Etude de la régulation des différentes cytokines de la famille de l’interleukine-12.

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Texte intégral

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UNIVERSITÉ LIBRE DE BRUXELLES Faculté de Médecine

Institut d’Immunologie Médicale

Etude de la régulation des différentes cytokines de la famille de l’interleukine-12.

Céline Molle

Travail réalisé sous la supervision du Professeur Michel Goldman et du Docteur Stanislas Goriely

Thèse présentée en vue de l’obtention du titre de Docteur en Sciences Biomédicales

Octobre 2009

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LISTE DES ABBREVIATIONS

-/-: Knock Out

ADN: acide désoxyribonucléique ADNdb: ADN double brin

APC: cellule présentatrice d’antigènes ARN: acide ribonucléique

ARNm: ARN messager ARNdb: ARN double brin ARNsb: ARN simple brin BCR: B cell receptor

BMDC: DC dérivée de moelle osseuse CBP: CREB-binding protein

CD: cluster of differentiation

cDC: cellule dendritique conventionnelle C/EBP: CAAT element binding protein CMH: complexe majeur d’histocompatibilité CTL: lymphocytes T cytotoxiques

DAI: DNA-dependent activator of IRFs DAMP: damage-associated molecula pattern DC: cellules dendritiques

DD: death domain

DBD: DNA binding domain

EAE: encéphalomyélite autoimmune expérimentale EBI3: EBV-induced gene 3

GL: ganglion lymphatique

GM-CSF: granulocyte-macrophage colony stimulating factor

GPCR: récepteurs couplés aux protéines G IAD, IRF association domain

IFN: interféron IL: interleukine IKK : IkB kinase

IPS-1: Interferon E promoter stimulator-1 IRAK : IL-1 receptor-associated kinase IRF: IFN regulatory factor

ISRE: IFN-stimulated response element JAK : Janus kinase

LPS : lipopolysaccharide LRR: leucine rich repeats LC: cellules de Langerhans

MAPK : mitogen-activated protein kinases

Mda5: melanoma differentiation-associated gene 5 mDC: cellules dendritiques myéloïdes

MEF: mouse embryonic fibroblast

moDC: DC généré à partir de monocytes du sang en présence de GM-CSF et d’IL-4.

MyD88: Myeloid differentiation factor 88 NAP1: NAK-associated protein 1

NES: sequence d'exportation nucléaire NFNB: nuclear factor-NB

NK: Natural Killer

NKT: lymphocyte T Natural Killer NLR: NOD-like receptors

NLS: signal de localisation nucléaire

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NOD: nucleotide-binding-oligomerization domain PAMP: pathogen-associated molecular patterns périphérique

pDC: cellules dendritiques plasmacytoïdes

PKR: double stranded RNA-dependent protein kinase polyI:C: polyinosine-polycytidylic acid

PRR: pathogen recognition receptor RLH: RIG-I-like Helicases

RIG-I: Retinoic acid Inducible Gene-I

STAT: signal transducer and activator of Transcription TAK1/TAB: TGFE-activated Kinase 1/TAK1 Binding protein TANK: TRAF family member-associated NFNB activator TBK1: TANK-binding kinase 1

TCR: T cell receptor

TJG: lymphocyte T gamma-delta Th: lymphocyte T auxiliaire TLR: Toll-like receptor

TIR: TLR and IL-1 receptor related

TIRAP: TIR domain containing adaptator protein TNF: tumor necrosis factor

TRAF: TNF receptor associated factor TRAM: TRIF-related adaptor molecule T reg: lymphocyte T régulateur

TRIF: TIR domain-containing adaptor inducing IFN-b, également appelée TICAM-1

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TABLE DES MATIERES

LISTE DES ABBREVIATIONS... i

TABLE DES MATIERES... iii

RESUME ... - 1 -

INTRODUCTION ... - 2 -

1 Les cellules dendritiques au sein de la réponse immune... - 2 -

1.1 L'immunité innée et adaptative ...- 2 -

1.2 Les sous-populations de cellules dendritiques ...- 4 -

1.3 La génération des cellules dendritiques...- 4 -

1.4 Les fonctions des cellules dendritiques ...- 5 -

2 Reconnaissance des pathogènes par les "pattern recognition receptors" de signalisation- 13 - 2.1 Les récepteurs de la famille Toll Like...- 13 -

2.2 Les récepteurs cytosoliques...- 18 -

3 La famille des IRFs (interferon regulatory factors) ... - 22 -

3.1 Structure et expression des IRFs ...- 22 -

3.2 Activation des IRFs...- 23 -

3.3 Les fonctions biologiques des IRFs...- 26 -

4 Les cytokines de la famille de l'interleukine 12 ... - 33 -

4.1 Les sources cellulaires...- 33 -

4.2 Les récepteurs et leur signalisation ...- 35 -

4.3 Les fonctions biologiques...- 36 -

4.4 La régulation transcriptionnelle...- 43 -

BUT DU TRAVAIL ... - 47 -

RESULTATS ... - 48 -

1 Implication d'IRF3 dans l'activation du gène de l'IL-12p35 induite par TLR4 et TLR3 - 48 - 2 La synthèse d'IL-27 induite en réponse à l'engagement de TLR4 dépend de manière critique d'IRF3 ... - 57 -

3 Le rôle du complexe ISGF3 dans l'expression du gène de l'IL-27p28 induite par les TLRs révèle un mécanisme d'activation transcriptionnelle en deux étapes... - 68 -

DISCUSSION ET PERSPECTIVES ... - 114 -

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1 Modèles de régulation transcriptionnelle des cytokines de la famille de l'IL-12... - 114 -

1.1 Régulation transcriptionnelle de l'IL-12...- 114 -

1.2 Régulation transcriptionnelle de l'IL-23...- 117 -

1.3 Régulation transcriptionnelle de l'IL-27...- 118 -

1.4 Régulation différentielle de l'IL-12, IL-23 et IL-27. ...- 121 -

2 Implication de l'axe IFNE/IL-27 dans les réponses antivirales. ... - 124 -

3 Importance de l'axe IFNE/IL-27 dans les maladies autoimmunes... - 126 -

4 Implication dans l'immaturité du système immunitaire néonatal. ... - 128 -

4.1 Production des cytokines de la famille de l'IL-12 par les cellules dendritiques néonatales. ...- 128 -

4.2 Implications pour les stratégies vaccinales...- 129 -

BIBLIOGRAPHIE ... - 131 -

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RESUME

Les cellules dendritiques sont les sentinelles du système immunitaire. Elles sont disséminées dans la plupart des tissus et organes et sont capables de détecter la présence de pathogènes. La perception des signaux de danger se fait notamment grâce à la présence de récepteurs de la famille Toll (TLRs). Deux voies de signalisation, qui reposent sur l'activation des molécules adaptatrices MyD88 ou TRIF, peuvent être induites par l’engagement de ces récepteurs par leur ligand. Ces voies de signalisation mènent à l’activation de différents facteurs de transcription nécessaires à la production de cytokines telles que les membres de la famille de l’interleukine-12 (IL-12).

La famille de l’IL-12 comprend quatre cytokines hétérodimériques: l’IL-12 (p35/p40), l’IL-23 (p19/p40), l’IL-27 (p28/EBI3) et l’IL-35 (p35/EBI3). Chacune de ces cytokines possède des fonctions bien définies et parfois complexes qui sont essentielles pour l’établissement des réponses immunes innées et adaptatives mais également pour l'atténuation de ces réponses limitant ainsi les effets délétères causés à l'organisme par des réponses immunes excessives. La régulation transcriptionnelle de ces cytokines est complexe puisque la présence des deux sous-unités est indispensable à leur production par la cellule.

