Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Faculté des Sciences

Aspects de la dynamique non linéaire

d’un oscillateur cellulaire : étude expérimentale et théorique du rôle de l’échange sodium/calcium

de la cellule B pancréatique

Thèse présentée en vue de l’obtention du grade légal de

Docteur en Sciences

David Gall

Mars 1999

C

^e travail à été effectué dans le service de Pharmacodynamie et Thérapeutique, l’Unité de Chronobiologie Théorique de l’Université Libre de Bruxelles et le dépar- tement de Physique Biomédicale de l’Université de Göteborg. Je remercie les nom- breuses personnes qui ont contribué à la réalisation de cette thèse :

– le Professeur André Herchuelz de m’avoir acceuilli au sein du service de Phar- macodynamie et d’encourager une approche multidisciplinaire des problèmes biologiques au sein de son laboratoire.

– le Professeur Guy Gusman qui m’a soutenu tout au long de ce travail.

– le Professeur Patrik Rorsman de m’avoir acceuilli au sein de son équipe dans le laboratoire de Physique Biomédicale de l’Université de Göteborg qui était l’endroit idéal pour s’initier aux techniques électrophysiologiques.

– le Professeur Albert Goldbeter pour m’avoir permis de travailler au sein de l’Unité de Chronobiologie Théorique et de découvrir la diversité et l’importance de l’organisation temporelle des systèmes biologiques.

– Isabella Susa avec qui j’ai eu le plaisir de collaborer pour la partie théorique de ce travail. Elle restera pour moi "le Soleil Noir d’Italie".

– Krister Bokvist qui m’a initié au "patch-clamp" et avec qui j’ai passé de longues et agréables soirées "magiques". Sa femme, Åsa, et lui m’ont toujours accueilli avec plaisir lors de mes divers séjours en Scandinavie. J’espère que nos chemins se croiseront encore souvent.

– le Professeur Philippe Lebrun qui a toujours été prêt à répondre à mes nom- breuses questions et qui est une source inépuisable de conseils judicieux et de références bibliographiques. Sa rigueur méthodologique constitue pour moi une référence.

Jeannot Hendrickx, Marcel Hermann, Adama Kamagate, Catherine Lebeau, Carine Maggetto, Quynh-Anh Nguyen, Jérome Ouedraogo, Christiane Pastiels, Rami Saba, Sophie Sokolow, Jacqueline Sergooris , Pascale Surardt, Françoise Van Eylen et Anne Van Praet.

– Erik Renström et Lena Sperling qui m’ont invité chez eux un nombre incalcu- lable de fois et m’ont permis d’apprécier les plaisirs de l’équitation, la beauté de la nature et la gastronomie suédoise.

– Juris Galvanovskis dont j’ai partagé l’amitié et avec qui j’ai eu de longues dis- cussions lors des nombreux "coffee-breaks" au coeur de l’hiver suédois.

– Sebastian Barg et Sven Göpel avec qui j’ai passé des moments mémorables à Copenhague.

– Carina Ämmällä qui m’a permis de vivre quelques mois dans l’un des plus agréables quartier de Göteborg.

– tous les autres membres du département de Physique Biomédicale de l’Univer- sité de Göteborg : Lena Eliasson, Mats Holmqvist, Barbro Jilderos, Jon Sand- blom, et Lena Olofsson.

– Geneviève Dupont pour sa lecture attentive des premières versions de ce ma- nuscript et pour son aide lors de la thèse annexe. Je remercie également tous les autres membres membres de la "Goldteam" pour leur accueil amical : Di- dier Gonze, Gianluca Maria Guidi, José Halloy, Gérald Houart, Jean-Christophe Leloup, Nicolas Markadieu, Pierre-Charles Romond et Marc Roussel.

– tous les membres du laboratoire de Recherche sur la Reproduction et du la- boratoire de Biochimie Pathologique avec qui j’ai partagé mes repas et de très nombreux gâteaux : Nadia Cirelli, Josiane Delogne, Claudine Dictus, Pénélope Fizman , le Professeur Guy Graff, Christiane Gueuning, Hubert Lisélélé, Sylvain Meuris, Jean-Bosco Mouafo, Anne-Marie Vanbellinghen.

– ma grand-mère, mes parents, pour leur soutien sans faille.

Ce travail à été rendu possible grâce au soutien financier du FRIA (Fonds pour la Formation à la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture), de l’IREN (Islet Research European Network), de Novo Nordisk A/S et du service de Pharmacodynamie et Thérapeutique de l’Université Libre de Bruxelles.

