pour la détection et la

Frédérique Viard ([email protected])

Les outils du (meta)barcoding pour la détection et la

surveillance des espèces

marines non-indigènes

Les introductions d’espèces non-indigènes s’accélèrent en milieu marin depuis le milieu du 20 ^ième siècle, du fait de l’accroissement des vecteurs d’introduction (transports maritimes, aquaculture)

Frédérique Viard; [email protected]

Nombre d’espèces signalées en

Europe : 1383 (source EASIN; European

Environment Agency 2015 assessment)

Directive Cadre Stratégie pour le Milieu Marin (2008/56/CE du 17 juin 2008) ^: atteindre ou maintenir le bon état

environnemental du milieu marin

 Descripteur de statut, e.g., D1 Biodiversité

 Descripteurs de pression, e.g. D2 Espèces non-indigènes (ENI)

Frédérique Viard; [email protected]

Frédérique Viard; [email protected]

Trois critères en appui du descripteur D2

Révisé par la décision de la commission européenne (EU) 2017/848 du 17 Mai 2017

Frédérique Viard; [email protected]

• D2C1: Nombre de nouvelles espèces

introduites par période d’évaluation (6 ans)

• D2C2: Abondance et distribution spatiale des ENI déjà répertoriées

• D2C3: Impacts=>Proportion (espèces,

habitats) affectée par des ENI

Rapport d’évaluation de la commission sur les progrès relatifs à la mise en oeuvre de la DCSMM – Mars 2017 :

Seulement 5% des 200 programmes de surveillance (20 états membres) dédiés à D2 (à comparer à 41% pour D1- biodiversité)

 D2: « Progrès insuffisants, Nécessité d’accélération, Nécessité de standardisation »

Frédérique Viard; [email protected]

1. Expertise taxonomique en déclin

2. Inopérants pour les espèces cryptiques et certains stades (ex. larves) 3. Coûts élevés (nombreux specimens, examines un par un)

Identifier (et donc surveiller) les ENI par les méthodes traditionnelles (critères morphologiques) est difficile

T. Comtet - SBR

Frédérique Viard; [email protected]

Frédérique Viard; [email protected]

 Outils moléculaires d’identification: le barcoding

GATCGTATCGTTTACTTGGATAATTGTGGTAATTCTAGAGC

TATCGTATCGTTTACTTGGATAACTGTGGTCATTCTAGAGC GATCATATGGTTTACTTGGATAACTGTGGTAATTCTAGGGC

UNE SEQUENCE UNE ESPECE

GATCGTATCGAAACTTGGATAATTCTGGTAATTCTAGAGC

Un espèce est associée à un code-barre (=une signature) moléculaire

GATCGTATCGAAACTTGGATAATTCTGGTAATTCTAGAGC

GATCGTATCGTTTACTTGGATAATTGTGGTAATTCTAGAGC

TATCGTATCGTTTACTTGGATAACTGTGGTCATTCTAGAGC GATCATATGGTTTACTTGGATAACTGTGGTAATTCTAGGGC

GATCGTATCGAAACTTGGATAATTCTGGTAATTCTAGAGC

Séquençage ADN (COI et 18S)

Comparaison avec des bases

de données de référence pour identifier l’espèce

Identique

 Outils moléculaires d’identification: le barcoding

1 cm 0 1 2 3

Abondance

Application: Signalisation d’une nouvelle espèce (D2C1)

Exemple: une ascidie non-indigène en Manche

Collab MBA Plymouth (J. Bishop) Bishop et al. (2013)- Biological Invasions 15(2), 253-260.

2010

Absente

Commune

Styela gibbsii 18S AY903923 Styela montereyensis 18S L12443 Styela plicata 18S L12444

Styela clava 18S L12442 Pelonaia corrugata 18S L12440 Polycarpa pomaria 18S L12441 Polycarpa tenera 18S FM738913

Polyandrocarpa zorritensis 18S FM897311 Cnemidocarpa humilis 18S FM244859 Ah-H1 Ah.SM.C.1

Dendrodoa grossularia 18S L12416 Dendrodoa aggregata 18S AJ250774

Polyandrocarpa tincta 18S FM897310 Eusynstyela hartmeyeri 18S FM897309

Polyandrocarpa misakiensis 18S AF165825 Symplegma rubra 18S FM897315

Symplegma viride 18S DQ346655 Symplegma reptans 18S AF165826

Botryllus schlosseri 18S FM244858 Botrylloides leachi 18S FM897305 Botryllus planus 18S DQ346653 Botrylloides violacea 18S AY903927 Cnemidocarpa finmarkiensis 18S L12413

