Stratégie de recherche de gènes impliqués dans la croissance folliculaire

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Submitted on 1 Jun 2020

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François Hatey

To cite this version:

François Hatey. Stratégie de recherche de gènes impliqués dans la croissance folliculaire. Productions

animales, Institut National de la Recherche Agronomique, 1998, 11 (3), pp.231-234. �hal-02693726�

LÕobjectif de cette recherche est dÕidentifier les g•nes responsables de la variabilitŽ natu- relle du taux dÕovulation, dans une perspec- tive dÕamŽlioration gŽnŽtique. Nous nÕenvisa- gerons ici que les g•nes impliquŽs dans la croissance folliculaire, ou folliculogen•se, lÕune des composantes du taux dÕovulation, lÕautre composante Žtant lÕatrŽsie folliculaire.

La stratŽgie du g•ne Ç candidat positionnel È proposŽe ici comprend quatre volets :

1 - lÕidentification des rŽgions du gŽnome o• se trouvent des g•nes impliquŽs dans la variabilitŽ du caract•re ;

2 - lÕidentification et la caractŽrisation des g•nes impliquŽs dans la fonction responsable du caract•re ;

3 - la recherche de g•nes candidats par co- localisations entre les rŽgions identifiŽes en 1 et les g•nes identifiŽs en 2 ;

4 - la recherche dÕun polymorphisme des g•nes candidats et dÕun lien entre ce polymor- phisme et la variabilitŽ du caract•re.

Identifier les rŽgions du gŽnome

Cette identification consiste en la recherche de locus quantitatifs (ou QTL pour Quantita- tive Trait Loci), cÕest-ˆ-dire de rŽgions du gŽnome impliquŽes dans lÕexpression dÕun caract•re quantitatif polygŽnique, ici le taux dÕovulation. Approche exclusivement gŽnŽ- tique, elle ne nŽcessite aucune information prŽalable de type physiologique, biochimique ou pathologique sur la nature et le lieu dÕex- pression des g•nes impliquŽs.

Cette recherche nŽcessite :

- des animaux issus de familles convenable- ment constituŽes et pour lesquels des mesures de diffŽrents caract•res sont effectuŽes ; ces familles doivent •tre informatives, cÕest-ˆ-dire prŽsenter des variations de performances pour les caract•res analysŽs, en particulier ici pour le taux dÕovulation ;

- des marqueurs polymorphes rŽpartis sur lÕensemble du gŽnome. Ces marqueurs sont essentiellement des microsatellites, cÕest-ˆ- dire des rŽpŽtitions, en nombre variable, dÕun m•me motif de 1 ˆ 4 bases, par exemple (CA)

. Ce nombre de rŽpŽtitions peut •tre dŽterminŽ facilement par amplification de lÕADN gŽno- mique par PCR (Polymerase Chain Reaction).

La recherche des locus quantitatifs consiste en une analyse de liaison entre dÕune part les diffŽrents marqueurs et dÕautre part le carac- t•re Ç taux dÕovulation È, cÕest-ˆ-dire que lÕon recherche une cosŽgrŽgation, association prŽ- fŽrentielle entre certains all•les dÕun mar- queur donnŽ et des valeurs faibles ou fortes du taux dÕovulation.

LÕINRA a mis en place en 1992 un pro- gramme de recherches de locus quanti-

tatifs sur les descendants dÕun croisement Meishan/Large White. LÕanalyse porte sur 1 000 animaux F2 (500 m‰les et 500 femelles), un premier lot de 63 marqueurs microsatel- lites (CA) et une centaine de mesures cou- vrant des caract•res de croissance, de qualitŽ de la viande, de reproduction et de comporte- ment. Pour la reproduction, sont mesurŽs lÕ‰ge ˆ la pubertŽ (dosage de progestŽrone), lÕ‰ge au premier Ïstrus, le taux dÕovulation ˆ 9 mois, les taux plasmatiques de FSH (Folli- culo Stimulating Hormone), le nombre dÕem- bryons ˆ 30 jours de gestation, les caractŽ- ristiques des tractus gŽnitaux m‰les (entre 160 et 180 jours) et femelles (ˆ 30 jours de gestation). Les premi•res analyses de donnŽes indiquent la prŽsence de QTL pour le taux dÕovulation et le nombre dÕembryons sur les chromosomes 7 et 8 (Milan et al 1998).

