Les gènes codant pour les différentes sous-unités qui composent les cytokines de la famille de l'IL-12 sont situés sur des chromosomes différents et chaque sous-unité possède ses propres mécanismes de régulation transcriptionnelle.
4.4.1 La p40
A l'état basal, des nucléosomes sont présents au niveau de la région promotrice de la
p40 et masquent des sites de liaison pour des facteurs de transcription 404. Le
remodelage du nucléosome 1 est induit par la stimulation de manière à rendre certains sites de liaison accessibles. Le promoteur de la p40 contient différents éléments
impliqués dans l'activation transcriptionnelle. Un site NFNB est présent entre les
nucléotides -117/-107 par rapport au site d'initiation de la transcription 405. Bien que des
hétérodimères p50/p65 et p50/c-Rel soient capables de se lier, c-Rel semble avoir un
rôle prédominant pour l'expression de l'ARNm dans les macrophages 406. L'induction de la
p40 est par contre conservée dans les DC CD8D+ provenant de souris c-Rel-/- indiquant une régulation spécifique selon le type cellulaire 407. Le site NFNB coopère avec un site C/EBP (CAAT element binding protein), localisé entre les nucléotides -96/-88, auquel se
lie le facteur C/EBPE 408,409. Ce dernier agit en synergie avec le facteur AP-1 qui se lie à
un site situé entre les nucléotides -79/-74 410. La surexpression de C/EBPE est suffisante
protéine dans les macrophages C/EBPE-/- induit une augmentation du taux d'ARNm de la p40 alors que ceux de la p35 et par conséquent la production d'IL-12 sont fortement
diminués 411. En aval du site NFNB, on trouve un site Ets (-211/-206) qui lie un complexe
moléculaire formé par les facteurs Ets2, PU.1, IRF1, IRF2 et IRF8 412-414. La liaison de ce
complexe est particulièrement importante lors de la stimulation par le LPS et l'IFNJ. Les
macrophages provenant de souris IRF1-/-, IRF2-/- et IRF8-/- sont profondément déficientes
pour l'expression de la p40 174,176,415. IRF8 participe également à la formation d'un complexe avec NFAT qui se lie dans la région du promoteur située entre les nucléotides
-71/-54 416. L'IL-10 inhibe la production de la p40 en empêchant la formation de ce
complexe. Un autre membre de la famille des IRFs, IRF5, est impliqué dans la régulation
transcriptionnelle de la p40 en réponse à l'engagement des TLRs 141,417. Le site de liaison,
probablement un site ISRE, n'a cependant pas été identifié. Plusieurs études mettent en avant une régulation positive de l'expression de la p40 par p300, facteur connu pour sa fonction d'histone acétyltransférase. L'effet de p300 est cependant indirect car il
n'interagit pas avec le promoteur mais avec les facteurs Ets2 et C/EBPE dont il augmente
l'activité par acétylation 418-420. En plus de ces sites de liaison qui régulent de manière positive l'expression de la p40, un site répresseur appelé GA12 est localisé entre les nucléotides -156/-153. Dans les cellules au repos, la protéine GAP-12 est lié à ce site mais s'en détache suite à une stimulation. Son rôle répresseur est démontré par l'augmentation de l'inductibilité de l'activité promotrice induite par l'introduction de mutation dans le site de liaison 409. L'activité inhibitrice de l'IL-4 et du PGE2 sur la production d'IL-12 dépend de la présence de ce site. En dehors de ces éléments régulateurs localisés dans la partie proximale du promoteur, un site enhancer HSS1 situé environs 10 kb en amont du site d'initiation de la transcription joue un rôle important dans le contexte de l'environnement chromatinien. En réponse au LPS, les protéines
OCT-1, OCT-2 et LAP (une isoforme de C/EBPE) sont recrutées au site HSS1 et
participent à l'augmentation de l'expression de p40 421.
