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Thèse de doctorat/ PhD Thesis Citation APA:

Fagny, C. (1996). Régulation de l'expression de l'endopeptidase neutre à la surface des granulocytes neutrophiles humains (Unpublished doctoral dissertation). Université libre de Bruxelles, Faculté des sciences, Bruxelles.

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Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Laboratoire Pluridisciplinaire de Recherche Expérimentale Biomédicale Faculté de Médecine

REGULATION DE L’EXPRESSION DE L’ENDOPEPTIDASE NEUTRE A LA

SURFACE DES GRANULOCYTES NEUTROPHILES HUMAINS

Promoteur:

Prof. M. Deschodt-Lanckman Co-promoteur:

Prof J.E. Dumont

Thèse présentée en vue de l'obtention du Grade Légal de Docteur en Sciences Christine FAGNY Année académique

1995-1996

LIBRE DE BRUXELLES

FACULTE DES SCIENCES

SECRETARIAT

d

L'épreuve publique pour l'obtention du grade légal de Docteur en Sciences de Me FAGNY, Christine, Licencié en sciences, pour le groupe des sciences chimiques, aura lieu le :

JEUDI 10 OCTOBRE 1996 A 17.00 HEURES

dans l'Auditoire Jean Brachet, campus de Rhode-St-Genèse, 67, rue des Chevaux à 1640 Rhode-St-Genèse.

Me FAGNY, Christine présentera et défendra publiquement une dissertation originale intitulée :

« Régulation de l'expression de l'endopeptidase neutre à la surface des granulocytes neutrophiles humains »

et une thèse annexe intitulée :

« L'antigène Kell des érythrocytes humains pourrait être une carboxypeptidase membranaire impliquée dans l'hydrolyse du peptide atrial natriurétique »

DEFENSE PRIVEE : Mardi 8 octobre 1996 à 16.30 heures Rhode-St-Genèse

Directeur de thèse : Me DESCHODT-LANCKMAN.

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Université Libre de Bruxelles Faculté des Sciences

Laboratoire Pluridisciplinaire de Recherche Expérimentale Biomédicale Faculté de Médecine

REGULATION DE L’EXPRESSION DE L’ENDOPEPTIDASE NEUTRE A LA

SURFACE DES GRANULOCYTES NEUTROPHILES HUMAINS

Promoteur:

Prof. M. Deschodt-Lanckman Co-promoteur:

Prof J.E. Dumont

Thèse présentée en vue de l'obtention du Grade Légal de Docteur en Sciences Christine FAGNY Année académique

1995-1996

Je voudrais manifester ici ma reconnaissance et exprimer mes plus chaleureux remerciements à toutes les personnes grâce auxquelles la réalisation de cette thèse a été rendue possible:

Je pense plus particulièrement au Professeur Monique Deschodt-Lanckman pour ses précieux conseils, ses encouragements, sa disponibilité, son attention ainsi que la patience qu 'elle a manifestée tout au long de cette collaboration qui a permis l'aboutissement de la présente thèse.

Mes plus vifs remerciements vont aussi au Professeur Jacques E. Dumont qui a accepté d’assumer la responsabilité de ce travail.

Mes remerciements vont également au Professeur Michel Goldman pour ses conseils scientifiques ainsi que pour m’avoir permis d’utiliser l’infrastructure du service d’immunologie de l’hôpital Erasme.

Je remercie le Docteur Arnaud Marchant pour m’avoir fait bénéficier de son expérience dans le domaine du choc septique.

Mes plus vifs remerciements vont également à Monsieur Eric De Prez pour son efficacité, sa compétence sur le plan technique et sans qui des expériences aussi complètes n 'auraient jamais pu être réalisées.

Je remercie Monsieur Patrick Stordeur qui m ’a appris, grâce à son sens pédagogique exemplaire, la technique de RT-PCR. Que le Professeur Michaël Svoboda trouve ici toute ma reconnaissance pour ses judicieux conseils en RT-PCR. Je leur dois tout ce que j’ai appris dans ce domaine.

Mes remerciements vont à Monsieur Jean-Pierre Delville qui m ’a prodigué toute la formation nécessaire dans le domaine de la cytométrie de flux.

Je remercie le Docteur Alain Michel pour la synthèse de Vendothéline-1, des

analogues du peptide fMLP et des standards ainsi que pour les analyses de composition en

acides aminés.

Je ne manquerai pas de remercier Monsieur François Jacques qui a participé activement à la mise en forme définitive de cette thèse.

Un grand merci à tous les membres du LPREB et du service d’immunologie de l’hôpital Erasme qui ont participé de près ou de loin au bon déroulement des expériences. Je pense particulièrement à tous les donneurs qui ont fait partie de cette étude ainsi qu’à

Madame Cécile Husson qui a réalisé les dosages d’endotoxine.

Je remercie chaleureusement les Fondations Demeurs-François, Van Buuren, Hoguet et Solvay pour le soutien et la contribution vitale qu ’ils m ’ont apportée et qui ont rendu ce travail possible.

Un très grand merci à tous.

RESUME... VI

I. INTRODUCTION... 1

1. L’ENZYME ENDOPEPTIDASE NEUTRE (EC 3.4.24.11)... 1

1.1. N

... 1

1.2. S

NEP... 1

1.3. L

GENE DE LA NEP... 2

1.4. S

NEP... 3

1.5. I

... 4

1.6. S

...4

1.7. D

NEP... 5

1. 7. 1. Au niveau central ...5

1.7.2. Au niveau périphérique ... 5

1.8. L

NEP DES GRANULOCYTES NEUTROPHILES... 7

1.8.1. Découverte de l'activité NEP à la surface des granulocytes neutrophiles ... 7

1.8.2. La NEP en interaction avec les peptides pro-inflammatoires ... 8

2. GRANULOCYTES NEUTROPHILES ET CHOC SEPTIQUE...9

2.1. L

CHOC SEPTIQUE... 9

2.1 1. Notions générales ... 9

2.1.2. Structure des lipopolysaccharides bactériens ou endotoxines ... 12

2.1.3. Interactions du LPS avec les cellules de mammifères ... 12

2.1.3.1. Le récepteur CD14...12

2.1.3.2. Les réponses biologiques des cellules au LPS... 14

2.1.3.2.1. Les neutrophiles...14

2.1.3.2.2. Autres cellules...18

II. BUT DU TRAVAIL...19

III. MATERIEL ET METHODES... 20

IV. RESULTATS:... 21

1. REGULATION DE L’EXPRESSION DE LA NEP A LA SURFACE CELLULAIRE DES GRANULOCYTES NEUTROPHILES...21

1.1. MODELE EN SANG TOTAL...21

1.1.1. Le stimulus LPS ... 21

1.1.1.1. Le LPS induit une augmentation de l’expression de la NEP/CD10 à la surface des granulocytes neutrophiles... 21

1.1.1.2. Corrélation entre les valeurs obtenues par cytométrie de flux et par dosage enzymatique... 22

1.1.1.3. L'effet du LPS est dose-dépendant... 23

1.1.1.4. Effet du plasma sur l’augmentation du CD10/NEP induite par le LPS... 23

1.1.1.5. La NEP n’est pas libérée dans le milieu extracellulaire après induction à la surface des granulocytes neutrophiles par le LPS... 24

1.1.1.6. Effet de cytokines recombinantes sur l’expression du CD10/NEP des granulocytes neutrophiles .24 1.1.1.6.1. LeTNF-a, l’IL-1 et l’IL-8... 24

1.1.1.6.1.1. Rôle du TNF-a dans l’induction du CD10/NEP par le LPS...25

1.1.1.6.2. Effet de l’IL-10 sur l’induction du CD10/NEP par le LPS... 26

1.1.1.7. Effet de la cycloheximide sur le CD10/NEP induit par le LPS... 26

1.1.1.8. Rôle du récepteur CD14 dans l’induction du CD10/NEP par le LPS... 28

1.1.1.8.1. Chez le sujet normal... 28

1.1.1.8.1.1. Cinétiques comparées de l’effet d’une dose faible de LPS et de la dose induisant l’effet maximum...28

1.1.1.8.1.2. Effet de l’anticorps anti-CD14 sur l’induction du CD10/NEP par le LPS... 28

1.1.1.8.2. Chez le sujet souffrant d’hémoglobinurie nocturne paroxystique (HNP)... 29

1.1.2. Le stimulus fMLP... 31

1.1.2.1. Le peptide fMet-Leu-Phe...31

1.1.2.1.1. Le fMLP induit une augmentation de l’expression du CD10 des granulocytes neutrophiles ..31

1.1.2.1.2. L’effet du fMLP est dose-dépendant...31

1.1.2.1.3. Effet de l’inhibition de l’activité enzymatique de l’endopeptidase neutre sur l’augmentation du CD10/NEP induite par le fMLP...32