Cette dŽmarche dÕidentification de locus quantitatifs constitue aussi le point de dŽpart du clonage positionnel qui vise ˆ dŽlimiter la zone le plus prŽcisŽment possible pour y rechercher ensuite les g•nes et, parmi ceux-ci, ceux qui prŽsentent un polymorphisme asso- ciŽ au caract•re. BasŽ uniquement sur des mŽthodes de biologie molŽculaire, le clonage positionnel a permis dÕidentifier pr•s dÕune centaine de g•nes, mais il demeure tr•s long et complexe (Ballabio 1993).

Identifier et caractŽriser les g•nes impliquŽs dans la fonction

Cette approche, fonctionnelle, est basŽe sur les donnŽes de la physiologie, de la biochimie ou de la pathologie qui permettent de dŽsi- gner le(s) lieu(x) dÕexpression des g•nes recherchŽs et m•me, plus prŽcisŽment, cer- tains g•nes importants dans la fonction consi- dŽrŽe. Dans le cas de la composante folliculo- gen•se du taux dÕovulation, lÕun des lieux dÕexpression est bien Žvidemment lÕovaire, et certains g•nes comme ceux des enzymes de la stŽro•dogen•se, des facteurs de croissance ou encore des rŽcepteurs aux hormones gonado- tropes, peuvent •tre considŽrŽs comme impor- tants dans le dŽveloppement du follicule ova- rien. Il est Žvident quÕil est tr•s difficile, ˆ ce stade et sur ces seules bases, dÕidentifier les g•nes responsables de la variabilitŽ du taux dÕovulation.

Cette identification passe par lÕŽtablisse- ment dÕun rŽpertoire plus ou moins ciblŽ des g•nes exprimŽs dans un tissu ou un organe, ici le follicule, cÕest-ˆ-dire lÕisolement et lÕiden- tification des diffŽrents transcrits prŽsents dans les cellules folliculaires. Parmi les diffŽ- rentes stratŽgies dÕisolement, certaines font

F. HATEY

INRA Laboratoire de GŽnŽtique Cellulaire, BP 27, 31326 Castanet- Tolosan Cedex

StratŽgie de recherche des g•nes impliquŽs

dans la croissance folliculaire

appel ˆ des gŽnoth•ques dÕADN complŽmen- taires (ADNc), dÕautres ne passent pas par une Žtape de clonage prŽalable ; les unes ana- lysent indistinctement tous les g•nes, les autres utilisent diffŽrentes techniques pour sŽlectionner certains g•nes en fonction dÕhy- poth•ses biologiques.

LÕidentification des g•nes par sŽquen•age et comparaison de sŽquences se fait sans cher- cher, au moins dans un premier temps, ˆ obte- nir la sŽquence compl•te de tout le transcrit.

Au contraire, en particulier avec les gŽno- th•ques, on ne dŽterminera que la sŽquence de lÕextrŽmitŽ des ADNc ; cÕest la stratŽgie des Ç Žtiquettes È (Expressed Sequence Tags ou EST, Adams et al 1991).

Analyse de lÕensemble des g•nes

LÕutilisation de gŽnoth•ques dÕADNc est un moyen privilŽgiŽ puisque, obtenues par trans- cription inverse des ARN messagers, elles sont un reflet du tissu dÕorigine ; il y a donc une bonne correspondance, qualitative et quantitative, entre les ARN messagers du tissu et les ADNc de la gŽnoth•que : lÕanalyse de clones prŽlevŽs au hasard constitue alors un moyen simple et efficace pour identifier les g•nes exprimŽs dans un tissu. Cette approche va cependant se trouver limitŽe par le phŽno- m•ne de redondance, cÕest-ˆ-dire la prŽsence de tr•s nombreuses copies des m•mes ARN messagers. En effet, au sein dÕune cellule, tous les ARN messagers ne sont pas prŽsents en un m•me nombre de copies, et si certains ARN messagers sont tr•s abondants, dÕautres peuvent •tre moins abondants ou rares. Des protocoles de Ç normalisation È ont ŽtŽ propo- sŽs pour rŽduire ces Žcarts dÕabondance des ADNc, lÕidŽal Žtant dÕobtenir une population dans laquelle tous les ADNc seraient prŽsents en une seule copie. Ils sont basŽs sur des cycles de dŽnaturation/renaturation au cours desquels les esp•ces les plus abondantes se renaturent prŽfŽrentiellement, ce qui conduit ˆ un enrichissement de la fraction simple brin en ADNc rares.

