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Submitted on 3 Jun 2020
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Analyse par voies physique et biochimique de la dégradation enzymatique de matrices lignocellulosiques
issues de l’industrie papetière.
Maud Babau, Luc Fillaudeau, Xavier Cameleyre, Eric Lombard, Dominique Anne-Archard
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Maud Babau, Luc Fillaudeau, Xavier Cameleyre, Eric Lombard, Dominique Anne-Archard. Analyse par voies physique et biochimique de la dégradation enzymatique de matrices lignocellulosiques issues de l’industrie papetière.. 45. Colloque du Groupe Français de Rhéologie, GFR10, 2010, Lyon, France.
�hal-02306114�
Analyse par voies physique et biochimique de la dégradation enzymatique de matrices lignocellulosiques issues de l'industrie
papetière
M. Babau1,2, L. Fillaudeau1, X. Cameleyre1, E. Lombard1, D. Anne-Archard2,3
1 Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, CNRS UMR5504, INRA UMR792, INSA, 135, avenue de Rangueil F-31077 Toulouse, France
2 Université de Toulouse ; INPT, UPS ; IMFT. Allée Camille Soula, F-31400 Toulouse, France
3 CNRS ; IMFT, Allée Camille Soula, F-31400 Toulouse, France
Résumé : Les ressources lignocellulosiques à haute teneur initiale en matière sèche (issues de l'industrie papetière) se présentent comme source potentielle de substrat fermentescible pour la production de biocarburant de 2nd et 3ème génération. Sous l'action de biocatalyseurs enzymatiques et microbiens la matrice solide complexe mise en solution se dégrade et évolue d’une structure solide fibreuse jusqu'à une solubilisation (liquide) lors de son prétraitement. La dynamique de ces mécanismes, où interviennent des transferts couplés de matière, chaleur et quantité de mouvement, est liée à la diffusion (dans les phases solide ou liquide), à la convection (dispersion mécanique, agitation-mélange et pompage) et à la libération d'inhibiteur (gradient de concentration). Notre étude rapporte l'analyse des mécanismes de liquéfaction du substrat à travers la caractérisation physique et biochimique d'une matrice complexe et des échelles macroscopique (consommation de puissance, rhéométrie), microscopique (granulométrie, morphologie) et moléculaire (analyse biochimique).
Mots-clé : cellulose, fibres, attaque enzymatique, rhéométrie, morphologie, granulométrie, consommation de puissance.
1. Introduction
Les ressources lignocellulosiques, disponibles en grandes quantités et peu coûteuses, constituent des ressources alternatives particulièrement intéressantes comme source de glucose pour l’obtention de molécules énergétiques ou chimiques par bioconversion [1.2]. L'industrie papetière est en capacité de produire une matrice cellulosique prétraitée présentant de nombreux avantages (aucune ou faible concentration de lignine, absence d'inhibiteur microbien) pour de nouveaux bioprocédés [3.4]. Cette matrice doit subir des traitements physico-chimiques et enzymatiques pour libérer les substrats fermentescibles en concentration compatible avec une transposition industrielle réaliste et répondant aux contraintes énergétiques et environnementales [5]. Au cours de ces traitements, la matrice solide complexe évolue d’une structure solide fibreuse dense (suspension solide- liquide), vers des fibres dégradées plus courtes jusqu'à une solubilisation des oligomères (liquide). Notre action se focalise sur la dynamique des phénomènes de transfert et les limitations des réactions biocatalytiques. Elle porte sur l'étude macroscopique des phases de mise en suspension et de liquéfaction du substrat par biocatalyse.
La dynamique de cette étape est liée à la diffusion (dans les phases solide ou liquide), à la convection et à la libération d'inhibiteur (gradient de concentration). Elle est
donc fortement influencée par le comportement rhéologique du milieu [6, 7, 8].
On présente ici la réaction de liquéfaction et son suivi par analyses biochimiques (activité enzymatique, dosages des oses) et physiques en ligne (consommation de puissance) et hors ligne (rhéométrie, granulométrie et morphologie).
Une étude préliminaire, non présentée ici, a permis de définir le mode de pré-traitement de la pâte à papier et le protocole de la réaction. L'objectif de l’étude consistera, à terme, à intégrer une modélisation rhéologique structurée en lien avec l'avancement de la cinétique réactionnelle.
2. Matériels & Méthodes
2.1 Montage et dispositif expérimental
Le dispositif expérimental mis en place se compose d’un système d’agitation intégré sur un viscosimètre, d’une cuve double enveloppe et d’un cryostat permettant le contrôle de la température. Les mesures de couple en ligne se font à l’aide d’un viscosimètre Viscotester VT 550 Haake (Thermo Fisher Scientific) travaillant à vitesse imposée. L’agitateur retenu est une hélice à trois pales profilées cerclées (IKA A310, ∅ 64 mm). Une cuve en verre à fond plat et à double enveloppe (∅int: 80 mm, H:
50 mm, 0.4L utile) a été utilisée. Le chauffage et la circulation d’eau se font via un cryostat HAAKE DC30.