1 Introduction 5

2 Physique de la membrane cellulaire et modèles théoriques 7

2.1 Introduction . . . 7

2.2 Propriétés électriques des membranes cellulaires . . . 7

2.3 Physiologie et activité électrique de la cellule B pancréatique . . . 17

2.4 Modèles théoriques de la cellule B pancréatique . . . 23

2.4.1 Le modèle de Sherman-Rinzel-Keizer . . . 26

2.4.2 Dynamique du modèle SRK . . . 33

2.5 L’échangeN a⁺/Ca²⁺ . . . 38

2.5.1 Rôle physiologique . . . 40

2.5.2 Modèle I . . . 40

3 Etude expérimentale de l’échange N a⁺/Ca²⁺ de la cellule B pancréa- tique 43 3.1 Introduction . . . 43

3.2 Dispositif expérimental . . . 44

3.2.1 La technique du voltage-clamp. . . 44

3.2.2 Microfluorimétrie . . . 50

3.2.3 Obtention des cellules . . . 52

3.2.4 Solutions. . . 54

3.2.5 Analyse des données . . . 54

3.3 Résultats. . . 55

3.3.1 Rôle de l’échange N a⁺/Ca²⁺ dans la régulation de [Ca²⁺]_i . . 55

3.3.2 Dépendance de I_{N a/Ca} au potentiel membranaire . . . 61

3.4 Discussion . . . 64

3.4.1 L’échangeN a⁺/Ca²⁺ est impliqué dans la régulation de[Ca²⁺]i 66 3.4.2 L’échange N a⁺/Ca²⁺ est électrogène . . . 69

3.4.3 I_{N a/Ca} est une fonction linéaire du potentiel membranaire . . 71

3.5 Conclusions . . . 71

4 Effet du N a⁺ extracellulaire sur l’activité électrique des îlots pan- créatiques 73 4.1 Introduction . . . 73

4.2 Dispositif expérimental . . . 74

4.2.1 La technique du current-clamp. . . 74

4.2.2 Obtention des cellules . . . 79

4.2.3 Solutions. . . 79

4.2.4 Analyse des données . . . 79

4.3 Effet du N a⁺extracellulaire sur l’activité électrique . . . 80

4.4 Discussion . . . 82

4.5 Conclusions . . . 85

5 Etude théorique du rôle de l’échange N a⁺/Ca²⁺ 87 5.1 Introduction . . . 87

5.2 Proposition d’un modèle minimal de I_{N a/Ca} . . . 87

5.3 Modèle I . . . 90

5.4 Modèle II . . . 92

5.5 Modèle III . . . 96

5.6 Effet du N a⁺ extracellulaire . . . 98

5.7 Modulation de la "plateau fraction" par I_{N a/Ca} . . . 100

5.8 Effet du glucose extracellulaire . . . 102

5.9 Modèle multicellulaire . . . 102

5.9.1 Modèle d’un réseau de cellules B électriquement couplées . . . 104

5.9.2 Dynamique du[Ca²⁺]i dans le modèle multicellulaire . . . 107

5.10 Discussion . . . 109

5.11 Conclusions . . . 111

6 Conclusions 113 A Equations et paramètres 115 A.1 Comparaison données/modèle minimal . . . 115

A.2 Modèle I . . . 116

A.3 Modèle II . . . 117

A.4 Modèle III . . . 117

A.5 Code FORTRAN . . . 118

A.5.1 Modèle I . . . 118

A.5.2 Modèle multicellulaire . . . 123

Introduction

L

^es organismes vivants sont des structures complexes où l’organisation temporelle joue un rôle aussi important que l’organisation spatiale. Cette organisation tem- porelle s’exprime au travers d’un large éventail de phénomènes oscillants. Ces rythmes sont perceptibles au niveau de l’organisme dans son ensemble : rythmes circadiens, cycles hormonaux, respiration, rythme cardiaque. Cette propriété s’étend naturelle- ment au niveau cellulaire où l’on rencontre oscillations biochimiques et activité élec- trique. C’est à cette dernière classe de phénomènes que nous allons nous intéresser.

L’activité électrique des cellules excitables se manifeste sous la forme d’oscillations de la différence de potentiel transmembranaire. L’existence de ces oscillations repose sur les propriétes électriques particulières de la membrane de ces cellules. L’exis- tence de gradients ioniques transmembranaires entretenus par la cellule, combinée avec la perméabilité ionique sélective de la membrane, permet à cette dernière de se comporter comme un circuit électrique non linéaire. Cette non linéarité permet l’ap- parition d’oscillations complexes du potentiel membranaire qui jouent un rôle clé dans de nombreux processus physiologiques, notamment au niveau neuronal, cardiaque et pancréatique. En effet, la sécretion d’insuline par la cellule B pancréatique est asso- ciée à une activité électrique périodique caractérisée par l’apparition d’oscillations en salves ("bursting"). Le but de cette thèse est d’évaluer le rôle d’une protéine mem- branaire, l’échangeur N a⁺/Ca²⁺ , dans la régulation des oscillations du potentiel membranaire de la cellule B pancréatique.

La motivation de ce travail est double. Premièrement, d’un point de vue théorique, aucun des modèles mathématiques de l’activité électrique de la cellule B pancréatique ne prend en compte l’existence de l’échange N a⁺/Ca²⁺ . D’autre part, d’un point de vue expérimental, l’absence d’inhibiteur spécifique de l’échange N a⁺/Ca²⁺ , uti- lisable dans les conditions physiologiques, empêche toute évaluation de l’influence de

cette protéine sur le processus insulino-sécrétoire. Notre approche a été à la fois expé- rimentale et théorique. Nous avons pu détecter et étudier l’activité de cette protéine dans la membrane de la cellule pancréatique. A partir de ces données expérimen- tales, nous avons modifié les modèles théoriques existant afin d’y inclure le processus l’échangeN a⁺/Ca²⁺ . Les modèles ainsi modifiés nous ont permis d’explorer le rôle de l’échange N a⁺/Ca²⁺ dans la régulation de l’activité électrique périodique de la cellule B pancréatique.

Après cette brève introduction, nous examinons, dans le chapitre deux, les pro- priétes électriques de la membrane cellulaire permettant de la décrire en terme de circuit équivalent. Ensuite, un bref apercu de la physiologie de la cellule B pancréa- tique nous permettra de comprendre les bases d’un modèle mathématique minimal décrivant l’activité électrique particulière de ces cellules. Enfin, nous verrons en quoi consiste le processus d’échangeN a⁺/Ca²⁺ et comment l’inclure dans le modèle théo- rique existant. Le chapitre trois décrit l’approche expérimentale qui nous a permis de détecter et d’étudier l’échange N a⁺/Ca²⁺ de la cellule B pancréatique isolée.

Nous présentons les résultats ainsi obtenus qui indiquent que l’échange N a⁺/Ca²⁺

est actif dans des conditions proches des conditions physiologiques. Nous examinons également comment l’activité de ce transporteur varie en fonction de la concentra- tion intracellulaire d’ions calcium libres ([Ca²⁺]i ) et de la différence de potentiel transmembranaire. Le chapitre quatre décrit la caractérisation expérimentale des ef- fets transitoires d’une réduction de la concentration extracellulaire de sodium sur les oscillations périodiques du potentiel membranaire de la cellule B pancréatique. Nous proposons une explication qualitative de nos résultats reposant sur une modification de l’activité de l’échangeN a⁺/Ca²⁺ . Nous débutons le chapitre cinq par la proposi- tion d’un modèle minimal du courantI_{N a/Ca} , lié à l’activité de l’échangeN a⁺/Ca²⁺

, basé sur les données du chapitre trois. Nous proposons ensuite trois modèles théo- riques de l’activité électrique de la cellule B pancréatique, reposant sur des hypothèses physiologiques différentes, incluant I_{N a/Ca} . Ces modèles nous permettent d’établir un lien quantitatif entreI_{N a/Ca} et les effets transitoires d’une réduction de la concen- tration extracellulaire de sodium sur les oscillations du potentiel membrananaire de la cellule B. Ainsi validés par l’expérience, ces modèles nous permettent d’étudier le rôle physiologique de l’échangeN a⁺/Ca²⁺ dans la régulation de la[Ca²⁺]_i et des os- cillations du potentiel membranaire de la cellule B. Finalement, dans le chapitre cinq, nous tirons des conclusions des résultats des chapitres précédents et nous tentons de définir les perspectives de recherches ouvertes par le présent travail.

Physique de la membrane cellulaire et modèles mathématiques de la cellule B pancréatique

2.1 Introduction

D

^ansce chapitre, nous allons tout d’abord examiner les bases physiques des mo- dèles mathématiques de l’activité électrique des cellules excitables. Nous allons nous intéresser particulièrement aux propriétés électriques des membranes cellulaires.

Nous nous pencherons également sur la physiologie de la cellule B pancréatique. En particulier, nous verrons que la sécretion d’insuline est étroitement liée à l’activité électrique de la cellule. Ensuite , nous étudierons le modèle mathématique de l’ac- tivité électrique de la cellule B pancréatique qui servira de point de départ à notre travail. Enfin, nous examinerons comment modifier ce modèle afin de tenir compte de l’existence du processus d’échange N a⁺/Ca²⁺ .

2.2 Propriétés électriques des membranes cellulaires

Comme toutes les cellules vivantes, la cellule B possède une membrane plasmique.

