Le canal calcique Orai1 : nouvel acteur impliqué dans la physiopathologie cardiaque

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Le canal calcique Orai1 : nouvel acteur impliqué dans la

physiopathologie cardiaque

Fiona Bartoli

To cite this version:

Fiona Bartoli. Le canal calcique Orai1 : nouvel acteur impliqué dans la physiopathologie cardiaque. Cardiologie et système cardiovasculaire. Université Paris Saclay (COmUE), 2018. Français. �NNT : 2018SACLS027�. �tel-02887083�

Le canal calcique Orai1 :

nouvel acteur impliqué dans la

physiopathologie cardiaque

Thèse de doctorat de l'Université Paris-Saclay préparée à l’Université Paris-Sud

École doctorale n°569

Innovation thérapeutique : du fondamental à l’appliqué (ITFA) Spécialité de doctorat: Physiopathologie moléculaire et cellulaire

Thèse présentée et soutenue à Châtenay-Malabry, le 29 janvier 2018, par

Fiona Bartoli

Composition du Jury : Imad Kansau

Professeur des Universités, HDR Président Université Paris-Sud (EA 4043)

Nathalie Neyroud

Chargé de recherche INSERM, HDR Rapporteur UPMC (UMR-S 1166)

Bruno Constantin

Directeur de recherche CNRS, HDR Rapporteur Université Poitiers (CNRS ERL 7368)

Marie Potier-Cartereau

Maitre de Conférences, Examinateur Université Tours (UMR 1069)

Romain Guinamard

Professeur des Universités, HDR Examinateur Université Caen (EA 4650)

Jean-Pierre Benitah

Directeur de recherche INSERM, HDR Directeur de thèse Université Paris-Sud (UMR-S 1180)

Jessica Sabourin

Maitre de Conférences, Co-Encadrante de thèse Université Paris-Sud (UMR-S 1180)

NNT : 2 0 1 8 S A CL S 0 2 7

REMERCIEMENTS

Je tiens en premier lieux à remercier les membres du jury pour s’être intéressés à mes travaux. Je remercie le Pr Imad Kansau d’avoir accepté de présider ce jury, le Dr Bruno Constantin et le Dr Nathalie Neyroud d’avoir accepté d’évaluer mes travaux de thèse en tant que rapporteurs ainsi que le Dr Marie Potier-Cartereau et le Pr Romain Guinamard d’avoir participé à ce jury en qualité d’examinateurs.

Je tiens ensuite à exprimer ma gratitude à Rodolphe Fischmeister de m’avoir accueillie initialement à l’U769 et à Ana Maria Gomez de m’avoir accueillie et gardée dans son équipe depuis mon stage de master 1. Merci à mes deux directeurs de thèse, Jean-Pierre Benitah et Jessica Sabourin, d’avoir accepté de m’encadrer durant 3 ans. Merci Jean-Pierre pour tes remarques et conseils constructifs m’ayant fait évoluer scientifiquement, du moins je l’espère. Merci également d’avoir toujours trouvé le temps de patcher pour mon projet. Merci Jessica d’avoir géré le plus gros de mon encadrement, d’avoir toujours été disponible, malgré un emploi du temps de ministre et/ou des enseignements tous les jours et/ou un congé mat’. Merci d’avoir pris le temps de m’apprendre toutes les techniques nécessaires à ma thèse et d’avoir énormément manipé pour faire avancer le projet au mieux. Merci pour toutes les discussions scientifiques, tout le temps passé sur mes travaux oraux/écrits dans le but de me faire progresser. Merci de m’avoir fait confiance pour présenter de nombreuses fois nos travaux dans divers congrès nationaux et internationaux, mais également pour tous les moments « off » à ces congrès Merci d’avoir renoncé à me faire arriver au labo aussi tôt que toi, je marcherais probablement sur mes cernes à l’heure qu’il est. Et surtout merci de m’avoir transmis la passion des canaux ioniques un peu différents/compliqués.

Je remercie également toutes les personnes de l’équipe 3 et notamment tout ceux qui se sont intéressés de près ou de loin à mon projet. Un grand merci à toutes les personnes qui m’ont apporté leur aide technique tout au long de mon parcours au laboratoire et notamment à Florence Lefebvre pour m’avoir enseigné l’art de la dissos’, pour avoir fait toutes mes souris parce que c’est quand même vachement mieux quand c’est toi qui les fait, merci de m’avoir supportée de longues heures en pièce de dissos’ avec toi, tôt le matin, avec un air surement pas aimable, merci de n’être jamais partie en courant quand tu me voyais débarquer dans ton bureau pour te coller 4 dissos’ pour la veuille. Merci d’avoir toujours été là quand j’avais des problèmes, parce que sans toi, je serais encore à l’animalerie en train d’essayer de TACquer une souris (sans succès évidemment, malgré une chirurgie facile et reproductible, mouahaha prove it !). Un grand merci à Philippe Matéo pour les nombreuses échographies faites pour moi, pour toutes les TAC que tu faisais si bien. Evidemment, ton départ pour cet autre laboratoire restera un des plus grands drames de ma thèse. Merci à Susana Gomez d’avoir repris les échos quand Jessica était en congés mat’. Merci à Patrick Lechêne d’être toujours disponible quand on est en galère informatique. Merci pour GraphPad (non j’déconne). Merci à Françoise Boussac, notre maman du labo, malheureusement à la retraite, pour avoir toujours rattrapé mes boulettes de commandes et pour nous avoir facilités la vie à un point qu’on n’imaginait pas. Merci à Sophie Seuron sans qui tout serait plus compliqué également. Un énorme merci aux « filles de l’animalerie », merci à Valérie Domergue, Julie Burlot, Pauline Robert et Ayma Galland pour tout ce que vous avez fait pour moi pendant plus de 3 ans. Merci pour votre bonne humeur, votre gentillesse et votre professionnalisme. Merci de vous être occupées de mes bébés et d’avoir massé des « fesses de souris » tous les jours, pendant des mois pour me faciliter la vie. Vous faites ça magnifiquement bien, c’est un vrai don. Merci à Claudine Deloménie pour son aide à la plateforme de qPCR. Merci à l’U999, Catherine Rucker-Martin pour les mesures de fibrose et pour votre gentillesse hors pair, et Fabrice Antigny pour m’avoir « chaudement » accueillie au microscope de son laboratoire, pour ta gentillesse également, pour les bons moments passés à LA et pour tes « idées tatouage » plus que litigieuses.

Merci, merci, merci à tous les copains du labo, sans qui ma vie aurait été bien plus triste. Je me dois « au jour d’aujourd’hui » de vous remercier même si je ne suis pas très douée pour ça... Merci de m’avoir soutenue et de m’avoir supportée surtout. Merci Marion Barthé, ma grôsse taûpe rôse, d’avoir été là quand ça n’allait pas, quand ça allait aussi, quand j’avais besoin d’un compagnon de flemme pour faire la sangsue alitée. Merci pour tous les apéros, repas, karaokés et j’en passe. Merci d’avoir illuminé mes journées par tant de vêtements/accessoires dont j’ignorais l’existence, ton sac en faûx crôcô, ton manteau yéti, ton pull cabillaud, ton autre pull boule-à-facette vont clairement me manquer. Merci d’avoir réveillée en moi la passion de Céline Dion. Merci pour tout, tout, tout est … ♫ Un grand merci à Marine Gandon de la Gandonnerie de la Gandonnette alias Gandoon the rolling raccoon (qu’est-ce qu’il y a ? t’as jamais vu un gros papillon ?!), déjà d’être toi, parce que c’est déjà beaucoup et parce que si tu n’étais pas là, ça serait quand même vachement moins drôle et nous serions tous perdus car oui, tu es une (grand) mère pour nous. Merci pour tous les gâteaux (bios) que tu m’as donné gracieusement (enfin avec les intérêts quand même, n’abusons pas), pour le stand d’aromathérapie dans le Burex, pour m’avoir refourgué tes tisanes « nuits calmes », pour que je dorme un peu, pour être toujours aux petits soins et surtout ne jamais te mêler de ton c**. Je te souhaite bon courage pour ta gamme BSA à l’avenir (si tu as un souci n’hésites pas à demander à Delphine, la biomol’ c’est son rayon). Merci Aurélia (dinde!) pour mon audition qui a baissée au moins de moitié depuis mon arrivée au Burex et pour mes acouphènes permanents mais surtout pour tous les moments de rigolade avec toi, corrélant de manière quasi-parfaite avec l’apparition de mes migraines. J’espère que ta jalousie envers ma capacité à déambuler gracieusement en talons ne te rongera pas trop. Merci Delphine Mika(kaka) pour tes claquettes à paillettes déjà (oui je sais à la base c’était tes claquettes okay ?!), grâce à toi j’ai pu enfin être mi-sexy et mi-humiliée en même temps, ce qui est assez exceptionnel finalement. Merci pour t’être occupée de Fluor maintes et maintes fois et toujours parfaitement bien, merci pour tous tes mots d’amour que j’ai du obligatoirement afficher dans mon bureau sous peine de ne plus être ta préférée et qu’on ne soit plus amies pour la vie. (Pas) merci d’avoir essayé tant bien que mal de me faire des câlins intempestifs, ça a amélioré mes réflexes d’auto-défense. Mais quoi qu’il en soit : DM4Ever. Ah oui et j’espère aussi qu’avec le temps tu arriveras à génotyper correctement tes souris en moins de 3 essais. Merci à Carole Deflers, la petite dernière du Burex, pour les nombreuses conversations démarrant par « Je peux poser une question ? ». J’espère que tu réaliseras ton rêve d’être bergère à Denfert Rochereau (peut-être même avec « l’amour de ta vie » qui sait !). Merci à Félix Peyré d’être à la foi extrêmement drôle et extrêmement à l’ouest (Nadine Blanchard ?), merci Audrey Ridoux pour ta bonne humeur qu’on entend de loin (allez muve maintenant) et merci Marti pour le vol manifeste de mon Tris HCl. Merci à toutes les autres personnes qui m’ont aidé aussi bien techniquement que psychologiquement.

