . Mandon, F . Escaig e t F . Vinzensr
Facuzte' de Me'decine, Laboratoire de Biopkysique, INSERM Service C o m n 27, Professeur P . GaZZe, 8 , rue du Ge'n6raZ SarnaiZ, 94010 Cre'teiz, France r ~ u s 6 m NationaZ % ' H i s t o i r e NatureZZe, Laboratoire de Biopkysique, INSBRM U. 201
R 6 s u m 6 - L ' o b s e r v a t i o n en rnicroscopie 6 l e c t r o n i q u e d e c o u p e s en s 6 r i e t r a n s v e r s a l e s et s a g i t t a l e s d ' u n e c e l l u l e ou d ' u n g r o u p e de c e l l u l e s , r e p e r 6 e s e n m i c r o s c o p i e p h o t o n i q u e , c o m p l e t e l a mi- c r o a n a l y s e p a r e m i s s i o n i o n i q u e s e c o n d a i r e de c e m O m e m a t e r i e l . C e s t e c h n i q u e s , m o r p h o l o g i q u e e t a n a l y t i q u e , a p p l i q u e e s 2 1 ' 6 - t u d e d e l a l o c a l i s a t i o n d u 5 - f l u o r o - u r a c i l e g r S c e 2 s o n a t o m e d e f l u o r d a n s u n e p r i m o c u l t u r e e f f e c t u 6 e 2 p a r t i r d e 1 1 6 p i d e r m e d e l ' o r e i l l e de c o b a y e a l b i n o s , m o n t r e u n e a c c u m u l a t i o n n u c l e - a i r e e t n u c l e o l a i r e de c e m e d i c a m e n t .
A b s t r a c t - E l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n o f t r a n v e r s e and s a g i t t a l serial s e c t i o n s o f a cell i d e n t i f i e d b y p h o t o n m i c r o s - c o p y is c o m p l e m e n t a r y t o s e c o n d a r y m a s s m i c r o a n a l y s i s . C e l l s in c u l t u r e f r o m t h e e p i d e r m i s o f a l b i n o s g u i n e a pig e a r s w e r e used t o s t u d y t h e cell l o c a l i z a t i o n o f 5 - f l u o r o u r a c i l by f l u o r i n e d e t e c t i o n . A f t e r i n c u b a t i o n w i t h t h e d r u g , t h e c e l l s w e r e f i x e d , d e s h y d r a t e d , and f l a t e m b e d d e d in Epon. F l u o r i n e i m a g e s m a d e o n serial 2 m i c r o m e t e r s t h i c k s e c t i o n s o f t h e c e l l s s h o w t h a t t h i s e l e m e n t is l o c a l l y c o n c e n t r a t e d in t h e n u c l e u s and n u c l e o l u s . L a m i c r o a n a l y s e p a r e m i s s i o n i o n i q u e s e c o n d a i r e p e r m e t , avec u n e t r e s g r a n d e s e n s i b i l i t e , la l o c a l i s a t i o n d e s 6 1 6 m e n t s en s u r f a c e e t e n p r o - f o n d e u r d a n s un e c h a n t i l l o n b i o l o g i q u e /1,2,3,4,5/. E l l e peut s t r e ap- p l i q u 6 e 2 1 1 6 t u d e de la l o c a l i s a t i o n d e s s i t e s d e f i x a t i o n d e c e r t a i n s m 6 d i c a m e n t s 2 l a 6 c h e l l e c e l l u l a i r e . P o u r f a c i l i t e r l i i n t e r p r 6 t a t i o n m o r p h o l o g i q u e d e s i m a g e s i o n i q u e s , les c o u p e s s e m i - f i n e s s o n t i m p r e - g n 6 e s a v e c u n e s o l u t i o n de c h l o r u r e de c 6 s i u m . C e t t e " c o l o r a t i o n " d o n - ne B l a m a s s e 1 3 3 , u n e i m a g e p o s i t i v e c o n t r a s t k e d e s c e l l u l e s e t des s t r u c t u r e s i n t r a c e l l u l a i r e s , qui peut E t r e c o m p a r e e a v e c l e s i m a g e s m o r p h o l o g i q u e s : p h o t o n i q u e e t 6 l e c t r o n i q u e d e s m O m e s c e l l u l e s . M A T E R I E L S ET M E T H O D E S
1. O b t e n t i o n d e s c e l l u l e s
D e s c u l t u r e s p r i m a i r e s d e k e r a t i n o c y t e s s o n t e f f e c t u e e s 2 p a r t i r d e 1 1 6 0 i d e r m e d e l ' o r e i l l e de c o b a y e a l b i n o s d a n s d e s b o i t e s d e P e t r i e n pla;tique d'aprPs l a t e c h n i q u e 2 6 c r i t e par R E G N I E R e t co31. / 6 / . L e s c e l l u l e s , d e 2 0 2 40 m i c r o m P t r e s i e d i a m s t r e , f o r m e n t r a p i d e m e n t u n e c o u c h e m o n o c e l l u l a i r e c o n f l u e n t e , p u i s p l u r i s t r a t i f i e e , bien d i f f e r e n - c i e e m o r p h o l o g i q u e m e n t .