1.1.2.1.4. Effet de la cycloheximide sur l’augmentation de l’expression du CD10/NEP induite par le fMLP 32 1.1.2.2. Les peptides fNle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys et fNle-Leu-Phe-Tyr: 2 analogues du fMLP... 33

1.1.2.2.1. fNle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys et fNle-Leu-Phe-Tyr induisent une augmentation de l’expression du CD10/NEP... 33

1.1.2.2.2. Les effets de fNle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys et de fNle-Leu-Phe-Tyr sont dose-dépendants... 34

1.1.3. Effet de l’augmentation de l'expression de la NEP induite par le LPS sur la dégradation de différents peptides... 34

1.1.3.1. Etude de dégradation des peptides par la NEP purifiée...34

1.1.3.1.1. Le peptide fNle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys... 34

1.1.3.1.1.1. fNle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys non radiomarqué... 34

1.1.3.1.1.2. fNle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys radiomarqué à l’iode 125...35

1.1.3.1.2. Le peptide ET-1...36

1.1.3.1.2.1. ET-1 non radiomarquée...36

1.1.3.1.2.2. ET-1 radiomarquée...37

1.1.3.2. Etude de dégradation des peptides par les cellules sanguines...37

1.1.3.2.1. Incubation de fNle-Leu-Phe-Nle-’^®l-Tyr-Lys avec une suspension de cellules sanguines après stimulation par le LPS...37

1.1.3.2.2. Incubation de l’’^®l-ET-1 avec une suspension de cellules sanguines après stimulation par le LPS... 38

1.2. L

GRANULOCYTES NEUTROPHILES PURIFIES... 39

1.2.1. Mise au point de la purification des granulocytes neutrophiles... 39

1.2.1.1. Une méthode de purification trop drastique des granulocytes neutrophiles provoque une libération des protéases lysosomiales...39

1.2.1.2. Une préparation douce des granulocytes neutrophiles provoque une expression accrue du CD10/NEP à la surface des cellules... 40

1.2.1.3. Comparaison des concentrations de CD10/NEP des granulocytes neutrophiles et des cellules mononuclées...41

1.2.2. Effet du LPS sur les granulocytes neutrophiles purifiés...42

1.2.2.1. Cinétique d’induction par le LPS du CD10/NEP des granulocytes neutrophiles purifiés... 42

1.2.2.2. Courbe dose-effet LPS sur les granulocytes neutrophiles purifiés... 42

1.2.3. Effet de l'anticorps anti-CD14 sur l’induction du CD10/NEP par le LPS sur les granulocytes neutrophiles purifiés...43

1.3. L

CELLULES DE LA LIGNEE PROMYELOCYTAIRE HL-60... 44

1.3.1. Dosage de différentes activités enzymatiques à la surface des cellules HL-60... 44

1.3.2. Différenciation des cellules HL-60 dans la voie neutrophilique... 44

2. DETECTION DE UARN MESSAGER DU CD10/NEP... 46

2.1. PRELIMINAIRES: MISES AU POINT ET CONTROLE « QUALITE »... 46

2.1.1. Extraction de l’ARN total...46

2.1.1.1. Qualité de l’ARN total... 46

2.1.1.1.1. Contrôle de la contamination protéique...46

2.1.1.1.2. Contrôle de la contamination par l’ADN génomique...47

2.1.1.1.3. Utilisation de l’ARN de rein comme référence... 47

2.1.2. Spécificité des amorces...47

2.1.3. Optimisation des conditions de PCR... 48

2.1.3.1 Détermination de la concentration optimale en MgCl

...48

2.1.3.2. Détermination de la quantité optimale d’ARN... 49

2.1.3.3. Détermination du nombre de cycles optimum pour une amplification PCR du CD10/NEP et de la P- actine... 49

2.1.3.4. Effet de la présence ou de l’absence de diméthylsulfoxyde (DMSO) sur l’amplification PCR du CD10/NEP... 49

2.1.3.5. Effet d’un démarrage « hot start »...50

2.1.4. Reproductibilité des résultats... 51

2.1.4.1. Au sein d’une même expérience d’amplification PCR... 51

2.1.4.2. Au sein d’expériences différentes d’amplification PCR... 51

2.2.2. Dans les cellules du sang total ... 52 V. DISCUSSION GENERALE...53 1. AUGMENTATION DE L’EXPRESSION DE LA NEP A LA SURFACE CELLULAIRE DES

GRANULOCYTES NEUTROPHILES INDUITE PAR LE LPS: ROLE DU RECEPTEUR CD14... 53 2. AUGMENTATION DE LA NEP A LA SURFACE DES GRANULOCYTES NEUTROPHILES PAR LES CYTOKINES PRO-INFLAMMATOIRES...56 3. CONSEQUENCES PHYSIOLOGIQUES D'UNE AUGMENTATION DE LA NEP SUR LA

DEGRADATION DE PEPTIDES PRO-INFLAMMATOIRES...57 4. ROLES PHYSIOLOGIQUES DE LA NEP...59 5. CONCLUSIONS... 60 VI. ANNEXES...Al ANNEXE 1: INTRODUCTION...Al EFFET DU LPS SUR LES CELLULES AUTRES QUE LES GRANULOCYTES NEUTROPHILES....A1 ANNEXE 2: DETAILS DU MATERIEL ET METHODES... A2 1. MATERIEL...A2 1.1. EXPERIENCES EN SANG TOTAL... A2 1.1.1. Anticoagulants... A2 1.1.2. Cytokines... A2 1.1.3. Anticorps... A2 1.1.4. Autres... A2 1.2. CYTOMETRIE DE FLUX...A2 1.3. D

’

NEP... A2 1.4. P

... A3 1.5. D

...A3 1.5.1. Peptides...A3 1.5.2. Enzymes...A3 1.5.3. Inhibiteurs enzymatiques...A3 1.6. C

...A3

1.6.1. Cellules...A3

1.6.2. Milieu... A3

1.6.3. Agents de différenciation...A4

1.7 DETECTION DE L'ARN MESSAGER DU CD10/NEP... ...A4

2. METHODES... A4

2.1. EXPERIENCES EN SANG TOTAL... A4

2. 1.1. Prélèvement du sang... A4

2.1.2. Incubations... A4

2.1.3. Cytométrie de flux... A 5

2.1.3.1. Marquage... !... A5

2.1.4. Dosage de l'activité endopeptidase neutre (NEP)... A5

2.1.5. Dosages d'endotoxine... A6

2.2. P

... A6

2.2.1. Méthode drastique... A 6

2.3.1. Marquage de peptides à l'iode 125 et purification ... A7 2.3.1.1. Marquage des peptides...A7 2.3.1.2. Purification des peptides monoiodés par HPLC...A7 2.4. C

... A8

2.4.1. Les cellules de la lignée promyélocytaire HL-60 ... A8 2.4.2. Les granulocytes neutrophiles purifiés ... A8 2.5. DETECTION DE L’ARN MESSAGER DU CD10/NEP PAR RT-PCR...A8

2.5.1. Extraction de l'ARN total ... A8 2.5.1.1. A partir de sang total citraté...A8 2.5.1.2. A partir de cellules en culture... A9 2.5.1.3. A partir d’un tissu...A9 2.5.2. Détermination de la concentration d'ARN total ... A10 2.5.3. Transcription reverse ... A10 2.5.4. Amplification PCR ... A10 2.5.4.1. Pour l'ARN messager du CD10/NEP... A10 2.5.4.2. Pour l'ARN messager de la p-actine... Ail 2.5.5. Gel d’agarose ... Ail 2.5.6. Analyse densitométrique du gel ... Al2 2.6. R