Je tenais également à remercier le Pr David Beech pour notre collaboration, pour tous ses compliments, son soutien et pour m’offrir l’opportunité d’effectuer mon post-doc’ dans son laboratoire.

Merci aux autres copains ; Camille, Mathieu, Ley, Jérôme, Antoine, Perrin ; d’être toujours là même si on ne se voit plus aussi souvent qu’avant. Les week-ends avec vous redonnent toujours le sourire. Merci à Benji pour le soutien téléphonique régulier.

Merci également à ma famille qui m’a permis d’en arriver où je suis aujourd’hui. J’ai évidemment une pensée particulière pour mon père Pascal et mon frère Cyr-Nicolas, j’espère que de là où vous êtes, vous serez fiers de moi. Merci à ma mère Astrid, mon frère Julien, ma belle sœur Anna et les petits Bartoli Nolan et Célia pour leur soutien et leurs encouragements.

Un grand merci à mes voisins et aux ouvriers roumains/polonais de m’avoir maintenue éveillée jour et nuit pour que je puisse rédiger ma thèse. Merci également à Régis d’avoir vidé mon compte en banque tout en me faisant croire que j’étais d’accord. Merci à Fluor de m’avoir fait me sentir moins seule à Châtenay et d’être toujours heureux de me voir, flou certes mais quand même.

Je finirais ces remerciements par la personne qui compte le plus pour moi, ma moitié, qui m’a soutenue et écoutée quand je voulais tout abandonner pour élever des chèvres dans le Larzac ou des capybaras au Pérou. Merci d’avoir rendue ma thèse plus supportable, de me donner confiance en moi, de m’encourager et d’être là malgré la distance, distance dont on se débarrassera très bientôt.

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Le système de conduction cardiaque

Figure 2 : Le couplage excitation-contraction cardiaque Figure 3 : La progression naturelle de l’IC

Figure 4 : Voies d’activation de la CaMKII

Figure 5 : Impact de la voie de signalisation CaMKII/HDAC dans l’hypertrophie et l’IC Figure 6 : Impact de la voie de signalisation CaN/NFAT dans l’hypertrophie et l’IC Figure 7 : Arbre phylogénétique de la famille des canaux TRP

Figure 8 : Structure des canaux TRPC Figure 9 : Structure des protéines Orai1-3

Figure 10 : Association des protéines Orai1 et Orai3 pour former les canaux ARC Figure 11 : Structure des protéines STIM1 et STIM2

Figure 12 : Modes d’activation possibles des canaux ARC Figure 13 : Propriétés électrophysiologiques du courant ICRAC

Figure 14 : Mesure d’entrée SOC dans des cardiomyocytes de rats nouveau-nés Figure 15 : Mesure d’entrée SOC dans des cardiomyocytes de rats adultes Figure 16 : Localisation d’Orai1 dans des cardiomyocytes de souris adultes

Figure 17 : Formation de punctae de STIM1 près de la membrane plasmique après déplétion des

stocks intracellulaires de Ca2+

Figure 18 : Activation des canaux SOC par la déplétion en Ca2+ du RS dans des cardiomyocytes adultes

Figure 19 : L’inhibition d’Orai1 par knock-down (KD) abolit l’entrée SOC et diminue les niveaux

calciques basaux

Figure 20 : Signalisation dépendante de TRPC1 dans les cardiomyocytes

Figure 21 : Signalisation dépendante de TRPC3 et TRPC6 dans les cardiomyocytes Figure 22 : Signalisation dépendante de TRPC4 dans les cardiomyocytes

Figure 23 : Inhibition de l’hypertrophie cellulaire par knock-down (KD) d’Orai1 et de STIM1 Figure 24 : Fonction cardiaque de souris KO Orai1-/+ soumises à une surcharge de pression induite par constriction de l’aorte transverse, mesurée par échocardiographie

Figure 25 : Schéma illustrant la localisation et le rôle potentiel de la machinerie SOC dans les

cardiomyocytes

Figure 26 : Signalisation dépendante de la voie aldostérone/SGK1

Figure 27 : Génération des souris double transgéniques dn-Orai1R91W/tTA

Figure 28 : Chirurgie de constriction de l’aorte transverse Figure 29 : Spectres d’excitation et d’émission du Fura-2

Figure 30 : Dispositif expérimental de microscopie à fluorescence Figure 31 : Dispositif expérimental de microscopie confocale

Figure 32 : Profil du gel de génotypage des souris contrôles et transgéniques dn-Orai1R91W/tTA

Figure 33 : Coloration X-gal de cardiomyocytes ventriculaires isolés provenant de souris WT et

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1 : La classification fonctionnelle des cardiopathies selon la NYHA

Tableau 2 : Modifications d’expression des différents membres des canaux SOCs dans le cœur

insuffisant humain

Tableau 3 : Composition des solutions utilisées pour l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires

de souris adultes

Tableau 4 : Composition des solutions utilisées pour l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires

de rats adultes

Tableau 5 : Composition des solutions utilisées pour l’isolement des cardiomyocytes de rats

nouveau-nés

Tableau 6 : Composition des milieux utilisés pour la culture des cardiomyocytes de rats

nouveau-nés

Tableau 7 : Composition des gels de WB

Tableau 8 : Liste des anticorps utilisés pour le WB Tableau 9 : Liste des amorces utilisées pour la RT-qPCR

RESUME

Alors que l’entrée SOC (store-operated Ca2+

entry) portée par les canaux calciques TRPCs (transient receptor potential canonical) et Orai1 est essentielle dans les cellules non-excitables, son

rôle physiologique dans les cardiomyocytes adultes reste à élucider. Néanmoins, il est largement admis qu’une entrée SOC exacerbée dépendante des canaux TRPCs et de la protéine régulatrice STIM1 participe à la pathogenèse de l’hypertrophie et de l’insuffisance cardiaque (IC) par induction de voies pro-hypertrophiques telles que la CaMKII (Ca2+/calmoduline-dépendante kinase II ) et la calcineurine (CaN)/NFAT (Nuclear factor of activated T-cells). Au contraire, une inhibition fonctionnelle ou une extinction génique des canaux TRPCs et de la protéine STIM1 serait cardioprotectrice contre le stress hypertrophique. Cependant, le rôle physiopathologique des canaux calciques Orai1 dans le cœur reste, à ce jour, méconnu et débattu puisque son extinction in vitro présente un effet bénéfique contre l’hypertrophie des cardiomyocytes alors que son extinction in

vivo présente des effets délétères avec le développement d’une cardiomyopathie dilatée. De plus