Cette membrane est constituée essentiellement de phospholipides et de protéines. La structure moléculaire des phospholipides est caractérisée par l’existence d’une partie polaire hydrophile connectée à deux chaines hydrophobes. Cette structure particulière implique qu’en milieu aqueux ces molécules forment spontanément une bicouche d’en- viron 50-100 Å, les parties hydrophobes s’associant et les parties hydrophiles faisant face à l’extérieur. L’intérieur fortement hydrophobe de ces bicouches constitue une

ATP ADP bicouche

lipidique

canal transporteurs

diffusion simple

diffusion facilitée (transport passif)

transport a c t i f

ion [ S ]_o

[ S ]_i [ S ]_o > [S]_i

Fig. 2.1 – Vue schématique de la membrane cellulaire et des différents types de mécanismes de transport ionique. On considère que les différents mécanismes sont sélectifs pour l’espèce ioniqueS et que les concentration intra,[S]_i, et extracellulaire, [S]o, en S sont telles que , [S]o>[S]i. On distingue la bicouche lipidique, un canal ionique, un transporteur passif et un transporteur actif (une ATP-ase dans ce cas)

barrière à la diffusion des ions solvatés. Cette faible diffusion des ions au travers d’une bicouche de phospholipides se traduit par une résistivité électrique élévée qui peut at- teindre10¹⁵Ω.cm(alors qu’elle n’est que de l’ordre de10²Ω.cmau sein du cytoplasme ou du milieu extracellulaire). Au sein de cette bicouche, on trouve un grand nombre de protéines. Elles remplissent les fonctions spécifiques de la membrane. Elles jouent le rôle de récepteurs, d’enzymes, elles constituent des mécanismes facilitant l’entrée et la sortie d’ions de la cellule. Cette aptitude de certaines protéines à moduler les flux ioniques transmembranaires est l’origine de l’existence de l’activité électrique des cellules excitables. Les protéines impliquées dans les mouvements ioniques trans- membranaires sont de deux types : les canaux ioniques et les transporteurs (figure

2.1).

Les canaux ioniques sont des protéines transmembranaires constituant des pores aquifères au travers de la membrane. Des changements conformationnels de la protéine peuvent amener ces canaux soit dans un état ouvert soit dans un état fermé. Dans l’état ouvert, les ions diffusent au travers du pore et, dans l’état fermé, la diffusion est empêchée. Une autre propriété importante de ces canaux est due au fait que ces pores, d’un diamètre de 5 à 8 Å, présentent une très grande sélectivité ionique. Cette sélectivité est explicable par la variabilité des dimensions moléculaires des pores et par l’existence de distribution des charges sur les parois internes de ceux-ci. Les différents canaux sont classés en fonction de leur sélectivité ionique et des facteurs modulant leur ouverture (par exemple : variation du potentiel membranaire, présence d’un ligand).

L’étude directe des propriétés de ces canaux a été rendue possible par la technique du patch clamp. Elle permet notamment de mesurer le courant associé à l’ouverture d’un seul canal (figure2.2). Les conductances unitaires des canaux ioniques ainsi observées peuvent aller de quelques pS à plus d’une centaine depS. Les courants unitaires sont au moins de l’ordre du pA, ce qui correspond au transport d’environ 6 10⁶ ions par seconde (Hille, 1992)[44].

Il existe un autre type de protéine impliquée dans la régulation des échanges io- niques transmembranaires. Il s’agit des transporteurs. Ces protéines transporteuses possèdent des sites de liaisons pour un soluté spécifique (ion, sucre ou acide aminé) et subissent des changements conformationnels leur permettant de transférer le soluté lié d’un côté à l’autre de la membrane. Il est probable que ces protéines forment des pores transmembranaires dont une extrémité est bloquée par une sous-unité qui assure la translocation des ligands (Läuger, 1991)[55]. Elles constituent soit des mécanismes de transport passif, facilitant la diffusion d’un soluté suivant son gradient électro- chimique, ou des mécanismes de transport actifs qui, couplé à une source d’énergie (hydrolyse de l’ATP ou gradient ionique), transfèrent des solutés contre leur gradient électrochimique. Par exemple, la protéine GLUT-2, présente dans la membrane de la cellule B pancréatique de rongeur, est un mécanisme de transport passif du glucose.

La N a⁺/K⁺ATPase, qui maintient une concentration de K⁺ intracellulaire dix à vingt fois supérieure à la concentration extracellulaire (inversement pour leN a⁺), est un exemple de transport actif. Au niveau des flux ioniques transmembranaires, les transporteurs se distinguent des canaux ioniques par un nombre d’ions transportés par protéine et par unité de temps beaucoup plus faible (de l’ordre de10⁴ions/s). Les courants unitaires correspondants sont inaccesibles expérimentalement, ce qui rend difficile l’étude des mécanismes moléculaires impliqués.

Fig. 2.2 – Courant élémentaire lié à l’ouverture d’un canal ionique mesuré à un potentiel membranaire constant de -140mV. Cet enregistrement montre 8 ouvertures successives d’un seul canal ionique dans un fragment de membrane d’une cellule.

Chaque ouverture correspond à une déflection de la trace vers le bas. Le courant élémentaire correspondant à l’ouverture du canal est d’une intensité 6.6 pA, ce qui correspond au transport de4.1 10⁷ ions/s (d’après Hille, 1992)

+ + + +

+

+ +

+

+ +

+ +

+ -

- - -

- -

- - - -

- -

- -

- -

+ +

+

+ -

membrane compartiment II

compartiment I

+ + -

Fig. 2.3 – Potentiel de membrane. Le système est divisé en deux parties homogènes I etII, occupées par deux solutions de KCl de concentrations différentes C_I < C_II, séparées par une membrane perméable à l’ion K⁺ mais imperméable aux ions Cl⁻. Les ions K⁺ diffusent spontanément au travers de la membrane de II vers I. Les compartiments se chargent respectivement négativement et positivement. Les deux solutions se comportent comme des conducteurs en équilibre, de potentiels électriques uniformesV_IetV_II, et leurs charges excédentaires respectives vont se localiser de part et d’autre de la membrane, donnant lieu à un saut de potentiel V_I−V_II >0.

L’existence de gradients ioniques transmembranaires, entretenus par la cellule, combinée à la perméabilité sélective de la membrane aux différents ions entraîne l’apparition d’une différence de potentiel entre le cytosol et le milieu extracellulaire.

Illustrons ce phénomène dans un cas simplifié, où l’on a un gradient ionique et une membrane semi-perméable. Considérons le cas idéalisé d’un système fermé , à tempé- rature et pression constantes et uniformes, mais de composition chimique spatialement inhomogène. Supposons que le système soit divisé en deux parties homogènesI etII, occupées par deux solutions deKCl de concentrations différentes C_I < C_II, séparées par une membrane perméable à l’ion K⁺ mais imperméable aux ions Cl⁻. Les ions K⁺ vont diffuser spontanément au travers de la membrane de II vers I et ces com- partiments vont se charger respectivement négativement et positivement (figure 2.3).

