Au sein d’expériences différentes d’amplification PCR

A partir d’une même solution d’ARN total, nous avons réalisé 3 expériences de RT-

PCR, à protocoles identiques. Les résultats de ces 3 expériences indépendantes sont résumés

à la Fig. 52. La comparaison montre qu’il est possible d’obtenir vme relativement bonne

reproductibilité des résultats entre expériences de RT-PCR indépendantes.

2.2. Détection de TARN messager du CD10/NEP

2.2.1. Dans les granulocytes neutrophiles purifiés

Lorsqu'une détection de TARN messager est réalisée sur les cellules polynuclées

(granulocytes neutrophiles) obtenues par purification des cellules sanguines au moyen de

polymorphprep, on observe une bande à 513 pb de très forte intensité. Cette intensité diminue

après que les granulocytes neutrophiles aient été mis en culture pendant une nuit à 37°C sous

5% de CO2. Par contre, une détection de TARN messager du CDIO/NEP sur les cellules

mononuclées (monocytes et lymphocytes) montre une bande de très faible intensité; celle-ci

disparaît au terme d'une nuit de culture (photo 3). Ce signal pourrait être dû aux granulocytes

neutrophiles qui contaminent la population de cellules mononuclées. La Fig. 53 représente les

valeurs de fluorescence obtenues pour la beinde à 513 pb après la séparation des cellules

polynuclées et mononuclées.

L'ARN messager du CDIO/NEP est détecté dans les cellules polynuclées (granulocytes

neutrophiles) et mononuclées (monocytes/lymphocytes) obtenues après purification à l'aide

de polymorphprep et après la mise en culture pendant une nuit à 37°C sous 5% de CÛ

2

-Blanc (piste 1), contrôle positif (rein; piste 2), après purification: granulocytes neutrophiles

(piste 3), monocytes/lymphocytes (piste 4) et après culture: granulocytes neutrophiles (piste

5), monocytes/lymphocytes (piste 6). Une expérience représentative parmi 3. Un échantillon

Fig. 53: Détection de l'ARN messager du CD10/NEP dans les cellules

sanguines purifiées

Histogramme représentant les résultats d'une détection de l'ARN messager du CDIO/NEP

dans les cellules polynuclées (granulocytes neutrophiles) et mononuclées

(monocytes/lymphocytes; M-L) obtenues après purification de cellules sanguines à l'aide de

polymorphprep (gradient) ainsi qu'après la culture de ces cellules pendant une nuit à 37°C

TEMPS (h)

Fig. 54: Cinétiques d'expression de l'ARN messager du CD10/NEP en présence

de LPS ou de fMLP en sang total

Les échantillons de sang sont incubés pendant différents temps à 37°C en absence (O) ou en

présence de LPS 0,5 ng/ml (•) ou 10 ng/ml (■) ou de fMLP 10'^ M (A). Après extraction de

l'ARN total, les échantillons sont amplifiés par RT-PCR. Les produits générés sont séparés

sur un gel d'agarose fixé au bromure d'éthidium. Une analyse densitométrique du gel permet

de déterminer la fluorescence de la bande à 513 pb et de la normaliser par rapport à la

A

Photo 4: Détection de TARN messager du CD10/NEP après incubation en sang

total en présence de LPS

Les échantillons de sang sont incubés pendant différents temps à 37°C en absence ou en

présence de LPS 0,5 ng/ml. Après extraction de l'ARN total, les échantillons sont amplifiés

par RT-PCR à 32 cycles (CDIO/NEP) ou 20 cycles (actine). Les produits générés sont

séparés sur un gel d'agarose fixé au bromure d'éthidium.

A: CD10/NEP. Tq (piste 1); 1 h (piste2), 3 h (piste 3), 5 h (piste 4) contrôle; 1 h (piste 5), 3

h (piste 6), 5 h (piste 7) en présence LPS 0,5 ng/ml.

B: p-ACTINE. Tq (piste 1); 1 h (piste2), 3 h (piste 3), 5 h (piste 4) contrôle; 1 h (piste 5), 3

h (piste 6), 5 h (piste 7) en présence de LPS 0,5 ng/ml.