amples investigations quant au rôle d’Orai1 dans la physiopathologie cardiaque apparaissent donc primordiales. De ce fait, les objectifs de ma thèse sont d’explorer le rôle de la signalisation calcique dépendante d’Orai1 dans le cœur dans des conditions physiologiques et pathologiques grâce à un modèle de souris transgéniques exprimant un mutant non fonctionnel d’Orai1, spécifiquement dans le cœur (dn-Orai1R91W_{/tTa) et un inhibiteur pharmacologique sélectif, le JPIII. Tout d’abord, nous}

montrons que les souris dn-Orai1R91W/tTa présentent une fonction cardiaque normale et une homéostasie calcique impliquée dans le couplage excitation-contraction conservée suggérant qu’Orai1 n’a pas de rôle majeur dans le coeur adulte en condition physiologique. Cependant, nous avons démontré une augmentation de l’expression et de l’activité d’Orai1 dans un modèle murin d’hypertrophie cardiaque induite par surcharge de pression, qui serait délétère pour la fonction ventriculaire. Au contraire, l’inhibition fonctionnelle d’Orai1 par manipulation génétique ou par l’outil pharmacologique (JPIII) semble protéger le coeur des dysfonctions ventriculaires au cours de l’hypertrophie. Cet effet bénéfique passerait par une restauration de l’homéostasie calcique et notamment par un maintien de l’expression de la pompe ATPase SERCA2a. Nous avons également mis en évidence que la voie de l’aldostérone/récepteurs aux minéralocorticoïdes modulait l’expression des canaux TRPC1, -C4, -C5 et notamment Orai1 via la protéine SGK1 (Serum and

Glucocorticoid-regulated Kinase 1) dans les cardiomyocytes ventriculaires de rat nouveaux-nés.

L’activation de cette voie de signalisation pourrait être à l’origine de la surexpression des canaux TRPCs/Orai1 retrouvée au cours de l’hypertrophie cardiaque. Ces travaux décrivent donc Orai1 comme une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l’hypertrophie cardiaque et de l’IC.

ABSTRACT

While the SOCE (store-operated Ca2+ entry), carried by TRPCs (transient receptor potential canonical) and Orai1 channels, is essential in non-excitable cells, its physiological role in adult cardiomyocytes remains elusive. Nevertheless, it is well established that exacerbated TRPCs/STIM1-dependent Ca2+ entry participates in the pathogenesis of hypertrophy and heart failure (HF) via the induction of pro-hypertrophic signaling pathways, such as CaMKII (Ca2+/calmodulin-kinase II) and calcineurin (CaN)/ NFAT (nuclear factor of activated T-cells). By contrast, functional inhibition or gene silencing of TRPCs and STIM1 is cardioprotective against hypertrophic insults. As for Orai1 Ca2+ channels, their pathophysiological roles in the heart remain unknown and under debate, since in vitro Orai1 silencing has a beneficial effect against cardiomyocyte hypertrophy, whereas in vivo silencing has deleterious effects with the development of dilated cardiomyopathy. Further investigations are necessary to determine the pathophysiological role of Orai1 in the heart. My thesis objectives are to explore the role of Orai1-dependent Ca2+ signaling in the heart under physiological and pathological conditions using a transgenic mouse model expressing a non functional mutant of Orai1, specifically in the heart (dn-Orai1R91W/tTa) and a selective pharmacological inhibitor, JPIII. First, we showed that dn-Orai1R91W/tTa mice have normal cardiac function and conserved Ca2+ homeostasis involved in the excitation-contraction coupling suggesting that Orai1 is not instrumental in regulating cardiac function under physiological conditions. However, we demonstrated an increased Orai1 expression and activity in a mouse model of cardiac hypertrophy induced by pressure overload, which is a maladaptive alteration involved in pathological ventricular dysfunction. By contrast, functional inhibition of Orai1 by genetic manipulation or by the pharmacological tool (JPIII) protects the heart from ventricular dysfunction after pressure overload-induced cardiac hypertrophy. This beneficial effect is related to a restoration of Ca2+ homeostasis and more specifically, is due to preserved ATPase SERCA2a pump expression. We also showed that the aldosterone/mineralocorticoid receptor signaling pathway modulates the expression of TRPC1, -C4, -C5 channels and also the Orai1 channels expression via the SGK1 (Serum and Glucocorticoid-regulated Kinase 1) protein, in neonatal rat ventricular cardiomyocytes. The activation of this signaling pathway could be the cause of the TRPCs/Orai1 channels overexpression found during cardiac hypertrophy. In conclusion, our studies highlighted that Orai1 Ca2+ channels could constitute potential therapeutic target in the treatment of cardiac hypertrophy and HF.

LISTE DES ABREVIATIONS

[Ca2+]i : Concentration intracellulaire en calcium

2-APB : 2-aminoethoxydiphenyl borate 5-HT2A : 5-hydroxytryptamine receptor 2A AA : Acide arachidonique

AAV : Adeno-associated virus

AEBSF HCl : 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride AF : Fibrillations atriales

AID : Auto inhibitory domain AM : Acétoxyméthylesther

AMPc : Adénosine monophosphate cyclique Ang-II : Angiotensine II

ANP : Atrial natriuretic peptide AP-1 : Activator protein 1

ARA II : Bloqueur des récepteurs de l’angiotensine II ARCs : Arachidonate-regulated calcium channels

ARM : Antagoniste des récepteurs aux minéralocorticoïdes ARNm : Acides ribonucléiques messagers

AT1 : Récepteurs de l’angiotensine II de type 1 ATP : Adénosine triphosphate

AVC : Accident vasculaire cérébral Ba2+ : Baryum

BCA : Bicinchoninic acid assay Bcl2 : B cell lymphoma 2 BNP : Brain natriuretic peptide BSA : Bovine serum albumine Ca2+ : Calcium

CaM : Calmoduline

CaMKII : Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II CaMKIV : Calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV CaN : Calcineurine

CC : Coiled-Coil

CDK1 : Cyclin dependent kinase 1 CEC : Couplage excitation-contraction CET : Couplage excitation-transcription

CHOP : CCAAT-enhancer-binding- protein homologous protein CICR : Calcium induced-calcium release

CIRB : Calmodulin IP3 receptor binding domain

CMV : Cytomegalovirus CPA : Acide cyclopiazonique

CRAC : Calcium release-activated calcium channels

CRACR2A : Calcium release activated channel regulator 2A Cs+ : Césium

CT : Cycle threshold

DAD : Delayed after depolarizations DAG : Diacylglycérol

DCM : Dilated cardiomyopathy DMSO : Dimethylsulfoxyde dNTP : Désoxyribonucléotide DOC : Sodium deoxycholate

DOCA : Deoxycorticosterone acetate

Domaine EF : Domaine hélice-boucle-hélice de liaison au calcium DTT : Dithiothreitol

E2 : 17β-oestradiol

EAD : Early after depolraizations ECG : Electrocardiogramme

EGTA : Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N’, N’-tetraacetic acid ENaC : Epithalial sodium channel

Epac : Exchange protein directly activated by cAMP ERK1/2 : Extracellular signal regulated kinases 1 and 2 ERM : Ezrin/radixin/moesin

ERp57 : ER-resident oxidoreductase ET-1 : Endothéline 1

FE : Fraction d’éjection

FKBP : FK506 binding protein

FRET : Fluorescence resonance energy transfer FSGS : Glomérulosclérose segmentaire focale GATA-4 : GATA transcription factor-4 Gd3+ : Gadolinium

GFP : Green Fluorescent Protein

GMPc : Guanosine monophosphate cyclique GRE : Glucocorticoïd response element HCM : Hypertrophic cardiomyopathy

HCN4 : K+/Na+ hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4

HDACs : Histones désacétylases

HEK293 : Human embryonic kidney cells 293

hESC-CM : Cardiomyocytes dérivés de cellules souches embryonnaires humaines HFpEF : Heart failure with preserved ejection fraction

HFrEF : Heart failure with reduced ejection fraction HRE : Hormone response element

HRP : Horseadish peroxydase I/R : Ischémie/reperfusion IC : Insuffisance cardiaque

ICa,L : Courant médié par les LTCCs

ICRAC : Courant médié par les canaux CRAC

IEC : Inhibiteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine IP3 : Inositol triphosphate