Les deux solutions se comportent comme des conducteurs en équilibre, de potentiels électriques uniformesVI et VII. Les charges excédentaires vont se localiser de part et d’autre de la membrane, donnant lieu à un saut de potentielV_I−V_II >0. La variation d’énergie libre de Gibbs associée au transfert spontané d’une petite quantitédnd’ions K⁺, de II vers I, est donnée par

dG=

µ^I_K−µ^II_K

dn+zF(V_I−V_II)dn≤0, (2.1) où µ^I_K et µ^II_K sont les potentiels chimiques de l’ion K⁺ respectivement dans le com- partiment I et dans le compartiment II. Le second terme étant le travail à fournir pour faire passer ces ions du potentielV_II au potentiel V_I et z est la valence de l’ion perméant etF la constante de Faraday. L’équilibre est atteint lorsqueC_I, C_II, V_I et V_II sont tels que :

µ^I_K−µ^II_K +zF(V_I −V_II) = 0, (2.2) Si les solutions sont suffisamment diluées,on a

∆V =VI −VII = RT zF lnC_II

C_I , (2.3)

C’est l’équation de Nernst (1888)[73]. Par exemple, si l’on considère C_I = 5mM et CII = 140mM, ce qui correspond approximativement aux concentrations physiolo- giques respectivement extra et intracellulaires en ions K⁺, on a

V ≡V_II −V_I =−75mV, (2.4) où V est la différence de potentiel membranaire, le potentiel de référence étant par convention celui du milieu extracellulaire. Cette valeur est proche de celle observée expérimentalement qui est d’environ - 70 mV. La situation représentée par l’équa- tion de Nernst est une simplification extrême de la réalité physique au niveau de la

concentration [ S ]_i

potentiel

x = 0 x = l

distance

V

I_S

0 mV [ S ]_o

ψ( x ) C (x)

S

membrane

i n t é r i e u r e x t é r i e u r

β_S[ S ]_i

β_S[ S ]o

Fig. 2.4 – Electrodiffusion des ions au travers d’une membrane à l’état stationnaire.

Le flux de l’ion S au travers de la membrane est associé à un courantI_S. On suppose que le champ électrique est constant au sein de la membrane.

membrane cellulaire. Elle représente la situation d’équilibre pour une membrane per- méable à une seule espèce ionique. Or, les membranes cellulaires sont perméables à plus d’une espèce ionique et les flux ioniques liés au processus d’électrodiffusion n’y sont pas à l’équilibre.

Dans ce cadre, Goldman (1943)[32] et Hodgkin et al. (1949)[46] se sont intéres- sés à l’électrodiffusion, à l’état stationnaire, de plusieurs espèces ioniques au travers d’une membrane. Leur point de départ est l’équation de Nernst-Planck modélisant le processus d’électrodiffusion d’ions S, sans interactions mutuelles, au travers d’une membrane. On considère une membrane d’épaisseurl séparant deux compartiments, de composition chimique homogène, contenant des ions S en solution et, respective- ment, de concentrations [S]_i et [S]_o. De plus, on suppose qu’il existe une différence de potentiel V entre les deux compartiments. L’intensité du courant par unité de surface, associé au passage des ions S au travers de la membrane, obéit à l’équation

différentielle suivante,

I_S =−z_SF D_S

dc_S(x)

dx + F z_sc_s(x) RT

dψ(x) dx

(2.5) oùz_S est la valence de S, D_S la constante de diffusion de S dans la membrane,c_S(x) la concentration en S etψ(x) le potentiel associé à l’existence d’un champ électrique transmembranaire. Remarquons que si l’on considère la situation d’équilibre (I_S=0), on retrouve bien l’équation (2.3). On peut réécrire la relation 2.5 comme,

I_S

exp(z_SF ψ/RT) DS

=−z_SF d

dx{c_Sexp(z_SF ψ/RT)} (2.6) Si l’on considère la situation illustrée à la figure 2.4, en supposant que ψ(x) varie linéairement dans la membrane (approximation du champ constant) et que D_S est constant pour l’ensemble de la membrane, l’intégration de2.6dex= 0 àx=ldonne,

I_S =P_Sz_S²V F² RT

[S]i−[S]oexp(−zSF V /RT)

1−exp(−z_SF V /RT) , (2.7) où P_S =β_SD_S/l définit la perméabilité de S au travers de la membrane, avec β_S le coefficient de partition eau-membrane pour S. On remarque que la relation entre I_S etV est non linéaire lorsque[S]i est différent de[S]o. Néanmoins, expérimentalement, on observe que certains canaux ioniques, lorqu’ils sont ouverts, se comportent comme des conducteurs ohmiques, même en présence d’un gradient de concentration. Cette observation s’explique par le fait que l’approximation du champ constant n’est pas valide pour ces canaux. La relation2.7nous permet d’obtenir le potentiel membranaire à l’état stationnaire, pour une membrane perméable à plusieurs espèces ioniques. Par exemple, si les seuls ions perméants sontN a⁺,K⁺etCl⁻et que la cellule maintient les gradients ioniques transmembranaires grâce à des transporteurs non électrogéniques, le potentiel membranaire,V tel que

I_{N a}+I_K+I_Cl= 0, (2.8)

est donné par,

V = RT

F lnP_K[K]_o+P_{N a}[N a]_o+P_Cl[Cl]_i

P_K[K]_i+P_{N a}[N a]_i +P_Cl[Cl]_o, (2.9) Dès lors, lorsque la membrane devient plus perméable pour un ion donné, le potentiel membranaire tend vers le potentiel de Nernst de cet ion. La composition ionique du milieu diffère de celle du milieu intracellulaire. De façon générale, le milieu extracel- lulaire est riche en ions N a⁺ et pauvre en ionsK⁺. Par contre, la concentration des ionsK⁺ est élevée et celle des ionsN a⁺ faible. La perméabilité de la membrane varie en fonction des circonstances. Par exemple, au repos, la membrane de la cellule est

essentiellement perméable au potassium. Dès lors le potentiel membranaire à l’état stationnaire est alors d’environ -70 mV, proche de la valeur théorique de -75 mV.

Dans les cellules nerveuses, à la suite d’une perturbation extérieure, la perméabilité de la membrane aux ionsN a⁺peut devenir dominante durant des périodes de l’ordre de la milliseconde. Le potentiel membranaire grimpe alors à des valeurs positives de l’ordre de +30mV. C’est ce type de phénomène qui est à l’origine de l’apparition de l’activité électrique des cellules excitables. En effet, l’ouverture des différents canaux en réponse à un stimulus modifie la perméabilité membranaire aux différents ions et donc la différence de potentiel membranaire. En présence de gradients ioniques trans- membranaires entretenus par la cellule, il faut remarquer que2.9, contrairement à2.3, ne correspond pas à une situation d’équilibre. Des flux ioniques nets, liés au processus d’électrodiffusion, existent à l’état stationnaire. Seule la charge totale transportée est nulle. Il s’agit donc d’une situation de régime stationnaire de non-équilibre.

Une théorie rigoureuse des phénomènes de transport ioniques au travers des mem- branes cellulaires doit se baser sur une connaissance détaillée des interactions entre les molécules d’eau, les ions, les canaux, les transporteurs et la membrane pour expliquer les propriétés macroscopiques telles qu’elles sont observées. Hélas, à l’heure actuelle, notre connaissance à ce niveau reste limitée. Néanmoins, une approche phénoméno- logique est possible et peut s’avérer constructive. En particulier, dans le cadre des phénomènes d’activité électrique des cellules excitables, nous allons nous intéresser au modèle introduit par Hodgkin et Huxley (Hodgkin and Huxley, 1952) [45]. Leur approche consiste à représenter l’ensemble des propriétés électriques de la membrane par un circuit équivalent.