L e s c e l l u l e s en c u l t u r e s o n t o b s e r v e e s en c o n t r a s t e d e p h a s e au m i c r o s - c o p e p h o t o n i q u e i n v e r s 6 .
2. I n c u b a t i o n des c e l l u l ~
A c e s t a d e de la c u l t u r e , p o u r l i 6 t u d e d e l ' i n c o r p o r a t i o n e t d e la 1 0 - c a l i s a t i o n d e s m 6 d i c a m e n t s , l e s c e l l u l e s s o n t i n c u b e e s avec u n e s o l u - t i o n de 5 - f l u o r o - u r a c i l e 1,41 M (18,4 m i c r o g r a m m e s de 5 - f l u o r o - u r a - c i l e S i g m a p a r m i l l i l i t r e ) d a n s le m i l i e u d e c u l t u r e , p e n d a n t 1 7 heures.
Article published online by EDP Sciences and available at http://dx.doi.org/10.1051/jphyscol:19842125
C2-550 JOURNAL DE PHYSIQUE
3. P r G p a r a t i o n d e s 6 c h a n t i l l o n s p o u r l a m i c r o s c o p i e p h o t o n i q u e , e l e c - t r o n i q u e e t l a m i c r o a n a l y s e
L e s c e l l u l e s s o n t f i x e e s d a n s les b o i t e s d e c u l t u r e a v e c u n e s o l u t i o n de g l u r a r a l d e h y d e 1% d a n s l e t a m p o n c a c o d y l a t e 0 , l M pH 7 , 2 , p e n d a n t 3 0 m i n u t e s a l a t e m p e r a t u r e du l a b o r a t o i r e , r i n c e e s avec le t a m p o n , puis p o s t f i x e e s a v e c une s o l u t i o n de t e t r o x y d e d ' o s m i u m 1% d a n s le m E m e t a m p o n .
A p r e s E t r e l a v 6 e s e t d e s h y d r a t 6 e s p a r l e s a l c o o l s d e c o n c e n t r a t i o n c r o i s s a n t e , 1 e s c e l l u l e s s o n t i n c l u s e s d i r e c t e m e n t d a n s les b o i t e s d e Petri d a n s u n e m i n c e c o u c h e d ' e p o n e .
L e s p l a g e s de c e l l u l e s r e p e r e e s au m i c r o s c o p e p h o t o n i q u e s o n t m a r q u e e s et d e c o u p e e s l ' a i d e d ' u n e m p o r t e - p i e c e . L e s d i s q u e s o b t e n u s , red@- c o u p e s , s o n t c o l l e s avec d e l ' e p o n e s u r un b l o c d ' e p o n e aplani.
Les c o u p e s s e m i - f i n e s s o n t e x 6 c u t 6 e s p a r a l l e l e m e n t ou p e r p e n d i c u l a i r e - ment au plan d ' e t a l e m e n t , et c l a s s e e s p o u r c o n s e r v e r l ' o r g a n i s a t i o n de la c u l t u r e . L e s c o u p e s f i n e s , o b t e n u e s a v a n t o u a p r P s l e s p r e c k d e n t e s , s o n t o b s e r v e e s au m i c r o s c o p e 6 l e c t r o n i q u e P h i l i p s E M 3 0 0 , t e l l e s q u e l - les, ou a p r s s G t r e c o n t r a s t e e s par c o n t a c t des g r i l l e s a v e c l ' a c e t a t e d ' u r a n y l e , p u i s le c i t r a t e de p l o m b , s e l o n R E Y N O L D S /7/.
