Rôle des polynucléaires neutrophiles et du FcgRIV dans les effets vaccinaux induit par immunothérapie antivirale par anticorps monoclonaux

Texte intégral

(1)Rôle des polynucléaires neutrophiles et du FcgRIV dans les effets vaccinaux induit par immunothérapie antivirale par anticorps monoclonaux Jennifer Lambour. To cite this version: Jennifer Lambour. Rôle des polynucléaires neutrophiles et du FcgRIV dans les effets vaccinaux induit par immunothérapie antivirale par anticorps monoclonaux. Médecine humaine et pathologie. Université Montpellier, 2018. Français. �NNT : 2018MONTT064�. �tel-02353233�. HAL Id: tel-02353233 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-02353233 Submitted on 7 Nov 2019. HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés..

(2) !. THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER En Biologie Santé École doctorale CBS2 Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé Unité de recherche IGMM-UMR5535-CNRS. !23)'()+'#$34-5637",%)+'-)5&%$#8,3)+')&'(5'96 γ !:;' ("-+'3)+')<<)&+'="66,-"5>' ,-(5,&'#"%' ,??5-$&87%"#,)'"-&,= ,%"3 )'#"%'"-&,6$%#+' ?$-$63 $-"5>'. ' Présentée par Jennifer LAMBOUR Le 31 Octobre 2018 Sous la direction de Mireia PELEGRIN-ZURILLA !. Devant le jury composé de Valérie GOUILLEUX-GRUART, MCU-PH, GICC. Rapporteur. Gisèle CLOFENT-SANCHEZ, Directeur de Recherche, CRMSB. Rapporteur. Julià BLANCO, Directeur de Recherche, IrsiCaxia. Examinateur. Pascale LOUIS-PLENCE, Chargé de Recherche, IRMB/ INSERM U1183. Examinateur. Gilles UZE, Directeur de Recherche, DIMNP. Président du Jury. Mireia PELEGRIN-ZURILLA, Chargé de Recherche, IGMM. Directrice de Thèse. !. !. "! !.

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(6) « Le progrès des sciences est l'ouvrage du temps et de la hardiesse de l'esprit ».. Voltaire ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !. !. !. &!.

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(8) REMERCIEMENTS En premier lieu, je tiens à remercier les membres du Jury, qui ont accepté d’évaluer mes travaux de Thèse et qui ont fait preuve d’une grande compréhension. Je tiens à remercier tout particulièrement les rapporteurs, qui ont pris le temps de me corriger et de me faire part de leurs remarques. Je remercie Marc Piechaczyk, pour m’avoir donné l’opportunité de réaliser ma Thèse au sein de son équipe, et pour l’initiation à l’escalade. Je remercie chaleureusement ma directrice de Thèse Mireia Pelegrin avec qui j’ai traversé cette aventure scientifique et humaine. Je te remercie de m’avoir conseillé, d’avoir pris en compte mes idées dans l’évolution de la Thèse. Tu as été une directrice de Thèse particulièrement à l’écoute, qui m’a fait progresser sans jamais dénaturer ma pensée. Merci également de ton investissement, au cours de ces années riches en rebondissements et en émotions. Car au-delà d’être une aventure scientifique et professionnelle, cela a aussi été une belle aventure humaine; que j’ai été heureuse de partager avec toi. Je remercie également particulièrement Mar Naranjo-Gomez, avec laquelle j’ai eu la chance de travailler et d’interagir au cours de ma Thèse. J’ai beaucoup appris à ton contact, je te remercie de m’avoir transmis tes connaissances. Merci aussi pour ton éternel optimisme, même dans les situations difficiles, de ton soutien et de ton sourire. Je tiens à remercier les membres de mon comité de Thèse qui ont évalué régulièrement mon travail et qui m’ont conseillé avec bienveillance au cours de ma Thèse. Merci à nos collaborateurs qui ont apporté un regard critique et une aide technologique. Je remercie particulièrement les membres de l’équipe MPL, passé et présent, pour l’ambiance chaleureuse dans laquelle j’ai eu la chance d’évoluer pendant ces années. Merci à Isa, Guillaume, et Marc pour vos remarques toujours constructives. Un grand merci aux Thésards et post-doc, Emilie et Rosy, et Fred, qui ont fait partie de l’équipe MPL. Vos sourires et votre bonne humeur, ont égayer ces années. Je ne pouvais rêver meilleurs collègues de travail. Je remercie particulièrement les Thésards, Claire, Hayeon, Fabienne, Pierre qui ont été plus que des collègues, et qui m’ont aidé et soutenu pendant ma Thèse, comme de vrais amis. Un merci spécial pour Mathias (non je ne t’ai pas oublié !), ça été un plaisir de partager un bureau avec toi pendant ces années de Thèse. Merci de m’avoir supporté, de ta gentillesse, de nos nombreux fous rires, qui m’ont toujours remonté le moral et pour les supers playlists ! Merci également aux membres de l’IGMM, Thésards et post-doc, spécialement les utilisateurs de la SCII, qui ont contribué à l’agréable ambiance de travail. Merci également aux personnels et responsables des plateformes (animalerie, cytométrie), ainsi qu’aux organismes qui m’ont financé, l’ANRS et la Ligue régionale contre le cancer, sans qui ces travaux n’auraient pas été possibles. Je finirai ces remerciements par une note plus personnelle, mais essentielle à mes yeux, car je remercie mes proches, famille et amis, qui ont été d’un soutien indéfectible et qui m’ont porté par leur amour et leur affection tout au long de ce périple.. !. (!.

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(10) ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !. ROLE DES POLYNUCLEAIRES NEUTROPHILES ET DU FCγRIV, DANS LES EFFETS VACCINAUX INDUIT PAR IMMUNOTHERAPIE ANTIVIRALE PAR ANTICORPS MONOCLONAUX ! ! ! ! ! ! ! !. !. !. *!.

(11) ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !. !. "+!.