4.4.2 La p35
Le gène murin codant pour la sous-unité p35 possède deux promoteurs (un situé avant l'exon 1 et l'autre situé entre l'exon 1 et l'exon 2) qui permettent la synthèse de plusieurs isoformes de l'ARNm de la p35. Ces isoformes diffèrent par le nombre et la
position des ATG dans la partie 5' non traduite 422,423. Dans les cellules au repos, les deux
isoformes prédominantes contiennent un ATG qui n'est pas en phase et ne permet donc par la traduction. La stimulation induit la production des isoformes compatibles avec la traduction. Chez l'homme, plusieurs ARNs sont également produits à partir du gène de la p35 régulé par un promoteur équivalent au promoteur murin situé en amont de l'exon 2
transcription de la sous-unité p35. Des complexes contenant c-Rel se lient au site NFNB
localisé entre les nucléotides –63/-54 407. La stimulation par l’IFNJ, quant à elle, mène à
l’activation des facteurs IRF-1 et IRF8. IRF-1 peut alors induire la transcription de p35 en se liant directement au site IRF-E (-243/-235) ou d’abord former un complexe avec IRF8 qui se lie au site ICSBP-RE (-226/-219)425-427. Lors de l'induction de l'expression de la p35 par des ligands des TLRs tels que le LPS ou le R848, la production optimale
d'IL-12p70 est dépendante de l'activation de la boucle autocrine des IFNs de type I 215. Cette
boucle agit principalement sur l'expression de la p35 cependant les facteurs de transcription impliqués n'ont pas été identifiés. Comme cité précédemment, les souris C/EBPE-/- présentent un défaut de production d'IL-12 lié à un défaut d'expression de la p35 411,428. De plus, le remodelage sélectif d’un nucléosome est indispensable à l’activation transcriptionnelle. Ce nucléosome est situé dans la région du promoteur où se trouvent deux sites de liaison pour le facteur de transcription Sp1 (-301/-274 et -360/-334). Le remodelage permet donc de contrôler l’accessibilité de ces sites de liaison 429. L'expression de la p35 peut également être régulée de manière négative. Lors de l'élimination de cellules apoptotiques par les macrophages, différents mécanismes sont mis en œuvre pour limiter la production de cytokines pro-inflammatoires. Parmi ceux-ci, la présence de phosphatidylsérine à la surface des cellules apoptotiques induit l'activation de la protéine GC-BP. GC-BP inhibe l'expression de la p35 en se liant à un site de liaison
appelé GCF situé juste après le site d'initiation de la transcription du gène (+13/+19) 430.
4.4.3 La p19
L'activité transcriptionnelle du promoteur de la p19 est régulée par deux sites NFNB localisés entre les nucléotides -107/-95 et -612/-600. Plusieurs membres de la famille NFNB coopèrent pour l'induction optimale de l'activité promotrice. c-Rel et RelA sont
indispensables pour l'expression de ce gène 431,432. Deux autres études montrent
cependant que p65 participe à l'induction de l'expression de la p19 339,433. Le rôle critique
de NFNB a été confirmé dans un modèle d'arthrite rhumatoïde dans lequel l'expression
d'IL-23p19 est induite par l'IL-17 via un mécanisme dépendant de la voie NFNB 434. Dans
les macrophages, l'expression de la p19 est induite par le TMV (Theiler's murine encephalomyelitis virus) via l'engagement de TLR3 et TLR7 435. En réponse à ce virus, l'activation du promoteur nécessite le recrutement de SMAD-3 et ATF-2 à leur site de liaison respectif (situé en -584/-581 et -215/-209) 436. Une étude récente montre que ATF-2 peut aussi s'associer à c-Jun, ce complexe se lie au site AP-1 (-199/-193) et régule de manière positive l'expression de la p19 437. Il a également été montré que dans les macrophages recrutés au sein de tumeurs, l'expression de la p19 est dépendante d'une
liaison directe de Stat3 à son promoteur 339. Le dernier facteur de transcription ayant un
production des ARNm de la p19 suite à une stimulation associant un ligand de TLR9 avec un ligand d'un autre TLR 417.