IRE1 : Inositol-requiring enzyme 1

ISOC : Courant médié par les canaux SOCs

JNK : c-Jun N-terminal kinase K+ : Potassium

KO : Knock-out

l’EBV : Epstein-barr virus La3+ : Lanthane

LTCCs : L-type calcium channels MEF-2 : Myocyte enhancer factor-2 MetS : Syndrome métabolique miRNA : micro-ARN

Mn2+ : Manganèse

mSTIM1 : STIM1 membranaire Na+ : Sodium

NCS : Newborn calf serum

Nedd4-2 : Neuronal precursor cells expressed developmentally down-regulated NFAT : Nuclear factor of activated T cells

NF-κB : Nuclear factor-κB

NHERF1 : Sodium/proton exchanger regulatory factor 1 NO : Nitric oxyde

NP-40 : Nonyl phenoxypolyethoxyethanol NYHA : New york heart association OASF : Orai1-activating small fragment PA : Potentiel d’action

PBS : Phosphate-buffered saline PCR : Polymerase chain reaction PDE : Phosphodiestérase

PE : Phényléphrine PFA : Paraformaldehyde

PI3K : Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase PIP2 : Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate

PKA : Protéine kinase A PKC : Protéine kinase C PKD : Protéine kinase D PKG : Protéine kinase G PLB : Phospholamban PLC : Phospholipase C

PMCA : Plasma membrane calcium ATPase PP1 : Protein phosphatase 1

PP2A : Protein phosphatase 2A PP2C : Protein phosphatase 2C

PVDF : Polyvinylidène difluoride hybond-P RCPG : Récepteurs couples aux protéines G RE : Réticulum endoplasmique

RGS4 : Protéine régulatrice de protéines G

RIP1 : Receptor-interacting serine/threonine-proteine kinase 1 RIP3 : Récepteurs à l’IP3

RIPA : Radioimmunoprecipitation assay buffer RM : Récepteurs des minéralocorticoïdes ROCs : Receptor-operated calcium channels ROS : Reactive oxygen species

RPL32 : Ribosomal protein L32 RS : Réticulum sarcoplasmique

RT-qPCR : Real-time quantitative PCR RyR2 : Récepteurs de la ryanodine de type 2 SAM : Sterile alpha motif

SAN : Nœud sino-atrial

SARAF : SOC-associated regulatory factor SCID : Severe combined immunodeficiency SDS : Sodium dodecyl sulphate

SERCA : Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase SGK1 : Serum and glucocorticoïd-regulated kinase 1 SHD : STIM1 homomerization domain

SHR : Rats spontanément hypertendus shRNA : Small hairpin RNA

siRNA : Small interfering RNA

SK3 : Small conductance calcium-activated potassium channel 3 SOAR : STIM-Orai activating region

SOCE : Store-operated calcium entry SOCs : Store-operated calcium channels

SRAA : Système rénine-angiotensine II-aldostérone STIM : Stromal interaction molecule

Synta 66 : N-(2’,5’-Dimethoxy[1,1’-biphenyl]-4-yl)-3-fluoro-4-pyridinecarboxamide TAC : Constriction de l’aorte transverse

TAM : Myopathies avec agrégats tubulaires TBP : TATA-box binding protein

Tg : Thapsigargine

TGF-β : Transforming Growth Factor β TM : Domaine transmembranaire TnC : Troponine C

TnI : Troponine I TnT : Troponine T

TRE : Elément de réponse à la tétracycline TRP : Transient receptor potential

TRPA : Transient receptor potential ankyrin TRPCs : Transient receptor potential canonical TRPM : Transient receptor potential melastatin TRPML : Transient receptor potential mucolipin TRPN : TRP no mechanoreceptor potential C TRPP : Transient receptor potential polycystin TRPV : Transient receptor potential vanilloid tTA : Protéine transactivatrice de la tétracycline TTCCs : T-type calcium channels

Tubules T : Tubules transverses

TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling VD : Ventricule droit

VG : Ventricule gauche WB : Western-Blot WT : Wild-type

YWHAZ : 14-3-3 protein zeta/delta α-MHC : Myosin heavy chain, isoforme α β-MHC : Myosin heavy chain, isoforme β

SOMMAIRE

INTRODUCTION ... 1

I. Préambule ... 2

II. L’homéostasie calcique dans le cœur ... 4

1) Le CEC cardiaque ... 5

2) La relaxation ... 6

III. Les pathologies cardiaques ... 7

1) L’hypertrophie cardiaque ... 8

2) L’insuffisance cardiaque ... 10

IV. Les dérégulations calciques au cours de l’hypertrophie cardiaque et de l’IC ... 12

1) Voie de la CaMKII/HDACs ... 13

2) Voie de la CaN/NFAT ... 19

V. Influx calciques membranaires à l’origine de l’activation des voies de signalisation pro-hypertrophiques Ca2+-dépendantes ... 21

1) TTCCs ... 22

2) LTCCs ... 22

VI. Les canaux SOCs... 25

1) Découverte des canaux SOCs ... 25

2) Candidats moléculaires de l’entrée SOC ... 26

3) L’entrée CRAC médiée par STIM1/Orai1 ... 38

4) L’entrée SOC médiée par les TRPCs en association ou non avec Orai1 ... 40

5) Rôles physiopathologiques de l’entrée SOC chez l’homme ... 42

VII. Les canaux SOCs dans le cœur ... 44

1) Découverte d’une entrée SOC dans le cœur ... 44

2) Rôles physiologiques de l’entrée SOC dans le cœur ... 52

3) Rôles pathologiques de l’entrée SOC dans le cœur ... 57

4) Revue scientifique : Chapter 26 – Store-Operated Ca2+ Entry (SOCE) pathways – second edition... 74

VIII. La voie de l’aldostérone/RM ... 75

1) La voie de l’aldostérone / RM : généralités ... 75

2) Essais cliniques ... 75

3) Rôles de la voie aldostérone / RM en pathologie cardiaque ... 76

IX. Régulation des canaux SOCs par la voie de l’aldostérone/RM ... 78

MATERIELS ET METHODES ... 84

I. Méthodes in vivo et modèle animal ... 85

1) Modèle de souris transgénique dn-Orai1R91W/tTA surexprimant la forme mutée dominante négative humaine R91W du canal Orai1 ... 85

2) Induction d’une hypertrophie cardiaque par constriction de l’aorte transverse (TAC) ... 86

3) Diffusion chronique d’un nouvel inhibiteur d’Orai1 : le JPIII ... 87

4) Etude de la fonction cardiaque par échocardiographie ... 88

5) Enregistrements d’électrocardiogrammes (ECG) par télémétrie ... 89

II. Isolement des cardiomyocytes et culture cellulaire primaire ... 89

1) Isolement de cardiomyocytes ventriculaires de souris adultes ... 89

2) Isolement de cardiomyocytes ventriculaires de rats adultes ... 91

3) Culture de cardiomyocytes de rats nouveau-nés ... 92

III. Méthodes de physiologie cellulaire ... 94

1) Mesure d’influx calcique médié par les canaux SOCs par microscopie conventionnelle ... 94

2) Mesure des transitoires calciques, sparks calciques et de la charge du RS par microscopie confocale ... 98

3) Mesure de potentiels d’action (PA) par patch-clamp ... 101

IV. Méthodes de biochimie et biologie moléculaire ... 102

1) Génotypage des souris dn-Orai1R91W/tTA ... 102

2) Marquage colorimétrique X-gal ... 104

3) Mesure de l’expression protéique par Western-blot ... 105

4) Mesure de l’expression des ARNm par RT-qPCR ... 109

5) Etude de la localisation cellulaire par immunomarquage ... 111

6) Mesure de l’activité de la phosphatase calcineurine (CaN) ... 112

V. Analyses statistiques ... 113

RESULTATS ... 114

I. Effet protecteur de l’inhibition d’Orai1 au cours de l’hypertrophie cardiaque ... 115

1) Résumé de l’article ... 115

2) Article 1 ... 116

II. Régulation de l’entrée SOC par la voie de l’aldostérone/récepteurs aux minéralocorticoïdes (RM) ... 117

1) Résumé de l’article ... 117

2) Article 2 ... 118

3) Résultats complémentaires : régulation des canaux SOCs par la voie aldostérone/RM dans les cardiomyocytes adultes ... 119

III. Potentiel rôle des canaux calciques Orai1 dans les différences de couplage excitation-contraction liées au sexe ... 124

1) Introduction ... 124

2) Résultats ... 125

3) Conclusion ... 133

DISCUSSION ET PERSPECTIVES ... 135

I. Rôle physiopathologique des canaux calciques Orai1 dans le cœur ... 136

1) Potentielle implication des canaux calciques Orai1 dans les différences d’homéostasie calcique liées au sexe ... 136

2) Rôle délétère des canaux Orai1 au cours de l’hypertrophie cardiaque et de l’IC ... 141

II. Mécanismes cellulaires modulant les canaux SOCs ... 150

Régulation des canaux SOCs par la voie de l’aldostérone/RM ... 150

CONCLUSION... 151

1

2

INTRODUCTION

I. Préambule

L’ion calcium (Ca2+

) est un second messager universel, utilisé par tous les types cellulaires en réponse à une grande variété de stimuli. La versatilité du Ca2+ est exploitée par les êtres vivants pour contrôler un grand nombre de processus physiologiques, du développement à la mort des cellules. Parmi ces processus se trouvent la contraction et la relaxation musculaire, la plasticité synaptique avec l’apprentissage et la mémorisation, la sécrétion et le trafic cellulaire, la fertilisation, la prolifération, la différenciation, la croissance et l’adhérence ou encore l’apoptose cellulaire.