(12) TABLE DES MATIERES TABLE DES MATIERES ............................................................................................... 11! TABLE DES ILLUSTRATIONS ...................................................................................... 15! TABLE DES TABLEAUX .............................................................................................. 19! TABLE DES ANNEXES................................................................................................. 21! ABBREVIATIONS ....................................................................................................... 23! INTRODUCTION ......................................................................................................... 27! I.Les anticorps monoclonaux antiviraux ...........................................................................27! I.1. Les anticorps monoclonaux antiviraux en quelques définitions .........................28! I.1.1. Structure des AcM antiviraux ..................................................................................... 28! I.1.2. Fonctions effectrices des AcM antiviraux.................................................................... 29! I.1.3. Histoire des techniques de production et d’isolation d’AcM ........................................ 31! I.1.3.L’évolution des formats d’AcM en thérapeutique :....................................................... 35! I.2. L’avènement des anticorps monoclonaux antiviraux..........................................37! I.3. Enjeux sociétaux, perspectives thérapeutiques ...................................................39! II. Modulation de la réponse immune par les AcM antiviraux.........................................39! II.1. Rôle des immuns complexes (IC) dans la modulation de la réponse immune ..........................................................................................................40! II.2. Effets vaccinaux des anticorps monoclonaux antiviraux...................................41! II.2.1. Modèle murin d’infection par le virus FrCasE :un modèle de choix dans la mise en évidence des effets vaccinaux des AcM antiviraux................... 41! II.2.2. Mis en évidence des effets vaccinaux induits par une immunothérapie antivirale par AcM .................................................................................................................................... 42!. II.3. Effets vaccinaux induits par des AcM antiviraux dans le cadre d’infections virales humaines .........................................................................................................44! III. Les FcγRs, atout des AcM antiviraux : .......................................................................46! III.1. Définition et classification des FcγRs ................................................................46! la III.2. Les FcγRs de type I, similitudes et différences entre l’Homme et souris ...........................................................................................................................47! III.3. Le FcγRIV ..........................................................................................................50! III.4. Conséquences immunologiques induites par des FcγRs ...................................51! III.4.1. Rôle des FcγRs sur les fonctions effectrices des AcM ............................................... 51! III.4.2. FcγRs et fragment Fc : variants et conséquences sur la réponse immunitaire ............. 52! IV. Les polynucléaires neutrophiles : des cellules aux multiples talents ..........................54! IV.1. Les polynucléaires neutrophiles ........................................................................54! IV.1.1. Présentation générale ............................................................................................... 54!. !. ""!.

(13) IV.1.2. Fonctions effectrices des neutrophiles ...................................................................... 55! IV.1.3. Fonctions immunomodulatrices des neutrophiles...................................................... 58!. IV.2. Rôle des neutrophiles dans le cadre d’une infection virale ..............................61!. RESULTATS ............................................................................................................... 69! I. Rôle clé des polynucléaires neutrophiles dans l’immunité induite par les immunothérapies antivirales. .............................................................................................69! II. Potentialisation de l’activation des polynucléaires neutrophiles in vitro par les IC ....89! II.1. Activation phénotypique des neutrophiles in vitro.............................................90! II.2. L’activation phénotypique des neutrophiles par les IC in vitro est dépendante du fragment Fc. ...........................................................................................................92! II.3. Activation fonctionnelle des neutrophiles par les IC in vitro. ............................93! II.4. Potentialisation de l’activation des neutrophiles par les IC dans des conditions inflammatoires et/ou immunomodulatrice in vitro. ...................................................99! II.4.1. Effet du TNFα sur la potentialisation de l’activation des neutrophiles par des IC in vitro .......................................................................................................................................... 100! II.4.2. Effet du IFNγ sur la potentialisation de l’activation des neutrophiles par les IC in vitro .......................................................................................................................................... 103! II.4.3. Effet du IFN-I sur la potentialisation de l’activation des neutrophiles par les IC in vitro .......................................................................................................................................... 105!. II.5. Bilan de la potentialisation de l’activation des neutrophiles par les IC in vitro. ...................................................................................................................................107! III. Modulation de l’expression des FcγRs dans un contexte d’immunothérapie antivirale par AcM ........................................................................................................... 109! III.1. Définition des populations étudiées : Une population inattendue.................. 110! III.2. Expression des différents FcγRs sur les cellules immunitaires à J8 p.i. ........ 112! III.2.1. Expression des FcγRs sur les neutrophiles et les monocytes à J8. ............................ 112! III.2.2. Expression des FcγRs sur les cellules dendritiques à J8 p.i...................................... 114! III.2.3. Expression des FcγRs sur les cellules de la lignée lymphoïde à J8 p.i...................... 116! III.3. Expression des différents FcγRs sur les cellules immunitaires à J14 p.i. ......118! III.3.1. Expression des FcγRs sur les neutrophiles et monocytes à J14 p.i. .......................... 118! III.3.2. Expression des FcγRs sur les cellules dendritiques à J14 p.i.................................... 119! III.3.3. Expression des FcγRs sur les cellules de la lignée lymphoïde à J14 p.i.................... 120! III.4. Conclusions sur les modulations de l’expression des FcγRs sur les cellules immunitaires à J8 et J14 p.i...................................................................................... 121! IV. Rôle du FcγRIV dans l’effet thérapeutique de l’immunothérapie antivirale par AcM ........................................................................................................................................... 123! IV.1. Mise au point du blocage du FcγRIV ..............................................................123! IV.2. Approche expérimentale.................................................................................. 125! IV.3 Rôle du FcγRIV sur la protection des animaux traités par immunothérapie antivirale par AcM ...................................................................................................126! IV.3.1. Rôle du FcγRIV sur le développement de la pathologie et la survie des animaux ... 126! IV.3.2. Rôle du FcγRIV sur la propagation virale ............................................................... 128! IV.3.3. Rôle du FcγRIV sur le développement de la réponse cellulaire CD8+...................... 128!. !. "#!.

(14) IV.3.4. Rôle du FcγRIV sur le développement de la réponse humorale ............................... 130!. V. Etude des fonctions immunomodulatrices des cellules exprimant le FcγRIV ........... 133! V.1. Approche expérimentale ................................................................................... 133! V.2. Rôle immunomodulateur des neutrophiles in vivo ........................................... 136! V.2.1 Rôle du FcγRIV dans le recrutement et l’activation des neutrophiles Ly6Ghi............. 136! V.2.2 Rôle immunomodulateur des neutrophiles Ly6Gint.................................................... 141! V.3. Rôle immunomodulateur des monocytes in vivo .............................................. 148! V.3.1. Étude du recrutement et de l’activation phénotypique des monocytes ...................... 148! V.3.2. Étude de l’activation fonctionnelle des monocytes ................................................... 150! V.4. Bilan des profils de sécrétion chimiokinique et cytokinique ex vivo des cellules exprimant le FcγRIV dans les différents contextes de notre modèle expérimental 152! ROLE IMMUNOMODULATEUR DES MONOCYTES IN VITRO ....................................... 161!. I. Activation différentielle des monocytes in vitro par les IC ..........................................161! II Modulation de l’activation des monocyte in vitro par des cytokines inflammatoires 165! II.1. Modulation de l’activation des monocytes in vitro par le TNFα ..................... 167! II.2. Modulation de l’activation des monocytes in vitro par l’FNγ .......................... 169! II.3. Modulation de l’activation des monocytes in vitro par l’IFNα11 ....................171!. DISCUSSION............................................................................................................. 177! CONCLUSION .......................................................................................................... 197! MATERIELS ET METHODES .................................................................................... 203! ANNEXES................................................................................................................. 215! BIBLIOGRAPHIE ...................................................................................................... 243!. !. !. !. "$!.

(15) ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !. !. "%!.