4.4.4 EBI3
La régulation de l'expression d'EBI3 a été peu étudiée à ce jour. Les DCs produisent des ARNm d'EBI3 suite à l'activation de TLR2, TLR4 et TLR9. Cette expression est complètement perdue en l'absence de la molécule adaptatrice MyD88. Des complexes
NFNBp50-p50 et p50-p65 participent à l'activité transcriptionnelle du promoteur en se
liant à un site situé entre les nucléotides -99/-79. Le recrutement du facteur PU.1 sur un site Ets (-70/-61) est également nécessaire à l'activation du promoteur 438. Dans les lymphocytes T régulateurs, le gene EBI3 est une cible du facteur de transcritpion Foxp3, ce qui contribue à l'expression d'IL-35 240.
4.4.5 La p28
A l'heure actuelle, seules quelques études concernant les facteurs impliqués dans l'expression de la p28 ont été menées. Que ce soit dans les DCs ou dans les macrophages humains, les IFNs de type I participent à l'induction de l'expression de la p28 par des ligands des TLRs. Lors de cette activation, IRF1 a été identifié comme le
facteur déterminant de part sa liaison à un site ISRE (-61/-45) 439,440. IRF1 joue
également un rôle critique dans la production de p28 par les macrophages murins en réponse à l'IFNJ (le site de laison est localisée en -57/-48) 214. Dans les mêmes conditions expérimentales, l'induction de la p28 par le LPS n'est que partiellement dépendante d'IRF1. C'est le recrutement de c-Rel, activé par la voie MyD88 dépendante, qui est requis en réponse au LPS 214. Ce facteur probablement en association avec un
autre membre de la famille NFNB se lie à un site de liaison distal (-3051/-3042). Comme
le promoteur de la p40, le promoteur de la p28 contient un site répresseur appelé "GATA-Like". Le facteur NonO est présent sur ce site de liaison dans les cellules au repos. La stimulation par le LPS induit sa phosphorylation ce qui empêche sa liaison au
BUT DU TRAVAIL
Etant donné les rôles divergents et prépondérants de l’IL-12, de l’IL-23 et de l’IL-27 dans l’induction et/ou le contrôle des processus inflammatoires auto-immuns ainsi que des réponses anti-tumorales, il est essentiel de définir les mécanismes qui orientent la balance de production de ces différentes cytokines par les cellules du système inné.
Les cellules dendritiques jouent un rôle déterminant dans l'établissement et l'orientation des réponses immunes adaptatives principalement par leur faculté à capturer et présenter les antigènes aux lymphocytes T naïfs mais également par leur capacité à sécréter différentes cytokines dont les cytokines de la famille de l'IL-12. C'est donc au sein de ces cellules, d'origine humaine ou murine, que nous avons entrepris de caractériser la production d'IL-12, d'IL-27 et d'IL-23. Nous nous sommes principalement focalisés sur les mécanismes de régulation de l’expression des sous-unités p35 et p28. Nous avons par ailleurs axé notre étude sur la réponse de ces cellules à différents ligands des TLRs, récepteurs impliqués dans la reconnaissance de nombreux pathogènes.
Afin de mieux comprendre les bases de l’expression différentielle des membres de la famille de l'IL-12, nous avons utilisé des techniques variées permettant l'étude des facteurs contrôlant la régulation transcriptionnelle des gènes codant pour les différentes sous-unités qui composent ces cytokines. Après l'analyse de l'implication des deux voies de signalisation activées en aval des TLRs, les voies MyD88 dépendante et TRIF dépendante, nous avons poursuivi l’étude du rôle des facteurs de transcription de la famille des IRFs. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à IRF3, facteur essentiel de la voie TRIF dépendante, pour ensuite étendre notre analyse aux facteurs IRF1, IRF9 et IRF7 d’une part et d’autre part, à l’implication des IFN de type I dans la
régulation de ces gènes. Nous avons également déterminé la relevance in vivo des
RESULTATS
1 Implication d'IRF3 dans l'activation du gène de l'IL-12p35 induite
par TLR4 et TLR3
RESUME
Objectif:
De nombreuses études concernant la régulation de la synthèse d'IL-12 sont focalisées sur l'expression du gène codant pour la sous-unité p40. Bien que les premières informations obtenues sur l'expression de la sous-unité p35 indiquaient une expression constitutive, il est maintenant évident que la transcription du gène de la l'IL-12p35 est également fortement régulée. L'implication des facteurs de transcription NFκB et Sp1 a été identifiée suite à l'engagement de TLR alors que l'expression de la p35 est induite par le recrutement d'IRF1 et IRF8 en réponse à l'IFNγ. Différents membres de la famille des IRFs sont activés par les cascades de signalisation en aval des TLRs, nous avons dès lors entrepris de définir leur rôle dans la régulation de la synthèse d'IL-12.