Le viscosimètre est piloté par le logiciel Haake Rheowin (Thermo Fisher Scientific)
2.2 Substrats et enzymes
La pâte à papier utilisée (FPP31) provient de l’usine Tembec de Saint-Gaudens (31). Il s’agit d’une pâte issue de bois de conifère, sa teneur en matière sèche est de 26,1% dont 75,1% de cellulose, 19,1% d'hémicellulose et 2,2% de Klason lignine et des cendres. Sur le protocole retenu, la pâte à papier brute a été prétraitée par extrusion (Prism TSE24MC, filière 400mm : 350 mélange / 50 cisaillement, Thermo Electron Corp.). Un mélange enzymatique (Accellerase 1500 Genencor, réf:
3015155108), constitué principalement d’exoglucanases, d’endoglucanases (2800 CMC U/g), d’hémicellulases et de β-glucosidases (775 pNPG U/g) a été utilisé. Leur activité enzymatique est optimale à 50°C et à pH 4,8.
2.3 Mode opératoire
Dans un premier temps, le substrat (45g) est mis en suspension dans 0.3L d’eau distillée (soit 3.4% massique en matière sèche). Le pH du milieu est ajusté à 4,8 (ajout d’acide orthophosphorique à 85%) et 5µL d’une solution chloramphénicol (5g/L) sont ajoutés pour éviter les contaminations microbiologiques. La température du milieu est maintenue à 40°C sous agitation (300 tr/min).
Dans un second temps, une fois que la suspension est homogène et la température du milieu stabilisée, les enzymes sont ajoutées. La réaction est suivie pendant une centaine d'heure sous agitation (300 tr/min) avec des périodes plus forte (300s, 500 tr/min) toutes les heures.
Les prélèvements (3-4mL) sont effectués toutes les 6 à 10h. Les échantillons sont inactivés par ajout de 50µL de potasse 10M puis stockés à 4°C. Le volume prélevé n'excède pas 15% du volume réactionnel.
2.4 Analyses physiques et biochimiques
Le dosage des sucres est effectué par chromatographie liquide haute performance (Waters Alliance 2690, détecteur d’indice de réfraction Waters 2414 à barrette d’iode 996, 190<λ<300 nm, logiciel d'exploitation Millenium). La colonne est de type HPX-87H (Biorad Aminex) et l'élution se fait avec une solution d'acide sulfurique (0.005M) à 0.5mL/min et 50°C. Avant analyse, les échantillons sont filtrés (filtre en polyamide, 0,45 µm). La calibration autorise la quantification des cellobiose, xylose et glucose jusqu'à 20g/L avec une LOQ de 1g/L et LOD de 0.3g/L.
La granulométrie laser permet d’obtenir une distribution statistique de la taille des particules en suspension par méthode optique (Mastersizer 2000, Malvern Instruments). Les échantillons sont dilués entre 1 et
5/100ème avant analyse. La morphologie des fibres est évaluée au moyen d'un morphogranulomètre (Morpho G3S, Malvern Instrument). Les échantillons sont analysés en voie humide entre lame et lamelle, sous un grossissement x2.5 (zone d'observation 8x8mm²) après dilution au 1/30ème.
Le comportement rhéologique est étudié avec un rhéomètre Bohlin C-VOR 200 (Malvern Instrument) équipé d’une géométrie plan-plan striée (rugosités 500µ).
Cette géométrie permet de minimiser les phénomènes de glissement observés dans de tels échantillons. La taille de l’entrefer est fixée à 1,5mm. Pour prévenir l’évaporation, la surface libre des échantillons est entourée d’un film de vaseline. Les caractérisations sont effectuées à 20°C.
3. Résultats et discussions
3.1 Puissance consommée et libération des oses La figure 1 montre l'évolution du couple normé et des concentrations en glucose libéré en fonction du temps (échelle logarithmique). La mise en suspension de la pâte à papier extrudée se traduit logiquement par une augmentation importante du couple (de 813µNm sur eau à 5991µNm avec la suspension). L'ajout des enzymes entraine une première et courte phase d'augmentation (+17%) de la puissance consommée (t<0.3h), puis une seconde marquée par une décroissance pendant environ 10h. Une dernière phase correspond à une stabilisation du couple à 25% de sa valeur nominale, soit environ 1500µNm. Les remontées soudaines du couple font suite à des phases d'agitation accrues (300s à 500tr/min) et se caractérisent par une courbe en dents de scie.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0,01 0,1 1 10 100 1000
Temps de réaction, [h]
Couple normée, [/]
0 2 4 6 8 10 12
Concentration en glucose et xylose, [g/L]
Mise en suspension Couple normé, [/]) Glucose [g/L]
Fig. 1 : Evolution du couple normée et des concentrations en glucose et xylose en fonction du temps pour 300RPM.