Photo 4 (suite)

C: CD10/NEP; courbe étalon d’ARN total de rein: 0 fig (piste 1); 0,1 pg (piste 2); 0,3 pg

(piste 3);1 pg (piste 4), 3 pg (piste 5).

Résultats

2.2.2. Dans les cellules du sang total

Une expérience typique est illustrée à la photo 4. On observe que les cellules du sang

total, en absence de tout stimulus, expriment TARN messager du CDIO/NEP. Une incubation

des cellules à 37°C pendant des temps allant jusqu'à 5 h montre que la bande demeure

présente à une intensité constante au cours du temps. En présence du stimulus LPS (0,5

ng/ml), on constate que l'intensité de la bande à 513 pb n’est pas augmentée et est comparable

à la fluorescence observée pour la série contrôle sauf pour le temps 5 h où l’intensité diminue.

Pour les stimuli LPS 10 ng/ml et fMLP 10'* M (photo non montrée), l'intensité de la bande

reste également relativement constante au cours du temps (comme le montrent les résultats de

l'analyse densitométrique du gel, Fig. 54). La légère diminution de l'ARN messager qui est

observée reste à être confirmée par un plus grand nombre d'expériences.

En conclusion, les résultats préliminaires de détection de l’ARN messager du

CDIO/NEP par PCR ont permis de montrer que les granulocytes neutrophiles expriment

l'ARN messager du CDIO/NEP mais que son expression n'est pas augmentée suite à une

stimulation par le LPS ou le fMLP. Cependant, des expériences complémentaires seraient

nécessaires avant de conclure à une absence totale d’effet de ces stimuli sur l’expression de

l’ARN messager du CDIO/NEP.

Discussion

V. DISCUSSION GENERALE

1. Augmentation de l’expression de la NEP à la surface

cellulaire des granulocytes neutrophiles induite par le LPS:

rôle du récepteur CD14

N

ous avons montré que le LPS bactérien induit une augmentation rapide de

l’expression du CDIO/NEP à la surface des granulocytes neutrophiles. Cet

effet est significatif malgré la variabilité interindividuelle observée pour les valeurs basales et

stimulées par le LPS. L’augmentation de NEP est observée après incubation des cellules avec

des concentrations de LPS de 0,1 ng/ml, similaires à celles rencontrées dans le plasma des

patients souffrant de septicémie à bactéries Gram-négatives.

Nous avons montré que l'augmentation de CDIO/NEP se produit par interaction directe

du LPS et avec le récepteur CD 14, présent à la surface des granulocytes neutrophiles: en sang

total, l’augmentation du CDIO/NEP qui s’opère en présence de faibles concentrations de LPS

(< 1 ng/ml) est totalement bloquée en présence d’un anticorps anti-CD 14 neutralisant.

L'inhibition incomplète de l'augmentation de l'expression du CDIO/NEP induite par le LPS 10

ng/ml suggère que d'autres récepteurs sont impliqués pour les concentrations plus élevées de

LPS, comme déjà mentionné pour d'autres systèmes expérimentaux (Couturier et al, 1992;

Halling et al, 1992). L'inhibition de l'induction du CDIO/NEP par le LPS à la surface des

granulocytes neutrophiles purifiés en présence d'un anticorps anti-CD 14 démontre que l'effet

du LPS dépend de l'interaction directe avec la molécule de CD 14 présente à la surface des

granulocytes neutrophiles.

Des granulocytes neutrophiles, d'une patiente atteinte d’hémoglobinurie nocturne

paroxystique, déficients en CD 14 ne montrent pas d'augmentation de l'expression du

CDIO/NEP après incubation des cellules avec le LPS 0,5 ng/ml. Cependant à nouveau, à la

dose élevée de 10 ng/ml de LPS, une stimulation proche du maximum est atteinte.