Dans le cadre de ce travail, nous avons étudié l'implication de facteurs de transcription de la famille des IRFs dans l’induction des gènes codant pour les sous-unités qui composent les cytokines de la famille de l'IL-12 en réponse à l’engagement des différents TLRs. Le facteur de transcription IRF3 activé en aval de la voie TRIF dépendante joue un rôle crucial dans la production des IFNs de type I et des réponses antivirales. Nos résultats indiquent que ce facteur est également directement impliqué dans l'activation des gènes codant pour les sous-unités p35 et p28. Par contre, ce facteur ne participe pas au contrôle de l'expression de l'IL-12/23p40, l’IL-23p19 et d'EBI3. Nos observations indiquent qu’IRF3 coopère avec d'autres membres de la famille des IRFs. En effet, IRF1 permet l'expression optimale des sous-unités p35 et p28 alors qu'IRF9 joue un rôle essentiel dans le contrôle de l'expression de la p28, deux facteurs activés par la boucle autocrine des IFNs de type I. Nos résultats indiquent donc qu’en réponse aux ligands TLRs, l'expression des différentes sous-unités qui composent les cytokines de la famille de l'IL-12 est régulée de manière différentielle et complexe. Les facteurs de transcription de la famille des IRFs, de par leur implication dans le contrôle de l’expression de certaines de ces sous-unités, participent à la balance entre ces différentes cytokines.

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INTRODUCTION

1 Les cellules dendritiques au sein de la réponse immune

1.1 L'immunité innée et adaptative

L'organisme doit faire face à des infections par une grande variété de pathogènes et la survie de l'hôte dépend de sa capacité à reconnaître l'agent infectieux et à induire une réponse immunitaire appropriée. Le système immunitaire comprend l’ensemble des cellules et des molécules qui nous protègent de tous ces dangers. Il est efficace grâce à l'action coordonnée de la réponse innée caractérisée par sa rapidité et de la réponse adaptative définie par sa spécificité.

Le premier mécanisme de défense du corps humain est constitutif et se compose des épithélia, comme la peau et les muqueuses, qui sont des barrières physiques ayant pour fonction d’empêcher l’invasion des pathogènes. De plus, certains peptides antimicrobiens sont produits de manière constitutive par les cellules épithéliales. Des enzymes, telles que le lysozyme et les défensines, sont ainsi présentes dans les fluides sécrétés comme les larmes. Ces mécanismes sont présents au niveau des sites continuellement en contact avec les microbes et leur capacité destructrice est strictement dirigée contre ces microbes et non contre les cellules de l'hôte, grâce à leur présence dans des compartiments bien définis ou à la nature de leur activité. Ces barrières ne sont cependant pas infaillibles et il arrive que certains micro-organismes les traversent, par exemple lors d’une lésion. La présence de l’agent pathogène au sein de l’organisme a pour conséquence l’activation du système immunitaire. La réponse immune se déroule en deux phases : dans un premier temps, la réponse innée et dans un second temps, la réponse adaptative (Fig 1).

Lors de l’infection, l’agent pathogène est rapidement confronté aux effecteurs de la réponse innée qui assure une protection de courte durée. Si l’infection persiste, la réponse adaptative est induite. Cette dernière est générée plus lentement mais est plus spécifique que la réponse innée et donne lieu au phénomène de mémoire, c’est-à-dire que lors d’une seconde exposition par le même antigène, la réponse qui se développe sera plus rapide et intense que la réponse initiale (Tableau 1).

Les effecteurs du système immunitaire inné peuvent être répartis en deux classes : les facteurs solubles et les composants cellulaires.

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Les facteurs solubles comprennent le complément qui est un ensemble de protéines plasmatiques intervenant dans la lyse de certaines bactéries, l’activation de cellules phagocytaires et l’opsonisation; les protéines de phase aigüe qui augmentent la résistance à l’infection et induisent la réparation des tissus endommagés et une série de chimiokines.

Les composants cellulaires comprennent les cellules polynucléaires (neutrophiles, éosinophiles, basophiles, mastocytes), les cellules phagocytaires telles que les cellules dendritiques (DCs), monocytes, macrophages qui internalisent les pathogènes alors exposés à une série de molécules intracellulaires toxiques, et d’autres sous-types cellulaires tels que les cellules T JG, les cellules NK (Natural Killer) ou les cellules NKT douées de propriétés cytotoxiques non spécifiques. L'activation de ces cellules nécessite la reconnaissance du micro-organisme infectieux. La nature du pathogène est définie grâce à des récepteurs génétiquement déterminés qui reconnaissent des structures moléculaires communes aux micro-organismes, les PRRs (Pathogen Recognition Receptor)1.

A côté de leur rôle effecteur dans les réponses innées, les cellules dendritiques permettent de lier l'immunité innée et adaptative de part leur propriété de cellules présentatrices d'antigènes (APCs) 2. La réponse adaptative dépend des lymphocytes T et B. Le récepteur porté par les lymphocytes T (T-cell receptor, TCR) et B (B cell receptor, BCR) est le résultat d’un réarrangement somatique des gènes des segments V, D et J 3. Ce mécanisme aléatoire de génération de récepteurs permet la formation d'un répertoire caractérisé par une grande diversité cependant ces récepteurs ne sont pas capables de déterminer la nature du pathogène 1. Les lymphocytes B reconnaissent l’antigène dans sa conformation native et répondent aux stimuli antigéniques par leur division et leur différenciation en plasmocytes qui sécrètent les anticorps. Les lymphocytes T, quant à eux, reconnaissent uniquement des peptides dérivés des protéines antigéniques logés dans une molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) présent à la surface des APCs 4. L'engagement du TCR induit l'expansion clonale des lymphocytes T et leur différenciation en lymphocytes T effecteurs. La nécessité d'une expansion clonale et d'une différentiation des cellules naïves spécifiques de l'antigène en cellules effectrices avant de pouvoir contribuer aux défenses de l'hôte explique le délai observé lors de la mise en place de la réponse adaptative ainsi que l'importance d'une première ligne de défense rapide médiée par la réponse innée.

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1.2 Les sous-populations de cellules dendritiques

Les cellules dendritiques sont décrites comme les principales cellules présentatrices d'antigènes. Ces cellules représentent une population hétérogène et sont présentes dans tous les organes lymphoïdes ainsi que dans la plupart des tissus non lymphoïdes. On distingue deux populations majeures de DCs: d'une part, les DCs migratrices des tissus non lymphoïdes et les DCs résidentes des tissus lymphoïdes communément appelées DCs conventionnelles (cDCs); d'autre part les DCs plasmacytoïdes (pDCs).

Les cDCs ont pour principales fonctions de maintenir la tolérance au soi et d'induire des réponses spécifiques dirigées contre les pathogènes 5. Les DCs migratrices capturent donc des antigènes au niveau des tissus et migrent en permanence vers la zone T des ganglions lymphatiques (GLs). Ce processus est amplifié en présence de signaux inflammatoires 6. Les cellules de Langherans (LC), présentes dans l'épiderme et certaines muqueuses, sont considérées comme l'exemple type de DC migratrice 7. Au niveau des tissus lymphoïdes, les DCs capturent et présentent des antigènes au sein de l'organe lymphoïde. Chez la souris, ces cellules sont les plus étudiées et ont été divisées en plusieurs populations: les DCs CD4+CD8D-, les DCs CD4-CD8D+ et une population double négative (CD4-CD8-8.

Les pDCs sécrètent d'importante quantité d'interféron (IFN) en réponse aux infections virales et activent les cellules T contre les antigènes viraux 9. Ces cellules circulent dans le sang et on les retrouve dans la moelle osseuse, la rate, le thymus, les GLs.

Contrairement aux autres DCs, en l'absence d'infection, ces cellules ne migrent pas de manière efficace vers les tissus périphériques.

A côté de ces deux populations de DCs, deux autres sous-types de DCs ont été décrits.

Les DCs inflammatoires ou Tip DCs sont des cellules qui ne sont pas présentes dans un organisme sain et apparaissent suite à une infection. Ces cellules se différencient à partir de monocytes, produisent des taux importants de TNFD et expriment fortement iNOS 10-

12. Finalement, les slan DCs sont des cellules présentes dans le sang qui diffèrent des DCs circulantes de par leur phénotype (6-sulfo LacNAc+ CD1c- CD16+). Ces cellules sont caractérisées par leur capacité à produire rapidement de grandes quantités d'IL-12 en réponse à divers stimuli 13.