... Al 2 3. DISCUSSION DE LA METHODOLOGIE... A13 3.1. DETECTION DU CD10/NEP A LA SURFACE DES GRANULOCYTES NEUTROPHILES PAR CYTOMETRIE DE FLUX ET DOSAGE ENZYMATIQUE... Al 3 3.2 METHODOLOGIE UTILISEE LORS DE LA PURIFICATION DES GRANULOCYTES NEUTROPHILES... Al 3 3.3. METHODOLOGIE UTILISEE POUR DETECTER L'ARN MESSAGER DU CD10/NEP DANS LES GRANULOCYTES NEUTROPHILES... Al 5 ANNEXE 3: RESULTATS... A16 LES CELLULES DE LA LIGNEE PROMYELOCYTAIRE HL-60...A16 1. REGULATION DE L’EXPRESSION DE LA NEP A LA SURFACE DES CELLULES HL-60...A16 1.1. D

HL-60... Al 6 1.1.1. Dosage de l’activité enzymatique NEP ... Al6 1.1.2. Dosage de l’activité enzymatique aminopeptidase N (APN) ... A17 1.2. DIFFERENCIATION DES CELLULES HL-60 DANS LA VOIE NEUTROPHILIQUE... A18 1. 2.1. Différenciation induite par l’acide rétinoïque ... Al8 1.2.1.1. Croissance des ceilules HL-60 en présence d’acide rétinoïque... A18 1.2.1.2. Dosage des activités enzymatiques NEP et APN à la surface des cellules HL-60 différenciées par l’acide rétinoïque... Al 8 1.2.1.3. Stimulation des cellules HL-60 différenciées à l’acide rétinoïque par le LPS ou le fMLP... A19 1.2.2. Différenciation induite parle DMSO ... A20 1.2.2.1. Croissance des cellules HL-60 en présence de DMSO... A20 1.2.2.2. Dosage des activités enzymatiques NEP et APN à la surface des cellules HL-60 différenciées par le DMSO...A20 1.2.2.3. Stimulation des cellules HL-60 différenciées au DMSO par le LPS ou le fMLP. ...A21 1.2.2.4. Dosage de l’activité enzymatique NEP totale des cellules HL-60 différenciées par le DMSO.... A22 2. DETECTION DE L’ARN MESSAGER DU CD10/NEP DANS LES CELLULES HL-60... A22 3. CONCLUSION... A23 ANNEXE 4: PUBLICATIONS... A24 ANNEXE 5: BIBLIOGRAPHIE...A25

IV

Al fNle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys A2 fNle-Leu-Phe-Tyr

AMC 7-amino-4-méthyl-coumarine ANP atrial natriuretic peptide BSA bovine sérum albumine B K brady kinine

CCK cholécystokinine

CD cluster of différentiation CHX cycloheximide

cpm coups par minute CTRL contrôle

DO densité optique ET endothéline

FBS foetal bovine sérum Fig. figure

FITC isothiocyonate de fluorescéine fMLP formyl-Met-Leu-Phe

GN granulocyte neutrophile

h heure

HL-60 human leukemia

HPLC high pressure (performance) liquid chromatography HNP hémoglobinurie nocturne paroxystique

Ig G immunoglobuline G IL-... interleukine -...

kDa kilodalton

LPS lipopolysaccharide mAb monoclonal antibody

MESF mean équivalent soluble molécule of fluorescein min minute

NEP EC 3.4.21.11, neutral endopeptidase, endopeptidase 24.11, CD 10, enképhalinase, néprilysine

pb paire de bases

PB S phosphate buffered saline PE phycoéritrine

PhA phosphoramidon, N-(a-Rhamnopyranosyloxy-hydrox'>'phosphinyI)-Leu-Trp TFA trifluoroacetic acid

TNF-a tumor necrosis factor - a

Tris hydroxyméthyl-aminométhane

Résumé

L

'endopeptidase neutre (EC: 3.4.24.11, NEP, CDIO, CALLA, enképhalinase ou néprilysine) est une métalloprotéase à Zn^ ancrée par son extrémité N-

terminale dans la membrane plasmique de nombreuses cellules, parmi lesquelles les granulocytes neutrophiles; elle est impliquée dans l’inactivation d’hormones peptidiques

présentes dans le milieu extracellulaire. In vitro, l’enzyme purifiée est capable d'hydrolyser des peptides pro-inflammatoires tels la Met-enképhaline, la substance P, l'endothéline-1.

Nous avons étudié la régulation de l’expression de la NEP à la surface des granulocytes neutrophiles. Ces cellules jouent un rôle clé dans l'éradication des infections par des bactéries Gram-négatives.

Dans la première partie du travail réalisée dans un modèle in vitro en sang total humain, nous avons observé que le lipopolysaccharide bactérien d'Escherichia Coli (LPS) induit une augmentation rapide et prolongée de la quantité de NEP exprimée au niveau de la membrane plasmique des granulocytes neutrophiles: la valeur médiane basale est de 751 pg/10^ GN (min-max: 434-834) et le maximum atteint après 1 h d’incubation avec le LPS est de 2.380 pg/10^ GN (min-max: 1.826-2.595); le coefficient de multiplication est donc de 3,2.

Grâce aux différents modèles utilisés (sang total, granulocytes neutrophiles purifiés et cellules sanguines d’une patiente atteinte d’hémoglobinurie nocturne paroxystique), nous avons montré que la réponse au LPS est complexe car elle implique des mécanismes différents suivant la concentration de LPS. En effet, à faibles doses (telles celles mesurées dans des situations pathologiques), le LPS agit pair l'intermédiaire du récepteur CD 14 des granulocytes neutrophiles tandis que des concentrations plus élevées mettent en jeu d'autres récepteurs.

Dans les temps de 30 min à 1 h suivant l’addition de LPS, l’augmentation d’expression de la NEP observée correspond vraisemblablement à la fusion de vésicules préformées contenant l’enzyme, car elle ne nécessite pas de synthèse protéique (insensible à la cycloheximide).

Pour les temps plus longs, le phénomène est, par contre, inhibé par la cycloheximide.

Lorsque les granulocytes neutrophiles sont exposés au peptide formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), un autre composé dérivé des bactéries, on observe aussi une augmentation de l'expression de la NEP mais celle-ci se traduit par une cinétique différente de celle du LPS. Cette augmentation est rapide, transitoire et indépendante de la cycloheximide. Le peptide fMLP étant à la fois substrat de l'enzyme et capable d'augmenter son expression à la membrane

VI

inhibiteur spécifique de l'enzyme) ne permet pas de restaurer un niveau d'expression de la NEP comparable à celui observé pour le LPS. La présence de la NEP à la surface des granulocytes neutrophiles n'est donc pas responsable du caractère transitoire de l’induction observée en présence de fMLP.

Dans la seconde partie du travail, nous avons tenté de mettre en évidence l'effet d'une augmentation de l'expression de la NEP induite par le LPS, sur les concentrations de peptides pro-inflammatoires et qui font partie des substrats de l’enzyme. Nous avons observé que l'endothéline-1 est dégradée par la NEP présente à la surface des granulocytes neutrophiles et que la formation du métabolite Val-Tyr est augmentée de 21% lorsque les cellules sont exposées au LPS. Ces données obtenues in vitro devraient être confirmées in vivo dans vm modèle d’endotoxémie chez la souris par exemple.

Après avoir caractérisé l'expression membranaire de la protéine, nous avons réalisé quelques expériences de détection de l'ARN messager de la NEP en réponse aux stimuli pour lesquels nous avons montré qu'ils augmentent l'expression de l'enzyme (LPS et fMLP). Des données récentes de la littérature montrent que les granulocytes neutrophiles sont capables de synthétiser de l'ARN et des protéines de novo en réponse à l'activation d'un nombre limité de stimuli pro-inflammatoires (Beaulieu et al, 1992). Nous avons montré que les granulocytes neutrophiles expriment l'ARN messager de la NEP mais que son expression n'est pas augmentée après une stimulation par le LPS ou le fMLP.