Les c o u p e s s e m i - f i n e s d e s t i n e e s l a m i c r o a n a l y s e s o n t r e c u e i l l i e s s u r d e s l a m e l l e s d ' o r , d ' a r g e n t o u d e q u a r t z . L e s l a m e l l e s d e q u a r t z qui p e r m e t t e n t d ' o b t e n i r l ' i m a g e p h o t o n i q u e d e s c e l l u l e s s o n t r e c o u v e r t e s d ' u n e m i n c e c o u c h e d ' o r p o u r la m i c r o a n a l y s e .
4. I m p r e g n a t i o n d e s c o u p e s s e m i - f i n e s a v e c du c e s i u m pour l a m i c r o a n a - 1 y s e
~ e s x p e s s e m i - f i n e s de 2 m i c r o m e t r e s d ' e p a i s s e u r s o n t i m p r 6 g n e e s s u r leur s u p p o r t , a v e c u n e s o l u t i o n de c h l o r u r e d e c e s i u m 1% d a n s l ' e a u b i d i s t i l l 6 e p e n d a n t 1 h e u r e 2 l a t e m p e r a t u r e du l a b o r a t o i r e . A p r s s G t r e r i n c 6 e s a v e c d e l ' e a u b i d i s t i l l g e , e l l e s s o n t s e c h e e s a l ' e t u v e a 3 7 O C p e n d a n t 48 heures.
R E S U L T A T S
1. C o r r e s p o n d a n c e d e l ' i m a g e i o n i q u e a v e c l ' i m a g e p h o t o n i q u e o u 6 l e c - t r o n i q u e
Un f i b r o b l a s t e , r e p e r 6 d a n s l a b o i t e d e c u l t u r e p u i s s u r l a c o u p e s e m i - f i n e e n m i c r o s c o p i e p h o t o n i q u e , e s t o b s e r v e l ' a i d e du m i c r o a n a l y s e u r C A M E C A S M I 3 0 0 a p r e s i m p r e g n a t i o n a v e c du Cs+ ( F i g . 1). Ce m G m e f i b r o - b l a s t e p e u t 6 g a l e m e n t O t r e o b s e r v e e n m i c r o s c o p i e 6 l e c t r o n i u e s u r u n e c o u p e f i n e ( F i g . 2). L o i m a g e i o n i q u e p o s i t i v e l a m a s s e 13QCs+ m e t n e t t e m e n t e n e v i d e n c e le c y t o p l a s m e (Cy), le n o y a u ( N ) et l e s n u c l e o - les (n) i d e n t i f i e s p a r a l l e l e m e n t g r 8 c e ?i l ' o b s e r v a t i o n 6 l e c t r o n i q u e .
2. E x a m e n d e s c o u p e s au m i c r o a n a l y s e u r A. V u e f r o n t a l e .
A p r e s i m p r e g n a t i o n avec du c e s i u m , l ' i m a g e d ' u n g r a n d f i b r o b l a s t e 2 noyau s e g m e n t e , e n t o u r 6 de k e r a t i n o c y t e s , s ' o b t i e n t avec un t e m p s d ' e x p o s i t i o n de 5 s e c o n d e s (Fig. 3). L ' i m a g e de la rnPme c e l l u l e , r e a - l i s 6 e e n 1 0 0 s e c o n d e s 2 la m a s s e 40, m o n t r e la r 6 p a r t i t i o n d u c a l c i u m i n t r a c e l l u l a i r e . L a d i s t r i b u t i o n de c e s d e u x e l e m e n t s , a s s e z s i m i l a i - r e , m e t en e v i d e n c e l a s u p e r p o s i t i o n p r e s q u e p o n c t u e l l e d e s s t r u c t u r e s c e l l u l a i r e s des d e u x c l i c h e s .
B . V u e s a g i t t a l e .
L e s p r e m i e r e s c o u p e s , c o r r e s p o n d a n t 2 l a p e r i p h e r i e de l'amas c e l - l u l a i r e , n e l a i s s e n t a p p a r a P t r e q u e du c y t o p l a s m e . Au f u r et a m e s u r e q u e l ' o n p r o g r e s s e v e r s le c e n t r e d e l a p r e p a r a t i o n , les c e l l u l e s s o n t plus n o m b r e u s e s . S o u v e n t d e s d e b r i s c e l l u l a i r e s ( d ) s o u s f o r m e d ' a m a s d e n s e s et d e v e s i c u l e s , t o u c h e n t o u s e t r o u v e n t g r o c h e s d e s c e l l u l e s ( F i q . 5). C e t t e i m a g e p o s i t i v e , o b t e n u e A l a m a s s e 1 3 3 ~ s + c o r r e s p o n d p a r f a i t e m e n t 2 l ' i m a g e n e g a t i v e C N - 2 la rnasse 26 (Fig. 6).