1.3 La génération des cellules dendritiques

In vivo, les DCs se différencient à partir de deux populations de progéniteurs: les "clonal common myeloid" progeniteurs et les "clonal common lymphoid" progeniteurs 14. Beaucoup de cellules intermédiaires entre ces progéniteurs et les différentes DCs ont été

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décrites mais les mécanismes exacts menant à la génération des DCs ne sont pas encore clairement définis 15.

Différentes cytokines et facteurs de transcription coopèrent pour le développement optimal des différentes sous-populations de DCs. De plus, de nombreuses cytokines telles que le GM-CSF, le TNFD et l'IL-4, produites lors d'une inflammation, jouent un rôle dans le processus de différenciation des monocytes en DCs observé dans ces conditions au niveau des tissus non lymphoïdes 16,17.

In vitro, différentes techniques de culture permettent de générer des DCs (Tableau 2). La plus courante pour les DCs humaines est la génération à partir des monocytes isolés du sang. La présence de cytokines, principalement le GM-CSF et l'IL-4, dans le milieu de culture induit leur différenciation en DCs. Pour la génération de DCs murines, ce sont le plus souvent des progéniteurs dérivés de la moelle osseuse qui sont utilisés. Différentes cytokines telles que le GM-CSF ou le FLT3L peuvent induire leur différenciation en différents sous-types de DCs selon la cytokine utilisée 16,17.

1.4 Les fonctions des cellules dendritiques

1.4.1 La reconnaissance des pathogènes

La reconnaissance des pathogènes par les effecteurs de la réponse innée se fait par l’intermédiaire de récepteurs dont la spécificité est génétiquement prédéterminée. Ces récepteurs reconnaissent certaines structures hautement conservées et présentes dans un large groupe de micro-organismes. Ces structures sont appelées "pathogen- associated molecular patterns" (PAMPs) et les récepteurs capables de les reconnaître sont appelés "pattern-recognition receptors" (PRRs).

Les PAMPs possèdent trois caractéristiques communes qui en font des cibles idéales 18:

ƒ Ce sont des structures moléculaires présentes uniquement chez les micro- organismes. La reconnaissance de ces PAMPs par les récepteurs du système immunitaire inné lui permet de faire la distinction entre le soi et le non-soi.

ƒ Ce sont des structures invariantes parmi les organismes appartenant à une même classe de manière à ce qu'un nombre limité de récepteur permettent la détection d'une grande variété de micro-organismes.

ƒ Ces structures sont essentielles à la survie des microbes, leur mutation ou leur perte serait létale. Par conséquent, des mutants qui pourraient échapper à la reconnaissance ne peuvent pas être générés.

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Il faut noter que la présence des PAMPs n'est pas restreinte aux micro-organismes pathogènes, ils sont également présents chez les micro-organismes non pathogènes. En effet, les PAMPs ne comprennent aucun facteur de virulence, unique aux organismes pathogènes. Les mécanismes permettant à l'hôte de tolérer les organismes non pathogènes ne sont pas encore entièrement définis. Ces mécanismes sont pourtant essentiels étant donné le contact permanent avec la flore commensale. Le confinement de cette flore ainsi que la production de cytokines anti-inflammatoire, telles que l'IL-10 et le TGFE, participent sans doute à cette tolérance. Un dérèglement de ces mécanismes induirait une activation continue des réponses inflammatoires ayant des conséquences potentiellement létales pour l'hôte.

Le système immunitaire est capable de répondre non seulement aux infections mais également à la mort, aux lésions ou encore au stress cellulaire non physiologiques 19. C'est la libération des DAMPs (damage-associated molecular patterns) à partir de compartiments intracellulaires suite à la perte de l'intégrité de la membrane plasmique lors de la nécrose qui active les cellules du système inné (Fig 2) 20. Ce phénomène est absent lors de l'apoptose qui correspond à la mort cellulaire physiologique. A l'heure actuelle, différentes molécules endogènes sont connues pour être des DAMPs. Quant aux récepteurs impliqués dans la reconnaissance de ces DAMPs, ils sont relativement divers et ont été beaucoup moins étudiés que les récepteurs des PAMPs. Certains récepteurs sont capables de reconnaître à la fois des PAMPs et des DAMPs. Le tableau 3 est une liste exhaustive de ces molécules et de leur récepteur.

Les PRRs sont exprimés par la plupart des effecteurs du système inné et en particulier par les cellules dendritiques. Ces récepteurs peuvent être divisés fonctionnellement en trois classes 21:

ƒ Les PRRs sécrétés, qui fonctionnent comme des opsonines en se liant sur les cellules de la membrane microbienne et facilitant la reconnaissance par le complément et les phagocytes (par exemple: Mannan-binding lectin).

ƒ Les PRRs participant à l’endocytose, qui interviennent dans la capture et le cheminement du pathogène vers les lysosomes (par exemple: Macrophage mannose receptor).

ƒ Les PRRs de signalisation qui induisent l’expression de gènes impliqués dans la réponse immunitaire, incluant les cytokines inflammatoires. Ce groupe comprend des PRRs membranaires auxquels appartient la famille des récepteurs Toll-like (TLRs); ainsi que des PRRs cytosoliques tels que la famille des RLHs ((RIG-1)-Like Helicases), la PKR (double stranded RNA-dependent protein kinase), la famille des

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NLRs (NOD-Like Receptors) et le DAI ( DNA-dependent activator of IFN regulatory factors).

L’engagement de ces récepteurs par leurs ligands respectifs a de nombreux effets, entre autres, sur les DCs. On observe une augmentation de leur survie, de la sécrétion de chimiokines ainsi que du niveau d’expression de récepteurs aux chimiokines induisant leur migration. Mais surtout, il induit l’augmentation de l’expression des molécules du CMH, des molécules de co-stimulation et la production de cytokines, trois évènements essentiels pour initier l’expansion clonale ainsi que la différenciation en cellules effectrices des lymphocytes T naïfs 22.

Les PRRs de signalisation sont les récepteurs qui jouent un rôle prépondérant dans l'activation des DCs. Nous les décrirons plus amplement dans le chapitre suivant.

1.4.2 La présentation des antigènes

Les DCs sont considérées comme des APCs professionnelles de par leur extraordinaire capacité à générer des peptides antigéniques et à les présenter en association avec une molécule de CMH. Les DCs immatures résident dans les tissus périphériques, elles ont un grand potentiel d'endocytose mais sont inefficaces pour la génération et la présentation de peptides antigéniques. L'exposition à un pathogène induit la maturation des DCs. En effet, la stimulation des DCs par des PAMPs, tel que les ligands des TLRs, influence la capture des antigènes, les réarrangements des endosomes, l'expression à la surface des molécules du CMH ainsi que l'expression de molécules de costimulation 23. En ce qui concerne l'acquisition des antigènes, la stimulation par les TLRs augmente de manière transitoire ce processus qui devient complètement inefficace lorsque la DC est mature.

L'ensemble de ces modifications s'opère au cours de la migration des DCs des tissus périphériques vers les organes lymphoïdes. Cette migration est dirigée par une chémokine (CCL19) dont l'expression du récepteur (CCR7) est induite à la surface des DCs par la rencontre avec le pathogène 24.

La présentation des antigènes peut se faire par deux voies distinctes: la voie endogène associée à la présentation de l'antigène par une molécule de CMH de classe I et la voie exogène associée à la présentation de l'antigène par une molécule de CMH de classe II (Fig 3). La voie endogène est active dans la plupart des types cellulaires et permet la présentation de peptides synthétisés par la cellule aux lymphocytes cytotoxiques T CD8+. Ce processus active donc les T CD8+ suite à des évènements intracellulaires comme une infection virale, la présence de bactéries intracellulaires ou la transformation de la cellule.

La voie exogène n'est fonctionnelle que chez les APCs (DCs, macrophages, cellules B et cellules épithéliales thymiques) et induit l'activation des lymphocytes T CD4+. Les

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peptides présentés par cette voie sont dérivés de protéines capturées à partir du milieu extracellulaire par des mécanismes tels que la phagocytose et l'endocytose 23.