Dans le modèle in vitro d'endotoxémie utilisé, nous avons mis en évidence une augmentation de la quantité de NEP, biologiquement active, à la surface des granulocytes neutrophiles. Cette augmentation permettrait de réguler les concentrations de peptides pro­

inflammatoires circulants, ou au niveau des foyers inflammatoires, et constituerait une boucle

de rétrocontrôle tendant à limiter les effets de peptides potentiellement toxiques, comme

l'endothéline- 1 .

/---

I. INTRODUCTION

I. INTRODUCTION

1. L’enzyme endopeptidase neutre (EC 3.4.24.11)

1.1. Nomenclature

L 'endopeptidase neutre (EC 3.4.24.11; NEP) a été découverte en 1968 lorsque Wong et Kenny ont détecté la présence d'une activité de type endopeptidase

neutre capable d'hydrolyser la chaîne B de l'insuline, dans une préparation membranaire de cortex rénal. Elle a été purifiée quelques années plus tard par le même groupe (Kerr et Kenny,

1974a).

En 1978, Malfroy et ses collègues ont mis en évidence une enzyme hydrolysant

« spécifiquement » les enképhalines, des peptides opioïdes endogènes possédant un effet analgésique. Cette enzyme reçoit le nom d'enképhalinase.

En 1987, ce sont les techniques de clonage moléculaire qui ont permis de montrer que l'endopeptidase neutre est identique à l'enképhalinase (Malfroy et al, 1987).

L’homologie de séquence entre le CALLA (Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen), un marqueur spécifique de leucémies lymphoblastiques aiguës et l'endopeptidase neutre a été démontrée grâce aux techniques de biologie moléculaire par Letarte et al, en 1988. Ce marqueur de surface est également considéré comme un antigène de différenciation puisqu'il est normalement exprimé par les granulocytes neutrophiles de phénotype mature (cluster of différentiation 10, CD 10); il est facilement détectable par cytométrie de flux, à l'aide d'un anticorps anti-CD 10 portant une molécule fluorescente (une des techniques que nous avons exploitée dans notre travail; LeBien et al, 1989).

Depuis 1993, la Commission des Enzymes a proposé le nom de néprilysine, abréviation NEP (« Neutral Endopeptidase »).

En résumé, endopeptidase neutre = enképhalinase = CALLA = CD 10 = néprilysine.

1.2. Structure primaire de la NEP

La NEP est constituée d'ime seule chaîne polypeptidique de 749 acides aminés,

caractéristique d'ime protéine membranaire de type II. En effet, sa séquence N-terminale

comporte un segment unique hydrophobe de 24 acides aminés qui joue le rôle de segment

transmembranaire d'ancrage dans la membrane cytoplasmique des cellules et de peptide signal

Ml MP ME

Fig.1: Représentation schématique de la structure de l'endopeptidase neutre humaine

MI: milieu intracellulaire; MP: membrane plasmique; ME: milieu extracellulaire; AH: ancre hydrophobe; SA: site actif; S',: poche S', qui lie l'acide aminé hydrophobe du substrat;SG:

site de glycosylation.

(Fig. 1). Le domaine intracytoplasmique de l'enzyme comporte l'extrémité N-terminale proprement dite. Il est constitué de 25 acides aminés parmi lesquels on trouve 8 résidus fortement chargés qui jouent le rôle de séquence "stop transfert". Le rôle de ce domaine reste à déterminer.

L'essentiel de la séquence forme le domaine extracellulaire (les 600 acides aminés C- terminaux) et contient le site actif. Celui-ci comporte un exemplaire de la séquence consensus des métalloprotéases à zinc formée par les 5 acides aminés His-Glu-Ile-Thr-His. Le segment N-terminal n'est pas nécessaire pour l'activité enzymatique de la protéine. En effet, la forme soluble de la NEP (dépourvue des domaines cytoplasmique et transmembranaire) exprimée dans des cellules rénales en culture, est sécrétée dans le milieu et conserve l'entièreté de l'activité enzymatique de la NEP membranaire (Lemay et al, 1989). Enfin, la NEP porte, selon les espèces, 5 (chez le lapin) à 6 (chez l'homme et le rat) sites potentiels de N- glycosylation. Son poids moléculaire est d'environ 94 kDa. La séquence de la NEP possède un degré d’homologie significatif avec la séquence de l'enzyme de conversion de l'endothéline-1 (ECE-1) et de l'antigène Kell, présent sur les globules rouges. C'est la raison pour laquelle ces 3 protéines ont été regroupées au sein d’une même famille: la famille NECK pour NEP-ECE-Kell (Xu et al, 1994).

1.3. Le gène de la NEP

Le gène de l'endopeptidase neutre est localisé sur le chromosome 3. Il s'étend sur plus

de 80 kb et comprend 24 exons séparés par de multiples introns dont les longueurs varient de

106 pb à plus de 13,5 kb. Les deux premiers exons codent pour les séquences 5' NTR (non

traduites). Le troisième, contenant le codon d'initiation, code pour la séquence N-terminale de

la NEP qui comprend le domaine cytoplasmique et la séquenee transmembranaire de la

protéine. L'essentiel du domaine extracellulaire (600 sur 700 acides aminés) est codé par une

succession de 20 petits exons dont la taille varie de 36 à 162 pb. La séquence consensus

formée par le pentapeptide His-Glu-Ile-Thr-His, caractéristique des métalloprotéases à zinc

est codée par l'exon 19. Le dernier exon, beaucoup plus long que les autres (3.400 pb) code

pour les 32 acides aminés C-terminaux de la protéine et l'entièreté de la région 3' NTR

(D’Adamio et al, 1989).

HYDROPHOBE

Fig. 2: Représentation schématique du site actif de la NEP et dénomination des positions occupées par les acides aminés de part et d'autre de la liaison peptidique qui est clivée

P

et P\: noms des positions des acides aminés situés de part et d'autre de la liaison à cliver

(entre P, et P').

Trois types différents de cDNA de la NEP humaine ont été identifiés. Ils diffèrent exclusivement par la séquence en amont du troisième exon. Leur existence découle de l'utilisation alternative de sites dormeurs d'épissage présents dans l'exon 1 et l'exon 2 associés à un même site accepteur d'épissage présent au sein de l'exon 3. Ceci génère 3 types d'ARN messagers différents appelés type 1,2a ou 2b (D’Adamio et al, 1989).

Les mécanismes de régulation du gène de la NEP sont encore incoimus. Cependant, deux régions régulatrices différentes ont récemment été mises en évidence dans la région 5' NTR du gène. Elles contrôlent l'épissage alternatif des transcrits de la NEP. Ces 2 régions régulatrices appelées de type 1 et de type 2 sont caractérisées par de multiples sites d'initiation de la transcription et l'absence de TATA box classique. Dans la majorité des tissus examinés à l'heure actuelle, le transcrit de la NEP de type 2 semble être le plus abondant (Ishimaru et al, 1995).

1.4. Structure du site actif et spécificité de la NEP

De nombreuses études réalisées sur la NEP au moyen de substrats synthétiques montrent l'importance relative des acides aminés engagés dans la liaison peptidique à cliver (position PI et P'I, Fig. 2) et celle des acides aminés voisins (positions P2 et P3 en allant vers l'extrémité N-terminale, P'2 et P'3 en allant vers l'extrémité C-terminale): bien que la nature et l'encombrement stérique des acides aminés voisins influencent les paramètres cinétiques qui caractérisent la réaction d'hydrolyse, la seule présence d'un acide aminé hydrophobe (par exemple: Phe, Leu, Val, Tyr, Ile, Trp, ...) non C-terminal en position P'I est une condition nécessaire pour qu'un peptide soit un substrat potentiel de la NEP. Ceci lui confère une spécificité assez large. Il faut cependant noter que bien que la NEP hydrolyse des peptides tant de forme linéaire (fMLP, ...) que cyclique (Endothéline-1, ...), elle n'agit pas sur des protéines de poids moléculaire important comme la caséine ou l'albumine par exemple. La NEP agit sur des peptides plutôt que sur des protéines: c'est une peptidase (Kerr et Kenny,

1974b).