(16) !TABLE DES ILLUSTRATIONS Figure 1 : Nombre de publications portant sur les anticorps fortement neutralisants (bNAbs) au cours des 28 dernières années ..........................................................................................28! Figure 2 : Structure d’un anticorps monoclonal (AcM) ........................................................29! Figure 3 : Fonctions effectrices des anticorps monoclonaux (AcM) antiviraux (Lambour et al., 2016) ..............................................................................................................................30! Figure 4 : Technique de formation des hybridomes chez la souris. (L’Italien, 2008). ...........32! Figure 5 : Techniques de production d’AcM (Marasco and Sui, 2007) .................................33! Figure 6 : Techniques d’isolation des AcM à partir de lymphocytes B mémoires .................34! Figure 7 : Paramètres à considérer pour optimiser la modulation de la réponse antivirale par les IC. (Lambour et al., 2016) ...............................................................................................41! Figure 8 : Induction d’une immunité protectrice sur le long terme contre le virus FrCasE, par des AcM antiviraux neutralisants (Pelegrin et al., 2015). ......................................................43! Figure 9 : Les différents types de FcγRs chez l’Homme. ( (Bournazos et al, 2017)...............46! Figure 10 : Conséquences immunologiques de l’engagement des FcγRs par des AcM (Bournazos and Ravetch, 2017) ............................................................................................51! Figure 11 : Migration sur le site de l’infection et phagocytose des pathogènes par les neutrophiles.. ........................................................................................................................55! Figure 12 : Composition des granules cytoplasmiques des neutrophiles (site Epo Medecine) .............................................................................................................................................56! Figure 13 : Schéma de la génération des formes réactives de l’oxygène (ROS) par les neutrophiles. (Baordel et al, 2014) ........................................................................................57! Figure 14 : Schéma du processus de génération de Neutrophil Extracellular Trap (NET) par les neutrophiles lors d’une infection. (Selder et al , 2017) .....................................................57! Figure 15 : Classification des facteurs solubles pouvant être sécrétés par les polynucléaires neutrophiles humains et murins (Tecchio et al, 2014) ...........................................................58! Figure 16 : Modulation de la réponse immunitaire par la sécrétion de chimiokines par les neutrophiles.(Tecchio and Cassatella, 2016).. .......................................................................59! Figure 17 : Élimination des pathogènes extracellulaires par les différentes fonctions des neutrophiles ..........................................................................................................................60! Figure 18 : Schéma expérimental de la déplétion des neutrophiles dans le model d’infection rétrovirale par FrCasE, traité par l’AcM 667..........................................................................69! Figure 19 : Rôle clé des neutrophiles dans l’établissement de l’immunité protectrice induite par les AcM antiviraux. ........................................................................................................71! Figure 20 : Protocole de purification et d’activation des neutrophiles issus de la moelle osseuse. ................................................................................................................................89! Figure 21 : Étude de l’activation phénotypique des neutrophiles (PNN) par l’analyse des marqueurs de surface ............................................................................................................91!. !. "&!.

(17) Figure 22 : Effet du blocage des FcγRs sur l’activation des neutrophiles les exprimant. .......93! Figure 23 : Méthode de quantification du profil de sécrétion cytokinique et chimiokinique par l’utilisation du Kit LegendPlex ™ ........................................................................................94! Figure 24 : Profil de sécrétion cytokinique et chimiokinique des neutrophiles stimulés in vitro .............................................................................................................................................96! Figure 25 : Effet du blocage des FcγRs sur le profil de sécrétion cytokinique et chimiokinique des neutrophiles activés par des stimuli viraux. .....................................................................97! Figure 26 : Schéma bilan de la production de chimiokines par les neutrophiles stimulés in vitro par les IC (flèche violette) et les virus (flèche rouge) et impact sur le recrutement d’autres cellules immunitaires. .............................................................................................98! Figure 27 : Schéma expérimental de l’activation des neutrophiles in vitro par des stimuli viraux associés à des cytokines inflammatoires et/ou immunomodulatrices. .......................100! Figure 28 : Effet du TNFα sur l’activation des neutrophiles stimulés par des antigènes viraux. ........................................................................................................................................... 102! Figure 29: Effet de l’IFNγ sur l’activation des neutrophiles stimulés par des antigènes viraux. ........................................................................................................................................... 104! Figure 30 : Effet du IFNα11 sur l’activation des neutrophiles stimulés par des antigènes viraux. ................................................................................................................................ 106! Figure 31 : Bilan de la potentialisation de l’activation fonctionnelle des neutrophiles par les IC et le virus FrCasE in vitro ...............................................................................................108! Figure 32 : Approche expérimentale permettant l’élaboration d’un répertoire d’expression des FcγRs présents à la surface des cellules du système immunitaire................................... 109! Figure 33 : Zoom sur la population de neutrophiles Ly6Gint. .............................................. 111! Figure 34 : Répertoire de l’expression des FcγRs exprimés sur les neutrophiles et monocytes issus de la rate à J8 p.i. ....................................................................................................... 113! Figure 35 : Répertoire de l’expression des FcγRs exprimés sur les cellules dendritiques issues de la rate à J8 p.i. ................................................................................................................ 115! Figure 36 : Répertoire de l’expression des FcγRs exprimés à la surface des cellules de la lignée lymphoïde issues de la rate, à J8 p.i. ......................................................................... 117! Figure 37 : Répertoire de l’expression des FcγRs exprimés sur les neutrophiles et monocytes issus de la rate à J14 p.i. ..................................................................................................... 118! Figure 38 : Répertoire de l’expression des FcγRs exprimés à la surface des cellules dendritiques issues de la rate à J14 p.i................................................................................. 119! Figure 39 : Répertoire de l’expression des FcγRs exprimés à la surface des cellules de la lignée lymphoïde issues de la rate à J14 p.i. ........................................................................ 120! Figure 40 : Évaluation de l’efficacité du blocage du FcγRIV.............................................. 124! Figure 41 : Schéma expérimental du blocage du FcγRIV dans le model d’infection rétrovirale par FrCasE, traité par l’AcM 667......................................................................................... 126! Figure 42 : Impact du blocage du FcγRIV sur la survie et la propagation virale. ............... 127!. !. "'!.