Comme déjà décrit pour le CD14 des monocytes, l'interaction du LPS avec le CD14

des granulocytes neutrophiles induit la production de TNF-a (Haziot et al, 1993),

l'augmentation de l'expression de molécules d'adhérence (Lynn et al, 1991) et de l'adhérence

des granulocytes neutrophiles aux cellules endothéliales in vitro (Worthen et al, 1992). Ce qui

suggère que le CD 14 joue un rôle important dans l'activation des granulocytes neutrophiles

lors d'infection par des bactéries Gram-négatives. Le récepteur CD 14 est impliqué dans les

effets de potentialisation du LPS par le fMLP (Koso et al, 1992).

L'augmentation des molécules de CDIO/NEP à la surface des granulocytes

neutrophiles se fait vraisemblablement par la fusion de vésicules préformées avec la

membrane plasmique des granulocytes neutrophiles. Les granulocytes neutrophiles

renferment différents types de granules intracytoplasmiques parmi lesquels on trouve les

vésicules sécrétoires qui sont im compartiment rapidement mobilisable. Ces vésicules

contiennent notamment la phosphatase alcaline membranaire mais aussi d'autres protéines

dites solubles (Borregaard et al, 1993).

Pour la concentration de LPS de 0,5 ng/ml, l'augmentation de CDIO/NEP est

maximum: les vésicules préformées fusionnent avec la membrane plasmique et l'effet de la

cycloheximide indique, de manière globale et assez paradoxalement, qu'une synthèse

protéique est requise. En ce qui concerne la concentration de 10 ng/ml, l'augmentation de

CDIO/NEP observée ne nécessite pas de synthèse protéique: le récepteur CD 14 n'est pas le

seul récepteur impliqué dans l'augmentation du CDIO/NEP; d'autres récepteurs prennent le

pas sur le récepteur CD 14. Le maintien de l'expression du CDIO/NEP nécessite une synthèse

protéique: une fois les stocks de vésicules préformées épuisés, les nouvelles molécules de

CDIO/NEP exprimées à la surface des cellules pourraient provenir d'une synthèse protéique

de novo.

Nos expériences de RT-PCR ont montré que les granulocytes neutrophiles expriment

TARN messager du CDIO/NEP mais que son expression n’est pas augmentée après

exposition des cellules au LPS ou au fMLP.

La recormaissance du LPS par les granulocytes neutrophiles fait intervenir plusieurs

types de récepteurs (Couturier et al, 1992). Parmi ceux-ci, le mieux connu est le CD 14

recoimaissant le complexe formé par le LPS et la protéine plasmatique appelée LPS binding

protein (LBP). Après la fixation du complexe LPS-LBP sur le récepteur CD 14, la voie de

transduction du signal intracellulaire est peu connue. La molécule CD 14 est attachée à la

membrane plasmique des granulocytes neutrophiles par un lien glycosylphosphatidylinositol

et ne possède pas de portion intracytoplasmique. La transmission du signal d’activation

cellulaire dépend probablement de l’association physique entre le CD 14 et une tyrosine kinase

Discussion

appelée p53/56|yn. Ces tyrosines kinases jouent un rôle central dans les mécanismes

d’activation cellulaire en stimulant la voie dite des « mitogen-activated protein » (MAP)

kinases. La transmission du signal au travers de cette voie dépend de l’activation en cascade

de plusieurs kinases phosphorylant les résidus sérine, thréonine et tyrosine et menant à

l’activation des MAP kinases elles-mêmes. Ces MAP kinases phosphorylent des résidus

sérine et thréonine d’un grand nombre de substrats, notamment des facteurs de transcription

(c-jun, myc, ...), des facteurs impliqués dans la traduction d’ARN messagers, d’autres

molécules transmettant des signaux intracellulaires (rsk) ou des enzymes (phospholipases A2).