Résultats:
Dans un premier temps, nous avons comparé la capacité de différents ligands des TLRs à induire l'expression des sous-unités p40 et p35 par des DCs dérivées de monocytes humains. Alors que l'expression de la p40 est induite par l'ensemble des ligands, l'expression de la p35 est restreinte à l'engagement de TLR3 et de TLR4 par le polyI:C et le LPS respectivement. Ces deux TLRs sont caractérisés par l'activation de la voie de signalisation TRIF-dépendante qui mène à l'activation d'IRF3. Nous avons identifié un site de liaison pour ce facteur, appelé ISRE-1, dans la région promotrice du gène de la p35. La liaison d'IRF3 à ce site a été mise en évidence par des expériences d'EMSA dans lesquelles une sonde comprenant le site ISRE-1 a été mise en présence soit de la protéine IRF3 purifiée soit d'extraits nucléaires de DCs stimulées au LPS ou au polyI:C. De plus, des expériences de ChIP ont confirmé le recrutement d'IRF3 au promoteur endogène de la p35. Le rôle fonctionnel de ce site de liaison a été mis en évidence par des expériences de transfection transitoire. En effet, le site ISRE-1 est indispensable à l'induction de l'activité transcriptionnelle du promoteur en réponse d'une part à la stimulation par le LPS et le polyI:C et d'autre part à la surexpression d'IRF3.
L'introduction de mutations dans ce site interfère de manière importante avec l'induction de cette activité transcriptionnelle. Nous avons finalement confirmé le rôle d'IRF3 par l'analyse de la régulation de l'expression l'IL-12 dans des DCs dérivées de moelle osseuse provenant de souris IRF3-/-. La production d'IL-12 par ces DCs est fortement diminuée en comparaison à la production par des DCs de type sauvage. Ce défaut est entièrement dépendant d'un défaut de production de la sous-unité p35 étant donné que l'absence d'IRF3 limite l'expression de la p35 mais n'affecte pas l'expression de la p40.
Conclusions:
La synthèse d'IL-12 par les DCs est induite par l'engagement de TLR3 et TLR4 et implique l'activation de la voie TRIF dépendante. Par une liaison directe au promoteur de la p35, le facteur de transcription IRF3 joue un rôle déterminant dans l'activation transcriptionnelle de ce gène. L'implication de ce facteur dans la régulation de la production d'IL-12 est spécifique à la sous-unité p35 puisque l'expression de la p40 est totalement indépendante d'IRF3.
2 La synthèse d'IL-27 induite en réponse à l'engagement de TLR4
dépend de manière critique d'IRF3
RESUME
Objectif:
L'IL-27 est une cytokine hétérodimérique de la famille de l'IL-12. Elle est formée par l'association de la sous-unité EBI3 à la sous-unité p28. Les fonctions de l'IL-27 ont été intensivement étudiées et cette cytokine apparaît aujourd'hui comme une molécule essentielle dans la régulation des réponses immunes. L'IL-27 est produite par les DCs en réponse à l'engagement des TLRs, cependant les mécanismes qui contrôlent l'expression d'EBI3 et de la p28 ne sont que peu définis. Nous avons donc étudié l'activation des gènes de la p28 et d'EBI3 dans les DCs.