CH^ O H

"S — CHj — CH — C — N — CHj— COOH Thiorphan

0 ‘ CH, H CH,

rhamnosyl — O — P — NH — CH — C — N— CH — COOH O

Phosphoramidon

Fig. 3: Structure de 2 inhibiteurs de la NEP

Le thiorphan (inhibiteur synthétique, IC^o = 4 nM) et le phosphoramidon (inhibiteur naturel,

ICso = 2 nM).

1.5. Inhibiteurs

La structure du site actif de la NEP est très proche de celle de la thermolysine, une métalloprotéase à zinc d'origine bactérienne. Cette similitude est à l'origine de l'inhibition de la NEP par le phosphoramidon, un composé naturel synthétisé par une souche de Streptomyces (Fig. 3). L'étude des caractéristiques du site actif de la NEP a permis, en utilisant la conception assistée par ordinateur, la mise au point d'une série d'inhibiteurs synthétiques puissants et sélectifs de cette enzyme. Le premier d'entre eux, le thiorphan a été suivi par une série d'autres composés de synthèse tels le rétrothiorphan et le kélatorphan (Roques et al, 1989). Les IC 50 du thiorphan et des thiorphans substitués suggèrent que l’Asn^^^ de la NEP lie le substrat à l'extrémité N-terminale de l’acide aminé en position P'2 en formant un lien hydrogène unique (Dion et al, 1995).

1.6. Substrats

La NEP est capable d’hydrolyser une grande variété de substrats peptidiques parmi lesquels les enképhalines (Hersh et al, 1984), la substance P (Skidgel et al, 1984), l’octapeptide C-terminal de la cholécystokinine (Najdovski et al, 1985), la gastrine (Deschodt- Lanckman et al, 1988), le peptide atrial natriurétique (ANP) (Vanneste et al, 1988), la somatostatine (Sakurada et al, 1990), l’endothéline-1 (Fagny et al, 1991), la bradykinine (Rosenbaum et al, 1995),...

(Met) enképhaline Substance P Neurotensine Somatostatine Bradykinine CCK -8

T yr-Gly-Gly-Phe-Leu(Met) t

Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH 2 t t t

p-Glu-Leu-Tyr-Gln-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu t t

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

t t t

Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg

t t

Asp-T yr-Met-Gly-T rp-Met-Asp-Phe-NH 2

SO3H T

Table 1 : Sites d’hydrolyse de différents peptides par la NEP

Les flèches indiquent les sites de clivage

Introduction

1.7. Distribution tissulaire de la NEP

La distribution de la NEP a été étudiée par plusieurs groupes de chercheurs. Ils ont utilisé un matériel biologique de différentes origines (homme, lapin, rat, cobaye,...) ainsi que des techniques de détection différentes (mesure de l'activité enzymatique sensible au phosphoramidon ou au thiorphan, détection radioimmunologique,...). Cependant, malgré ces différences, la NEP est décrite comme une enzyme qui possède une large distribution tissulaire. Elle est souvent détectée à la surface de cellules épithéliales avec le site actif orienté vers le milieu extracellulaire.

1.7.1. Au niveau central

Dans le système nerveux central, la distribution de la NEP est assez hétérogène. On en trouve en quantités importantes dans les plexus choroïdes, la substance noire, le striatum, les tubercules olfactifs et en quantités moindres dans la couche moléculaire du cervelet.

L'enzyme est localisée essentiellement à la surface des neurones mais aussi sur des cellules gliales et endocrines (Pollard et al, 1989).

1.7.2. Au niveau périphérique

La NEP est présente dans le rein (Schultz et al, 1988), les ganglions lymphatiques (Bowes et al, 1986), le tractus génital mâle (Erdôs et al, 1985), le tractus génital femelle (Head et al, 1993), le système digestif (Pollard et al, 1991), dans les poumons (Kummer et al, 1991), le placenta (Johnson et al, 1984), les glandes salivaires, la thyroïde, les glandes surrénales (Ronco et al, 1988), les cartilages (Gee et al, 1985), les fibroblastes (Lorkowski et al, 1987) et les granulocytes neutrophiles (Iwamoto et al, 1991).

Le rein est l'organe le plus riche en NEP (5.000 ng/mg protéines; Gee et al, 1985).

Celle-ci est présente exclusivement dans le cortex rénal, où elle est localisée sur la membrane plasmique apicale des cellules épithéliales des tabules contournés proximaux (Schulz et al, 1988). Elle est également détectée le long de la membrane basale des glomérules (Metzgar et al, 1981).

5

Les ganglions lymphatiques sont la seconde source la plus abondante de la NEP (1.370 ng/mg protéines; Gee et al, 1985). Cependant, la quantité de NEP varie fortement d'un ganglion à l'autre. Grâce à une mise en culture des cellules ganglionnaires, les auteurs montrent que la NEP est exprimée par les cellules réticulaires, cellules qui représentent 5 à 25% des cellules des ganglions et qui assurent le maintien de la structure anatomique des ganglions (Bowes et al, 1986).

La NEP est également présente au niveau du tissu lingual (16,2 ng/mg protéines), du thymus (3,5 ng/mg protéines), de la rate (1,5 ng/mg protéines), des glandes surrénales (1,5 ng/mg protéines), des chondrocytes du cartilage articulaire (650 ng/mg protéines) (Gee et al,

1985).

La NEP est présente en concentration élevée dans le tractus génital mâle. Le liquide séminal est riche en NEP; après son ultracentrifugation, la NEP sédimente et se retrouve dans la fraction particulaire. L'activité NEP est faible dans les homogénats de testicules mais élevée dans la fraction particulaire de l'épididyme et de la prostate (Erdôs et al, 1985).

Au niveau du tractus génital femelle, la NEP est détectée au niveau des cellules stromales de l'endomètre. L'activité de la NEP dans l'endomètre est corrélée positivement avec les concentrations de progestérone plasmatique (Head et al, 1993).

La NEP est présente au niveau du placenta. La surface maternelle du syncythiotrophoblaste placentaire humain se prolonge par une série de microvillosités. Cette bordure en brosse est riche en NEP (Johnson et al, 1984).

Le long du tractus gastro-intestinal, l'immunoréactivité la plus forte de la NEP est trouvée dans les muqueuses comme les villosités intestinales, les couches épithéliales basales de l'oesophage ou du sphincter gastro-œsophagien (cardia gastrique), la muqueuse musculaire de l'estomac et du gros intestin. L'immunoréactivité est également élevée dans la submuqueuse de l'estomac et modérée dans la musculature propre au caecum. Cette distribution montre que la NEP est exprimée par les entérocytes et sur les cellules de la musculature lisse sous-jacente (Pollard et al, 1991). Au niveau du pancréas, la NEP est trouvée sur les cellules acineuses (Terashima et al, 1992).

Dans les voies respiratoires, l'activité NEP la plus intense se localise au niveau de

l'épithélium respiratoire. Elle se situe également sur les cellules épithéliales. Une faible

Introduction activité NEP est également détectée au niveau du tissu conjonctif. Cependant, aucune activité NEP n’est trouvée sur les cellules musculaires lisses de la trachée ni sur les vaisseaux sanguins qui la parcourent (Kummer et al, 1991).

La NEP est présente en quantité faible dans le plasma, le fluide cérébrospinal, le fluide amniotique (Spillantini et al, 1990).

La NEP est présente sur la membrane plasmique des fibroblastes en culture (Lorkowski et al, 1987) et sur les granulocytes neutrophiles (Iwamoto et al, 1991; voir § 1 . 1 . 8 ).

1.8. La NEP des granulocytes neutrophiles

1.8.1. Découverte de l'activité NEP à la surface des granulocytes neutrophiles

Les neutrophiles ou granulocytes neutrophiles naissent dans la moelle osseuse à partir de cellules souches promyélocytaires. A la fin de leur maturation, ils sont libérés dans la circulation sanguine et participent au pool de leucocytes comprenant les lymphocytes, les monocytes, les granulocytes éosinophiles et les granulocytes basophiles. Les granulocytes neutrophiles représentent de 40 à 75% des cellules de la population des cellules blanches du sang humain.