Le contrôle d’un si grand nombre de fonctions biologiques nécessite une régulation spatio-temporelle extrêmement fine du signal calcique, que ce soit au niveau cellulaire ou tissulaire. En fonction de la combinaison de paramètres tels que la fréquence, l’amplitude, la durée ou encore la localisation cellulaire du signal calcique, les cellules peuvent alors élaborer une réponse spécifique et précise à un stimulus donné (Berridge et al., 1998, 2000).

Au cours du développement embryonnaire, les cellules se différencient pour assurer un rôle spécifique au sein de l’organisme. Le Ca2+

contrôle les étapes de différenciation et prolifération cellulaire dans un grand nombre de tissus comme dans le muscle squelettique où il permet la bonne organisation du réseau myofibrillaire et l’assemblage des sarcomères (Tu et al., 2016; Zvaritch et al., 2007) mais aussi le maintien d’une plasticité musculaire à l’âge adulte ainsi qu’une capacité de régénération du muscle (Tu and Borodinsky, 2014; Tu et al., 2016). Dans le muscle cardiaque, le Ca2+ permet la bonne formation du septum et des valves (de la Pompa et al., 1998) ainsi que la régulation du mouvement de boucle cardiaque, assurant le développement du cœur en permettant l’évolution du tube cardiaque primitif vers une structure plus complexe, représentative de la forme adulte (Porter et al., 2003). De plus, le Ca2+ est essentiel à la fonction électrique et contractile du cœur. Le Ca2+

est également un élément clé dans le développement du système nerveux, depuis l’induction neurale (Moreau and Leclerc, 2004) jusqu’à la prolifération (Somasundaram et al., 2014; Spitzer, 2006), la migration (Zheng and Poo, 2007) et la différenciation des cellules neurales (Rosenberg and Spitzer, 2011). Cependant, si le Ca2+ a un rôle crucial dans l’établissement et le maintien de la vie, il possède également un rôle très important dans la mort cellulaire. En effet, un excès de Ca2+ est toxique pour les cellules et entraîne la mort cellulaire par nécrose ou apoptose (Mattson and Chan, 2003; Zhivotovsky and Orrenius, 2011).

3

La concentration intracellulaire en Ca2+ ([Ca2+]i) est donc étroitement contrôlée pour la maintenir

relativement stable. Ce maintien de l’homéostasie calcique est particulièrement important dans le cœur, où des dérégulations calciques sont corrélées au développement de nombreuses pathologies comme l’insuffisance cardiaque (IC) ou les arythmies (Lou et al., 2012). L’IC est une maladie grave résultant d’une diminution de la capacité de pompage du cœur, conduisant à un apport en oxygène insuffisant pour répondre aux besoins métaboliques des différents organes. Sa prévalence est estimée à plus d’un million de cas en France, et plus de 26 millions dans le monde, avec une létalité très forte (Levy et al., 2002; Taylor et al., 2017). Malgré une amélioration de la prise en charge thérapeutique, la prévalence de l’IC ne cesse d’augmenter, poussant donc la recherche à une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires impliqués.

Une nouvelle voie d’entrée de Ca2+

par les canaux calciques indépendants du voltage appelés SOCs, (Store-Operated Ca2+Channels) a été récemment mise en évidence dans les cardiomyocytes. Ces

canaux SOCs, comprenant les canaux TRPCs (Transient Receptor Potential Canonical) et Orai, sont les canaux calciques majoritaires des cellules non excitables (Lewis, 2011). Cependant leur expression est également détectée dans les cellules excitables, notamment dans le cœur de souris, rat et humain. L’entrée de Ca2+

médiée par ces canaux, appelée entrée SOC (SOCE ; Store-Operated Ca2+Entry), est prédominante dans les cardiomyocytes ventriculaires embryonnaires et

néonataux. Elle participerait au maintien de l’homéostasie calcique diastolique en conditions physiologiques et serait cruciale pour le développement cardiaque postnatal (Cheng et al., 2013; Collins et al., 2013; Lewis, 2011; Prakriya, 2013; Sabourin et al., 2016). Cependant chez l’adulte, la contribution de ces SOCs dans l’homéostasie calcique et la fonction cardiaque en condition physiologique reste toujours à élucider. A contrario, plusieurs études ont montré un rôle de ces canaux calciques dans la pathogénèse de l’hypertrophie cardiaque, des arythmies ou encore de l’IC (Camacho Londoño et al., 2015; Horton et al., 2014; Hulot et al., 2011; Kuwahara et al., 2006; Nakayama et al., 2006; Seth et al., 2009; Voelkers et al., 2010; Völkers et al., 2012; Wang et al., 2012; Wolkowicz et al., 2011). Les études portant sur les canaux TRPCs et leur protéine activatrice STIM1 (Stromal Interaction Molecule 1) démontrent clairement leur implication dans l’hypertrophie et l’IC, avec un effet bénéfique sur la fonction cardiaque lorsqu’ils sont inhibés (Camacho Londoño et al., 2015; Hulot et al., 2011; Kuwahara et al., 2006; Nakayama et al., 2006; Ohba et al., 2009; Seth et al., 2009). Néanmoins, l’effet des canaux Orai1 sur le développement de l’hypertrophie cardiaque et l’IC est à ce jour moins clair que celui des canaux TRPCs et de STIM1. Les données in vitro montrent clairement un rôle cardioprotecteur de l’inhibition des canaux Orai1 dans la pathogénie de l’hypertrophie cardiaque (Voelkers et al., 2010) tandis que les rares études in

vivo montrent plutôt un rôle délétère de l’inhibition d’Orai1 (Horton et al., 2014; Völkers et al.,

4

Mon travail de thèse consiste à mieux comprendre les mécanismes pathologiques à l’origine des dérégulations de l’homéostasie calcique au cours de l’hypertrophie et l’IC. Au vu du faible nombre d’études portant sur les SOCs dans le cœur et notamment sur Orai1, et des contradictions entre études in vitro et in vivo, je me suis attachée à mieux comprendre le rôle de ces canaux Orai1 dans le cœur adulte sain et hypertrophique, les voies de signalisation impliquées dans la pathogénèse de l’hypertrophie et l’IC découlant de ces canaux Orai1 ainsi que les facteurs pouvant être à l’origine de la dérégulation des influx calciques médiés par les SOCs retrouvés au cours de la pathologie. Une meilleure compréhension des mécanismes pathogéniques de l’hypertrophie et de l’IC permettront d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques plus ciblées et donc plus efficaces pour traiter ces pathologies.

II. L’homéostasie calcique dans le cœur

De par sa fonction de pompe, le cœur est un organe essentiel assurant la perfusion sanguine des organes. La circulation sanguine est assurée par la succession de contractions et relaxations du cœur, appelée cycles cardiaques. Ces contractions régulières sont dues à la propriété d’autorythmicité du cœur et trouvent leur origine dans l’oreillette droite. Au sein de ce tissu se trouvent des cellules spécialisées appelées cellules pacemaker, situées dans le nœud sinusal, qui présentent la particularité de ne pas avoir de potentiel de repos stable, mais plutôt une phase de dépolarisation diastolique lente qui aboutit au déclenchement régulier de potentiels d’action (PA). Le PA se propage ensuite à l’ensemble du tissu auriculaire, atteignant le nœud auriculo-ventriculaire, pour ensuite se propager aux ventricules par l’intermédiaire d’un tissu conducteur composé du faisceau de His et des fibres de Purkinje (Figure 1). La propagation de l’influx électrique est permise par l’existence de jonctions communicantes, ou jonctions gap, entre les cellules. Le couplage excitation-contraction (CEC) correspond à la transformation par les cardiomyocytes, de l’influx électrique en réponse mécanique (Bers, 2002).