(18) Figure 43 : Impact du blocage du FcγRIV sur le pourcentage de lymphocytes T CD8 spécifiques du virus FrCasE. ...............................................................................................129! Figure 44 : Impact du blocage du FcγRIV sur la réponse humorale et le développement de l’érythroleucémie. .............................................................................................................. 131! Figure 45 : Schéma expérimental de l’étude du blocage du FcγRIV sur la réponse immune innée, par immunophénotypage par cytométrie en flux et isolation des cellules immunitaires exprimant le FcγRIV, à J8 et J14 p.i.................................................................................... 134! Figure 46 : Stratégie d’isolation des cellules exprimant le FcγRIV ..................................... 135! Figure 47 : Effet du blocage du FcγRIV sur la fréquence et activation des neutrophiles Ly6Ghi à J8 p.i. et J14 p.i., issus des différents groupes d’études. ........................................ 137! Figure 48 : Profil de sécrétion chimiokinique des neutrophiles Ly6Ghi à J8 p.i................... 139! Figure 49 : Profil de sécrétion cytokinique des neutrophiles Ly6Ghi à J8 p.i....................... 140! Figure 50 : Effet du blocage du FcγRIV sur la fréquence et activation des neutrophiles Ly6Gint à J8 p.i. et J14 p.i., issus des différents groupes d’études. ....................................... 142! Figure 51 : Profil de sécrétion chimiokinique des neutrophiles Ly6Gint à J8 p.i. ................. 144! Figure 52: Profil de sécrétion cytokinique des neutrophiles Ly6Gint à J8 p.i. ...................... 145! Figure 53 : Profils de sécrétion chimiokinique et cytokinique des neutrophiles Ly6Gint à J14 p.i. ......................................................................................................................................146! Figure 54 : Effet du blocage du FcγRIV sur la fréquence et l’activation des monocytes Ly6Ghi à J8 p.i. et J14 p.i., issus des différents groupes d’études. ........................................ 149! Figure 55 : Profil de sécrétion chimiokinique des monocytes Ly6Chi à J8 p.i. ....................150! Figure 56 : Profil de sécrétion cytokinique des monocytes Ly6Chi à J14 p.i. ...................... 151! Figure 57 : Cinétique de production des chimiokines/cytokines par les cellules exprimant le FcγRIV issus des animaux infectés-traités à J8 et J14 p.i.....................................................157! Figure 58 : Protocole de purification et d’activation des monocytes issus de la moelle osseuse ........................................................................................................................................... 162! Figure 59 : Étude de l’activation des monocytes par l’analyse des marqueurs de surface. ........................................................................................................................................... 163! Figure 60 : Profil de sécrétion cytokinique et chimiokinique des monocytes stimulés in vitro ........................................................................................................................................... 164! Figure 61 : Schéma bilan de la production de chimiokines par les neutrophiles Ly6Ghi et les monocytes Ly6Chi stimulés in vitro par les IC ou les virus et impact sur le recrutement d’autres cellules immunitaires. ...........................................................................................165! Figure 62 : Schéma expérimental de l’activation des monocytes in vitro par des stimuli viraux associés à des cytokines inflammatoires. .................................................................. 166! Figure 64 : Effet du TNFα sur l’activation des monocytes stimulés par des antigènes viraux. ........................................................................................................................................... 168! Figure 65 : Effet de l’IFNγ sur l’activation des monocytes stimulés par des antigène viraux. ........................................................................................................................................... 170!. !. "(!.

(19) Figure 66 : Effet de l’IFNα11 sur l’activation des monocytes stimulés par des antigène viraux. ................................................................................................................................ 172! Figure 67 : Bilan de la potentialisation de l’activation fonctionnelle des monocytes par les IC et les virus in vitro .............................................................................................................. 173! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !. !. ")!.

(20) TABLE DES TABLEAUX Tableau 1 : Caractérisation des FcγRs, chez la souris, par leurs expressions à la surface des cellules immunitaires, leurs affinités pour les différents isotypes d’IgGs, et leurs fonctions (activateur, inhibiteur) (Bruhns and Jönsson, 2015) ..............................................................48! Tableau 2 : Caractérisation des FcγRs, chez l’Homme, par leurs expressions à la surface des cellules immunitaires, leurs affinités pour les différents isotypes d’IgG et leurs functions (activateur, inhibiteur) (Bruhns and Jönsson, 2015). .............................................................49! Tableau 3 : Bilan de l’expression des différents FcγRs exprimés sur les cellules immunitaires issues de la rate à J8 p.i. dans les différentes conditions expérimentales. ............................. 122! Tableau 4 : Bilan de l’expression des différents FcγRs exprimés sur les cellules immunitaires issues de la rate à J14 p.i. dans les différentes conditions expérimentales. ...........................122! Tableau 5 : Profils de sécrétion chimiokinique des neutrophiles Ly6Ghi (in vitro et ex vivo) et Ly6Gint (ex vivo) à J8 et J14 p.i dans un contexte d’immunothérapie antivirale par AcM153! Tableau 6 : Profils de sécrétion cytokinique des neutrophiles Ly6Ghi (in vitro et ex vivo) et Ly6Gint (ex vivo) à J8 et J14 p.i dans un contexte d’immunothérapie antivirale par AcM ...154! Tableau 7 : Profils de sécrétion chimiokinique des neutrophiles (Ly6Ghi et Ly6Gint) et monocytes Ly6Chi ex vivo à J8 et J14 p.i dans un contexte d’immunothérapie antivirale par AcM ...................................................................................................................................156! Tableau 8 : Profils de sécrétion cytokinique des neutrophiles (Ly6Ghi et Ly6Gint) et monocytes Ly6Chi ex vivo à J8 et J14 p.i dans un contexte d’immunothérapie antivirale par AcM ...................................................................................................................................156! Tableau 9 : Profils de sécrétion chimiokinique et cytokinique des monocytes Ly6Chi (in vitro et ex vivo) à J8 et J14 p.i dans un contexte d’immunothérapie antivirale par AcM............... 174! Tableau 11 : Anticorps de cytométrie utilisés pour caractériser les cellules de la lignée myéloïde ............................................................................................................................ 209! Tableau 12 : Anticorps de cytométrie utilisés pour caractériser les cellules de la lignée lymphoïde .......................................................................................................................... 209! Tableau 13 : Limites de détections des cytokines et des chimiokines par la technique du LegendPlex. .......................................................................................................................212! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !. !. "*!.

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(22) !TABLE DES ANNEXES Annexe 1 : “Converting monoclonal antibody-based immunotherapies from passive to active: bringing immune complexes into play”. Lambour J, Naranjo-Gomez M, Piechaczyk M, Pelegrin M. 2016; Emerging Microbes & Infections. .......................................................... 215! Annexe 2 : Efficacité du blocage des FcγRs exprimés sur les neutrophiles ......................... 225! Annexe 3 : Profil de sécrétion de cytokines par les neutrophiles, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout du TNFα ..................................................... 226! Annexe 4 : Profil de sécrétion de cytokines par les neutrophiles, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout de l’IFNγ ..................................................... 227! Annexe 5 : Profil de sécrétion de cytokines par les neutrophiles, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout de l’IFNα11................................................. 228! Annexe 6 : Profil de sécrétion de cytokines par les neutrophiles Ly6Ghi, stimulés par des antigènes viraux in vitro, ne présentant pas de différences entre les conditions expérimentales à J8 p.i. ...............................................................................................................................229! Annexe 7 : Profil de sécrétion des chimiokines et des cytokines par les neutrophiles Ly6Ghi, stimulés par des antigènes viraux in vitro, ne présentant pas de différences entre les conditions expérimentales à J14 p.i...................................................................................................... 230! Annexe 8 : Profil de sécrétion de cytokines par les neutrophiles Ly6Gint, stimulés par des antigènes viraux in vitro, ne présentant pas de différences entre les conditions expérimentales à J8 p.i. ...............................................................................................................................231! Annexe 9 : Profil de sécrétion de cytokines par les neutrophiles Ly6Gint, stimulés par des antigènes viraux in vitro, ne présentant pas de différences entre les conditions expérimentales à J14 p.i. ............................................................................................................................. 232! Annexe 10 : Profil de sécrétion de chimiokines par les monocytes, stimulés par des antigènes viraux in vitro, ne présentant pas de différences entre les conditions expérimentales à J8 p.i. ........................................................................................................................................... 233! Annexe 11 : Profil de sécrétion de cytokines par les monocytes, stimulés par des antigènes viraux in vitro, ne présentant pas de différences entre les conditions expérimentales J8 p.i. 234! Annexe 12 : Profil de sécrétion de chimiokines par les monocytes, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout du TNFα ..................................................... 235! Annexe 13 : Profil de sécrétion de cytokines par les monocytes, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout du TNFα ..................................................... 236! Annexe 14 : Profil de sécrétion de chimiokines par les monocytes, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout d’ l’IFNγ...................................................... 237! Annexe 15 : Profil de sécrétion de cytokines par les monocytes, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout d’ l’IFNγ...................................................... 238! Annexe 16 : Profil de sécrétion de cyhimiokines par les monocytes, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout d’ l’IFNα11.................................. 239! Annexe 17 : Profil de sécrétion de cytokines par les monocytes, stimulés par des antigènes viraux in vitro, n’étant pas modulé par l’ajout d’ IFNα11. .................................................. 240. !. #"!.