En 1985, Connelly et ses collaborateurs détectent une activité NEP sur une préparation de granulocytes neutrophiles purifiés à partir de sang total humain. Par fractionnement subcellulaire et localisation immunocytochimique, ils localisent la majeure partie de l'activité NEP à la membrane plasmique des granulocytes neutrophiles (Connelly et al, 1985). Une étude de distribution de la NEP élargie aux leucocytes du sang humain périphérique basée à la fois sur la détection de l’activité enzymatique par la dégradation de la Met-enképhaline et sur des analyses par cytométrie de flux indique la présence de la NEP à la surface des granulocytes neutrophiles (Tran-Paterson et al, 1990; Iwamoto et al, 1991). D'autres chercheurs ont travaillé sur des homogénats de cellules sanguines en utilisant un substrat comportant un site de clivage spécifique de la NEP (Glutaryl-Gly-Ala-Phe-2-nitroanilide, Glt- Gly-Ala-Phe-2NA). Ils ont mesuré une activité NEP importante sur les granulocytes neutrophiles et des quantités faibles mais significatives sur les homogénats des lymphocytes

7

T, des lymphocytes B et des monocytes. Les auteurs affirment que cette activité ne peut pas être attribuée à une contamination par des granulocytes neutrophiles parce que les populations individuelles contiennent moins de 1% de neutrophiles (Casale et al, 1995). De plus, les granulocytes neutrophiles immatures comme les myélocytes, les métamyélocytes, ...

n'expriment pas d'activité NEP; l'activité NEP est associée aux granulocytes neutrophiles de phénotype mature (Tran-Paterson et al, 1990).

1.8.2. La NEP en interaction avec ies peptides pro-infiammatoires

La migration des granulocytes neutrophiles de la circulation vers les sites d'infection ou d'inflammation est initiée par une série de substances chimiotactiques comme le peptide formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), par exemple. Des études cinétiques montrent que ce peptide est un des meilleurs substrats biologiquement actifs de la NEP (Connelly et al, 1985). Lorsque celui-ci est mis au contact de granulocytes neutrophiles, on observe une libération de Leu-Phe qui est inhibable à 95% par le phosphoramidon, due à la NEP ancrée dans la membrane plasmique des granulocytes neutrophiles. La NEP clive le peptide fMet-Leu-Phe au niveau de la liaison Meti-Leu 2 et libère ainsi le dipeptide Leu-Phe. Dans un second temps, Leu-Phe est clivé par l'aminopeptidase N (Connelly et al, 1985; Painter et al, 1988; Yuli et al, 1991).

La substance P est un autre médiateur puissant de l'inflammation dans les voies respiratoires, sa libération locale induit une perméabilité vasculaire et la migration des granulocytes neutrophiles vers les sites de l'inflammation. La présence de la NEP module négativement les effets de ce peptide qui induit des modifications morphologiques (taille, forme), un chimiotactisme et l'adhérence des granulocytes neutrophiles (expression du MO-1, du LAM-1). La présence d'un inhibiteur de la NEP contrebalance cette action (Shipp et al,

1993).

Le rôle anti-inflammatoire de la NEP a également été mis en évidence chez les

organismes invertébrés tel le mollusque Mytilus edulis où le peptide Met-enképhaline sert de

médiateur inflammatoire en induisant des changements morphologiques, la migration et

l'agrégation des haemocytes. Une enzyme comparable à celle de la NEP humaine est

exprimée par les haemocytes; son inhibition réduit la quantité de Met-enképhaline requise

pour leur activation. Les auteurs ont observé des résultats tout à fait similaires avec les

granulocytes neutrophiles matures humains (Shipp et al, 1990). Ceci suggère que la

Introduction modulation des réponses induites par la Met-enképhaline est un mécanisme très ancien puisqu'il existe déjà chez les invertébrés alors que les organismes vertébrés ont divergés voici 500 millions d'années. La conservation de cette activité enzymatique, qui régule l’activité pro-inflammatoire de certains peptides, au cours de l'évolution témoigne de l'importance de ce mécanisme de contrôle.

2. Granulocytes neutrophiles et choc septique

2.1. Le choc septique 2.1.1. Notions générales

Les endotoxines sont le composant majeur de la paroi externe des bactéries Gram- négatives. Elles sont composées d'une partie lipidique et d'une partie saccharidique, c'est la raison pour laquelle les endotoxines sont également appelées lipopolysaccharides (LPS) (Raetz et al, 1991; Rietschel et al, 1992). Le LPS n’est normalement pas sécrété dans le milieu extracellulaire. Cependant, il peut être libéré dans certaines circonstances telle une division cellulaire ou après la mort de la bactérie (Hewett et al, 1993). Une fois dans la circulation, il stimule directement /ou indirectement les leucocytes (monocytes, granulocytes neutrophiles,...) de l’hôte. En effet, le LPS induit notamment la sécrétion de médiateurs (cytokines,...) qui agissent localement ou qui circulent dans le sang et déclenchent des réactions à distance. Ainsi, lorsque quelques bactéries envahissent un tissu et libèrent des faibles quantités de LPS, les granulocytes neutrophiles jouent un rôle clé dans l’éradication de cette infection (Hewett et al, 1993).

La réponse des granulocytes neutrophiles au LPS implique vme série d'événements complexes (§ 1.2.1.3.2) qui inclus l’accumulation de ces cellules sur le site d'infection pour tuer les bactéries infectieuses. Le recrutement des granulocytes neutrophiles sollicite plusieurs fonctions particulières de ces cellules: le chimiotactisme, l'adhérence des granulocytes neutrophiles aux cellules endothéliales vasculaires et la diapédèse (migration transendothéliale). Le chimiotactisme est le processus par lequel les granulocytes neutrophiles migrent vers un endroit particulier (le site d’infection) en suivant un gradient de concentration établi par des facteurs chimiotactiques solubles spécifiques. La migration

9

transendothéliale est un processus complexe qui nécessite des interactions entre les granulocytes neutrophiles et l’endothélium vasculaire (Godin et al, 1993). Ces interactions se font grâce à des molécules d’adhérence qui sont exprimées à la surface des granulocytes neutrophiles et des cellules endothéliales (Albelda et al, 1994). Il existe 3 familles principales;

- Les sélectines, protéines transmembranaires dont le domaine externe est de type lectine. La lectine L (LAM-1) est présente sur les leucocytes. Elle interagit avec des contre-récepteurs présents sur les cellules endothéliales activées par les processus inflammatoires. La sélectine E (ELAM-1) est exprimée sur les cellules endothéliales activées. Elle interagit avec des contre-récepteurs présents sxir les granulocytes neutrophiles. La sélectine P est exprimée à la surface des plaquettes et des cellules endothéliales; elle interagit avec des ligands analogues à ceux de la sélectine E (Durand et al, 1992).

- Les molécules de type ICAM, qui font partie de la superfamille des immunoglobulines. Il en existe de 2 types à la surface des cellules endothéliales: ICAM-1 (CD54) qui apparaît à la surface des cellules endothéliales au cours de processus inflammatoires sous l’effet de cytokines (TNF-a, ...) et lCAM-2 qui est exprimée de façon constitutive sur les cellules endothéliales au repos.

- Les intégrines, glycoprotéines transmembranaires formées de deux chaînes différentes. Les P2 intégrines sont constituées d’une chaîne P (CD 18) commune aux 3 molécules de cette famille (LFA-1, MAC-1/CR3, pl50,95/CR4) et d’une chaîne a (CDU) qui est variable:

CDllapour LFA-1, CDl Ib pour MAC-1/CR3, CDl le pour pl50,95/CR4. LFA-1 (leucocyte function-associated antigen-1 ) est exprimé sur la plupart des leucocytes. Elle interagit avec les molécules ICAM, l’affinité de LFA-1 pour ICAM-1 augmente au cours des processus inflammatoires, favorisant ainsi l’adhérence leucocytaire. MAC-1/CR3, exprimé par les neutrophiles, les monocytes et les macrophages, intervient également dans l’adhérence aux cellules endothéliales activées en se liant aux molécules ICAM-1.