Dans cette optique, la bicouche lipidique constitue une fine couche isolante sépa- rant les milieux intra et extracellulaires qui sont conducteurs. Elle peut dès lors être considérée comme un condensateur. La capacité membranaire par unité de surface des membranes biologiques est de l’ordre de 1µF/cm². Ce qui permet de se rendre compte que le transfert d’ions requis pour obtenir une différence de potentiel membra- naire physiologique est très faible et ne perturbe généralement pas les concentrations ioniques mesurées (le Ca²⁺ étant une exception notable). En effet, la charge totale transferée,Q, pour obtenir une différence de potentiel V est telle que

Q=V C_m (2.10)

Le transfert de10⁻¹²mol/cm² d’ions K⁺ suffit à produire une différence de potentiel membranaire de -100 mV.

D’autre part, en première approximation, un canal ionique ouvert peut être consi- déré comme un conducteur ohmique. Cette hypothèse constitue, en général, une bonne

e x t é r i e u r

i n t é r i e u r C_m

IC INa IK IL

g_Na g_K g_L

V_Na V_K V_L

V

Fig. 2.5 – Circuit équivalent de l’axone de calmar (Hodgkin & Huxley, 1952). Les propriétés électriques de la membrane de l’axone de calmar peuvent être décrites par un circuit équivalent composé de quatre branches en parallèle. La branche avec le condensateur représente la bicouche lipidique, les trois autres branches correspondent respectivement aux canaux K⁺, N a⁺et de fuite. Chaque ensemble de canaux est équivalent à une résistance en série avec une pile dont le potentiel correspond au potentiel de Nernst pour l’ion pour lequel les canaux sont sélectifs. Pour les canaux K⁺etN a⁺, les résistances sont variables car il s’agit de canaux sensibles au potentiel membranaire.

approximation de la réalité expérimentale et sera utilisée tout au long de ce travail.

Pour l’ensemble des canaux ioniques d’un type donné présents dans la membrane, le courant membranaire total est proportionnel à la différence entre le potentiel mem- branaire et le potentiel d’inversion (donné par l’équation 2.3) de l’ion pour lequel le canal est sélectif :

Iion =gion(V −Vion) (2.11)

La conductance g_ion dépend de l’état des canaux qui est fonction (non linéaire dans certains cas) du potentiel membranaire, ou de la présence d’un ligand. Elle est d’au- tant plus élevée qu’il y a un grand nombre de canaux ouverts. L’ensemble des canaux ioniques d’un type donné présents dans la membrane est électriquement équivalent à une résistance variable montée en série avec une pile. Le circuit équivalent de la membrane correspond donc à un circuit composé d’un condensateur avec , en paral- lèle, une branche pour chaque type de canal ionique (figure2.5). A ce circuit, on peut appliquer la première loi de Kirchoff. Ce qui nous donne,

C_mdV

dt =−X

I_ion(V) (2.12)

oùP

Iion(V)est une fonction non linéaire de V. Cette équation constitue la base des modèles mathématiques décrivant l’activité électrique des cellules excitables.

Dans la section suivante, nous allons brièvement décrire l’activité électrique de la cellule B pancréatique et examiner son rôle dans le processus insulino-sécrétoire.

L’identification des différents canaux ioniques impliqués nous permettra de préciser la forme de la fonctionP

I_ion(V)dans le cas particulier de la cellule B pancréatique et d’établir un modèle minimal de l’activité électrique de la cellule B pancréatique.

2.3 Physiologie et activité électrique de la cellule B pancréatique

Les cellules B sont localisées au sein des îlots pancréatiques. Ces îlots représentent des unités fonctionnelles très organisées, constituées de populations cellulaires hétéro- gènes en inter-relations. Le nombre de cellules B par îlot est estimé à 3000-4000. Elles constituent ainsi environ 80 % des cellules d’un ilôt et sont couplées par des "gap- junctions" (Meissner, 1976) [68]. Les gap-junctions sont des canaux connectant des cellules adjacentes. Ils permettent l’échange d’ions et de molécules de faibles tailles d’un cytoplasme à l’autre. L’existence de tels canaux implique notamment que les cellules sont électriquement couplées. Dans ce contexte, il est important de souligner

Fig.2.6 – Effet de différentes concentrations de glucose sur le potentiel membranaire et l’activité électrique d’une cellule B au sein d’un îlot pancréatique de souris : (a) absence de glucose, (b) glucose 5.6 mM, (c) glucose 8.3 mM, (d) glucose 11.1 mM, (e) glucose 16.7 mM et (f) glucose 22.2 mM. Les différentes concentrations ont été testées sur la même cellule. (d’après Lebrun, 1993)

que les oscillations en salves du potentiel membranaire sont une propriété intrinsèque des cellules B couplées au sein d’un îlot pancréatique. L’activité éléctrique, induite par le glucose, d’une cellule B isolée est irrégulière (Rorsman & Trube, 1986)[93].

Une caractéristique essentielle des cellules B pancréatiques est leur capacité à jouer le rôle de "détecteur métabolique". Elles adaptent leur sécrétion d’insuline afin de maintenir la glycémie (la concentration sanguine de glucose) dans d’étroites li- mites. L’insuline est la seule hormone capable d’empêcher une élévation excessive de la glycémie en déclenchant le stockage du glucose au niveau du foie, des cellules adipeuses et musculaires. Le mécanisme permettant cette régulation est inhabituel.

En effet, dans la majorité des cellules, c’est la liaison d’un stimulus extracellulaire à un récepteur membranaire qui déclenche une réponse spécifique. Dans le cas de la cellule B pancréatique, le glucose ne se lie pas à un récepteur, mais exerce son effet en augmentant le métabolisme cellulaire.

D’un point de vue expérimental, la conjonction de multiples approches a permis de confirmer (Henquin and Meissner, 1984 ; Howell, 1984 ; Malaisse, 1979 et al. ; Malaisse et al., 1985 ; Malaisse, 1992) [40, 48, 62, 61,60] que le phénomène insulino-sécrétoire consiste en une suite logique d’événements cytophysiologiques étroitement connectés.

Cette séquence comporte :

– L’identification du glucose par les cellules B.

– L’apparition d’une activité électrique périodique

– La migration des grains sécrétoires contenant l’insuline et l’exocytose

Les mécanismes biochimiques sous-tendant le couplage stimulus-sécrétion sont com- plexes et restent, encore à l’heure actuelle compris de façon imparfaite. Néanmoins, un large consensus existe au sujet de l’importance de l’activité électrique dans le processus insulino-sécretoire.