D'importants changements intracellulaires dans des cellules non immunes sont induits par une infection virale ou par la transformation. Ces évènements doivent être rapportés au système immunitaire pour assurer une activation efficace de la réponse T CD8+. En plus des deux voies classiques, les DCs sont capables de faire ce qu'on appelle la

"présentation croisée" leur donnant ainsi la possibilité d'activer des T CD8+ contre des virus ou des bactéries dont elles ne sont pas la cible cellulaire 23. Ce mécanisme implique la phagocytose de fragments dérivés des cellules infectées ou des pathogènes intracellulaires lorsqu'il possèdent une forme extracellulaire transitoire et le passage des antigènes de la vacuole de phagocytose vers le cytoplasme de la DC 25.

1.4.3 L'induction de la différenciation des cellules T effectrices

Lorsque les cellules du système immunitaire inné ne parviennent pas à éliminer un agent microbien et que par conséquent l'infection persiste, les défenses de l'hôte sont renforcées par la génération des cellules de la réponse adaptative. La protection contre différents groupes de pathogènes requière différentes sortes de réponses effectrices et le développement d'une réponse inappropriée mène souvent à des immunopathologies. Le récepteur permettant l'activation des lymphocytes T effecteurs n'est cependant pas capable d'identifier l'origine du pathogène. Cette information lui est fournie par la DC 26.

Arrivées dans la zone des cellules T des GLs, les DCs matures fournissent différents signaux aux lymphocytes T (Fig 4). La liaison du TCR au CMH de classe II présentant le peptide antigénique (signal 1) assure la spécificité antigénique mais n’assure en aucun cas l’origine pathogène de l’antigène présenté. L'initiation de la réponse T nécessite la présence de molécules costimulatrices à la surface de la même DC qui interagissent avec leur récepteur à la surface du lymphocyte T (signal 2). Les molécules costimulatrices peuvent modifier le signal induit par le TCR. Selon les molécules, elles peuvent être exprimées de manière constitutive ou inductible cependant la majorité est induite par l'activation de la cellule. Bien que l'effet le plus connu de la liaison des molécules de costimulation à leur récepteur est l'activation des cellules T, certaines molécules ont un rôle de régulation négative. Une même cellule peut exprimer des molécules de costimulation à effet positif et négatif ce qui contribue à la complexité du processus d'activation des lymphocytes T 27. Les molécules les mieux caractérisées sont le CD80 (B7.1) et le CD86 (B7.2) qui se lient au récepteur CD28 du lymphocyte T 21. La zone de contact entre la DC et la cellule T est appelée synapse immunologique. Le regroupement dans cette région des différentes molécules indispensables à l'activation des T effecteurs

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ainsi que des molécules d'adhésion assure une interaction durable nécessaire à l'activation complète du lymphocyte T 28. L'engagement du TCR et des molécules de costimulation activent la cellule T mais ne lui donnent pas d'information quant à la nature du pathogène et donc du type de réponse nécessaire. Ce sont les cytokines, produites par les DCs et les autres acteurs de la réponse innée, qui dirigent le type de réponse effectrice qui résultera de la différenciation des cellules T (signal 3) 29. Les cytokines impliquées dans la maturation des cellules T peuvent avoir un effet activateur ou inhibiteur de l'expression de facteurs de transcription critiques pour la différenciation d'une réponse effectrice spécifique. Les cytokines produites par un sous-type de T effecteur donné participent au maintien de la différenciation de ce sous-type et agissent comme régulateur négatif de la différenciation des autres sous-types de réponse.

Finalement, les cytokines sécrétées par les T effecteurs jouent aussi un rôle de messager permettant aux cellules T d'influencer les autres cellules au cours de la réponse immune 30.

En l'absence d'infection, une faible proportion des DCs périphériques capture des antigènes dérivés du soi et migre vers les GLs. Ces cellules ne sont que partiellement matures puisqu'elles n'ont pas reçu la stimulation par les PAMPs dérivés des pathogènes.

Par conséquent, elles n'expriment que peu de molécules du CMH, pas de molécules de costimulation à régulation positive et ne produisent pas de cytokines. Dans ces conditions, la reconnaissance du peptide par des lymphocytes T va induire leur apoptose.

Si les DCs expriment des molécules de costimulation à régulation négative, elles vont induire le phénomène d'anergie par lequel la cellule T devient incapable de répondre à une stimulation antigénique. Ces mécanismes contribuent au phénomène de tolérance au soi.

1.4.3.1 Les différentes réponses effectrices

Les lymphocytes de type Th1 et Th2 ont été longtemps considérés comme les seules orientations possibles pour la différenciation des lymphocytes T naïfs. La découverte des lymphocytes T régulateurs induits (iTreg) et surtout des Th17 a boulversé ce dogme. A présent, d'autres types de réponse effectrice ont été décrits, à savoir les lymphocytes Tfh (follicular helper), les Th9 et les Th22 (Fig 5). Dans certains cas, les mécanismes de différenciation et les fonctions précises de ces effecteurs doivent encore être définis.

Le développement de la réponse de type Th1 est initié par la présence d'IFNJ (produit par exemple par les cellules NK) et favorisé par l'IL-27, cytokine de la famille de l'IL-12 produite par les APCs (Fig 6). Les voies de signalisation activées par ces cytokines ainsi que par l'engagement du TCR induisent l'expression de T-bet (Th1-specific T box transcription factor), facteur de transcription crucial pour la différentiation des cellules

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Th1 31,32. En association avec d'autres facteurs de transcription, T-bet induit à son tour la production d'IFNJ et l'expression d'IL-12RE2 qui forme avec la sous-unité IL-12RE1 le récepteur à l'IL-12 33. L'IL-12 produite par les APCs peut alors se lier à son récepteur ce qui amplifie la production d'IFNJ mettant en place une boucle de rétrocontrôle positif.

D'autre part, T-bet inhibe l'expression de GATA3 (GATA-binding protein 3), facteur de transcription indispensable à la différenciation des cellules Th2 34. En plus de l'IFNJ, les cellules Th1 produisent principalement du TNFE. Ces cytokines permettent une meilleure activation des cellules T CD8+ qui, par la sécrétion de perforines, granzymes ou par le système Fas-FasL, vont éliminer les cellules infectées. Les cellules Th1 interagissent avec les macrophages de manière à augmenter leurs fonctions microbicides naturelles. Cette voie favorise donc l’élimination des agents intracellulaires.

La présence d’IL-4 induit le développement de cellules T CD4+ de type Th2. La liaison de cette cytokine à son récepteur active une cascade de signalisation qui mène à l'expression de GATA3 (Fig 6) 35. Ce facteur avec l'aide de Stat6 induit la production d’IL- 4, IL-5 et IL-13. L'IL-4 agit de manière autocrine et paracrine pour stabiliser la différenciation des cellules Th2. GATA3 est également un inhibiteur de l'expression d'IFNJ

35. Les lymphocyte Th2 induisent, tant par l’action des cytokines produites que par une interaction directe, la différenciation des lymphocytes B en plasmatocytes ainsi que le recrutement des éosinophiles. Cette voie favorise donc l’élimination des parasites extracellulaires.

La différenciation des lymphocytes Th17 dépend de la présence de TGFE (transforming growth factor-E) et d'IL-6 (Fig 6) 36. Ces deux cytokines permettent l'expression de RORJT (retinoic-acid-receptor-related orphan receptor-JT). Ce facteur de transcription initie l'expression d'IL-21 qui lui-même induit l'expression du récepteur à l'IL-23 à la surface de ces cellules T 37. L'IL-23 produite par les APCs agit sur ces cellules pour stabiliser et amplifier la différenciation des Th17 ainsi que pour induire la production de cytokines effectrices telles que l'IL-17 et l'IL-22 38. Il faut noter que des différences ont été observées entre l'homme et la souris concernant les cytokines nécessaires à la différenciation des Th17. En effet, chez l'homme, c’est l'IL-1E et non le TGFE qui semble être impliqué dans la génération de ces cellules 39,40. Les cellules Th17 permettent une mobilisation des neutrophiles et sont impliquées dans la protection contre Klebsiella pneumoniae, Citrobacter rodentium, Mycobacteria, Borrelia burgdorferi et Candida albicans indiquant un rôle dans les défenses contre les bactéries extracellulaires et les champignons41.