Les interactions entre les granulocytes neutrophiles et l’endothélium s’opèrent schématiquement en 3 phases (Fig. 4):

Au cours d’une première phase, les granulocytes neutrophiles sont freinés à la surface des

cellules endothéliales et exercent un mouvement rotatif à leur niveau. Cette phase fait

intervenir les sélectines. Au cours de la seconde phase, dite d’adhérence ferme (fait intervenir

Lumière vasculaire

ROULEMENT

ADHERENCE CD11b

CD62L

Interstitium

Fig.4 : Etapes effectuées par les granulocytes neutrophiles lors de la migration transendothéliale afin de rejoindre ie foyer d'infection

La phase dite de roulement ("rolling"), la phase d'adhérence et la phase de diapédèse. CD62L: sélectine L; CD62E: sélectine E; CD62P:

sélectine P; CDlla: LEA-1; CDllb: MAC-1; IL-8: interleukine-8.

les interactions p2 intégrines-ICAMs), les granulocytes neutrophiles se lient fermement aux cellules endothéliales à la surface desquelles ils s’aplatissent. Simultanément, les granulocytes neutrophiles s’activent sous l’effet de ces interactions et des substances qui sont sécrétées par les cellules endothéliales activées comme l’interleukine -8 (IL- 8 ). La troisième phase de diapédèse (consiste en la migration des granulocytes neutrophiles de la lumière vasculaire vers l'interstitium) dépend également des interactions P2 intégrines-ICAMs ainsi que de substances chimiotactiques diverses (Albelda et al, 1994).

Lors de l’arrivée des granulocytes neutrophiles sur le site d'infection, les bactéries sont englobées par phagocytose. La bactérie est alors piégée dans une vacuole de phagocytose (phagosome), les phagosomes migrent dans le cytoplasme et fusionnent avec des granules contenant une série d'enzymes protéolytiques capables de lyser les bactéries.

Si l’infection est locale, celle-ci se résorbe grâce à l’immunité naturelle ou non adaptative. Cependant, lorsque l’infection est importante, le LPS circulant dans le sang provoque une septicémie ou syndrome septique. Ce syndrome est défini comme une réponse systémique (« généralisée ») à une infection se manifestant par de la tachycardie, de la tachypnée, une modification de la température corporelle ainsi que d’une leucocytose ou une leucopénie. La septicémie sévère peut s'accompagner d'hypotension, on parle alors de choc septique, et conduire à un dysfonctionnement des organes vitaux et finalement au décès du patient. L’infection par des bactéries Gram-négatives représente 40 à 60% des infections.

Aux Etats-Unis, on enregistre approximativement 400.000 cas par an de septicémie avec une mortalité dans 10 à 40% des cas (Centers for Disease Control, 1990). Le LPS a été identifié comme étant le facteur majeur contribuant à la haute mortalité associée à l'infection par des bactéries Gram-négatives.

L'injection d'endotoxines à un animal entraîne des manifestations sévères et des lésions

tissulaires analogues à celles observées lors du choc septique (Raetz et al, 1991). Cette

ressemblance et la simplicité de l'injection de LPS à un animal ont justifié la large utilisation

du choc endotoxinique comme modèle du choc septique.

Lipide Polysaccharide

Fig. 5: Structure de la molécule de LPS

Kdo: acide 3-déoxy-D-manno-2-octulosonique.

2.1.2. Structure des lipopolysaccharides bactériens ou endotoxines

Les lipopolysaccharides sont composés d’un polysaccharide, qui varie selon l’espèce, et d’ime partie membranaire le lipide-A (Fig. 5). La chaîne 0-spécifique est le segment le plus variable du LPS. Elle déclenche une réaction immunitaire en faisant produire à l’organisme infecté des anticorps qui la reconnaissent spécifiquement. Cette chaîne diffère généralement, suivant les espèces bactériennes, par le type et la séquence des sucres qui constituent la sous-unité de base et par le nombre de sous-unités. Le noyau oligosaccharidique, composé d’un noyau interne et d’un noyau externe, varie moins que la chaîne 0-spécifique et joue un rôle moins important dans la réponse immunitaire. Le lipide-A est la région la moins variable structurellement. Il est responsable du pouvoir pathogène du LPS. C’est au niveau du lipide-A que se lie la polymixine B, antibiotique qui est le principal inhibiteur des endotoxines (Rietschel et al, 1992).

2.1.3. Interactions du LPS avec les cellules de mammifères

2.1.3.1. Le récepteur CD14

La reconnaissance du LPS par les cellules (granulocytes neutrophiles, monocytes, macrophages,...) fait intervenir plusieurs types de récepteurs (Couturier et al, 1992; Ingalls et al, 1995; Wright et al, 1991). Parmi ceux-ci, le mieux caractérisé est le récepteur CD14.

Le CD 14 est un antigène de différenciation fortement exprimé sur les cellules myéloïdes au stade final de maturation des monocytes et macrophages; il est exprimé en quantité nettement plus faible sur les granulocytes neutrophiles. Le CD 14 est une glycoprotéine de 55 kDa insérée dans la membrane plasmique par une ancre glycosylphosphatidylinositol (GPI) (Haziot et al, 1993). Elle joue le rôle de récepteur pour le complexe entre le LPS et une protéine plasmatique soluble qui lie le LPS, appelée LBP pour

« LPS binding protein» (Lee et al, 1993). D’autres protéines plasmatiques telles les HDL

« High Density Lipoprotein» peuvent également jouer ce rôle (Vosbeck et al, 1990).

L'interaction du complexe avec le récepteur CD 14 initie, entre autres, la production du facteur

de nécrose tumorale (TNF-a) par les monocytes et les granulocytes neutrophiles (Haziot et al,

1993). Il a été montré qu’un contact de 5 à 15 min des monocytes, en sang total, avec le LPS

suffit pour assurer un maximum de liaison du LPS au CD 14, activer les cellules et conduire à

Introduction

la production de TNF-a (Gallay et al, 1993). Un prétraitement des cellules avec un anticorps monoclonal anti-CD 14 bloquant réduit la production de TNF-a des monocytes et des granulocytes neutrophiles pour des concentrations physiologiques de LPS (< 1 ng/ml) (Wright étal, 1991).

Certaines cellules comme les cellules endothéliales, par exemple, sont cependant capables de répondre au LPS alors qu'elles n'expriment pas de CD 14 membranaire. Dans ce cas, la réponse au LPS est médiée par la forme soluble du CD 14 (CD 14s; Frey et al, 1992;

Pugin et al, 1993; Hailman et al, 1996). En effet, Read et ses collaborateurs ont montré que les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC, Human Umbilical Vein Endothélial Cells), pour lesquelles aucune expression détectable de CD 14 n'est mesurée, deviennent 3.000 fois plus sensibles à une activation par le LPS après addition de sérum. Les auteurs ont démontré que cette activation se fait par l'intermédiaire du récepteur CD 14 soluble présent dans le plasma (de sujets normaux), à des concentrations de 1-3 pg/ml (Read et al, 1993). Cette molécule dériverait du CD 14 membranaire, clivé de la surface cellulaire par l'action de phospholipases agissant sur l'ancre GPl ou éventuellement de protéases (phénomène appelé «shedding» ; Ziegler-Heitbrock et al, 1993). Après activation des monocytes par le LPS, le CD 14 situé en surface est libéré dans le milieu extracellulaire (Bazil et al, 1991). Deux formes différentes de CD 14 solubles ont été observées dans une lignée tumorale de cellules monocytaires humaines. Elles se distinguent par une mobilité électrophorétique et une sensibilité aux endoglycosidases différentes. Elles présentent des poids apparents de 48 kDa (CD 14s a) et 56 kDa (CD 14s P) (Labeta et al, 1993).

La LBP est une protéine du sérum qui a été isolée, clonée et séquencée par Ulevitch et ses collaborateurs (Schumann et al, 1990). Sa structure est comparable à celles des protéines transporteuses de lipides (Schumann et al, 1990; Tobias et al, 1993). La LBP facilite la liaison du LPS au CD 14 (Hailman et al, 1994). Une molécule de LBP transfert 100 molécules de LPS à 100 molécules de CD 14s en 1 h. Elle augmente la sensibilité des cellules CD 14 positives à une stimulation par le LPS (Wright et al, 1990; Schumann et al, 1990). Weersnick suggère que la liaison du LPS au CD 14 nécessite la mobilisation de granules intracellulaires contenant les molécules de LBP. Ceux-ci seraient rapidement transloqués à la membrane plasmique des granulocytes neutrophiles lorsque ceux-ci sont stimulés par le TNF-a ou le LPS (Weersnick et al, 1994).