DÕautres techniques permettent dÕobtenir directement un profil dÕexpression plus ou moins facile ˆ analyser, comme la SAGE (Serial Analysis of Gene Expression, Velcu- lescu et al 1995), le mRNA Differential Dis- play (Liang et Pardee 1992) ou lÕAFLP-cDNA (Amplified restriction Fragment Length Poly- morphism, Bachem et al 1996). Ces deux der- ni•res techniques sont bien adaptŽes ˆ la recherche ciblŽe de g•nes et seront envisagŽes dans le paragraphe suivant. Dans la SAGE, un court fragment est prŽlevŽ ˆ un endroit prŽcis des ADNc, les diffŽrents fragments sont assemblŽs entre eux, clonŽs et sŽquencŽs. La sŽquence de ces fragments et leur frŽquence permettent de dŽfinir un profil dÕexpression.

Recherche ciblŽe

En fonction dÕhypoth•ses biologiques, diffŽ- rentes stratŽgies peuvent •tre utilisŽes pour rechercher des g•nes spŽcifiques : par

exemple, compte tenu du r™le primordial de la FSH dans le dŽveloppement folliculaire, les g•nes rŽgulŽs par cette hormone.

Pour sŽlectionner les ADNc rŽgulŽs, diffŽ- rentes stratŽgies de tri peuvent •tre utilisŽes, comme le tri diffŽrentiel dÕune gŽnoth•que, le mRNA Differential Display et lÕAFLP-cDNA, ou encore diffŽrents protocoles de soustrac- tion, tels le cDNA-RDA (Representational Dif- ference Analysis, Hubank et Schatz 1994) et la PCR suppressive (Diatchenko et al 1996).

Dans le tri diffŽrentiel, deux rŽpliques de la gŽnoth•que sont hybridŽes avec des sondes correspondant aux deux situations que lÕon veut comparer. La diffŽrence dÕintensitŽ des signaux dÕhybridation observŽs pour un clone donnŽ indique quÕil contient un ADNc corres- pondant ˆ un ARN messager rŽgulŽ.

Dans le mRNA Differential Display et lÕAFLP-cDNA, les ADNc sont sŽparŽs en diffŽ- rents sous-groupes de telle sorte que lÕon puisse les individualiser par Žlectrophor•se apr•s amplification par PCR. Ici encore, la comparaison de lÕintensitŽ des bandes obte- nues pour les ADNc correspondants dans les diffŽrentes situations analysŽes permet dÕidentifier les ARN messagers rŽgulŽs.

Dans les techniques de soustraction, la population dÕARN messager Ç cible È, conte- nant les transcrits spŽcifiques (ou les ADNc correspondants) est ŽpuisŽe par hybridation avec un exc•s dÕARN messagers (ou dÕADNc) ne contenant pas ces transcrits. Par exemple, si lÕon cherche les g•nes dont lÕexpression est stimulŽe par la FSH dans les cellules de la granulosa en culture, les ARN extraits des cellules traitŽes par la FSH seront ŽpuisŽs par ceux extraits de cellules non traitŽes. Dif- fŽrents protocoles permettent ensuite de sŽpa- rer les sŽquences spŽcifiques et lÕARN entra”- neur. Ainsi, dans le cas de la RDA et de la PCR suppressive, des adaptateurs sont ajou- tŽs aux ADNc Ç cible È de sorte que, apr•s soustraction, seuls les ADNc spŽcifiques recherchŽs peuvent •tre amplifiŽs par PCR.

La mise en Ïuvre de banques organisŽes

permet une meilleure gestion des informa-

tions concernant les diffŽrents clones : ceux-ci

sont dŽposŽs individuellement dans les puits

de microplaques qui servent pour la conserva-

tion des clones et pour la rŽalisation de

rŽpliques ˆ haute ou tr•s haute densitŽ, par le

dŽp™t dŽcalŽ de lÕensemble des clones de plu-

sieurs plaques sur une m•me membrane. Ces

membranes sont ensuite hybridŽes avec diffŽ-

rentes sondes, de telle sorte quÕil est possible

dÕŽtablir un profil dÕhybridation pour chacun

des clones. LÕacquisition des donnŽes dÕhybri-

dation et leur traitement requi•rent des

moyens dÕanalyse particuliers (Lennon et Leh-

rach 1991, Auffray et al 1995, Nguyen et al

1995). Gr‰ce au dŽveloppement de diffŽrentes

technologies, cette approche peut •tre minia-

turisŽe : des milliers ou des dizaines de mil-

liers de sŽquences peuvent •tre dŽposŽes sur

des surfaces de quelques cm

, permettant

ainsi lÕacquisition simultanŽe dÕun tr•s grand

nombre de profils dÕexpression ; ce sont les Ç

microarrays È, Ç puces ADN È ou Ç DNA chips È (Daignan-Fornier et Aigle 1998), en plein dŽveloppement, qui vont certainement boule- verser lÕŽtude de lÕexpression des g•nes.