La réponse des granulocytes neutrophiles aux stimuli extérieurs a été souvent

modélisée à la réponse induite par les chimioattractants comme le peptide fMLP. La liaison

du fMLP à son récepteur ancré dans la membrane plasmique des granulocytes neutrophiles via

sept segments transmembranaires, induit une cascade d’événements intracellulaires qui ont été

partiellement décrits. Les étapes importantes dans la transduction du signal comprennent

l'activation de Ras-dépendant kinases (Raf et MEKK) qui phosphorylent et activent les

MAP/ERK kinases (MEK-1 et MEK-2) qui, à leur tour, activent (par phosphorylation sur

tyrosine et thréonine) les ERK-1 et ERK-2 MAP kinases (p42 et p44 MAP kinases). Le

résultat final de l'activation des granulocytes neutrophiles par le fMLP inclut une large série

de réponses fonctionnelles comme la migration, l'explosion respiratoire, la libération des

enzymes des granules, l'assemblage des filaments d'actine, l'adhérence, l'influx de calcium.

Contrairement à la stimulation par les chimioattractants, l’activation des granulocytes

neutrophiles par le LPS possède un répertoire de réponses fonctionnelles plus limitées:

l'assemblage des filaments d'actine, l'adhérence, la capacité de potentialiser certaines réponses

sécrétoires en réaction à des autres stimuli, mais pas d'influx de calcium, de migration,

d'explosion respiratoire ni de libération d'enzymes des granules. Les différences de réponses

des granulocytes neutrophiles observées pour le LPS et celles induites par le fMLP indiquent

que les voies de transduction du signal sont différentes (Nick et al, 1996).

2. Augmentation de la NEP à la surface des granulocytes

neutrophiles par les cytokines pro-inflammatoires

Parmi les cytokines sécrétées lors des réactions inflammatoires, le TNF-a est celle qui

apparaît en premier. Nous avons testé son implication dans l’augmentation de CDIO/NEP

observée en sang total. Nous avons mis en évidence que le TNF-a et l’IL-8 augmentent

toutes les deux l’expression du CDIO/NEP alors que l’IL-ip à une concentration de 50 ng/ml

a un effet marginal sur l’expression du CDIO/NEP, dans les conditions testées. Des

expériences réalisées avec un anticorps anti-TNF-a montrent cependant qu'il ne joue pas un

rôle déterminant dans l’augmentation de CDIO/NEP observée.

Connelly et al, en 1993 ont montré que l'IL-la, l'IL-6, l'IL-8, le « granulocyte colony-

stimulating factor » (G-CSF) ou le « granulocyte-macrophage colony-stimulating factor »

(GM-CSF) induisent une augmentation de la NEP à la surface des granulocytes neutrophiles

purifiés. La cytokine GM-CSF est sans conteste celle qui provoque la plus forte

augmentation. L’induction de l'activité NEP est de 225% par rapport à la valeur contrôle. De

plus, les auteurs montrent que l'IL-1 potentialise l'effet du GM-CSF (Connelly et al, 1993).

Dans ce travail, l’activité enzymatique NEP est mesurée après incubation des granulocytes

neutrophiles purifiés pendant 1 h à 37°C avec les cytokines. L’augmentation de l’activité

NEP observée est exprimée en % de la valeur contrôle. Ainsi, les auteurs observent un faible

effet de l’IL-1 sur l’activité enzymatique NEP, pour la gamme de concentrations 10'^ à 10’*

M. Ceci est en accord avec ce que nous avons observé dans notre modèle en sang total. Pour

riL-8, les auteurs n’observent pas d’augmentation de NEP pour la même gamme de

• -9 -8

concentrations (10 à 10 M) alors que nous avons mesuré une augmentation très transitoire

de la quantité de NEP avec un maximum à 30 min.

Les granulocytes neutrophiles ont longtemps été caractérisés comme des cellules ayant

perdu la capacité de faire de la synthèse protéique. En fait, la plupart des protéines contenues

dans les granules sont synthétisées pendant la période durant laquelle les cellules maturent

dans la moelle osseuse. Récemment, plusieurs chercheurs ont montré que les granulocytes

neutrophiles matures sont capables de produire certaines protéines comme l’IL-la, l’IL-ip,

l’IL-6, riFN-a et le TNF-a (Cassatella et al, 1995). Les granulocytes neutrophiles (et les

monocytes) stimulés par le LPS, le TNF-a ou l’IL-lp sécrètent aussi de l’IL-8 (Fujishima et

al, 1993), cytokine capable de stimuler le chimiotactisme des neutrophiles.