Cnemidocarpa clara 18S AJ250775 Metandrocarpa taylori 18S AY903922

Polyzoa opuntia 18S FM897314 Distomus variolosus 18S FM897308 Stolonica socialis 18S FM897317

Polycarpa mytiligera 18S FM244860 Polycarpa aurata 18S FM897312 Polycarpa papillata 18S DQ346654

Halocynthia papillosa 18S FM897326 Halocynthia pyriformis 18S FM897327

Pyura spinifera 18S FM897342 Pyura praeputialis 18S FM897340 Pyura gibbosa 18S FM897338 Pyura australis 18S FM897335

Herdmania grandis 18S FM897328 Boltenia ovifera 18S FM883163

Pyura squamulosa 18S FM897341 Pyura dura 18S FM897337

Microcosmus squamiger 18S FM897334 Microcosmus polymorphus 18S FM897332

Microcosmus sabatieri 18S FM897333 Microcosmus claudicans 18S FM897331

100 66 68 95

100

88

88 97

64

55

50 94

97

80 41

98

29

18

5 59

92 47 46 40

94 62

95

37

89

41

43 28

35 52

19 22 20

11

9

29 11

4

0.005

Frédérique Viard; [email protected]

+

Asterocarpa humilis

Les spécimens échantillonnés sont similaires (100% similaire) à une référence

 Une nouvelle espèce (D2. C1) largement présente (D2C2) en Manche Ouest

Bishop et al. (2015) – Mar. Poll. Bull.

2010 2013

Frédérique Viard; [email protected]

 Applicable à d’autres mers/océans, ex. Chili

Identification d’A. humilis dans un port, des filières aquacoles et un cargo naviguant entre Concepcion (Chili) et Vancouver (Canada)

Pinochet et al. (2017) - PeerJ

0 1 2 3

Abondance Absente

Commune

Botrylloides violaceus Botrylloides diegensis Botrylloides leachi

Espèces introduites Espèces locale

Application: Distinguer des espèces proches

Exemple: les ascidies coloniales du genre Botrylloides

Collab MBA Plymouth (J. Bishop)

BlrfH3BOII2 BlrfH2BOII1

BlrfH5BMW H1 BlrfH1Blrf1 BlrfH4BMW H2

Botrylloides leachii

BdH2BBTI10 BdH1BSMB1 BdH6BvSQ87 BdH5BSMB15 BdH4BPTQI12 BdH3BSMB24

Botrylloides diegensis

BvH6XBSS3

BvH5BQABI19 BvH1BSS10 BvH4BW MII1 BvH2BvLOD3

BvH3BvSQ812

Botrylloides violaceus

BsH1BoFAL1 BsH2BsAW B1 BsH3BSOVI15 BsH4BoQABI2

BsH5BsTPI1 BsH7BsRSK1

BsH6BsTPI2 BsH8BsRSK4

Botryllus schlosseri

95 100

99 100

87

93 100

74 100

99

50 88

100 54

0.206

0.023

0.021 0.246

0.025 0.105

0.119

0.180

0.106

0.047 0.068

0.062

0.135

COI est un excellent barcode pour le genre Botrylloides :

• distinction des deux ENI et de l’espèce locale

COI est un excellent barcode pour le genre Botrylloides

• distinction des deux ENI et de l’espèce locale

• correction des erreurs d’identification morphologique de B. violaceus

<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<

<<<<<

2 1 3 5 4

6 7 8 9 10 11

12

13 14 15 16 17

18 19 20

0%

20%

40%

60%

80%

100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

% des erreurs d’identifcation : les colonies sont souvent B. diegensis

‘B. violaceus’ supposés (mono-couleur)

Viard et al. (in prep.)

Y. Fontana

F. Viard - CNRS

Frédérique Viard; [email protected]

• Procédure standard

• Pas d’expertise taxinomique

• Accès à des données mondiales

• Compense l’absence de caractères morphologiques

(juveniles, specimens degrades etc.)

Barcoding identifier avec confiance des ENI









D2C1 D2C2

Limitations:

- Nécessite des données de référence fiables

- un specimen à la fois….très peu efficace

Extraction de tous les ADN

ATCGGTGTGAC ATCGGTGTGAC ATCGGTGTGAC

ATCGGTTTGACC ATCGGTTTGACC

ATCAGTTTGACC ATCAGTTTGACC ATCAGTTTGACC

ATCAGTGCGAC ATCAGTGCGAC

Séquençage haut-débit (lecture de millions de

fragments d’ADN)

Comparaison des millions de séquences obtenues avec des bases de données moléculaires