L'IL-6 et l'IL-21 sont également impliquées dans la différenciation des Tfh par l'induction de l'expression du facteur de transcription Bcl-6 spécifique à cette réponse lymphocytaire

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42. Bcl-6 augmente l'expression des ARNm pour l'IL-6R, l'IL-21R et le CXCR5, tous importants pour la différenciation et la fonction de ces cellules. L'IL-6, quant à lui, augmente aussi la production d'IL-21 mettant en place un rétrocontrôle positif 43. L'IL- 21, avec l'aide d'autres molécules telles que ICOS et OX40, participe en plus à la fonction des Tfh qui est de permettre aux cellules B de se différencier en cellules mémoires ou en plasmatocytes producteurs d'anticorps de grande affinité 44.

Lorsque seul le TGFE est présent, c'est la différenciation des lymphocytes iTreg qui est induite via l'expression de Foxp3 45. L'expression optimale de ce facteur de transcription dépend de la présence d'IL-2 qui est donc nécessaire pour l'expansion des iTreg 46. Les iTreg, en association avec les Treg naturels générés au niveau du thymus, contrôle les différentes réponses immunes qui peuvent causer des destructions tissulaires lors d'une activation excessive. Les iTreg inhibent les réponses lymphocytaires par des mécanismes variés illustrés à la figure 7.

Récemment, deux équipes ont mis en évidence que l'association du TGFE à l'IL-4 induit la différenciation d'une population effectrice distincte caractérisée par une production importante d'IL-9 et par conséquent nommée Th9 47,48. Un facteur de transcription spécifique à cette réponse effectrice n'a pas encore pu être identifié. De plus, l'ajout de TGFE à des lymphocytes T différenciés en cellules de type Th2 induit une reprogrammation de ces cellules en lymphocytes de type Th9. Une telle plasticité n'avait jamais été observée entre les différentes réponses effectrices. Il est donc envisageable que les Th9 se différencient à partir des Th2. D'autre part, les Th2 et les Th9 sont associés à l'élimination des helminthes et donc une autre explication de ce phénomène serait une adaptation du système pour un meilleur contrôle des réponses dirigées contre ces parasites. Par ailleurs, il a été montré que l'IL-9 d'une part contribue à la génération de Th17 et induit sa propre production par ces cellules, et d'autre part améliore les fonctions régulatrices des T régulateurs 49. Ces données suggèrent des relations complexes entre les Th9 et les autres populations effectices.

Les Th22 sont les derniers lymphocytes effecteurs à avoir été décrits 50,51. Ces cellules productrices d'IL-22 mais pas d'IL-17, dont la différenciation in vitro peut être induite en présence d'IL-6 et de TNF, pourraient être responsables de plusieurs maladies inflammatoires de la peau. Les résultats obtenus concernant les facteurs de transciption impliqués dans la génération de ces Th22 sont contradictoires. Des études supplémentaires sont donc nécessaires pour comprendre les mécanismes impliqués dans la différenciation de ces cellules.

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1.4.4 L'induction de la tolérance

En plus de leur rôle dans la réponse innée et dans l'induction de la réponse adaptative, les DCs sont également impliquées dans les mécanismes de tolérance indispensables au maintien de l'intégrité de l'organisme hôte. En effet, des TCRs capables de reconnaître des peptides antigéniques dérivés de protéine du soi peuvent être générés par le processus de recombinaison aléatoire du TCR. Un système de sélection, appelé tolérance centrale, permet d’éliminer les lymphocytes porteurs de tel TCRs avant qu'ils ne soient largués dans le flux sanguin. Les DCs du thymus jouent un rôle majeur dans la présentation du peptide lors de cette sélection 52.

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2 Reconnaissance des pathogènes par les "pattern recognition receptors" de signalisation

Nous allons détailler les principaux PRRs qui permettent d’activer les cellules dendritiques suite à la reconnaissance d’un pathogène ainsi que les voies de signalisation induites par l’engagement de ces récepteurs. La première partie de ce chapitre est consacrée aux récepteurs membranaires de la famille Toll Like. La seconde partie décrit les RLHs, PKR, NLRs et DAI, ensemble de récepteurs appartenant à la famille des récepteurs cytosoliques.

2.1 Les récepteurs de la famille Toll Like

2.1.1 Structure et expression des TLRs

Les Toll-Like récepteurs (TLRs) sont des molécules hautement conservées au cours de l'évolution (le plus ancien TLR identifié est exprimé chez le ver Caenorhabditis elegans).

Cette famille de récepteurs a initialement été découverte chez la drosophile. La protéine Toll a d'abord été identifiée comme essentielle pour l’établissement de la polarité dorso- ventrale lors de l’embryogenèse. D’autres études ont ensuite révélé que Toll a aussi un rôle critique dans les réponses immunes innées antifongiques et antibactériennes de l’insecte adulte 53.

Chez les mammifères, on identifie à l'heure actuelle une dizaine de protéines homologues à Toll qui forme la famille des TLRs. Ce sont des récepteurs de type I transmembranaires caractérisés par un domaine extracellulaire riche en séquence répétée de leucine (LRR) et un domaine intracellulaire homologue à celui du récepteur à l’interleukine 1 (Toll/IL-1 receptor (TIR) domain) (Fig 8).

Impliqué seul ou en association avec des molécules accessoires dans la reconnaissance de divers composants issus de pathogènes 54, le domaine extracellulaire des TLRs contient 19 à 25 copies en tandem du motif LRR dont la séquence consensus est XLXXLXLXX. Malgré la conservation des domaines LRR, les différents TLRs sont capables de reconnaître des ligands structurellement différents 55. Les mécanismes permettant aux LRRs de reconnaître des ligands distincts sont encore incompris.

Le domaine intracytoplasmique des TLRs, le domaine TIR, permet des interactions protéine-protéine avec les molécules adaptatrices qui possèdent également un domaine

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TIR. Cette région d’homologie contient trois boîtes conservées parmi les membres de cette famille56. L'analyse de la structure des domaines TIR de TLR1 et TLR2 a révélé un élément structurel important autour de la deuxième boîte. Cette région forme une boucle orientée vers l'extérieur de la protéine contenant des acides aminés déterminant pour le contact avec les molécules de signalisation 57. L'ensemble des molécules contenant un domaine TIR a une fonction essentielle dans les défenses de l'hôte.

Les TLRs sont exprimés par de nombreuses cellules du système immunitaire, incluant les DCs, les macrophages, les lymphocytes B et certains types de lymphocytes T, de même sur des cellules non immunes comme les fibroblastes ou les cellules épithéliales (Tableau 4) 21,55. Il est important de noter que les TLRs sont exprimés différentiellement par les cellules du système immunitaire. En particulier, les APCs expriment des répertoires de TLRs différents (Tableau 5), révélant ainsi une spécialisation de leur réponse vis-à-vis de différents agents pathogènes. Chez l'homme, les monocytes montrent une expression de TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7 et TLR8 et une absence d’expression de TLR3, TLR9 et TLR10. Les DCs myéloïdes expriment la plupart des TLRs à l’exception de TLR9. Les pDCs expriment par contre des taux importants de TLR7 et TLR9 mais pas de TLR2, TLR3, TLR4, TLR5 ou TLR8 58. Chez la souris, les différents sous-types de DCs présentent également de légères différences dans le profil d'expression des TLRs. De plus, l'expression des TLRs n'est pas statique mais modulée de manière rapide en réponse à certains pathogènes, de nombreuses cytokines ou des stress environnementaux.

Certains TLRs tels que TLR1, TLR2 et TLR4 sont exprimés à la surface cellulaire. D'autres comme TLR3, TLR7, TLR8 et TLR9 sont exprimés exclusivement dans des compartiments intracellulaires tels que les endosomes (Fig 9). Les ligands de ces récepteurs, principalement des acides nucléiques, nécessitent leur internalisation au niveau de ces endosomes avant que toute induction de signalisation ne soit possible 59.