Discussion

Ceci suggère que les cytokines libérées au niveau des sites inflammatoires peuvent

réguler la réponse des neutrophiles localement et attirer des leucocytes supplémentaires au

niveau de ces sites.

3. Conséquences physiologiques d'une augmentation de la

NEP sur la dégradation de peptides pro-inflammatoires

Les cytokines sont les médiateurs les plus étudiés dans la pathologie du choc septique.

Cependant, d’autres molécules médiatrices jouent également un rôle important dans la

physiopathologie de la septicémie: c’est le cas des peptides pro-inflammatoires. Nous avons

cherché à mettre en évidence une augmentation de la dégradation de deux peptides en

l'occurrence le fMLP, pour lequel un effet chimioattractif sur les granulocytes neutrophiles est

connu, et l'endothéline-1 (ET-1) qui est augmentée lors du choc septique.

Dans nos expériences, nous avons utilisé un analogue du fMLP (fNle-Leu-Phe-Nle-

Tyr-Lys) qui possède une tyrosine dans sa séquence et peut donc être marqué à l'iode 125. Le

peptide radiomarqué est utilisé comme traceur et mis au contact de suspensions de cellules

sanguines préalablement incubées avec le LPS. Bien que l'analyse par cytométrie de flux et le

dosage de l'activité enzymatique NEP ont confirmé une augmentation du nombre de

molécules de NEP biologiquement actives, à la surface des granulocytes neutrophiles, nous

n'avons pas pu mettre en évidence une augmentation de la dégradation de ce peptide par la

NEP. D'autres enzymes telles des aminopeptidases ou des carboxypeptidases dégradent le

peptide et masquent la dégradation par la NEP qu'on souhaite étudier. A cette occasion, il est

bon de souligner que le substrat Succinyl-Ala-Ala-Phe-AMC utilisé lors du dosage de

l'activité enzymatique NEP (sur des suspensions de cellules sanguines stimulées ou non par le

LPS) possède à la fois des protections contre l'action des aminopeptidases (partie N-terminale

succinylée) et des carboxypeptidases (partie C-terminale portant le groupe AMC).

Des taux élevés d'ET-1 circulante sont détectés chez les patients atteints de choc

septique. Ils peuvent être corrélés positivement avec la sévérité du choc. Les principaux

effets de l'ET-1 s’opèrent essentiellement au niveau local de manière paracrine et autocrine.

Ainsi, les concentrations d'ET-1 mesurées dans les plasmas ne sont pas le reflet de celles

atteintes au niveau local. L’ET-1 pourrait jouer un rôle important dans la physiopathologie du

syndrome MODS (« multiple organ dysfonction syndrome ») associé au choc septique. Elle

pourrait accélérer la défaillance des organes vitaux par vasoconstriction locale des vaisseaux

sanguins qui irriguent les organes et induire un état d’hypoxie.

Plusieurs études de différents laboratoires montrent un effet significatif de l'ET-l sur

les granulocytes neutrophiles en augmentant: l'agrégation des granulocytes neutrophiles

(Gômez-Garre et al, 1992), l'expression du CDllb/GD18 à la surface des granulocytes

neutrophiles (Lôpez Farré et al, 1993) et le chimiotactisme (Wright et al, 1994). L’effet

chimiotactique de l’ET-l dépendrait de la mobilisation de calcium contenu dans des stocks

intracellulaires et serait médié par le récepteur à l’endothéline de type ET^. (Elferink et al,

1994). L’ET-l n’induit pas la libération des enzymes des granules des cellules (Elferink et al,

1994). Elle n'induit pas non plus l'explosion respiratoire des granulocytes neutrophiles mais

elle potentialise celle induite par le peptide fMLP (Ishida et al, 1990).

Pour notre part, nous avons montré que l’induction de la NEP à la surface des

granulocytes neutrophiles par le LPS a im effet sur la dégradation de l'ET-l : la production du

métabolite Val-Tyr est augmentée de 21%. L’enzyme permettrait de réguler les

concentrations d’ET-1, peptide potentiellement toxique.