(23) ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !. !. ##!.

(24) !ABBREVIATIONS Ac : anticorps AcM : anticorps monoclonaux ADC: antibody drug conjugate ADCC : antibody-dependent cell cytotoxicity ADCP : antibody-dependent cell phagocytosis ADCVI : antibody-dependent cell-mediated virus inhibition ADN : acide désoxyribonucléique AEM : agence européenne du médicament ART: antiretroviral treatment CDC : Complement-dependent cytotoxicity CDR: Complementarity-determining region CH : constant heavy CL : constant light CMV: cytomégalovirus DC : cellule dendritique ETM : erreur type des valeurs moyennes Fab : fragment antigen binding Fc : fragment cristalisable FDA : food and drug administration HAART: highly active antiretroviral treatment IC : immun complexe IFN: interferon IgG : immunoglobuline G M :milieu MPO : myélopéroxidase NET : neutrophil extracellular trap NK : natural killer NS : non stimulé PAMPs : pathogen associated molecular patterns PNN: polynucléaire neutrophile PRR: pattern recognition receptor ROS : reactive oxygen species SEM: standard error of the mean SHIV: simian-human immunodeficiency virus SIV: simian immunodeficiency virus TNF: Tumor necrosis factor TLR: toll like receptor V : virus VH :variable heavy VHC : virus de l’hépatite C VHB : virus de l’hépatite B VIH : virus de l’immunodéficience humaine VL : variable ligh. !. #$!.

(25) !. #%!.

(26) INTRODUCTION. !. #&!.

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(28) INTRODUCTION I.Les anticorps monoclonaux antiviraux ! A l’ère de la course effrénée aux nouvelles technologies, l’une des révolutions majeures dans le domaine de la santé a été l’apparition et le développement des biothérapies. Elles peuvent se définir par l’utilisation de molécules issues de la biologie du vivant, qui vont être ensuite transformées par l’industrie biotechnologique, en vue de produire des médicaments. L’un des meilleurs exemples est sans doute les anticorps monoclonaux (AcM). En effet les AcM représentent à l’heure actuelle la plus grande classe de médicaments biothérapeutiques en occupant plus de 50 % du marché des biothérapeutiques. A l’heure actuelle plus de 70 AcM sont commercialisés (TreDenick et al, 2018), permettant de cibler 28 pathologies différentes et plus de 50 sont en dernière phase d’essais cliniques. Depuis une dizaine d’années, on assiste à une véritable accélération de l’approbation de nouveaux AcM que ce soit par les organismes de santé Europeen (AEM) ou des Etats Unis (FDA); 6 ont été approuvés en 2009, contre 10 fin 2017 (Reichert, 2017), leur nombre continuant d’augmenter chaque année. Pour preuve pas moins de 12 nouveaux anticorps sont en dernière phase d’essai clinique et sont pressentis pour être à leur tour autorisés sur les marchés européens et américains d’ici fin 2018 (Kaplon and Reichert, 2018). Cet engouement s’explique par les extraordinaires propriétés des AcM, de par leur spécificité et leurs diverses fonctions sur la réponse immunitaire. Néanmoins malgré le fait que la découverte des propriétés thérapeutiques des anticorps soit ancienne (Emil von Behring et Shibasaburo Kitasato, 1890), ce n’est que bien plus tard que l’amélioration des connaissances et des technologies ont permis de révéler et d’exploiter toute la mesure du potentiel thérapeutique des AcM ; ce qui est d’autant plus vrai pour les AcM antiviraux. En effet jusqu’à cette année, un seul AcM antiviral était commercialisé, le Palivizumab (1998), utilisé en tant que traitement prophylactique contre le RSV (Canfield and Simoes, 1999). Il a été rejoint vingt ans plus tard par un AcM ciblant le CD4, visant à traiter les patients infectés par le VIH, l’Ibalizumab (2018). Cet AcM, n’est pas encore autorisé sur le marché Europpéen, mais il est sur le point d’être approuvé par la FDA. Par ailleurs la compagnie le fabriquant (Theratechnolies INc et TaiMed Biologics) a déjà conclu un accord pour sa commercialisation aux USA et au Canada. Un tel écart temporel entre la commercialisation de ces deux AcM s’explique notamment par une évolution tardive des technologies permettant d’isoler et de produire des AcM antiviraux efficaces. Après une longue période d’attente, on assiste depuis une dizaine d’années à une véritable explosion du nombre de publications portant sur les AcM antiviraux hautement neutralisants (Figure 1), ainsi qu’à la multiplication de leur nombre engagé dans des essais cliniques. Les AcM antiviraux apparaissent aujourd’hui comme une alternative thérapeutique viable contre les infections virales, aussi bien aiguës que chroniques.. !. #(!.

(29) 400. 300. 200. 100. 2014 2015 2016 2017. 2012. 2010. 2008. 2006. 2004. 2002. 2000. 1998. 1996. 1994. 1992. 1990. 0. Adapté de Cohen J . Bound for glory. Science 2013.. Figure 1 : Nombre de publications portant sur les anticorps fortement neutralisants (bNAbs) au cours des 28 dernières années. !. I.1. Les anticorps monoclonaux antiviraux en quelques définitions !. I.1.1. Structure des AcM antiviraux ! Tout d’abord, revenons plus en détails sur la nature et les fonctions des AcM. (Figure 2) Les AcM sont des immunoglobulines de la classe des IgG. Ce sont des glycoprotéines hétérodimériques constituées de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères, reliées entre elles par des ponts disulfures. Les chaînes se structurent en différents domaines, un domaine variable (VL) et un domaine constant (CL) pour les chaînes légères et un domaine variable (VH) et trois domaines constants pour les chaînes lourdes (CH). On distingue plusieurs types de chaînes. Les chaînes légères en possèdent deux, κ et λ, qui ont 30 à 40 % d’homologie. Les chaînes lourdes en possèdent cinq, α, δ, ε, γ, µ, qui vont définir la classe de l’anticorps IgGA, IgGD, IgE, IgG, IgM, respectivement. A noter également que certaines classes possèdent aussi des sous-classes, c’est le cas des IgG qui possèdent quatre sous classes (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), chez l’Homme. D’autre part ces domaines constituent deux fragments qui confèrent aux anticorps des fonctions distinctes. Le fragment Fab, par les domaines variables (VL et VH), composés en réalité de trois régions hypervariables, les CDR (complementarity-determining regions), forment le paratope, une région qui va permettre de reconnaitre spécifiquement la région de l’antigène cible ou épitope.(Rosenberg and Demeule, 2015). Les domaines constants forment le fragment cristallisable (Fc) qui va permettre la liaison entre l’anticorps et ces récepteurs à la surface des cellules immunitaires, les FcγRs ou au complément (C1q), permettant la mise en place des fonctions effectrices des anticorps. De plus, le fragment Fc peut aussi se lier au récepteur intracellulaire FcRn impliqué dans la pharmacocinétique des anticorps. Il permet notamment le recyclage des IgG augmentant ainsi leur demi-vie. Entre le domaine CH1 et CH2 se situe la région charnière (H) qui va apporter de la flexibilité à l’anticorps pour lui permettre d’optimiser sa liaison à l’antigène. (Rosenberg and Demeule, 2015). !. #)!.