En présence d’une concentration insulinotrope de glucose, l’activité électrique des cellules B au sein d’un îlot pancréatique se présente sous la forme d’oscillations en salves ("bursting") du potentiel membranaire . Elle fut mesurée pour la première fois par Dean & Matthews (1968) [17] dans des îlots pancréatiques de souris par la technique de l’empalement cellulaire. Par la suite, des résultats similaires furent ob- tenus pour les îlots pancréatiques de rat (Ikeuchi & Cook, 1984 ; Pressel & Missler, 1991)[49, 86] et humains (Falke et al., 1989)[22]. De facon générale, il apparaît que le profil de l’activité électrique de la cellule B pancréatique est contrôlé par la concen- tration extracellulaire de glucose (figure 2.6). En l’absence de glucose, le potentiel membranaire est stable, avoisinant -60, -70 mV. A une concentration extracellulaire de glucose de 5.6 mM, une dépolarisation membranaire de±15 mV est visible mais ne

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0

Vm (mV)

16 12

8 4

0

temps (s)

-50 -40 -30 -20 -10

V m (mV)

6.5 6.4

6.3 6.2

6.1 6.0

temps (s)

A

B

a b

c

d

Fig.2.7 – (A) Illustration des caractéristiques d’un cycle des oscillations en salves du potentiel membranaire d’une cellule B en présence de 11.1 mM de glucose : (a) phase silencieuse de dépolarisation lente, (b) phase de dépolarisation rapide, (c) plateau d’activité au cours duquel apparaissent les potentiels d’actions, (d) phase de repola- risation. (B) Vue détaillées des potentiels d’action produits durant la phase active.

Ces mesures ont été effectuées sur un îlot pancréatique intact, le jour de son isolation (D. Gall, données non publiées)

fait pas apparaître d’activité électrique. Par contre, à 8.3 mM de glucose, on observe une activité électrique périodique faite de la succession de phases silencieuses et de bouffées d’activité qui ont reçu le nom de "burst". Pour des valeurs supérieures de glucose extracellulaire, on assiste à une réduction progressive de la phase silencieuse et à un allongement de la phase active. Par exemple, à 11.1 mM de glucose, la cellule passe 50 % de son temps dans la phase active. Ceci se poursuit jusqu’à la disparition de la phase silencieuse [56].

Il est remarquable que, pour les concentrations de glucose où les oscillations du potentiel membranaire existent, l’allure de celles-ci reste quasiment inchangée. Un cycle de bursting présente toujours la même structure : une phase silencieuse de dé- polarisation lente , une phase de dépolarisation rapide, une phase active formée de la succession de potentiels d’action et une phase de repolarisation (figure 2.7). La conjonction de différentes approches expérimentales a permis d’identifier un certain nombre de canaux ioniques impliqués dans le bursting. Il ressort de ces multiples études que la phase de dépolarisation rapide et la phase ascendante des potentiels d’action sont provoquées par l’ouverture de canaux Ca²⁺ sensibles au potentiel, de type L (canaux Ca(V)). Des canaux K⁺, sensibles au potentiel (canaux K(V)) sont impliqués dans la repolarisation des potentiels d’action. Le mécanisme exact contrô- lant la repolarisation des bursts reste sujet à controverse. Il semble néanmoins que des canaux K⁺, activés par une augmentation de la [Ca²⁺]_i (canaux K(Ca)), soient impliqués.

De plus, des canaux ioniques perméables aux ionsK⁺et sensibles à l’ATP (canaux K(ATP)) ont été mis en évidence dans la membrane de la cellule B (Ashcroft and Rorsman, 1989)[2]. Une augmentation de la concentration en ATP a pour effet la fermeture de ces canaux. Bien qu’ils ne semblent pas impliqués directement dans le bursting (Smith et al., 1990 ; Rosario et al., 1993) [106, 94], ces canaux sont les médiateurs de l’effet du glucose sur l’activité électrique. En absence de glucose, le niveau d’ATP intracellulaire est tel que ces canaux sont ouverts et maintiennent le potentiel membranaire de repos proche du potentiel d’équilibre du K⁺(-70 mV).

L’effet du glucose sur la cellule B s’exerce au travers du mécanisme suivant : le glucose entre dans la cellule et y est métabolisé, la production accrue d’ATP provoque la fermeture des canaux K(ATP). Cette diminution de la perméabilité membranaire au ionsK⁺permet une dépolarisation membranaire et l’apparition de l’activité électrique.

D’autre part, il ne fait plus de doute, à l’heure actuelle, que les canaux K(ATP) sont une composante essentielle dans la régulation du rapport entre la durée de la phase active et la période du bursting ("plateau fraction"). De plus, la valeur de la plateau

16 14 12 10 8 6 4 2 0

Insuline (ng/h/îlot)

35 30 25 20 15 10 5 0

Glucose (mM)

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

plateau fraction

35 30 25 20 15 10 5 0

Glucose (mM)

Aschroft et al. (1972)

Meissner & Schmelz (1974)

A

B

Fig.2.8 – (A) Effet du glucose extracellulaire sur la sécrétion d’insuline. (B) Effet du glucose sur la durée relative de la phase active par rapport à la période du bursting ("plateau fraction").

fraction est corrélée à la quantité d’insuline sécrétée par unité de temps (Meissner &

Schmelz, 1974 ; Wollheim & Sharp, 1981 ; Ashcroft & Rorsman, 1989b) [69, 112, 3].

Elle atteint 50% de sa valeur maximale à 11.1 mM et sature à partir de 18 mM de glucose extracellulaire (figure 2.8).

Les variations de [Ca²⁺]_i constituent le lien entre l’activité électrique et la sé- crétion. Dans la cellule B pancréatique, la [Ca²⁺]_i basale est d’environ 100 nM. La concentration extracellulaire est de l’ordre de 1 mM. La cellule maintient donc un gradient de concentration de Ca²⁺ très important entre les deux faces de la mem- brane plasmique. L’existence d’un tel gradient permet aux ionsCa²⁺ de jouer le rôle de signal amplificateur intracellulaire. En effet, dans de telles conditions, une faible augmentation de la perméabilité membranaire auCa²⁺ provoque une augmentation importante de la[Ca²⁺]_i . Il est établi que l’influx périodique deCa²⁺ par les canaux Ca(V), durant la phase active de l’activité électrique, constitue le signal déclenchant de la sécretion d’insuline. Lors d’une stimulation par le glucose, les oscillations du po- tentiel membranaire entraînent des oscillations synchrones de la [Ca²⁺]i dans toutes les cellules B de chaque îlot (Santos et al., 1991 ; Gilon & Henquin., 1992)[98, 29].

Des mesures simultanées de la [Ca²⁺]_i et de la sécrétion d’insuline dans un même îlot indiquent que la sécrétion oscille en phase avec les variations de la [Ca²⁺]_i , qu’elles soient spontanées ou induites (Rosario et al., 1986 ; Gilon et al., 1993)[95, 30]. Les détails du mécanisme biochimique par lequel une élévation de la [Ca²⁺]_i déclenche la migration des granules sécrétoires et l’exocytose ne sont pas encore connus à l’heure actuelle. La figure 2.9donne un schéma simplifié de l’ensemble du processus insulino- sécrétoire.

2.4 Modèles mathématiques de l’activité électrique de la cellule B pancréatique

Dans cette section, nous allons examiner en détail le modèle le plus simple de l’activité électrique de la cellule B pancréatique tel qu’il a été proposé par Sherman et al. (1988). Nous étudierons ensuite brièvement la dynamique non linéaire sous tendant les oscillations en salves du potentiel membranaire. Ce modèle nous servira de base lorsque nous entamerons l’étude de l’impact de l’activité de l’échangeN a⁺/Ca²⁺ sur l’activité électrique de la cellule B pancréatique.