Analyses bioinformatiques

Un changement d’échelle avec le

« metabarcoding » : vers une surveillance 2.0

GATCGTATCGTTTACTTGGATAATTGTGGTAATTCTAGAGC

TATCGTATCGTTTACTTGGATAACTGTGGTCATTCTAGAGC GATCATATGGTTTACTTGGATAACTGTGGTAATTCTAGGGC

GATCGTATCGAAACTTGGATAATTCTGGTAATTCTAGAGC

Liste d’espèces contenues dans

l’échantillon

Morlaix Roscoff

Site

d’échantillonnage

• Série temporelle menée depuis > 10 ans (2 fois par mois)

• Filet à plancton 63µm

Application à une série temporelle d’échantillonnage de

méro-plancton (stades larvaires)

©Florentine Riquet

 Responsables de l’introduction primaire (ex. ballast)

 Vecteurs de dispersion naturelle ( expansion)

 Indicatrices du succès de reproduction (établissement)

Les larves sont des stades clés dans le processus d’introduction

Frédérique Viard; [email protected]

• ADN extrait d’échantillons de zooplancton (22 mois)

• 2 marqueurs

• 4 groupes cibles (bivalves, gastéropodes, ascidies, bryozoaires)

 52 ENI potentielles : 44 avec références (BDD publiques ou locale) 18 S

(primers: Fonseca et al. 2010) COI

(primers: Leray et al. 2013)

« Universel » + -

Résolution

taxinomique - +

Metabarcoding du zooplancton

Couton et al. (en révision)

Projet AquaNIS2.0

Groupe Species 18S COI Déjà signalé

Bivalves Crassostrea gigas   OUI

Mercenaria mercenaria   Non mais signalée en Bretagne

Mya arenaria   OUI

Ruditapes phillipinarum   ^{Non mais}

signalées dans des baies proches Gastéropodes Crepipatella dilatata  ^{biais PCR} NON

Crepidula fornicata   OUI

Ascidies Asterocarpa humilis ^{biais PCR} OUI mais DD

Botrylloides diegensis ^genre  OUI

Botrylloides violaceus ^genre  OUI

Corella eumyota  ^{biais PCR} OUI

Bryozoaires Bugula neritina   OUI

Watersipora subatra  o OUI

Résultat 12 ENI (11 avec confiance)

subsamples of 100-150 larvae

% reads ou sequences parmi les bivalves

 Nouvelles signalisations dans la baie étudiée, ex. la palourde japonaise Ruditapes phillipinarum

validation par comparaison avec des approches classiques

La crépidule Crepidula fornicata

ID basée sur la morphologie larvaire

(échantillon total; moyenne mensuelle sur 6 années) ID basée sur metabarcoding

Comparaison

Révèle les variations saisonnières de reproduction

En accord avec l’hypothèse d’un mauvais succès reproducteur de l’huitre creuse dans cette baie (température), où elle n’est pas invasive

Crassostrea (Magallana) gigas

5200 tonnes/an sur 682 ha Ostrea edulis (native)

De rares populations naturelles

Nreads

Nreads

Nreads

Nreads

Permet l’évaluation du succès de reproduction

Frédérique Viard; [email protected]

• Procédure standard

• Pas d’expertise taxinomique

• Accès à des données mondiales

• Compense l’absence de caractères morphologiques

(juveniles, specimens degrades etc.)

• Très grand nombre d’échantillons ( pression d’observation)

• Accès aux espèces associées

Metabarcoding détecter simultanément de nombreuses ENI, et les espèces associées, sur un grand nombre d’échantillons









D2C1 D2C2



 ^D2C3

Limitations:

- Disponibilité et fiabilité des données de reference

- Ajustements méthodologiques (biais de PCR, marqueurs, standardisation)

Ba rco di n g

• Le barcoding moléculaire a depuis longtemps montré son efficacité pour compléter les observations morphologiques

• Un changement d’échelle est possible grâce à l’utilisation d’ADN environnemental ou massal associé à du séquençage haut-débit

 Un excellent rapport coût-efficacité

 Permet de combler des lacunes d’observation et augmenter la pression d’observation

 Recherches en cours (ex. diversité intra- vs. Interspécifique, réseaux d’acteurs)

 une approche prête pour une mise en œuvre opérationnelle pour de la surveillance active (lise fermée, espèces cibles)

Points clés

Frédérique Viard; [email protected]

Remerciements à mes étudiants et collaborateurs, aux plongeurs scientifiques de Roscoff, à l’équipage du

NéoMysis, et aux agences de financements

Roscoff team

Sarah Bouchemousse Thierry Comtet

Marjorie Couton

Claire Daguin-Thiébaut Laurent Lévêque

Sabrina Le Cam

Charlotte Roby

MBA team

John Bishop

Chris Wood

Anna Yunnie

Merci de votre attention