(30) ()$*+,)' !"#"$%&' !%)$-.*/0120#'-. ()$*+,)'. !"#$%&'()!#+ 34+*%) 56"#)*,#'. !"#$%&'()!*. Adapté de teaching.ncl.uk. Figure 2 : Structure d’un anticorps monoclonal (AcM) Un AcM est constitué de 2 chaînes lourdes (HC) (bleu) et de 2 chaînes légères (LC) (vert). Chaque chaine est composée d’un domaine variable (VL ou VH) et d’un ou plusieurs domaines constants (CL ou CH). Les chaînes se regroupent pour former 2 fragments. Le fragment Fab (rose), permet la reconnaissance de l’antigène via le paratope (orange), constitué de 6 régions hypervariables CDR (complementary-determining régions) et le fragment constant, Fc (violet), est responsable des fonctions effectrices de l’AcM.. !. I.1.2. Fonctions effectrices des AcM antiviraux ! Les AcM antiviraux ont à leur disposition un véritable arsenal thérapeutique pour lutter efficacement contre les infections virales. (Figure 3) Les antigènes viraux sont d’abord reconnus de façon hautement spécifique par le fragment Fab. Dans le cas d’AcM antiviraux neutralisants, cette fonction leur permet non seulement de cibler efficacement l’antigène mais aussi de réduire la quantité de virions circulants et de cellules infectées, par opsonisation, contrôlant ainsi la propagation virale. (Forthal, 2014) Le fragment Fc est responsable des fonctions effectrices de l’AcM, en interagissant avec les récepteurs (FcγRs ou complément) exprimés à la surface des cellules immunitaires. Ainsi, un virus peut être directement lysé par l’interaction du fragment Fc avec le complément via le C1q ou être phagocyté, après avoir été opsonisé, par interaction avec les FcγRs exprimés à la surface des phagocytes (macrophages, neutrophiles). (Marasco and Sui, 2007) D’autre part les cellules infectées peuvent aussi être reconnues par les AcM à condition que l’antigène ciblé soit exprimé à leur surface. Ils disposent alors, par leur fragment Fc, de plusieurs moyens pour éliminer les cellules infectées. Via l’interaction avec le complément par CDC (Complement-dependent cytotoxicity) qui active la voie classique du complément qui permet la formation du complexe d’attaque membranaire, créant des pores entrainant la lyse de. !. #*!.

(31) la cellule. Via interaction avec les FcγRs, par ADCP (antibody-dependent cellular phagocytosis) (Euler and Alter, 2015; Nimmerjahn et al., 2015), où différentes cellules du système immunitaire (neutrophiles, macrophages) vont phagocyter les cellules infectées recouvertes d’anticorps, ou par ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) (Su and Moog, 2014) où l’interaction avec les cellules immunitaires (surtout les cellules « natural killer » NK) déclenche la sécrétion de granules cytotoxiques menant à la lyse de la cellule infectée. De plus, l’interaction entre le fragment Fc et les FcγRs peut impacter la propagation virale par ADCVI (antibody-dependent cell-mediated virus inhibition).(Malbec et al., 2013) (Figure 3). En effet, une cellule immunitaire exprimant des FcγRs reconnaissant une cellule infectée peut entrainer son élimination par un mécanisme lytique (ADCC) ou non lytique (sécrétion de chimiokines ou de cytokines), ayant pour conséquence la réduction de la propagation virale.. Lambour et al, 2016. Figure 3 : Fonctions effectrices des anticorps monoclonaux (AcM) antiviraux (Lambour et al., 2016) Les AcM antiviraux peuvent opsoniser des virus et des cellules infectées dans la mesure où l’antigène ciblé est exprimé à leur surface (A). Ceci conduit à l’élimination du virus par différents mécanismes impliquant les cellules immunitaires. Le fragment Fc permet la liaison des virions circulants au complément, induisant une virolyse directe (B). La reconnaissance des virions opsonisés par les FcγRs et le complément conduit à leur phagocytose par les cellules de l’immunité innée. (C). Les cellules infectées peuvent aussi être éliminées par complement-dependent cytotoxicity (CDC), antibodydependent cellular phagocytosis (ADCP) et/ou antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) induit par les cellules effectrices de l’immunité innée exprimant des FcγRs (D–F). Les complexes immuns (IC) formés par l’AcM et les déterminants viraux (virions ou cellules infectées) peuvent être reconnus par les cellules présentatrices d’antigènes exprimant les FcγRs telles que les cellules dendritiques (DC) (G). La reconnaissance des IC par les DC peut augmenter la présentation antigénique permettant l’induction d’une forte réponse immune antivirale. (Michaud et al., 2010). !. $+!.

(32) I.1.3. Histoire des techniques de production et d’isolation d’AcM Tout a commencé en 1890 avec les travaux de Emil von Behring et Shibasaburo Kitasato qui ont développé le premier traitement par immunisation passive, en montrant qu’une injection de sera contenant des anticorps anti-toxine diphtérique pouvait soigner la diphtérie. Ces résultats ont été reproduits en 1894 en France, par Emile Roux à l’Institut Pasteur, sur 300 enfants traités avec succès. C’est alors l’avènement de la sérothérapie qui sera très développée dans les années qui suivirent. Par la suite, durant une cinquantaine d’années des transferts de sera ont été utilisés pour traiter efficacement de nombreuses infections (méningite, pneumonie à pneumocoque, infection a streptocoque). Cependant le développement des antibiotiques a considérablement réduit l’utilisation de sérum, à partir de 1940, excepté pour les toxines virales (Berry and Gaudet, 2011). D’autre part, des problèmes liés à la production des anticorps se sont multipliés, avec notamment des agrégats d’anticorps. Dans les années 1920-1930, la purification du sérum par fractionnement et élimination du fragment Fc par l’ajout de pepsine, a limité les problèmes d’agrégations. Mais la production était d’une part très hétérogène et aléatoire en fonction des lots, et d’autre part polyclonale, plusieurs anticorps avec des épitopes différents étaient présents dans le sérum. Ce sont les avancées sur la caractérisation structurale des anticorps qui ont permis une réelle avancée dans la production des anticorps. Le premier modèle de la structure d’une immunoglobuline a été présenté par Pauling en 1940. (Pauling, 1940). Il a été complété par les travaux de Porter et Edelman en 1959, sur la structure moléculaire des anticorps (Edelman, 1959; Porter, 1959), ce qui leur vaudra le prix Nobel en 1972. L’année suivante, en 1960, Georges Barski, Boris Ephrussi et John Littlefield ont publié leurs travaux sur la fusion cellulaire et la synthèse d’ADN ce qui a permis d’envisager la fusion cellulaire entre des cellules de myélomes et des lymphocytes B. Une quinzaine d’année plus tard, en 1975 ces nouvelles connaissances ont permis à César Milstein et Georges Köhler de mettre au point les hybridomes (Köhler and Milstein, 2005), ce qui leur vaudra d’être récompensés d’un prix Nobel en 1984. Les hybridomes sont des cellules hybrides, entre des lymphocytes B qui sécrètent des anticorps, les plasmocytes, et des cellules de myélomes, pouvant se cloner et être cultivées in vitro. Chaque clone est unique et va produire le même anticorps indéfiniment, c’est un AcM. (Figure 4) La production par hybridome possède plusieurs avantages. Tout d’abord, la fusion avec les cellules myélomateuses, est nécessaire car les lymphocytes B ne survivent pas longtemps en culture. Ensuite les hybridomes garantissent une production monoclonale, constante et homogène. De nos jours la production d’AcM par hybridome, a bénéficié des améliorations technologiques et peut être désormais utilisée à grande échelle. Cependant, d’autres techniques de production et de sélection se sont également développées au cours du temps grâce au développement de l’ingénierie.. !. $"!.