Fig. 2.9 – Modèle schématique du processus insulino-sécrétoire chez le rongeur. Le glucose est transporté dans la cellule par le transporteur GLUT-2, présent dans la membrane de la cellule B pancréatique. Le glucose est ensuite métabolisé, ce qui augmente la concentration intracellulaire en ATP ([AT P]_i ). Cette augmentation de [AT P]_i provoque la fermeture des canaux K(ATP). Cette inhibition des canaux K(ATP) induit une dépolarisation membranaire, permettant l’apparition d’une ac- tivité électrique périodique. L’ouverture périodique des canaux Ca(V) provoque une entrée massive d’ions Ca²⁺ dans la cellule. Ces ions Ca²⁺ vont activer des protéines impliquées dans la migration des granules sécrétoires et leur exocytose.

e x t é r i e u r

i n t é r i e u r C_m

I

IC Ca(V) IK(V) IK(Ca)

g_Ca(V) g_K(V) g_K(Ca)

V_Ca V_K V_K

Fig.2.10 – Circuit équivalent de la membrane de la cellule B pancréatique (Sherman et al., 1988). La branche avec le condensateur représente la bicouche lipidique, les trois autres branches correspondent respectivement aux canaux Ca²⁺ sensibles au potentiel, canauxK⁺ sensibles au potentiel, et au canauxK⁺ activés par la[Ca²⁺]_i .

2.4.1 Le modèle de Sherman-Rinzel-Keizer

Dès 1980, Atwater et al. (1980) [4] ont proposé une premiere explication qualita- tive de l’existence de l’activité électrique périodique de la cellule B pancréatique. Le mécanisme proposé, basé sur les données disponibles à l’époque, reposait sur l’exis- tence dans la membrane de la cellule B de trois types de canaux ioniques : des canaux Ca²⁺

(Matthews and Sakamoto ;1975)[65] etK⁺(Atwater et al., 1979 ; Henquin, 1977 ; Hen- quin, 1980) [5,38,39] sensibles au potentiel (canaux Ca(V) et K(V)), dont l’ouverture est provoquée par une dépolarisation membranaire et des canauxK⁺sensibles au cal- cium (Atwater et al., 1979 ; Ribalet and Beigelman,1979) [6, 89], activés par une augmentation de la [Ca²⁺]_i (canaux K(Ca)). Au départ de cette hypothèse, Chay et Keizer (1983) [15] proposèrent le premier modèle mathématique à 5 variables décri- vant l’activité électrique de la cellule B pancréatique. Dans les années qui suivirent, la validité du modèle de Chay et Keizer fut confirmée par l’observation directe par la technique du "patch clamp", au niveau de la cellule B pancréatique , des courants associés aux canaux K(Ca) (Findlay et al., 1985) [23], aux canaux K(V) (Rorsman

& Trube, 1986) [93] et aux canaux Ca(V) de type L (Rorsman & Trube, 1986) [93]

. Sherman et al. (1988) [103] proposèrent alors un modèle simplifié, à trois variables, (modèle SRK) tenant compte de ces données expérimentales. Les équations du modèle SRK fournissent une description en accord avec les mesures expérimentales d’activité électrique de cellule B au sein d’un îlot de pancréatique (figure 2.11). Dans le cadre de ce modèle, l’équation 2.12 donnant l’évolution temporelle de V devient,

Cm

dV

dt =−X

Iion(V) =−I_K(V)−I_Ca(V)−I_K(Ca) (2.13) où C_m est la capacité membranaire, I_K(V) est le courant correspondant aux canaux K⁺ sensibles au potentiel, I_Ca(V) est le courant correspondant aux canaux Ca²⁺ sen- sibles au potentiel etI_K(Ca)est le courant correspondant aux canauxK⁺sensibles au calcium . Examinons l’expression détaillée des différents courants.

Le courant des canaux K(V) est donné par,

I_K(V) =g_K(V)n(V −V_K) (2.14) oùg_K(V)est la conductance maximale due aux canaux K(V) (correspondant à la situa- tion où tous les canaux K(V) sont ouverts) etV_K est le potentiel de Nernst pourK⁺. La variablenreprésente la fraction de canaux K(V) ouverts, ou, de façon équivalente, la probabilité d’ouverture d’un canal K(V). Les auteurs supposent que l’ouverture du

-80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10

V (mV)

40 30

20 10

0

temps (s)

0.80

0.75

0.70

0.65

0.60

0.55

0.50 [Ca2+ ] i (µM)

Fig.2.11 – Oscillations du potentiel membranaire et de la[Ca²⁺]_i obtenues à partir du modèle SRK. Potentiel membranaire, V, (trait continu) et concentration cytosolique de Ca²⁺, [Ca²⁺]_i , (trait pointillé). Les courbes ont été obtenues par intégration numérique des équations 2.13, 2.21 et2.36.

canal est liée à l’existence d’une sous-unité, électriquement chargée, de la protéine ca- nal. Dès lors, lorsque le champ électrique transmembranaire est modifié, la variation de la force exercée sur cette sous-unité induit des changements conformationnels de la protéine. Ces changements conformationnels vont provoquer l’ouverture du canal en cas de dépolarisation membranaire. Par conséquent, n représente la probabilité que la sous-unité chargée de la protéine soit dans un état provoquant l’ouverture du canal. Les auteurs font l’hypothèse que les transitions entre l’état activateur et l’état inactivateur de la sous-unité correspond à une réaction du premier ordre. Dès lors, l’évolution temporelle den est donnée par,

dn

dt =α_n(V)(1−n)−β_n(V)n (2.15) oùα_n(V)etβ_n(V)sont les fonctions cinétiques caractérisant, respectivement, le pas- sage de l’état inactivateur à l’état activateur et le passage de l’état activateur à l’état inactivateur de la sous-unité de la protéine canal. L’équation 2.15 peut être réécrite comme,

dn

dt = n∞(V)−n

τ_n(V) (2.16)

où on a défini la probabilité d’ouverture à l’état stationnaire, n∞(V), et le temps caractéristique,τ_n(V), par

n∞(V) = αn(V)

α_n(V) +β_n(V) (2.17)

τ_n(V) = 1

α_n(V) +β_n(V) (2.18)

Les fonctions n∞ et τn sont obtenues par ajustement sur les données expérimen- tales de (Rorsman & Trube, 1986) [93] et sont de la forme,

n_∞(V) = 1

1 +exp[(Vn−V)/Sn] (2.19)

τ_n(V) = c

exp[(V −V)/a] +exp[(V −V)/b] (2.20) où Vn, Sn, a, b, c et V sont des constantes. La figure (2.12) montre l’allure de ces deux fonctions. En particulier, on voit quen∞(V)est une fonction croissante de V et correspond bien à une activation produite par une dépolarisation membranaire (figure 2.12). De façon à obtenir une activité électrique proche des observations, les auteurs introduisent également un paramètre sans dimension,λ, permettant l’ajustement de τ_n, l’équation 2.16 devient donc,

dn

dt =λn∞(V)−n

τ_n(V) , (2.21)

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

n ∞

-70 -60 -50 -40 -30 -20

V (mV)

40 35 30 25 20

τ n (ms)

-70 -60 -50 -40 -30 -20

V (mV)

0.4 0.3 0.2 0.1 0.0

m ∞

-70 -60 -50 -40 -30 -20

V (mV)

1.0 0.9 0.8 0.7 0.6

h ∞

-70 -60 -50 -40 -30 -20

V (mV)

Fig.2.12 – graphique des fonctions liées à l’activation du courant des canauxK⁺ sen- sible au potentiel s, n∞(V) et τ_n(V), des fonctions liées à l’activation, m∞(V), et l’inactivation, h∞(V) , du courant des canaux Ca²⁺ sensibles au potentiel .