En utilisant comme mod•le de folliculoge- n•se des cellules de granulosa en culture, nous avons recherchŽ les g•nes rŽgulŽs par la FSH, en utilisant les techniques de tri diffŽ- rentiel et de Differential Display. Nous avons ainsi isolŽ pr•s de 200 sŽquences uniques dont 70 correspondent ˆ des sŽquences identifiŽes.

Parmi celles-ci, le g•ne de la glutathion S- transfŽrase dont lÕexpression prŽsente des caractŽristiques intŽressantes et que nous prendrons comme mod•le.

Rechercher les co-localisations entre les rŽgions et les g•nes

La localisation chromosomique des g•nes du rŽpertoire est obtenue par cartographie cyto- gŽnŽtique ou par cartographie physique.

La cartographie cytogŽnŽtique est rŽalisŽe soit par hybridation in situ sur les chromo- somes en mŽtaphase, soit, de plus en plus souvent, en utilisant un panel dÕhybrides somatiques. La mise en Ïuvre dÕun tel panel est en effet beaucoup plus simple : elle consiste ˆ rechercher une cosŽgrŽgation entre les chromosomes ou les fragments de chromo- some du porc et les produits dÕamplification PCR spŽcifiques du g•ne que lÕon cherche ˆ localiser (Wilcox et al 1991). La rŽsolution de la carte cytogŽnŽtique est de lÕordre de 10 mŽgabases (Mb).

En utilisant le panel dÕhybrides dŽveloppŽ ˆ lÕINRA (Yerle et al 1996), nous avons localisŽ une quarantaine de g•nes, identifiŽs ou non, parmi les 200 isolŽs. A titre dÕexemple, le g•ne codant pour la glutathion S-transfŽrase de type alpha a ŽtŽ localisŽ sur le bras long du chromosome 7 porcin.

Une localisation rŽgionale est gŽnŽralement obtenue, mais peut ne pas •tre suffisante.

Pour obtenir une localisation plus fine, lÕutili- sation dÕun panel dÕhybrides irradiŽs dans lequel les chromosomes du porc ont ŽtŽ frag- mentŽs en morceaux plus petits par irradia- tion avant la fusion cellulaire est nŽcessaire.

La rŽsolution obtenue en utilisant les hybrides irradiŽs est de lÕordre de la centaine de kilobases (kb).

La cartographie physique utilise des frag- ments dÕADN gŽnomique de plusieurs cen- taines de kilobases, clonŽs dans des chromo- somes artificiels de levure (Yeast Artificial Chromosomes ou YAC) ou de bactŽries (Bacte- rial Artificial Chromosomes ou BAC). Ces fragments de grande taille sont aisŽment loca- lisŽs directement par hybridation in situ ; la rŽsolution est de 150 kb ˆ 1 Mb. La prŽsence du g•ne analysŽ est recherchŽe dans ces frag- ments par amplification PCR ˆ lÕaide dÕamorces spŽcifiques.

En absence de g•nes localisŽs dans la zone dÕintŽr•t, les donnŽes de cartographie compa-

rŽe peuvent permettre de proposer des candi- dats en recherchant, dans les esp•ces pour lesquelles les cartes gŽnŽtiques sont bien dŽveloppŽes, comme lÕhomme et la souris, quels sont les g•nes qui sont localisŽs dans la rŽgion correspondante du gŽnome. En effet, pour la quasi totalitŽ des chromosomes du porc, les rŽgions correspondantes sur les chro- mosomes humains ont ŽtŽ identifiŽes. Dans un deuxi•me temps, il faut vŽrifier si les g•nes candidats ainsi dŽsignŽs correspondent ˆ une fonction qui peut rendre compte des dif- fŽrences dans lÕexpression du caract•re.