Des chercheurs ont également étudié d’autres peptides comme la substance P et la

somatostatine. Ce sont des peptides qui sont stockés dans les granules sécrétoires des

neurones sensoriels et sont libérés après stimulation axonale. La substance P augmente la

perméabilité microvasculaire et a un effet direct sur les granulocytes neutrophiles en induisant

le chimiotactisme, en potentialisant la phagocytose, en stimulant l’explosion respiratoire et la

dégranulation. La substance P stimule directement la libération de la cytokine chimiotactique

IL-8 (Serra et al, 1994) et augmente l’adhésion des granulocytes neutrophiles aux cellules

épithéliales bronchiques (DeRose et al, 1994). La somatostatine n’active pas les granulocytes

neutrophiles. Cependant, elle inhibe le chimiotactisme des granulocytes neutrophiles et

l’activité GTPase provoquée par la substance P mais pas par le fMLP. La substance P peut

stimuler le chimiotactisme probablement par les effets d’une « GTP-binding protein »

distincte de celle ciblée par le fMLP. La somatostatine se comporte comme un antagoniste de

la substance P (Kolasinski et al, 1992). L’angiotensine III exerce également un effet

chimioattractif sur les granulocytes neutrophiles mais aucun effet de potentialisation du

chimiotactisme n’a été observé lorsque le peptide est mis en présence de fMLP (Yamamoto et

al, 1993).

Lumière vasculaire (SANG)

Endotoxine

CD11a Big ET-1

Adhérence apa apn

Big ET-1 —► ET-1

fMLP

ET-1

Chimiotactisme

LBP ^{Substance P}

Met-enképhaiine

Explosion

respiratoire

f^ANP

BK

dégradée

NEP

APN

enzymes des

granules

Fig. 55: Représentation schématique d'un granuiocyte neutrophiie en

interaction avec les médiateurs peptidiques lors du choc septique

La présence de récepteurs spécifiques a été montrée en ce qui concerne l'a-MSH; pour les

autres peptides leur présence est suggérée par les expériences.

Le peptide ANP (« atrial natriuretic peptide ») a également un effet chimioattractif sur

les granulocytes neutrophiles (Elferink et al, 1995). L’ANP potentialise l’explosion

respiratoire et la libération d’enzymes lysosomiaux. Une incubation d’ANP radiomarqué avec

du sang total ou une suspension de cellules sanguines permet de mettre en évidence les

métabolites générés par la NEP, présente à la surface des granulocytes neutrophiles (Nortier et

al, 1995). L’inhibition de la NEP à la surface des granulocytes neutrophiles permet

d’augmenter les taux d’ANP et BNP (« brain natriuretic peptide ») pour lesquels il est connu

qu'ils jouent un rôle protecteur important vis-à-vis des lésions endothéliales au cours de

l’infarctus du myocarde (Matsumura et al, 1996).

Récemment, Catania et al (en 1996), a découvert que le peptide a-MSH (« a-

melanocyte stimulating hormone ») exerce des effets anti-inflammatoires en inhibant la

migration des granulocytes neutrophiles vers les sites d’infection. L’a-MSH inhibe le

développement du syndrome de l’ARDS (« adult respiratory distress syndrome »; associé au

choc septique) chez le rat, après injection d’endotoxines (Catania et al, 1996). Dans cette

complication du choc septique, les concentrations de NEP sérique sont 50 à 60 fois plus

élevées que celles mesurées chez les sujets normaux (Johnson et al, 1985). Cependant, il est

difficile de corréler ces concentrations sériques à celles mesurées à la surface des granulocytes

neutrophiles.

L'effet sur d'autres peptides et plus particulièrement la bradykinine (BK) devrait être

exploré car celle-ci est également un substrat de la NEP et certains récepteurs à la BK sont

induit in vivo sous l'action du LPS (Nicolau et al, 1996).

Un schéma reprend les interactions des différents peptides avec les granulocytes

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