Le courant dû aux canaux Ca(V) est donné par,

I_Ca(V) =g_Ca(V)m∞(V)h∞(V)(V −VCa) (2.22) oùg_Ca(V)est la conductance maximale due aux canaux Ca(V) etV_Caest le potentiel de Nernst pourCa²⁺. Ici l’activation dépend de l’état de deux sous-unités indépendantes, électriquement chargées, de la protéine obéissant à une cinétique du premier ordre.

Mais afin de tenir compte de l’existence d’un processus d’inactivation, deux types de sous-unités ont été introduites. Une sous-unité contrôle l’activation et une autre sous-unité l’inactivation. Les variables m et h représentent les probabilités que les sous-unités contrôlant, respectivement l’activation et l’inactivation, soient dans un état provoquant l’ouverture du canal. La probabilité d’ouverture du canal est donc mh. L’évolution temporelle de m eth correspondante est

dm

dt = m∞(V)−m

τ_m(V) , (2.23)

dh

dt = h∞(V)−h

τ_h(V) , (2.24)

où on a défini,

m_∞(V) = α_m(V)

α_m(V) +β_m(V) (2.25)

τ_m(V) = 1

α_m(V) +β_m(V) (2.26)

h∞(V) = α_h(V)

α_h(V) +β_h(V) (2.27)

τh(V) = 1

α_h(V) +β_h(V) (2.28)

oùα_m(V),α_h(V),β_m(V)etβ_h(V)sont les fonctions cinétiques caractérisant le passage entre l’état activateur et l’état inactivateur des deux sous-unités impliquées dans l’ouverture de la protéine canal. Les données expérimentales ayant montré queτ_m(V) et τ_h(V) sont très faibles devant l’échelle temporelle des oscillations du potentiels membranaires, les auteurs font l’approximationm =m∞(V) eth=h∞(V), avec,

m∞(V) = 1

1 +exp[(V_m−V)/S_m] (2.29) h∞(V) = 1

1 +exp[(V −Vh)/Sh] (2.30) oùV_m, S_m,V_h etS_h, sont des constantes. La figure (2.12) montre l’allure de ces deux fonctions. On voit queh∞(V)est une fonction décroissante deV et correspond à une

inactivation produite par une dépolarisation membranaire.

En se basant sur le modèle proposé par Plant (1978)[81], les auteurs utilisent l’expression suivante pour le courant des canaux K(Ca) :

I_K(Ca)=g_K(Ca)([Ca²⁺]_i)(V −V_K) (2.31) La conductance de l’ensemble des canaux K(Ca),g_K(Ca), est une fonction de[Ca²⁺]_i puisque les canaux passent de l’état ouvert (O) à l’état fermé (C) en cas de liaison de la protéine avec un ionCa²⁺. Les auteurs supposent que cette liaison s’effectue avec avec une cinétique du premier ordre :

k₊

C+Ca O (2.32)

k₋

Si les cinétiques du processus de liaison et de dissociation sont rapides par rapport à la variation temporelle de [Ca²⁺]_i , la réaction 2.32 est toujours à l’équilibre, les populations relatives de canaux dans l’état ouvert et fermé satisfont donc,

[O]

[C] = [Ca²⁺]_i

[K_d] (2.33)

oùKd =k−/k+. Par conséquent, la fraction de canaux dans l’état ouvert est [O]

[O] + [C] = [Ca²⁺]_i

K_d+ [Ca²⁺]_i (2.34)

et donc

g_K(Ca)([Ca²⁺]_i) = g_K(Ca) [Ca²⁺]_i Kd+ [Ca²⁺]i

(2.35) oùg_K(Ca) est la conductance maximale due aux canaux K(Ca).

Enfin, ils complètent leur approche par une équation de bilan pour [Ca²⁺]_i qui constitue un modèle minimal de la régulation du Ca²⁺dans la cellule. L’influx de Ca²⁺dans le cytosol est dû au courant des canaux Ca(V), I_Ca(V). Les processus d’ex- pulsion et séquestration intracellulaire des ions Ca²⁺du cytosol sont eux représentés par un terme linéaire −kCa[Ca²⁺]i, où kCa est une constante. L’équation donnant l’évolution temporelle de[Ca²⁺]_i est donc,

d[Ca²⁺]_i dt =f

αI_Ca(V)−k_Ca[Ca²⁺]_i

(2.36)

où f traduit le fait que la plus grande partie du Ca²⁺entrant dans la cellule va se lier à des protéines et ne participe donc pas à la modification de la [Ca²⁺]_i et α est un facteur permettant la conversion du courant I_Ca(V)en variation de concentration cytosolique par unité de temps donné par,

α= 1

2V_cellF (2.37)

où V_cell est le volume cellulaire et F la constante de Faraday. Les équations (2.13), (2.21) et (2.36) définissent le modèle SRK à trois variables de l’activité électrique de la cellule B pancréatique.

Ce type de modèle est souvent qualifié de modèle unicellulaire ("single cell mo- del"). Cette terminologie est quelque peu abusive. Ce type de modèle ne permet pas d’expliquer l’activité électrique irrégulière d’une cellule isolée. Les modèles correspon- dant à cette situation incluent explicitement l’aspect stochastique de l’ouverture des canaux ioniques (Sherman et al, 1988)[103]. Le couplage électrique entre un grand nombre de ces cellules "stochastiques" permet de restaurer une activité électrique régulière de type bursting (Sherman & Rinzel,1991)[102]. Cet effet du couplage in- tercellulaire peut être compris intuitivement. Le couplage électrique entre cellules B permet une diminution de la perturbation relative due au caractère aléatoire des ou- vertures des canaux ioniques. En effet, ce couplage permet l’addition des courants élémentaires. Plus le nombre de cellules couplées est élevé, plus le comportement de cette somme de courants aléatoires se rapproche de son comportement moyen. Dans ce cadre, les modèles similaires au modèle SRK correspondent à une "supercell" dans la terminologie utilisée par Sherman & Rinzel (1991)[102]. La "supercell" correspond au cas limite d’un nombre infini de cellules "stochastiques" couplées entre-elles par une conductance infinie.

D’autre part, il est important de souligner que les modèles que nous considérons ici sont des modèles minimaux, c’est à dire des modèles dont le nombre minimal de variables permet néanmoins de reproduire le phénomène observé. Cette reduction de la complexité de la réalité expérimentale à la dynamique liant quelques variables permet la mise en lumière des mécanismes sous-tendant les oscillations du potentiel membranaire. Dans un tel contexte, les paramètres utilisés ne correspondent pas tou- jours à une realité expérimentale simple mais caractérisent plutôt le comportement global de plusieurs mécanismes. Par exemple, dans le modèle SRK, k_Ca caractérise l’activité de l’ensemble des processus impliqués dans l’expulsion des ions Ca²⁺ du cytosol.