C2-552 JOURNAL DE PHYSIQUE
3. L o c a l i s a t i o n d u 5 - f l u o r o - u r a c i l e
L a p r e m i e r e c o u p e f r o n t a l e de la c u l t u r e c e l l u l a i r e , i m a g e e 2 la m a s s e 2 6 C N - , m o n t r e d e s k e r a t i n o c y t e s c o n f l u e n t s avec l e u r s n o y a u x (N) e t l e u r s n u c l 6 o l e s (n) (Fig. 7). L e 5 - f l u o r o - u r a c i l e , d e t e c t 6 p a r son ion n e g a t i f F - 2 l a m a s s e 1 9 e s t l o c a l i s 6 d a n s l e s n o y a u x et l e s n u c l e o l e s (Fig. 8).
C O N C L U S I O N
1. A p r e s i m p r g g n a t i o n des c o u p e s s e m i - f i n e s a v e c une s o l u t i o n d e c h l o - r u r e de c e s i u m , l ' i n t e n s i t e d e 1 1 6 m i s s i o n des i o n s 1 3 3 ~ s + f a c i l i t e l ' o b s e r v a t i o n e t la p r i s e des c l i c h e s i o n i q u e s a v e c un t e m p s d ' e x p o s i - t i o n c o u r t . L ' e x i s t e n c e d ' u n c o n t r a s t e e n t r e l e s s t r u c t u r e s c e l l u l a i r e s par r a p p o r t au m a t e r i e l d ' i n c l u s i o n p e r m e t l ' i d e n t i f i c a t i o n d e s c e l l u - les e t d e c e r t a i n s o r g a n e l l e s i n t r a c e l l u l a i r e s . L e s mPrnes o r g a n e l l e s de c e s m s m e s c e l l u l e s p e u v e n t G t r e e g a l e m e n t e t u d i e s en m i c r o s c o p i e p h o t o n i q u e o u e l e c t r o n i q u e .
2. L e s c o u p e s s e r i 6 e s p a r a l l s l e s ou p e r p e n d i c u l a i r e s au plan d 1 6 t a l e - m e n t d e l a c u l t u r e c e l l u l a i r e p e r m e t t e n t u n e m e i l l e u r e l o c a l i s a t i o n
s p a t i a l e d e s e l e m e n t s au s e i n d e la c e l l u l e o u d e l a c u l t u r e c e l l u l a i - r e .
3. L a l o c a l i s a t i o n du 5 - f l u o r o - u r a c i l e ainsi d 6 t e r m i n e e est e n accord a v e c l e s h y p o t h e s e s a c t u e l l e s c o n c e r n a n t l e s i t e d ' a c t i o n de c e m 6 d i - c a m e n t a n t i c a n c e r e u x au n i v e a u d e 1 ' A D N et de 1 ' A R N n u c l 6 a i r e /8/.
B I B L I O G R A P H I E
C A S T A I N G R., S L O D Z I A N G . : In P r o c e e d i n g o f t h e E u r o p e a n R e g i o n a l C o n f e r e n c e o n E l e c t r o n M i c r o s c o p y , D e l f (1960) 1 6 9 .
C A S T A I N G R., S L O D Z I A N G. : J . M i c r o s c o p i e 1 ( 1 9 6 0 ) 3 9 5 . G A L L E P. : Ann. P h y s . Biol. M e d . 4 2 (1970)-84.
G A L L E P . : In M i c r o p r o b e ~ n a l y s i s x p p l i e d t o C e l l s and T i s s u e s . L o n d o n / N e w Y o r k , A c a d e m i c P r e s s ( 1 9 7 4 ) 8 9 .
G A L L E P. : S c a n E l e c t r o n M i c r o s c . 1 1 (1979) 7 0 3 .
R E G N I E R M., D E L E S C L U S E C . and PRUNERAS M. : A c t a D e r m a t o v e n e r 53
( 1 9 7 3 ) 241.
R E Y N O L D S E.D. : J. Cell. B i o l . 1 7 (1963) 2 0 8 .
G O O D M A N L.S., G I L M A N A.: In t h e ~ h a r m a c o l o g i c a l basis o f T h e r a p e u - t i c s , F i r t h E d i t i o n ( 1 9 7 5 ) 1 2 7 4 .