2.1.2 Les ligands des TLRs

Les ligands des TLRs sont largement exprimés par les bactéries, champignons, virus et protozoaires permettant ainsi la détection de l'entrée de l'ensemble de ces pathogènes dans l'organisme hôte par les sentinelles du système immunitaire. L'engagement des TLRs par un de ces PAMPs (définit précédemment cf 1.1) induit l'expression d'un grand nombre de gènes impliqués dans les défenses de l'hôte 60. Les ligands des TLRs peuvent être divisés en trois grandes catégories: les lipides et lipopeptides reconnus par TLR2 (en association avec TLR1 ou TLR6) et TLR4; les protéines détectées par TLR5 et TLR4; les acides nucléiques reconnus par TLR3, TLR7, TLR8 et TLR9. En dehors de cette répartition générale, il faut noter que certains TLRs sont capables de reconnaître des ligands variés

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ne partageant aucune similarité structurelle. Le nombre de ces ligands ne cesse d'augmenter, le tableau 6 en donne un aperçu.

L'invasion de l'organisme par un pathogène induit en réalité l'activation de plusieurs TLRs mais aussi de PRRs autres que les TLRs. L'amplitude et la qualité de la réponse immune induite dépendent donc de la distribution des ces récepteurs sur les cellules immunes rencontrées par le pathogène. Ainsi, il a été montré que la stimulation de macrophages ou de DCs par une combinaison de plusieurs ligands des TLRs tels que le polyI:C (ligand TLR3) et le CpG ADN (ligand TLR9) a une action synergique sur la production de cytokines, dont le TNF, l'IL-6 ou l'IL-12 61,62. Cependant, la production de cytokines peut aussi être influencée de manière négative par l'engagement simultané de plusieurs TLRs.

En particulier, la production d'IL-10 suite à une stimulation de TLR2 bloque l'expression d'IL-12 et d'IP10 produites par les DCs en réponse à une stimulation de TLR3 ou TLR4 63. L'induction synergique de cytokines a également été décrite lorsque les macrophages ou les DCs sont stimulées par l'association d'un ligand TLR et d'un ligand de NOD1, NOD2, du récepteur au E-glucan ou encore du récepteur Dectin-1 64.

2.1.3 Les voies de signalisation induites par l’activation des TLRs

La stimulation des TLRs par leur ligand déclenche l’expression de nombreux gènes impliqués dans les réponses immunes.

Après la liaison du ligand, les TLRs dimérisent (formation d’hétérodimère entre TLR2 et TLR1 ou TLR6, formation d’homodimère pour les autres TLRs), ce qui induit un changement de conformation nécessaire pour le recrutement de molécules adaptatrices.

Ce recrutement est possible grâce à la présence du domaine TIR cytoplasmique des TLRs. Quatre molécules adaptatrices sont connues à ce jour: MyD88 (Myeloid differentiation factor 88), TIRAP (TIR domain containing adaptator protein), TRIF (TIR domain-containing adaptor inducing IFN-E) et TRAM (TRIF-related adaptor molecule).

L'existence de plusieurs molécules adaptatrices et leur participation dans les diverses voies de signalisation activées par les TLRs permet de générer une diversité et une spécificité au niveau de la réponse immune innée vis-à-vis d'un grand nombre de pathogènes. On distingue principalement deux voies de signalisation activées par l'engagement des TLRs, la voie "MyD88 dépendante" et la voie "MyD88 indépendante"

(Fig. 10) 59.

2.1.3.1 La voie "MyD88 dépendante"

La voie MyD88 dépendante est analogue à la voie de signalisation induite par le récepteur à l’IL-1. Tous les TLRs à l'exception de TLR3 activent cette voie de

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signalisation. MyD88 possède un domaine TIR en position C-terminale, par lequel il s’associe avec le domaine TIR du TLR et un "Death domain" (DD) en position N- terminale, par lequel il recrute IRAK-4 (IL-1R-associated protein Kinase 4). IRAK-4 est une protéine kinase qui comporte un DD en N-terminal et un domaine kinase (KD) dans sa partie centrale 65. Le recrutement d'IRAK-4 induit son association avec IRAK1 ainsi que la phosphorylation de ce dernier. Le complexe IRAK-4/IRAK-1 ainsi activé se détache de MyD88 et s’associe alors avec TRAF-6 (Tumor necrosis factor (TNF) receptor-activated factor 6) menant à l’activation de TAK1/TAB (TGFE-activated Kinase 1/TAK1 Binding protein). TAK1 induit l'activation de deux voies de signalisation. La première voie aboutit à l’activation du facteur de transcription JNK (c-jun N-terminal kinase) et p38 via l’activation des MAPKs (mitogen-activated protein kinase). La seconde voie augmente l’activité du complexe INB kinase (IKK) composé de IKKD, IKKE et NEMO (ou IKKJ). Ce complexe induit la phosphorylation et la dégradation de INB (Inhibitor of NFNB) qui entraîne la translocation nucléaire de NFNB (nuclear factor-NB). Ces facteurs de transcription coopèrent pour l'induction de l’expression de cytokines pro-inflammatoires, de molécules de co-stimulation et de médiateurs variés 66-68. Différents membres de la famille de IRFs (interferon regulatory factor) sont activés par la voie de signalisation MyD88 dépendante. Les mécanismes impliqués seront décrits dans un chapitre concernant cette famille de facteur de transcritpion (cf 3.2.1.2)

Dans cette voie, le rôle essentiel de la molécule MyD88 est démontré par le fait que la production de cytokines inflammatoires, telles que le TNFD et l’IL-12p40, par les souris invalidées pour MyD88 en réponse à la plupart des ligands TLRs est fortement réprimée

69. De plus, les souris MyD88-/- sont résistantes au choc endotoxique induit par le LPS mais sont très sensibles aux infections bactériennes 70. De manière étonnante, les DCs isolées à partir de ces souris présentent une maturation phénotypique comparable à celle des DCs de type WT et produisent des IFNs de type I en réponse au LPS et au polyI:C.

En outre, l'activation de NFNB et des MAPKs par ces deux ligands est toujours observée dans les DCs MyD88-/-, bien que ce soit de manière retardée 71. Les découvertes faites à partir des souris déficientes pour MyD88 ont été des indices quant à l'existence d'autres voies de signalisations activées par l'engagement de TLR3 et TLR4 et fonctionnant de manière indépendante à MyD88.

Une autre molécule adaptatrice, TIRAP, contient un domaine TIR dans sa partie C- terminale et interagit avec la partie intracellulaire de TLR4 et TLR2 72. Grâce aux souris invalidées pour le gène codant pour TIRAP, il a été montré que celui-ci est impliqué dans l’activation précoce de NFNB en réponse au LPS mais pas dans son activation tardive. De plus, la production de cytokines pro-inflammatoires en réponse au ligand TLR2 est sévèrement diminuée dans les cellules déficientes pour TIRAP 72. Cet adaptateur joue en

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fait un rôle important dans les réponses immunes dépendantes de MyD88 induites par TLR4 et TLR2 puisqu'il permet le recrutement via sa partie N-terminale de MyD88 56,73.

2.1.3.2 La voie "MyD88 indépendante"

La recherche d'autres molécules contenant un domaine TIR a permis l'identification du troisième adaptateur nommé TRIF. Le rôle physiologique de TRIF a été révélé par l'analyse des souris déficientes pour TRIF et des souris Lps2 présentant une mutation menant à l'inactivation du gène codant pour TRIF. Ces études démontrent que TRIF est essentiel pour l'activation de la voie MyD88 indépendante induite par l'engagement de TLR3 et TLR4. Les DCs générés à partir des souris TRIF-/- ou Lps2 mutant présentent un défaut de production d'IFNs de type I mais aussi de cytokines pro-inflammatoires en réponse au LPS et au polyI:C. Une observation importante est le maintien de l'activation de NFNB dans la phase précoce de l'activation par le LPS alors que l'absence de TRIF inhibe complètement l'activation de ce facteur suite à la stimulation par le polyI:C74,75. Cette voie MyD88 indépendante participe aussi à l'augmentation de l'expression des marqueurs d’activation à la surface des cellules dendritiques induite par le LPS et ce par l'intermédiaire des IFNs de type I 76. Ces observations indiquent que la cascade de signalisation activée par la stimulation de TLR4 par le LPS est séparée en deux groupes:

une voie MyD88 dépendante qui mène à la production de cytokines pro-inflammatoires avec une activation rapide de NFNB, et une voie MyD88 indépendante associée à l’induction de gènes IFN-inductibles et à la maturation des cellules dendritiques avec une activation lente de NFNB.