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Figure 1: Le système de conduction cardiaque (modifié d’après Munshi et al. 2012)

L’influx électrique est initié dans l’oreillette droite au niveau du nœud sinusal et se propage à travers le tissu auriculaire. Il est ensuite relayé au nœud auriculo-ventriculaire avant d’être conduit rapidement vers les ventricules via le faisceau de His et les fibres de Purkinje. RA: Oreillette droite. LA: Oreillette gauche. TV: Valve tricuspide. MV: Valve mitrale. RV: Ventricule droit. LV: Ventricule gauche.

1) Le CEC cardiaque

La dépolarisation membranaire se propage le long du sarcolemme des cardiomyocytes et provoque, au niveau ventriculaire, l’ouverture des canaux calciques de type L (LTCCs ; L-Type Ca2+

Channels)

conduisant un courant calcique entrant lent (ICa,L). Ces canaux sont majoritairement situés au niveau

d’invaginations de la membrane plasmique appelées tubules transverses (tubules T). Ces structures représentent 20 à 60% de la membrane cellulaire totale en fonction des espèces (Bers, 2001a) et concentrent la majorité des LTCCs, avec 80% des courants ICa,L totaux (Brette et al., 2004).

L’ouverture des LTCCs est suivie par une entrée de Ca2+

dans les cardiomyocytes, cependant cette entrée calcique n’est pas suffisante pour induire une augmentation de la [Ca2+]i permettant le

déclenchement de la contraction cellulaire. Néanmoins, cet influx de Ca2+ va pouvoir déclencher une sortie massive de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (RS) vers le cytosol, de par l’activation des récepteurs de la ryanodine de type 2 (RyR2) situés à la membrane du RS, en regard des LTCCs au niveau des dyades. Ce phénomène de sortie de Ca2+ du RS induit par l’influx calcique à travers le sarcolemme est appelé CICR pour « Ca2+ Induced-Ca2+ Release » (Fabiato and Fabiato, 1975), et

constitue l’étape cruciale pour induire l’augmentation de la [Ca2+

]i nécessaire à la contraction (Figure 2). En effet, la [Ca2+]i diastolique est d’environ 100 nM et passe à 1 µM en systole grâce au

CICR. La contraction des cardiomyocytes est permise par l’organisation des myofilaments en sarcomères, unités composées de filaments épais de myosine, de filaments fins d’actine et de la

6

protéine géante titine, qui joue un rôle majeur dans leur assemblage et leur maintien. D’autres protéines sont associées à ces myofilaments comme la tropomyosine, la troponine (Parmacek and Solaro, 2004) ou encore les protéines calsarcines, jouant également un rôle dans le maintien sarcomérique (Frey et al., 2000). En diastole, lorsque la [Ca2+]i est faible, le site de fixation du Ca2+

sur la troponine C (TnC) est libre, favorisant ainsi l’interaction de la troponine I (TnI) avec l’actine et l’éloignement du complexe tropomyosine-troponine des filaments fins d’actine, ce qui empêche l’interaction entre les têtes de myosine et l’actine. Lorsque la [Ca2+

]i augmente suite au CICR, le

Ca2+ se fixe sur la TnC, favorisant l’interaction de cette dernière avec la TnI et la levée de l’inhibition exercée par la TnI sur l’actine. Cela entraîne un déplacement de la tropomyosine, démasquant ainsi les sites d’interaction entre l’actine et les têtes de myosine. Les deux filaments glissent sur eux-mêmes grâce à l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate (ATP) par les têtes de myosine, entrainant un raccourcissement des sarcomères à l’origine de la contraction.

2) La relaxation

La relaxation des cardiomyocytes fait suite à un détachement du Ca2+ des myofilaments. Pour cela, la [Ca2+]i doit diminuer et cela est permis d’une part par l’arrêt de la libération de Ca2+ via la

fermeture des RyR2 et d’autre part par l’extrusion du Ca2+

cytosolique vers le compartiment extracellulaire ou vers les organites de stockages intracellulaires. La majorité du Ca2+ est repompé de manière active à l’intérieur du RS grâce à la pompe ATPase SERCA (Sarco/Endoplasmic

Reticulum Ca2+ ATPase), située à la membrane du RS. L’activité de cette pompe est inhibée de

manière constitutive par sa protéine régulatrice, le phospholamban (PLB). Lors d’une augmentation de la [Ca2+]i, la fixation de Ca2+ sur la pompe SERCA induit une dissociation partielle du PLB et

donc la levée de son inhibition. Le reste du Ca2+ est expulsé en dehors de la cellule par l’échangeur Na+/Ca2+ (NCX ; Na+/Ca2+Exchanger) présent à la membrane plasmique. Une part négligeable du

Ca2+ est prise en charge par la pompe à Ca2+ de la membrane plasmique (PMCA, Plasma membrane

Ca2+ ATPase), ou réintégrée dans les mitochondries via l’uniporteur mitochondrial. La contribution

de ces différents mécanismes diffère en fonction des espèces. En effet, chez le lapin, le chien ou encore l’homme, la pompe SERCA recapte 70% du Ca2+

cytosolique, le NCX expulse 28% du Ca2+ tandis que les 2% restants sont pris en charge par les pompes PMCA et les mitochondries. Mais en ce qui concerne la souris ou le rat, la pompe SERCA présente un rôle prépondérant avec 92% du Ca2+ cytosolique qui est recapté dans le RS. Le NCX ne participe à la relaxation qu’à hauteur de 7% alors que les pompes PMCA et les mitochondries ne participent qu’à maximum 1% de l’expulsion du Ca2+ cytosolique (Bassani et al., 1994; Bers, 2001b).

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Figure 2: Le couplage excitation-contraction cardiaque (d’après Bers, 2002)

La dépolarisation membranaire induite par le PA entraîne l’ouverture des LTCCs, permettant un influx de Ca2+ vers le cytosol entrainant la vidange du RS, de par l’ouverture des RyR2. Il s’en suit une augmentation de la [Ca2+

]i, activant les myofilaments et aboutissant à la contraction du cardiomyocyte. Lors de la relaxation, le Ca2+ est majoritairement recapté par la pompe SERCA2a dans le RS ou expulsé hors de la cellule par le NCX et à plus faible échelle expulsé par la pompe sarcolemmale PMCA ou recapté par les mitochondries.

Le Ca2+ joue donc un rôle primordial dans les performances du myocarde et dans les processus physiologiques du tissu cardiaque. Cependant, une dérégulation de son homéostasie présente des effets néfastes sur le cœur et est associée à de nombreuses pathologies comme l’hypertrophie et l’IC, les arythmies ou encore l’ischémie myocardique.

III. Les pathologies cardiaques

En 2015, les maladies cardiovasculaires étaient responsables de 17.7 millions de décès, soit 31% des décès totaux mondiaux (Townsend et al., 2016), constituant de ce fait la première cause de mortalité dans le monde, devant les cancers. Elles regroupent un grand nombre de pathologies pouvant toucher les vaisseaux sanguins et/ou le cœur. Les pathologies affectant les vaisseaux sanguins incluent les cardiopathies coronariennes comme l’infarctus du myocarde, les artériopathies

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périphériques, les maladies cérébrovasculaires comme les AVC (accident vasculaire cérébral), les sténoses rénales, les anévrismes aortiques ou encore les thromboses veineuses profondes et embolies pulmonaires. Les maladies affectant le myocarde regroupent diverses formes de cardiomyopathies, comme la cardiomyopathie dilatée (DCM ; Dilated Cardiomyopathy), hypertrophique (HCM ; Hypertrophic Cardiomyopathy), ventriculaire droite arythmogène, restrictive ou encore ischémique. On retrouve également des maladies du rythme et de la conduction électrique, des maladies inflammatoires comme la péricardite, l’endocardite ou la myocardite ainsi que des valvulopathies variées. L’IC est le stade ultime de la progression des différentes maladies cardiovasculaires et résulte en une altération fonctionnelle très grave et irréversible du cœur. De nombreux facteurs de risques sont associés aux maladies cardiovasculaires tels que l’athérosclérose, le diabète, l’obésité, l’alcool ou encore le tabac.