Résultats:
La production de l'IL-27p28 par les DCs dérivées de moelle osseuse de souris de type sauvage est induite de manière préférentielle par le polyI:C et le LPS qui sont les ligands de TLR3 et TLR4 respectivement. En réponse au LPS, les deux voies de signalisation, MyD88 et TRIF dépendantes, contribuent à l'expression des sous-unités EBI3 et p28. En particulier, la voie TRIF dépendante est essentielle à l’expression de l’IL-27p28. Nous avons par conséquent poursuivi notre étude par l'analyse du rôle d'IRF3 dans l'induction de l'expression de ces deux sous-unités. En l'absence d'IRF3-/-, les DCs sont incapables de produire des ARNm de la p28 et par conséquent la production de la protéine est profondément déficiente par rapport à la production par les DCs de type sauvage. Par contre, la production des ARNm de la sous-unité EBI3 est totalement indépendante d'IRF3. L'ajout d'IFNβ lors de la stimulation des DCs IRF3-/- par le LPS ne permet pas de restaurer la production de p28 suggérant un rôle direct d'IRF3. Nous avons ensuite identifié un site de liaison ISRE dans le promoteur de la p28. Des expériences de retard sur gel réalisées à la fois avec une protéine purifiée et des extraits nucléaires de DCs ont confirmé la liaison d'IRF3 à ce site. Par ailleurs, l'utilisation de transfection transitoire nous a permis de démontrer le rôle fonctionnel du site ISRE tant en réponse au LPS qu'en réponse à une surexpression d'IRF3. Afin de mettre en évidence la relevance in vivo de nos observations, nous avons appliqué le modèle de choc endotoxique au LPS à des souris IRF3-/- ou contrôles. Le dosage de la production d'IL-27p28 dans le sérum de ces souris révèle un rôle critique d'IRF3 in vivo. Finalement, nous avons confirmé nos
résultats dans les cellules dendritiques humaines. En effet, le LPS et le polyI:C sont également les ligands les plus puissants pour l'induction l'expression de la p28 chez les DCs dérivées de monocytes humains et nous avons identifié la liaison d'IRF3 au promoteur endogène de la p28 dans ces cellules.
Conclusions:
L'expression de l'IL-27p28 est régulée de manière similaire chez l'homme et la souris. La voie de signalisation TRIF dépendante est requise pour la production de la p28 en aval de TLR4. Le facteur de transcription critique pour la régulation de l'expression de la p28 est IRF3 alors que ce facteur ne participe pas à la régulation de l'expression d'EBI3.
3 Le rôle du complexe ISGF3 dans l'expression du gène de
l'IL-27p28 induite par les TLRs révèle un mécanisme d'activation
transcriptionnelle en deux étapes
RESUME
Objectif:
La famille des IRFs comporte neuf membres et différentes études ont mis en évidence une coopération entre plusieurs de ces facteurs pour l'induction de l'expression de l'IL-12/IL-23p40 mais aussi de l'IL-12p35. Certains membres de cette famille, à savoir IRF9, IRF7 et IRF1, sont activés par la boucle autocrine des IFNs de type I induite par l'engagement de TLR3 et TLR4. Nous avons donc poursuivi l'étude de la régulation de l'expression de la sous-unité IL-27p28 en déterminant l'implication de cette boucle amplificatrice des IFNs de type I et des différents IRFs activés par cette voie de signalisation. De plus, nous avons étendu notre étude à la régulation de l'expression des sous-unités IL-12p35 et IL-23p19.
Résultats:
L'analyse des cinétiques de production des ARNm de l'IL-27p28 suite à une stimulation
par les ligands de TLR3 et de TLR4 de DCs murines provenant de souris IRF3-/- ou
contrôles a révélé d'une part une cinétique spécifique et d'autre part une régulation spécifique à chaque ligand. En effet, en réponse au LPS, la production des ARNm est rapide, transitoire et fortement dépendante d'IRF3 alors qu'en réponse au polyI:C, elle est plus lente, maintenue dans le temps et seulement partiellement dépendante d'IRF3.
La production résiduelle observée lors de la stimulation des DCs IRF3-/- par le polyI:C
nous a poussé à analyser le rôle des IFNs de type I dans la régulation de la p28. Les résultats obtenus lors de la stimulation de DCs déficientes pour le récepteur des IFNs de type I (IFNAR) montrent que la production des ARNm en réponse au polyI:C est presque totalement abolie; par contre, en réponse au LPS, la phase précoce de la production d'ARNm est maintenue mais la phase tardive est fortement diminuée. Nous avons déterminé l'implication des IRFs activés en aval du récepteur des IFNs de type I par
l'utilisation de souris IRF1-/- et IRF9-/-. A nouveau, nous avons observé une régulation