Cette voie TRIF-dépendante implique des molécules de signalisation qui lui sont propres mais également des molécules qu'elle partage avec la voie MyD88 dépendante. TRIF interagit avec le TIR domaine du TLR et recrute ensuite plusieurs protéines effectrices grâce à différents motifs d'interaction protéique. TRAF3 se lie à la partie C-terminale de TRIF et permet le recrutement de TANK (TRAF family member-associated NFNB activator) ou de NAP1 (NAK-associated protein 1), selon l'engagement de TLR4 ou TLR3 respectivement. Ces deux facteurs sont des protéines "scaffold" qui assurent l'activation optimale de TBK1 (TRAF-family-member-associated NFNB-activator (TANK)-binding kinase 1) et IKKH, kinases indispensables pour la phosphorylation d'IRF3 77. Ce dernier est le facteur critique pour l'induction de la production d'IFNE et de cytokines interféron- dépendantes 78. Pour l'activation de NFNB, TRIF utilise deux voies de signalisation. D'une part, TRAF-6 est recruté au niveau de la région N-terminale de TRIF. L'introduction d'une mutation dans cette région de TRIF inhibe par conséquent l'activation de NFNB mais pas celle d'IRF3 79. D'autre part, l’activation de NFNB peut aussi impliquer RIP-1 (receptor-

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interacting protein 1) qui s’associe avec la région C-terminale de TRIF et active le complexe IKK 80.

Le quatrième adaptateur contenant un domaine TIR, TRAM, est impliqué dans la voie MyD88 indépendante/TRIF dépendante induite par TLR4. L'analyse du rôle de TRAM grâce à l'utilisation des souris TRAM-/- indique que cette molécule est spécifiquement impliquée dans la voie de signalisation MyD88 indépendante en aval de TLR4. Les DCs isolées de ces souris présentent un défaut d'activation d'IRF3 en réponse au ligand de TLR4 81. Par contre, l'activation d'IRF3 et de NFNB ainsi que la production de cytokines suite à la stimulation de TLR3 est normale dans les DCs TRAM-/-.

2.1.4 La régulation négative des TLRs

La production efficace de médiateurs inflammatoires est essentielle pour le développement de réponses immunes effectrices. Cependant, si ces réponses ne sont pas contrôlées, elles peuvent aboutir à une réponse inflammatoire excessive et des lésions tissulaires. Dans le cas de l'activation des TLRs, les voies de signalisation induites par l'engagement de ces récepteurs sont soumises à une régulation négative impliquant différentes molécules à de multiples niveaux. Parmi les inhibiteurs de la signalisation en aval des TLRs, un membre de la famille IRAK, IRAK-M, a la particularité de ne pas avoir d'activité kinase et empêche la formation du complexe entre IRAK-4 et TRAF6 82. MyD88s est une isoforme de MyD88 qui ne possède pas la région intermédiaire et par conséquent est incapable de recruter IRAK-4 et d'activer IRAK-1 83. SOCS1 par contre exerce un effet suppresseur direct sur NFNB en facilitant l'ubiquitination et par conséquent la dégradation de p65 84. L'ubiquitination et la dégradation de la forme phosphorylée de MAL sont aussi induites par SOCS1 85.

En plus des régulateurs endogènes des TLRs, de nombreux virus ont développé des mécanismes permettant d'inhiber l'activation de ces voies de signalisation. Par exemple, la protéine A46R du virus de la vaccine contient un domaine TIR qui lui permet de se lier à MyD88, Mal, TRIF et TRAM inhibant l'activation des molécules de signalisation en aval de ces adatapteurs 86. Le virus de l'hépatite C produit une protéine appelée NS3/4A qui clive TRIF d'une part et inhibe l'interaction de TBK1 avec IRF3 d'autre part 87,88.

2.2 Les récepteurs cytosoliques

Les virus et certaines bactéries peuvent accéder au cytoplasme des cellules. Il est donc indispensable pour l'hôte d'avoir à sa disposition des molécules lui permettant de détecter la présence de ces pathogènes. Ce sont des récepteurs cytosoliques qui jouent ce rôle de PRRs intracellulaires.

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2.2.1 La protéine kinase activée par l'ARN double brin (PKR)

La PKR est la première molécule possédant la capacité de détecter la présence d'ARNdb à avoir été identifiée. L'activité de la PKR est induite par la liaison de l'ARNdb produit lors de la réplication virale aux deux "dsRNA binding motifs" (dsRBM) présents dans la région N-terminale de la protéine 89. La PKR bloque la traduction des ARNm viraux et cellulaires par la phosphorylation du facteur eIF-2 (eukaryotic initiation factor 2) ce qui empêche la réplication virale (Fig 11) 90. Par l'intermédiaire de molécules de signalisation telle que TRAF, cette enzyme mène à l'activation de NFNB qui participe à la production d'IFN et l'établissement de la réponse antivirale. Les souris PKR-/- sont plus sensibles aux infections par le VSV (Vesicular Stomatitis Virus), indiquant que la PKR joue un rôle dans la génération de réponses antivirales in vivo89.

2.2.2 La famille des "RIG-1 Like Helicases" (RLHs)

Cette famille de récepteur reconnaît l'ARN viral et est importante pour la production d'IFNs de type I dans de nombreux types cellulaires à l'exception des DCs plasmacytoïdes 91,92. Elle comprend trois récepteurs cytosoliques: RIG-1 (retinoic acid inducible gene 1), Mda5 (melanoma differentiation-associated gene 5) et LGP2 (laboratory of genetics and physiology 2). RIG-1 et Mda5 contiennent un domaine hélicase en C-terminal impliqué dans la détection de l'ARN et deux domaines CARD (Caspase recruitment domain)-like dans la partie N-terminale qui sont nécessaires pour l'activation de la cascade de signalisation 93. LGP2 possède le domaine hélicase mais pas le domaine CARD-like indiquant que ce récepteur jouerait plutôt un rôle de régulation négative en entrant en compétition avec RIG-1 et Mda5 pour la liaison de l'ARN viral 94. L'utilisation des souris déficientes pour RIG-1 ou Mda5 ont permis de démontrer la pertinence in vivo de ces récepteurs dans les réponses antivirales 92,95. Ces souris nous ont également permis de mieux définir la spécificité de ces deux récepteurs. Les souris RIG-1-/- ont une sensibilité accrue à des virus possédant un génome à ARNsb (simple brin) comme le virus influenza, le virus de l'encéphalite japonaise et le VSV (Vesicular Stomatitis Virus) 93. Les souris Mda5-/- développent une réponse normale contre ces virus mais sont sensibles à d’autres virus à ARNsb tel que la famille des picornavirus 92. Mda5 est aussi impliqué dans la reconnaissance du polyI:C (ARN double brin synthétique)

96. Récemment, la structure moléculaire qui est à la base de la reconnaissance des ARNsb par RIG-1 a été découverte alors que le ligand de Mda5 n'est pas encore caractérisé.