(33) !"#$%&'()**#+",-*./"0"12&3(4"5&06+&(78)/.02&+. Figure 4 : Technique de formation des hybridomes chez la souris. (L’Italien, 2008) La technique. consiste à injecter un antigène d’intérêt chez la souris, puis après quelques semaines les rates sont prélevées, et les plasmocytes, sont collectés. La fusion des plasmocytes avec les cellules myélomateuses qui ont perdu leur capacité à produire des anticorps, est possible par la fusion membranaire, induite par l’ajout de PEG (polyéthylène glycol). Chaque hybridome est isolé à une cellule par puits. Le clonage est effectué par dilution limite et le criblage des clones a été fait par ELISA. Les clones produits sont identifiés et amplifiés, puis les anticorps sont purifiés et concentrés. Anciennement l’amplification était réalisée en réinjectant les hybridomes dans le péritoine de souris, provoquant des ascites dans lesquelles était prélevés les anticorps. De nos jours cette technique n’est plus utilisée et a été remplacée par des techniques in vitro ou des bioréacteurs, à plus grande échelle. Les techniques de sélection et de criblage des AcM produits ont également évoluées, avec notamment la technique de présentation à la surface des phages filamenteux, ou phage display (Clementi et al., 2012).(Figure 5a) Brièvement, cette technique consiste à cloner les gènes des chaînes lourdes et légères d’anticorps, d’animaux ou d’hommes, immunisés ou naïfs, sous forme de scFv ou Fab, fusionné au gène du bactériophage qui exprime une protéine de capside. !. $#!.

(34) afin de pouvoir exposer le Fab à la surface du phage filamenteux; qui sont ensuite produit par infection de bactérie Escherichia coli. Ces phages exprimant le Fab des anticorps sont ensuite mis au contact de l’antigène cible. Les phages ne présentant pas de reconnaissance pour l’antigène sont éliminés par lavage, ceux fixant l’antigène vont effectuer plusieurs cycles, afin de valider la spécificité du Fab et de le cloner sous forme d’AcM. Cette approche a été notamment utilisée pour isoler des anticorps neutralisants issus de macaques immunisés avec un virus recombinant exprimant le gène de l’hémagglutinine (HA) du virus de la grippe (influenza)(Meng et al., 2013). Cette approche a permis de constituer des librairies de fragments d’anticorps, notamment de patients infectés par le VIH. (Burton et al., 1991). Cette technique présente cependant quelques inconvénients. Elle n’est pas aussi représentative que le répertoire naturel d’anticorps d’un individu, et les modifications post-traductionnelles sont différentes, en particulier la glycosylation. De plus, elle nécessite un antigène pré-définie pour constituer la librairie, et n’est peut être donc pas la méthode optimale pour identifier de nouveaux épitopes neutralisants viraux.. Figure 5 : Techniques de production d’AcM (Marasco and Sui, 2007). a) Méthode de production par phage display.(b). Utilisation de souris transgéniques exprimant des IgG humaines.. !. $$!.

(35) Une autre des technologies pour générer des anticorps humains sont les souris transgéniques exprimant des IgG humaines. (Figure 5b). Pour cela le locus du gène immunoglobuline des souris a été remplacé par le gène humain par une technique de knock-in (KI) et des lymphocytes B exprimant des IgG humains sont isolés de souris transgéniques, après une immunisation par un antigène. Les cellules sont ensuite immortalisées par fusion avec des cellules myélomateuses.(Marasco and Sui, 2007). Cette technique a été utilisée pour produire des AcM contre le SARS-Cov ou syndrome respiratoire aiguë du coronavirus.(Greenough et al., 2005) Mais l’avancée majeure dans l’isolation d’AcM antiviraux de ces dernières années, fut la capacité de cloner des anticorps provenant de lymphocyte B mémoire unique issu d’individus sains ou infectés. (Figure 6) !. Salazar et al, 2017.. !. Figure 6 : Techniques d’isolation des AcM à partir de lymphocytes B mémoires Isolation des lymphocytes B mémoires d’intérêts, puis collecte de leur production d’anticorps par différentes méthodes (culture, clonage, immortalisation). Sélection de l’anticorps souhaité en fonction de l’antigène cible. Clonage des chaînes lourdes et légères en vue de la production de l’AcM.. Différentes méthodes ont été mises au point pour cette approche, et ont permis d’isoler des AcM neutralisants antiviraux. Une méthode consiste à isoler les lymphocytes B mémoires spécifiques d’un antigène viral par cytométrie en flux et à cloner les gènes codants pour les anticorps. Elle a été utilisée pour isoler des AcM neutralisants issus d’individus infectés par les virus Zika (Wang et al., 2016a) , HIV (Shields et al., 2002), RSV (Gilman et al., 2016). Cette approche ne permet cependant pas, d’isoler de nouveaux AcM neutralisants car elle requiert que l’antigène viral soit connu, pour sélectionner les lymphocytes B mémoires. Pour identifier de nouveaux épitopes d’intérêts, une autre méthode consiste à récupérer le surnageant d’un grand nombre de lymphocytes B mémoires cultivés individuellement dans du milieu enrichi, et d’établir contre quels antigènes ces anticorps sont dirigés. Cette technique est. !. $%!.