Comme dŽmonstration de lÕintŽr•t de la car- tographie comparŽe, rappelons que lÕidentifi- cation du g•ne de lÕhyperthermie maligne au g•ne du rŽcepteur de la ryanodine a dÕabord ŽtŽ Žtablie chez lÕhomme puis, par homologie, chez le porc. Pour apprŽcier le potentiel de cette cartographie comparŽe, les chiffres par- lent dÕeux-m•mes : le nombre de g•nes locali- sŽs chez le porc Žtait de 158 dŽbut 1997 (Yerle et al 1997) ; chez lÕhomme, les rŽsultats accu- mulŽs par un consortium international ont permis la localisation de plus de 16 000 trans- crits (Schuler et al 1996)

Au terme de cette Žtape, nous disposons donc de g•nes candidats qui sont ˆ la fois localisŽs dans la rŽgion du gŽnome identifiŽe au cours de la recherche de QTL et impliquŽs dans lÕexpression du caract•re.

Rechercher le polymorphisme et le lien entre ce polymorphisme et la variabilitŽ du caract•re

La variabilitŽ du caract•re rŽsultant de celle dÕun ou plusieurs g•nes, la derni•re Žtape est la recherche du polymorphisme des g•nes can- didats, polymorphisme qui rŽsulte de plu- sieurs phŽnom•nes diffŽrents, tels que muta- tions ponctuelles, insertions ou dŽlŽtions.

DiffŽrentes mŽthodes permettent de rŽvŽler ce polymorphisme, en particulier la recherche de polymorphisme de conformation et le sŽquen•age.

Le polymorphisme de conformation est basŽ sur la diffŽrence de mobilitŽ des fragments dÕADN en fonction de leur conformation tridi- mensionnelle, et donc de leur sŽquence. Les syst•mes qui ont ŽtŽ dŽveloppŽs permettent de dŽtecter des diffŽrences minimes telles que les substitutions. Ce sont essentiellement la SSCA (Single Strand Conformation Analysis, Orita et al 1989) et la DGGE (Denaturing Gra- dient Gel Electrophoresis, Myers et al 1985).

Dans lÕune et lÕautre technique, les diffŽrences de sŽquence entra”nent des diffŽrences de conformation des brins dÕADN, diffŽrences qui sont rŽvŽlŽes par Žlectrophor•se o• elles se traduisent par des diffŽrences de migration.

Ainsi, la simple analyse par SSCA dÕun

fragment de 220 paires de bases du g•ne de la

glutathion S-transfŽrase, amplifiŽ par PCR ˆ

partir de lÕADN de 12 animaux non apparen-

tŽs, rŽv•le 6 profils diffŽrents. Il reste ˆ dŽter-

miner lÕexistence dÕun lien entre ce polymor- phisme et le taux dÕovulation.

Par ailleurs, le sŽquen•age direct de la zone concernŽe permet dÕidentifier la mutation ˆ lÕorigine du polymorphisme et de pressentir le caract•re Ç causal È de la mutation. Ceci est important puisque seule la mutation Ç causale È prŽsente une liaison absolue avec le carac- t•re.

Il reste enfin ˆ Žtablir sur des familles le lien entre ce polymorphisme et la variabilitŽ du caract•re, aussi bien au niveau de la sŽquence quÕˆ celui de lÕexpression du g•ne correspondant.

Conclusion

Cette approche de candidat positionnel per- met aujourdÕhui dÕidentifier avec certitude le ou les g•nes impliquŽs dans une fonction com- plexe telle que le taux dÕovulation. Elle nÕen reste pas moins une approche longue, nŽcessi- tant plusieurs annŽes de recherches, aussi bien dans les aspects gŽnŽtiques que fonction- nels. Elle a fait ses preuves en pathologie humaine (Collins 1995), il est raisonnable dÕespŽrer quÕil en sera de m•me pour lÕamŽlio- ration gŽnŽtique des esp•ces domestiques.

Contributions

Les donnŽes expŽrimentales prŽsentŽes ici ont ŽtŽ obtenues au laboratoire de GŽnŽtique Cellulaire de lÕINRA (Toulouse), par les cher- cheurs des groupes Ç Carte du porc È : Jo‘l Gellin, AndrŽ Goureau, Yvette Labhib-Man- sais, Denis Milan, Annie Robic et Martine Yerle, Ç GŽnŽtique et DiffŽrenciation ova- rienne È : Catherine Clouscard-Martinato, Fran•ois Gasser, Fran•ois Hatey, Philippe Mulsant et Gwenola Tosser-Klopp et Ç Bioma- thŽmatiques È : Claude Chevalet et Magali San Cristobal-Gaudy.

Le programme de recherche de locus quan- titatifs implique de nombreuses autres Žquipes de lÕINRA, en particulier la Station de GŽnŽtique Quantitative et AppliquŽe (Jouy- en-Josas) et le domaine du Magneraud.

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