Simultanément, la concentration en glucose croît jusqu'à 10g/L correspondant à un avancement du pourcentage de bioconversion de 31%. La libération du glucose se fait quasi-linéairement pendant 120 heures, mais un plateau est observé au-delà. Deux hypothèses peuvent être
émises: (i) une moindre accessibilité des fibres par les enzymes, traduisant une limitation des transferts et (ii) un phénomène d’inhibition par le substrat, le glucose et le cellobiose étant identifiés comme des inhibiteurs des cellulases et β-glucosidases. Ces 2 hypothèses sont confortées par l'observation en fin d’expérimentation de fibres traduisant des réactions enzymatiques inachevées.
3.2 Evolution granulométrique et morphologique La figure 2 présente la distribution volumique en particules en fonction du diamètre de sphère équivalente et de l'avancement de la réaction. Étant donné la dispersion de taille des fibres, la présence d'un réseau fibrillaire hétérogène, et malgré toutes les précautions prises, le prélèvement d’échantillons quantitativement représentatifs demeure difficile. De plus les analyses morphologiques nécessitent un second échantillonnage et une dilution. Aussi ces caractéristiques seront principalement analysées d’un point de vu qualitatif, le biais des mesures étant trop important pour que les données quantitatives soient significatives.
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
1 10 100 1000 10000
taille du diamètre de la sphère de volume équivalent (µm)
Distribution volumique, [%]
Ech1 (suspension) Ech2, t=0,28h Ech3, t=6,5h Ech4, t=20h Ech5, t=24,1h Ech6, t=28,5h Ech7, t=42h Ech8, t=50,6h Ech10, t=72,7h Ech11, t=86,3h Ech13, t=113,6h Ech15, t=134,1h
Fig. 2 : Evolution de la distribution granulométrique Une distribution bimodale caractérise la suspension initiale : la première population est centrée sur 600µm et la seconde sur 100µm. La forte superposition de ces populations traduit une large dispersion et résulte du pré- traitement mécanique de la pâte à papier, comme l'illustre la figure 3a. La population de "fines" est majoritaire (environ 60%v/v). L'attaque enzymatique induit différentes évolutions corrélées à la fois aux mesures de puissance et à la libération des oses. Dès les premières heures (t<10h), une césure plus accentuée apparaît entre les deux populations, traduisant une rupture entre des fibres et fibrilles plus ou moins solidaires et une diminution du diamètre moyen. La première population tend à se translater vers les fines, ce qui se traduit par une diminution de la taille moyenne des fibres et une dispersion asymétrique accentuée. Cette tendance se prolonge par l'apparition d’une troisième population
(t>30h), autour de 40 µm. La seconde population se translate rapidement vers les fines (t<10h, dp∼300- 400µm) puis se maintient au cours de la bioréaction (t<25h). Enfin, elle devient progressivement majoritaire.
Une dispersion accrue est observée et s'accompagne d'un gonflement et augmentation du diamètre moyen (t>30h).
Ces observations résultent de deux phénomènes: (i) une activité de "découpage" des enzymes entraînant une diminution de taille de la première population, et simultanément (ii) une activité de déstructuration des fibres plus grossières correspondant à une augmentation de la taille apparente. Les hypothèses proposées sont confortées par les figures 3-a, b et c. Initialement, la présence de macro-fibres et de particules plus petites est observée et concorde avec la distribution granulométrique. La présence de fibres "débobinées"
s'accentue avec l'avancement de la réaction pendant que les fines s'amenuisent. La figure 3c confirme la persistance de macro-fibres très fortement débobinées.
L'ensemble démontre le caractère inachevé de la réaction enzymatique.
a) Ech. 1, t=0 b) Ech. 6, t = 28.4h
c) Ech. 15, t = 134h
Fig. 3 : Evolution morphologique des fibres en suspension (Echantillons 1, 6 et 15, dilution 1/30ème)
3.3 Evolution du comportement rhéologique
Il n’a pas été possible de réaliser des mesures de viscosité du milieu réactionnel sous cisaillement ou contrainte imposé car les fibres s’agglomèrent extrêmement rapidement et le milieu est alors très différent de celui présent dans le réacteur. Nous avons donc réalisé des mesures en oscillations pour lesquelles, restant dans le domaine des petites déformations, le milieu ne subit pas de réorganisation. Le domaine linéaire est déterminé sur un balayage en contrainte à 1Hz entre 0.1 et 10 Pa. Un balayage en fréquence est ensuite réalisé dans le domaine linéaire. Les résultats obtenus sur des échantillons
prélevés à différentes étapes de la réaction, entre 0 et 100h, sont présentés sur les figures 4 et 5 avec, respectivement, l’évolution temporelle au cours de la réaction de G’ et G’’ dans le domaine linéaire, et une caractérisation en fréquence de ces prélèvements.