1) L’hypertrophie cardiaque

L’hypertrophie cardiaque est caractérisée par une augmentation de la masse du ventricule gauche (VG) due à un élargissement et non à une multiplication des cardiomyocytes (Lorell and Carabello, 2000). Ce processus est une réponse adaptative du cœur à des besoins énergétiques plus importants résultant de contraintes de tension au niveau des parois cardiaques (Berenji et al., 2005). La réponse hypertrophique du cœur permet de diminuer les contraintes pariétales et de maintenir une fonction cardiaque normale. Le développement hypertrophique est le résultat d’une série de modifications transcriptionnelles, structurelles, électrophysiologiques et fonctionnelles, aussi appelées remodelage cardiaque (Berk et al., 2007; Burchfield et al., 2013; Schwartzkopff et al., 1993).

L’hypertrophie pathologique se met en place suite à un stress hémodynamique chronique du cœur. Elle peut être d’origine génétique, on parle alors d’hypertrophie primaire ou elle peut être déclenchée suite à une autre pathologie, elle est alors dite secondaire. L’hypertrophie cardiaque primaire regroupe les HCM et les DCM. L’HCM est due à des mutations de gènes codants pour des protéines sarcomériques comme la chaine lourde de myosine (30% des cas), la protéine C de liaison à la myosine (20% des cas) ou la troponine T (TnT) (20% des cas) (Alcalai et al., 2008). Elle touche environ 1 personne sur 500 (Maron et al., 1995) et est caractérisée par une dysfonction diastolique de degré variable sans atteinte de la fraction d’éjection (FE), paramètre reflétant la fonction ventriculaire et mesuré comme la quantité de sang éjectée du VG à chaque contraction (systole). En ce qui concerne la DCM, dans 20 à 30% des cas, des mutations génétiques sont retrouvées, affectant diverses protéines impliquées dans l’échafaudage membranaire (dystrophine), l’appareil sarcomérique (chaine lourde β de la myosine, TnT), l’enveloppe nucléaire (lamine A et C),

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l’homéostasie calcique (PLB) ou encore la machinerie énergétique (Watkins et al., 2011). L’hypertrophie cardiaque secondaire fait suite à une myocardite virale ou bactérienne, à l’exposition à des substances cardiotoxiques ou suite à une pathologie chronique sous-jacente comme l’hypertension artérielle ou une sténose aortique. Ces pathologies entraînent une surcharge de pression ou de volume au niveau des parois du cœur, entrainant un stress hémodynamique ainsi qu’une augmentation des besoins énergétiques du cœur. L’hypertension artérielle est la condition la plus courante entrainant une surcharge de pression et un stress cardiaque (Cuspidi et al., 2012), et une augmentation de la masse du VG est retrouvée chez 20 à 60% des patients hypertendus (Devereux et al., 1987). Chez les patients hypertendus présentant une hypertrophie ventriculaire légère à modérée, les performances cardiaques au repos sont généralement normales. La sténose aortique touche environ 4% des personnes âgées de plus de 75 ans (Nkomo et al., 2006) et une hypertrophie ventriculaire est corrélée à la sévérité de la pathologie (Cioffi et al., 2012b). Malgré une fonction systolique normale au repos, les patients présentent des dysfonctions diastoliques (Rader et al., 2015). L’hypertrophie pathologique apparaît donc comme un mécanisme compensatoire bénéfique dans un premier temps, on parle alors d’hypertrophie compensée. En effet, la fonction systolique est préservée et une hyper contractilité ventriculaire est souvent retrouvée avec une FE pouvant être augmentée, traduisant de meilleures performances cardiaques. Cependant, ce mécanisme devient maladaptatif avec le temps, on parle alors de décompensation et il s’en suit une dilatation ventriculaire ainsi qu’une dysfonction progressive du VG. In fine, cette transition aboutit au développement d’un syndrome d’IC (Figure 3). L’hypertrophie cardiaque pathologique est considérée comme un prédicateur de morbidité et de mortalité car les patients présentent des risques d’arythmies, d’infarctus du myocarde ou de mort subite (Kavey, 2013).

Figure 3: La progression naturelle de l’IC (modifié d’après Taimeh et al. 2013)

Suite à un stress hémodynamique chronique du cœur, une hypertrophie ventriculaire se met en place dans le but de compenser ce stress. L’hypertrophie est tout d’abord bénéfique pour la fonction cardiaque mais avec le temps une décompensation est observée incluant un remodelage intense, entrainant le développement de l’IC.

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2) L’insuffisance cardiaque

L’IC est un syndrome clinique reflétant le stade évolutif ultime de la majorité des pathologies cardiovasculaires et correspondant à l’incapacité du cœur à assurer un débit cardiaque suffisant pour subvenir aux besoins énergétiques des organes vitaux. L’IC est caractérisée par une dyspnée et une asthénie, d’abord à l’effort, rendant les patients intolérants à tout effort physique, puis au repos lors de la progression de la pathologie. De plus, des œdèmes périphériques touchant les membres inférieurs ainsi que des œdèmes pulmonaires provoquant des râles crépitants sont retrouvés chez les patients IC. Une cyanose peut être observée en cas d’œdème pulmonaire extrêmement sévère. D’autres signes peuvent indiquer une IC comme la présence d’un 3ème

bruit cardiaque appelé galop, traduisant une augmentation de la pression intracardiaque. En cas d’IC droite, une hépatomégalie ainsi qu’un reflux hépato-jugulaire peuvent être détectés. Basée sur les symptômes, la classification NYHA (New York Heart Association) permet de déterminer la sévérité de la pathologie et d’adapter la prise en charge des patients (Tableau 1).

Classe I (aucun symptôme) Les tâches quotidiennes sont effectuées sans fatigue Classe II (symptômes légers) Une activité physique modérée entraîne une fatigue Classe III (symptômes modérés) Une activité physique même limitée entraîne une fatigue

importante

Classe IV (symptômes sévères) Une quelconque activité physique est impossible sans inconfort et les symptômes surviennent même au repos

Tableau 1: La classification fonctionnelle des cardiopathies selon la NYHA

L’IC peut refléter des anomalies de la contraction ventriculaire (dysfonctions systoliques) et/ou des anomalies de remplissage des ventricules (dysfonctions diastoliques). Elle peut atteindre soit le VG, on parle alors d’IC gauche, soit le ventricule droit (VD) dans le cas d’une IC droite, soit les deux ventricules dans le cas d’une IC globale. L’IC est divisée en deux types basés sur l’étude de la FE du VG des patients. L’IC à FE réduite (HFrEF ; Heart Failure with reduced Ejection Fraction), aussi appelée IC systolique, est caractérisée par une FE inférieure à 45% traduisant une mauvaise fonction ventriculaire puisque la valeur moyenne chez un individu sain est d’environ 60%. L’IC à FE préservée (HFpEF ; Heart Failure with preserved Ejection Fraction), appelée IC diastolique est caractérisée par une FE supérieure à 45% (Philbin et al., 2000; Smith et al., 2003) traduisant une bonne fonction ventriculaire mais un mauvais remplissage en diastole. Ce type d’IC est retrouvé chez 30 à 50% des patients (Kitzman et al., 2001; Senni et al., 1998; Vasan et al., 1999).