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Cytokines:

TNF-a IL-la,P IL-6 IL-8 IL-10 GM-CSF G-CSF

fMLP

enzymes des granules Cytokines:

TNF-a IL-1a,p IL-8 IL-1ra IL-3 MIP-1a IFN-a GM-CSF G-CSF TGF-p

Chimiotactisme

CD11b

NEP ace

V Y V ^{Adhérence V}

Cellule endothéliale

Interstitium

Introduction

Le rôle du récepteur CD 14 dans le choc endotoxinique a été clairement mis en évidence in vivo, par l'utilisation de souris transgéniques surexprimant le récepteur CD 14 humain à la surface des monocytes et des granulocytes neutrophiles. Ces souris présentent une hypersensibilité au LPS (Ferrero et al, 1993).

De plus, le LPS induit une augmentation d’expression de son propre récepteur (le CD14) à la surface des monocytes dans les 30 min qui suivent l’exposition des cellules au LPS. Le maximum d’expression du CD 14 se situe entre 1 et 3 h puis une diminution graduelle est observée. Cette augmentation est indépendante de la présence d'un inhibiteur de synthèse protéique, la cycloheximide (Marchant et al, 1992).

Une représentation schématique des principales cellules et cytokines impliquées dans la physiopathologie du choc septique est présentée à la Fig. 6 .

2.1.3.2. Les réponses biologiques des cellules au LPS

Le développement d’un syndrome septique est dû à une activation non contrôlée de la réponse inflammatoire par le LPS qui conduit à la libération massive dans le sang de différentes cytokines et médiateurs dont le NO. Cette activation induit une cascade d’événements complexes qui implique les granulocytes neutrophiles (Fig. 7) mais aussi d'autres cellules comme les monocytes, les macrophages, les cellules endothéliales. Nous nous limiterons ici à décrire les effets du LPS sur les granulocytes neutrophiles. Pour les autres types cellulaires, un résumé est publié en annexe 1 .

2.1.3.2.1. Les neutrophiles

La réponse chimiotactique induite par les produits libérés par les bactéries et par les leucocytes arrivés au site d’infection s’accompagne d’une augmentation de l'adhérence au niveau des cellules endothéliales due à une induction de l'expression des molécules d'adhérence à la surface des granulocytes neutrophiles et des cellules endothéliales. Le LPS induit une augmentation de CD 11 b/CD 18 à la surface des granulocytes neutrophiles. Cette augmentation n'est pas interrompue par la présence d'un inhibiteur de synthèse protéique (Lynn et al, 1991).

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O I

Enzymes des granules

sérine protéases neutres:

- élastase

- cathepsine G, ...

métalloprotéases:

- collagénase - gélatinase

myéloperoxydase protéases acides

Métabolites oxygénés^

OH

Lipides bioactifs Cytokines

leucothéne B4 (LTB4)

platelet activating factor (PAF) Adhérence

Cellule

endothéliale

Introduction

Les granulocytes neutrophiles du courant circulatoire n'ont pratiquement pas d'activité respiratoire génératrice d' 02 *. La production d' 02 * est induite quelques secondes après la fixation du LPS sur son récepteur de surface. Elle est si rapide qu'elle a reçu le nom d'explosion respiratoire. Une accélération du cycle des pentoses phosphates pourvoit à une demande accrue en équivalents de réduction sous forme de NADPH. L'explosion respiratoire de granulocytes neutrophiles est observée lors de la phagocytose des bactéries. La NADPH oxydase présente dans la membrane des granulocytes neutrophiles produit et sécrète des métabolites oxygénés tel le radical hydroxyl (OH ), le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ) et l'ion superoxyde (O 2 ). Ces dérivés sont toxiques pour les bactéries et aussi pour les tissus lorsqu'ils sont produits en grande quantité.

Parmi les lipides bioactifs qui sont synthétisés, le LTB 4 (leucotriène B4) est le produit majoritaire synthétisé par la voie de la lipooxygénase des granulocytes neutrophiles. Le leucotriène B4 est un facteur chimiotactique puissant et un faible activateur des granulocytes neutrophiles in vitro, il est donc essentiellement responsable de l'accumulation des granulocytes neutrophiles au site d'infection (Surette et al, 1993). Le PAF (platelet activating factor), également généré par les granulocytes neutrophiles, a des effets biologiques divers dont un effet cytotoxique direct sur les cellules endothéliales.

Les granulocytes neutrophiles libèrent également des enzymes contenues dans les granules intracellulaires, qui contribuent à endommager les tissus de l'hôte. Parmi celles-ci, citons le lysosyme qui dégrade les parois bactériennes à base de peptidoglycans; la lactoferrine qui chélate le fer et bloque ainsi l'activité d’enzymes bactériennes dépendantes du fer; l'élastase qui dégrade l'élastine mais aussi d’autres substrats tel la fibronectine; la collagénase qui s’attaque au collagène, ... Les connaissances actuelles suggèrent que ces enzymes se répartissent dans trois types de granules différents: les granules primaires (ou granules azurophiles) qui apparaissent au stade promyélocyte, les granules secondaires (ou spécifiques) apparaissant au stade myélocyte et métamyélocyte et les granules tertiaires (ou granules de gélatinase). Ceux-ci se forment plus tard que les granules spécifiques et renferment la majeure partie de la gélatinase de la cellule. La localisation de certaines enzymes doit encore être confirmée par localisation subcellulaire ou immunocytochimique.

De plus, les granules contiennent également des agents anti-microbiens (Borregaard et al, 1993).

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Les granulocytes neutrophiles produisent une série de cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires et leurs antagonistes. Nous n'évoquerons que les principales d'entre elles:

- Le facteur de nécrose tumorale (TNF-al:

Il a été découvert comme une substance induisant la nécrose des tumeurs (Tumor Necrosis Factor, TNF-a) mais il exerce de multiples autres effets. Il est le médiateur principal dans la réponse des cellules aux endotoxines. Le TNF se lie à deux types de récepteurs que l'on distingue par leurs poids moléculaires différents (55 et 75 kDa) et qui sont à l'origine d'effets biologiques différents. Les récepteurs du TNF-a peuvent apparaître sous forme soluble et interviennent alors comme des antagonistes neutralisant le TNF-a en l'empêchant de se fixer sur ses cibles cellulaires. A faible concentration, le TNF-a agit de façon paracrine et autocrine sur les leucocytes, ce qui favorise le recrutement et l'activation de ces cellules.

Cet effet local fait intervenir notamment l'induction de molécules d'adhérence et la stimulation de la synthèse d'autres cytokines (IL-1, IL- 8 , ...). Lorsqu'il est synthétisé en abondance, le TNF-a apparaît dans la circulation et déclenche une réaction généralisée en synergie avec d'autres cytokines dont il stimule la production (IL-1, IL- 6 ,...; Yonemaru et al, 1989).

- L'interleukine-1 HL-IL

L'IL-1 existe sous deux formes moléculaires (IL-la et IL-1(Î), codées par des gènes différents et qui présentent moins de 30 % d'homologie structurale. Ces deux formes possèdent des poids moléculaires équivalents (17 kDa). Une fois synthétisée, l'IL-la n’est presque pas sécrétée et jouerait le rôle d’un médiateur intracellulaire. L’IL-lp est sécrétée dans le milieu extracellulaire et possède des propriétés inflammatoires multiples. L'IL-1 se lie à deux types de récepteurs (I et II). Les effets de l'IL-1 sont très voisins de ceux du TNF-a. Les effets de riL-1 sont également contrôlés par un antagoniste naturel, l'IL-lra (« receptor antagonist ») qui est produit par les mêmes cellules que celles qui sécrètent l'IL-1 (monocytes, macrophages, cellules endothéliales,...). L'IL-lra se fixe sur les récepteurs de l'IL-1 et bloque ses effets par compétition (Tiku et al, 1986).

- L'interleukine -6 (IL-ôL

Le rôle de l'IL -6 au cours des infections bactériennes n'est pas encore bien défini.

Cependant, elle constitue un excellent témoin des processus inflammatoires: elle est

facilement détectée dans le sérum et dans d'autres liquides biologiques.