1 10 100 1000 10000
0 50 100
Temps (h)
G', G'' (Pa)
0 45 90
δδδδ (°)
G' G'' δ δ δ δ
Fig. 4 : Evolution temporelle de G’, G’’ (f=1Hz) On observe un comportement très élastique avec un module élastique élevé au temps t=0, c'est-à-dire lorsque la suspension de pâte à papier extrudée est homogène et avant introduction des enzymes. On observe ensuite une décroissance régulière tout en conservant un caractère fortement élastique. Le comportement dynamique de ces suspensions (Fig. 5) évoque un comportement de type viscoplastique, ce qui est en adéquation avec les résultats de Agoda-Tandjawa et al. [9].
1 10 100 1000 10000
0.01 0.1 1 10
f (Hz)
G', G'' (Pa)
G' - 0h G'' - 0h G' - 6.5h G'' - 6.5h G' - 24h G'' - 24h G' - 42h G'' - 42h G' - 64h G'' - 64h G' - 100h G'' - 100h
Fig. 5 : Comportement dynamique des différents prélèvements Au cours de la réaction enzymatique, la quantité et la taille des fibres diminuent tandis que la concentration en sucre augmente. Corrélativement, les caractérisations en oscillations deviennent plus délicates et la dispersion augmente (cf. Fig. 5). Les dernières caractérisations ont ainsi pu être effectuées à t=100h. La figure 4 montre que lorsque le milieu s’appauvrit en fibres, les modules visqueux et élastiques diminuent. Toutefois, on observe également que l’angle de perte varie très peu au cours de la réaction. Ceci peut s’expliquer par l’évolution des
propriétés granulométriques et morphologiques : les deux phénomènes observés sur les évolutions granulométriques (cf. 3.2), à savoir la disparition progressive des fibres petites et fines et la déstructuration des fibres plus grossières dont la taille apparente augmente agissent de façons opposées.
4. Conclusion
Ce travail présente la caractérisation et l’analyse de la dégradation par réaction biocatalytique de matrices ligno- cellulosiques complexes. Il met en évidence un fort impact de l’attaque enzymatique sur la dérive des propriétés mécaniques macroscopiques, ainsi que l’existence de plusieurs phases au cours de la réaction. Il propose une interprétation des phénomènes de limitation observés dans les transferts par une corrélation entre dégradation des fibres et comportement rhéologique macroscopique. La poursuite de ces travaux visera en particulier à analyser l’impact des concentrations d’enzymes et des phénomènes d’inhibition par le glucose.
Références
[1] Sims, R., Taylor, M., Saddler, J. Mabee, W. From 1st to 2nd generation biofuel technologies – An overview of current industry and R&D activities. OECD/IEA Bioenergy, 2008.
[2] Académie des technologies, Les Biocarburants, (Collection:
Académie des technologies, ISBN: 978-2-304-03052-5, 2009).
[3] Vallette, P., de Choudens, C., Le bois, la pâte, le papier.
(Ed. Centre Technique de l'Industrie des Papiers, Cartons et Celluloses, ISBN: 2-906579-00-9, 1987).
[4] Gibbons, W. R., Hughes, S. R., Integrated biorefineries with engineered microbes and high-value co-products for profitable biofuels production, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant, 45, 218–
228 (2009)
[5] Howard, R.L., Abotsi, E., Jansen van Rensburg, E.L. and Howard, S., Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African J. Biotechnol., 2(12), 602-619 (2003)
[6] Tatsumi, D., Matsumoto, T., Rheological properties of cellulose fiber wet webs. J. Cent. South Univ. Technol., 14, 250-253, (2007).
[7] Tatsumi, D., Ishioka, S., Matsumoto, T., Effect of fiber concentration and axial ratio on the rheological properties of cellulose fiber suspensions. J. Soc. Rheology Japan, 30(1), 27- 32, (2002)
[8] Negro, C.; Blanco, A., Fuente, E., Tijero J., Rotor selection for a Searle-type device to study the rheology of paper pulp suspensions. Chem. Eng. Processing A. 46, 37-44 (2007).
[9] Agoda-Tandjawa, G., Durand, S., Berot, S., Blassel, C., Gaillard, C., Garnier, C., Doublier, J.-L. Rheological characterization of microfibrillated cellulose suspensions after freezing. Carbohydrate Polymers, 80, 677-686 (2010)