11

Cette pathologie touche plus de 26 millions de personnes dans le monde et plus de 15 millions en Europe (Bui et al., 2011). La France compte environ 1 million de patients insuffisants cardiaques. Dans les pays développés, on estime la prévalence de la pathologie à environ 2% chez les adultes et cela augmente jusqu’à 20% chez les personnes âgées de plus de 65 ans. La prévalence augmente donc avec l’âge. Chaque année, 120000 nouveaux cas sont diagnostiqués dans notre pays et la prévalence continue d’augmenter de par le vieillissement général de la population, le meilleur taux de survie suite à un infarctus ou encore l’augmentation de la prévalence des facteurs de risques comme l’hypertension artérielle, le diabète, les dyslipidémies ou l’obésité (Bui et al., 2011). Bien que certaines personnes atteintes d’IC vivent plusieurs années après le diagnostic, le taux de mortalité 5 ans après le diagnostic est estimé à 50% (Ho et al., 1993) et les causes de décès sont principalement dues à des événements arythmiques, des morts subites ou des AVC ischémiques. Les études montrent des différences liées au genre très marquées dans le développement de l’IC. En effet, le risque de développer une IC suite à un infarctus est plus important chez les femmes que chez les hommes (Lam et al., 2015). Les femmes sont majoritairement plus atteintes d’HFpEF alors que les hommes développent plutôt une IC de type HFrEF (Cleland et al., 2003) et elles présentent également un meilleur taux de survie. Le cœur des femmes s’adapte différemment de celui des hommes à une IC. Dans l’HFpEF, les femmes développent une moindre dilatation ventriculaire que les hommes, cependant elles présentent des ventricules plus petits et rigides (Regitz-Zagrosek et al., 2007), ce qui est principalement dû à une fibrose moins marquée (Villar et al., 2009) ou aux différences de genre impliquées dans le CEC (Regitz-Zagrosek et al., 2007). Les raisons de ces différences entre hommes et femmes au niveau cardiovasculaire sont nombreuses. En effet, cela peut être expliqué par des différences génétiques entre hommes et femmes mais également par des différences hormonales. Les œstrogènes et en particulier le 17β-œstradiol (E2) jouent un rôle important dans les différences de genre au cours des maladies cardiovasculaires. Plusieurs évidences cliniques montrent que les femmes non ménopausées sont relativement protégées du développement de pathologies cardiovasculaires alors qu’après la ménopause, l’incidence des pathologies cardiaques augmente (Hayward et al., 2000; Ren and Kelley, 2009; Yang and Reckelhoff, 2011). Cela suggère un rôle plutôt protecteur de l’hormone E2. Ces différences cliniques majeures entre hommes et femmes doivent être prises en compte dans la prise en charge des patients, pour un meilleur suivi et donc un traitement plus efficace, cependant à l’heure actuelle la majorité des patients participant aux essais cliniques sont des hommes, les femmes ne représentant que 20% des sujets (Heiat et al., 2002).

Les traitements mis en place dépendent principalement de la sévérité de l’IC et de la cause sous-jacente. Les personnes atteintes d’IC chronique faible à modérée sont tout d’abord soumises à des modifications strictes de leur mode de vie pour réduire les facteurs de risques, incluant l’arrêt

12

immédiat du tabac, un changement de régime alimentaire et un maintien d’exercice physique régulier si possible ainsi qu’une perte de poids pour les personnes obèses. Les traitements médicamenteux les plus courants reposent sur l’utilisation d’inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine (IEC), de bloqueurs des récepteurs de l’angiotensine II (ARA II), de β-bloquants, d’antagonistes des récepteurs de l’aldostérone ou de diurétiques. Dans les cas les plus sévères, il est possible d’envisager l’implantation d’un pacemaker ou d’un défibrillateur cardiaque voire d’une transplantation cardiaque, réservée aux patients les plus atteints ne répondant pas aux traitements médicamenteux et ayant un très mauvais pronostic à court terme. Malheureusement, les traitements médicamenteux actuels ne sont que symptomatiques et ne ralentissent que temporairement la progression de la maladie. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies ciblant les mécanismes pathogéniques basaux de cette maladie. Les deux causes principales de décès chez les patients insuffisants sont liées au déclin de la fonction de pompe du cœur et à la survenue d’arythmies, les deux étant associées à une altération de l’homéostasie calcique des cardiomyocytes. La dérégulation de cette homéostasie calcique a des répercussions évidentes sur le CEC, et peut également aboutir à l’activation de voies de signalisation pro-hypertrophiques dépendantes du Ca2+

, comme la voie de la CaMKII (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II)/HDACs (Histones

désacétylases) ou de la calcineurine (CaN)/NFAT (Nuclear Factor of Activated T-cells).

IV.

Les

dérégulations

calciques

au

cours

de

l’hypertrophie cardiaque et de l’IC

Au cours de l’IC, deux grandes voies neurohormonales sont impliquées précocement dans le remodelage hypertrophique ventriculaire : la voie β-adrénergique et la voie du SRAA (système rénine-angiotensine II-aldostérone). L’activation de la voie β-adrénergique a pour but d’augmenter la pression artérielle en augmentant la fréquence et la contractilité du cœur pour maintenir un débit cardiaque adapté aux besoins, ainsi que les résistances périphériques vasculaires par vasoconstriction. L’activation du SRAA est moins précoce et permet une vasoconstriction ainsi qu’une rétention hydrosodée, aboutissant à l’augmentation de la post-charge et pré-charge du cœur. Si initialement l’activation de ces voies neurohormonales tend à compenser les effets délétères de la pathologie, l’activation chronique de ces voies deviennent néfastes pour le cœur, concourant à l’activation de voies de signalisation intracellulaires impliquées dans le développement hypertrophique et/ou impliquées dans la modulation de l’homéostasie calcique.

Deux voies de signalisation sont particulièrement importantes dans les dérégulations de l’homéostasie calcique retrouvées au cours de l’hypertrophie et l’IC : la voie de la CaMKII/HDACs

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et la voie de la CaN/NFAT. Ces deux voies sont activées en réponse à une élévation de la [Ca2+]i.

Les ions Ca2+ s’associent alors avec la calmoduline (CaM) et les complexes Ca2+/CaM activent en retour de nombreuses protéines comme la CaMKII et la CaN.

1) Voie de la CaMKII/HDACs

1.1 Structure et activation

La CaMKII est une kinase sérine/thréonine régulée par le complexe Ca2+/CaM dont l’isoforme prédominante dans le cœur est la CaMKIIδ (Edman and Schulman, 1994; Schworer et al., 1993). Deux variants d’épissage majeurs de la CaMKIIδ sont exprimés dans le cœur, la CaMKIIδB

présentant une localisation principalement nucléaire et la CaMKIIδC présentant une localisation

principalement cytoplasmique (Srinivasan et al., 1994). La CaMKIIγ est également présente dans le tissu cardiaque mais son expression est minoritaire par rapport à celle de la CaMKIIδ (Colomer et al., 2003). La CaMKII est retrouvée sous forme hexamérique et chaque monomère est composé de 3 domaines : un domaine d’association C-terminal requis pour l’association multimérique de la CaMKII, un domaine catalytique N-terminal liant les substrats de la CaMKII et un domaine régulateur. En conditions basales, le domaine régulateur agit comme substrat du domaine catalytique. Ces deux domaines sont donc étroitement liés, ce qui entraîne l’auto-inhibition de la CaMKII. Lorsque la [Ca2+]i augmente, la CaM lie le domaine régulateur de la CaMKII, ce qui

entraîne un changement de conformation de la kinase, rompant l’interaction entre les domaines catalytique et régulateur et donc levant l’auto-inhibition de la kinase (Erickson, 2014). En cas d’augmentation brève de la [Ca2+

]i, le complexe Ca2+/CaM va se dissocier de la CaMKII, inactivant

alors la kinase. Cependant, en cas de signal calcique prolongé, le complexe Ca2+/CaM reste associé à la CaMKII, ce qui entraîne alors l’auto-phosphorylation de la kinase sur le résidu thréonine 287. L’addition d’un groupement phosphate sur ce résidu à deux effets principaux sur la fonction de la CaMKII. Tout d’abord l’affinité de la CaM pour la CaMKII augmente drastiquement (environ 1000 fois) (Meyer et al., 1992), ce qui prévient leur dissociation. De plus, l’auto-inhibition de la CaMKII est prévenue même en cas de diminution de la [Ca2+]i et de dissociation de la CaM. Cela confère à

la CaMKII une activation constitutive, indépendante de la CaM (Lai et al., 1987). L’activation chronique et excessive de voies neurohormonales au cours de l’hypertrophie cardiaque contribue à l’augmentation de la [Ca2+

]i et donc à l’auto-phosphorylation de la CaMKII (Zhang et al., 2003)

ainsi qu’à la production de ROS (Reactive Oxygen Species) (Rude et al., 2005). Le stress oxydatif entraîne également une activation constitutive de la CaMKII via l’oxydation des résidus méthionines 281/282 (Erickson et al., 2008) (Figure 4), mais cette activation requiert initialement la liaison de la CaM à la CaMKII. L’oxydation entraîne une modification de la dépendance au Ca2+