RIG-1 détecte la présence d'ARN dont la partie 5' triphosphate ne possède pas de "cap"

97. De tels ARNs ne sont pas produits par les cellules eucaryotes.

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La cascade de signalisation activée par l'engagement de RIG-1 et Mda5 induit l'activation de NFNB et des IRFs (Fig 12). La première molécule à s'associer à RIG-1 et Mda5 par une interaction CARD-CARD est IPS-1 (Interferon E promoter stimulator-1, aussi connu sous le nom de Cardif, MAVS ou VISA) 98. En dehors de son domaine CARD, IPS-1 possède une région transmembranaire qui lui permet d'être localisé dans la membrane externe de la mitochondrie. Cette localisation lui est indispensable puisque son clivage le rend inactif

99. Les macrophages et les DCs isolés de souris IPS-1-/- sont déficients pour la production d'IFNs de type I suite à l'activation de RIG-1 et Mda5 mais pas suite à l'engagement des TLRs ou du DAI 100. IPS-1 recrute TRADD (TNFR-associated death domain) ensuite TRAF3 qui fait le lien avec les kinases TBK1 et IKKH responsables de l'activation d'IRF3 et IRF7 induisant ainsi la production d'IFNs de type I 101,102. L'activation de NFNB par contre dépend du recrutement de FADD (Fas-associated death domain protein) et RIP-1 (receptor-interacting protein 1) qui activent à leur tour le complexe IKK 103. Les cellules déficientes pour FADD ont une production réduite d'IFNE et de cytokines pro- inflammatoires suggérant que FADD participe aussi à l'activation des IRFs 104.

2.2.3 Le "DNA-dependent activator of IFN regulatory factors" (DAI)

En plus de récepteurs cytosoliques permettant la détection des ARNs, une molécule capable d'avertir la cellule de la présence d'ADN dans le cytoplasme a été mise en évidence et appelée DAI (DNA-dependent activator of IFN regulatory factors) 105. Cette protéine contient en N-terminal trois régions, ZD, ZE et D3 qui forment le domaine de liaison de l'ADN (Fig 13) 106. DAI possède aussi un domaine de signalisation encore peu étudié. DAI est impliqué dans la détection d'ADN d'origine virale et bactérienne et d'ADNsb synthétique tel que le poly(dA-dT) (ou B-DNA). Suite à la présence d'un de ces ligands, DAI subit une oligomérisation et interagit directement avec TBK1 et IRF3 107. D'autres molécules, RIP1 et RIP3, interagissent avec DAI et induisent l'activation de NFNB

108. Finalement, une étude met en évidence un défaut partiel de la réponse au B-DNA lorsque IPS-1 est absent 109. Un facteur récemment découvert, STING/MITA (Stimulator of interferons genes/mediator of IRF3 activation) pourrait intervenir en association avec IPS-1 puisque la production d'IFNE est fortement déficiente en l'absence de ce facteur

110,111.

L'activation de la réponse immune presque normale obtenue suite à une stimulation de souris DAI-/- par l'ADN in vivo et in vitro suggère la présence d'autres récepteurs cytosoliques permettant la détection de l'ADN 105.

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2.2.4 La famille des "NOD Like Receptors" (NLRs)

La famille des NLRs regroupe les sous-familles des protéines NODs (nucleotide-binding oligomerization domain), des protéines NALPs (NACHT- ; LRR- and pyrin-domain- containing proteins) et de IPAF/NAIP (ICE-protease activating factor/neuronal apoptosis inhibitor protein). Les protéines de cette famille possèdent trois domaines: un domaine LRR (leucine-rich repeats) en C-terminal pour l'activation par le ligand, un domaine central NACHT permettant une oligomérisation et un domaine effecteur en N-terminal qui active la cascade de signalisation 112.

Les protéines NODs, NOD1 et NOD2 étant les plus connues, sont les premiers NLRs identifiés. Ils détectent la présence de PAMPs d'origine bactérienne dans le cytoplasme

113. Un domaine CARD constitue le domaine effecteur des NODs; NOD1 en possède un alors que NOD2 en possède deux. NOD1 est exprimé de manière ubiquitaire et son ligand est un dérivé du peptidoglycan provenant des bactéries Gram- dont la structure minimale est l'acide g-D-glutamyl-meso-diaminopimalique (iE-DAP). L'expression de NOD2 est restreinte aux cellules myéloïdes. Son ligand est aussi un dérivé du peptidoglycan, le muramyl dipeptide (MDP) qui lui est présent chez les bactéries Gram- et Gram+. Lors de l'activation de l’un de ces récepteurs, la molécule RIP2/RICK est recrutée grâce à une interaction entre le domaine CARD qu'elle possède et le domaine CARD de NOD. Cette interaction mène à l'activation de NFNB via le complexe IKK. L'activation de facteurs en aval de la voie des MAPKs, en particulier de p38MAPK, ERK et JNK, en réponse à l'engagement des NODs a été décrite (Fig 14) 114,115.

La famille des protéines NALPs comprend 14 membres qui présentent un domaine effecteur commun appelé PYD 116. NALP3, la protéine la mieux caractérisée, est activée en réponse à des PAMPs provenant de bactéries telles que Staphylococcus aureus ou Listeria monocytogenes ainsi que par des signaux de danger endogènes comme l'ATP ou les cristaux d'acide urique. La présence d'un de ces ligands va induire l’oligomérisation de NALP3 et ensuite son association à ASC par une interaction PYD-PYD. ASC va ensuite recruter la pro-Caspase-1 par une interaction CARD-CARD pour former l'inflammasome indispensable dans le processus qui mène au clivage de la pro-Caspase-1 en Caspase-1 active et ainsi à la production d'IL-1E et d’IL-18 mature (Fig 15) 117. La protéine IPAF par contre, possède un domaine CARD et peut induire la formation de l’inflammasome par le recrutement direct de la pro-Caspase-1. Seule ou en association avec NAIP, elle participe à la détection de pathogènes intracellulaires tel que Salmonella typhimurium, Shigella flexneri ou Legionella pneumophila (Fig 16) 118.

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3 La famille des IRFs (interferon regulatory factors)

La famille des IRFs (IFN regulatory factors) se compose de neuf membres: IRF1, IRF2, IRF3, IRF4 (aussi connu sous le nom de PIP, LSIRF ou ICSAT), IRF5, IRF6, IRF7, IRF8 (également appelé ICSBP) et IRF9 (aussi appelé ISGF3J). Ces facteurs de transcription jouent des rôles déterminants et variés au cours des réponses immunes innée et acquise.

3.1 Structure et expression des IRFs

Les IRFs contiennent plusieurs domaines qui sont communs à tous les membres de la famille ainsi que des domaines qui sont spécifiques à certains membres (Fig 17). Tous les IRFs possèdent un "DNA-binding domain" (DBD) ainsi qu'un domaine de régulation. Le DBD est situé en position N-terminale et contient cinq résidus tryptophane conservés. Ce domaine possède une structure hélice-boucle-hélice et permet aux facteurs de se lier spécifiquement à une séquence d'ADN appelée "IFN-stimulated response element" (ISRE,

A/GNGAAANNGAAACT). Tous les IRFs à l'exception d'IRF6 contiennent un "IRF association domain" (IAD) dans la partie C-terminale. Ce domaine leur permet de former des homodimères ou hétérodimères. Un signal de localisation nucléaire (NLS) est également présent chez la plupart des membres de la famille des IRFs. IRF2, IRF3, IRF4 et IRF5 possèdent un domaine de répression qui devient actif en présence de partenaires de liaison spécifiques ou après phosphorylation 119.

L’expression des IRFs par les différents types cellulaires de même que les facteurs qui influencent cette expression ont été résumés dans 119,120.

IRF1 est faiblement exprimé par de nombreux types cellulaires au repos tels que les cellules T, les cellules NK, les macrophages et les DCs. Cependant, l'expression d'IRF1 est fortement augmentée par différents agents tels que les virus, le LPS, l'IFNEet l'IFNJ

121,122. Les lésions à l'ADN induisent également l'expression de ce facteur.

IRF2 est exprimé constitutivement par les cellules B, les cellules T et les macrophages.

Son expression est induite par l'IFNE ou les infections virales mais dans une moindre mesure que celle d'IRF1.

IRF3 est exprimé de manière constitutive dans le cytoplasme de tous les types cellulaires. Son IAD est entouré par deux domaines d’autoinhibition (ID), qui interagissent pour générer une conformation fermée d'IRF3. Sous cette forme, les IAD, DBD et la séquence de localisation nucléaire sont masqués, ce qui empêche la

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