(36) à l’origine de la découverte d’anticorps hautement neutralisants contre le VIH, et la découverte d’une nouvelle cible pour l’élaboration d’un vaccin contre le VIH.(Walker et al., 2009). Une dernière approche consiste à immortaliser des cellules B par le virus d’Epstein Barr en présence de TLR, elle a permis d’isoler des anticorps neutralisants contre la grippe H5N1 (Simmons et al., 2007), ou le SARS-CoV (Traggiai et al., 2004). Les anticorps sont clonés à partir de cellule unique (plasmocyte ou B mémoire), et représentent le répertoire génétique d’anticorps d’un individu à un moment donnée et suite à une infection, mais il n’est pas forcément représentatif des anticorps circulants. Des techniques ont été développées en combinaison avec une approche de séquençage haut débit (NGS : nextgeneration sequencing) pour isoler à partir d’anticorps polyclonaux circulants d’individus infectés les séquences des anticorps spécifiques de l’antigène (Cheung et al., 2012). Cette approche permet la création d’une base de données du répertoire des IgG d’un individu immunisé par un virus. Les séquences des chaînes lourdes et légères sont associées et exprimées comme un anticorps recombinant. Cette technique a été utilisée avec succès pour isoler des anticorps ciblant le cytomégalovirus humain (HCMV)(Sato et al., 2012). Une autre technique consiste à utiliser des lymphocytes B mémoires humains, issus du sang de patients ayant été infectés par une infection virale. Ces cellules sont ensuite transformées avec le virus d’Epstein Barr associé à un agent activant les cellules B mémoires (oligonucléotide CpG, cellules mononucléaires irradiée), qui augmente l’efficacité de la transformation. Ainsi les cellules B mémoires issus du sang de patients infectés par la grippe aviaire H5N1, ont été immortalisées par cette méthode pour obtenir des AcM neutralisants contre ce virus (Kwakkenbos et al 2016). L’isolement des cellules rares et du clonage des anticorps, expliquent en partie les raisons de l’explosion des AcM antiviraux.. I.1.3.L’évolution des formats d’AcM en thérapeutique : Au cours du temps et de l’évolution des connaissances et des technologies, le format des AcM thérapeutique a évolué, pour être de plus en plus spécifique et efficace. Le premier AcM produit chez la souris, est le muromomab anti-CD3 (Orthoclone OKT3)(Van Wauwe et al., 1980) commercialisé en 1986, utilisé en tant qu’immunosuppresseur contre le rejet de greffe. La structure de cet anticorps est entièrement murine. Par la suite une multitude d’autres anticorps produit chez la souris ont été testés mais leur efficacité s’est montrée décevante en raison de la faible affinité des FcγRs humains pour le fragment Fc des IgGs de souris, réduisant ainsi considérablement les fonctions effectrices des anticorps ainsi que leur demi-vie. De plus ils sont aussi à l’origine de l’induction d’une forte immunogénicité se manifestant par la production d’HAMA (human anti-mouse antibodies ou anticorps humain anti-souris), dû à l’interaction entre une molécule murine dans un organisme humain. Il a fallu attendre les progrès de la génie-génétique pour passer aux AcM chimériques (Liu, 2014), qui consistent à isoler l’ADN des régions variables VH et VL d’un AcM murin et à les lier au fragment Fc d’une IgG humaine. Ces modifications n’affectent normalement pas la spécificité et l’affinité de l’anticorps, mais là encore la présence de fragment Fc murin limite considérablement la réponse immunitaire. Puis dans le but de diminuer l’immunogénicité et d’augmenter les fonctions effectrices, les AcM sont devenus humanisés (le daclizumab :anti-chaine alpha d’IL2 , utilisé comme anti. !. $&!.

(37) rejet), seule une partie des domaines variables VH et VL, la région CDR reste encore murine, le reste des domaines VH et VL ainsi que le fragment Fc sont humains. Pour finir, les avancées technologiques nous permettent désormais d’obtenir des AcM intégralement humain tel que l’Adalimumab (2002) qui est un anti-TNFα, utilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Néanmoins l’humanisation des anticorps de souris peut conduire à une diminution de l’affinité de l’AcM pour sa cible, nécessitant l’utilisation de technologies complémentaires, pour améliorer l’efficacité de l’AcM notamment par des modifications au niveau des fragments Fc. Désormais il est donc possible de produire des AcM entièrement humanisés, ce qui permet d’éviter une réaction du système immunitaire en réponse à un composé d’une autre espèce et d’augmenter la durée de vie des AcM, mais les améliorations ne se sont pas arrêtées à l’optimisation d’anticorps « nu ». Les avancées technologiques en matière d’ingénierie, ont permis d’aboutir à la synthèse de nouveaux formats d’anticorps. Maintenant il est possible de coupler les anticorps à d’autres composés (toxine, radioisotope, drogue, agent biologique…), dans le but d’augmenter leur efficacité ce sont les immunoconjugués ou ADC (antibody drug conjugate). En effet ces AcM possèdent tous des fonctions effectrices et une spécificité qui fait d’eux des guides amenant la molécule toxique aux cellules indésirables, ils sont particulièrement utilisés dans le traitement de cancers.(Haeuw et al., 2009) D’autres approches consistent à fusionner non pas le Fc comme les immunoconjugués mais le Fab avec des molécules pouvant agir sur les cellules immunitaires comme les cytokines. C’est le cas des immunocytokines (List and Neri, 2013) ou des AcTakines (Garcin et al., 2014). Ces dernières permettent d’avoir une forte activité sur les cellules cibles tout en réduisant les effets indésirables, liés à la forte réponse inflammatoire induite par les cytokines. Ceci par l’utilisation de cytokines mutées qui ont une affinité réduite pour leur récepteur naturel et ne s’activent qu’au contact de la cible antigénique. On peut également citer les anticorps bispécifiques, dont le premier fut commercialisé en 2009 (catumaxomab anti-CD3 et anti-tumeur) qui peuvent reconnaitre deux antigènes différents, ce qui peut permettre de lier un antigène tumoral à une de leur région Fab et une cellule immunitaire à l’autre et permettant aussi d’administré qu’un seul AcM, ce que limite les effets secondaires dû à l’immunothérapie. Dans le cas des AcM antiviraux des bispécifiques peuvent aussi être formés contre deux épitopes différents d’un même virus afin d’optimiser l’efficacité de l’immunothérapie. Il est aujourd’hui aussi possible d’utiliser des composés plus petits, dont certains ne comportent que les fragments VH et VL des AcM,(Hamers-Casterman et al., 1993) ce sont les scFv (single chain variable fragment) et d’autres comme les nanobodies (Flajnik et al., 2011)(12 à 15 kDa) qui s’inspirent des anticorps des camélidés qui ne possèdent pas de chaînes légères et ne disposent donc que de la chaine lourde (domaine VHH) pour reconnaitre les antigènes (Gholamreza et al 2013). Ceux-ci possèdent l’avantage d’être des composés très stables et faciles à produire comparés aux VH humains ou murins. En revanche ils ont aussi l’inconvénient d’avoir une demi vie courte et sont rapidement éliminés par l’organisme. Leur utilisation en thérapeutique nécessite donc l’adjonction de molécules qui vont augmenter leur durée de vie. Les quelques exemples de formats d’anticorps présentés ci-dessus, nous donne un aperçu de l’éventail de possibilités qu’offrent les AcM et ses dérivées. Les avancées technologiques ont permis le développement de ces immunothérapies par AcM et ne cessent de participer à leur. !. $'!.