Mesure d’influx calcique médié par les canaux SOCs par microscopie conventionnelle

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III. Méthodes de physiologie cellulaire

1) Mesure d’influx calcique médié par les canaux SOCs par

microscopie conventionnelle

Dans le but de mesurer l’entrée SOC dans des cardiomyocytes ventriculaires isolés de souris WT et dn-Orai1^R91W/tTA, de rats Wistar adultes ou de cardiomyocytes de rats nouveau-nés, nous avons utilisé la microscopie conventionnelle à fluorescence à l’aide de la sonde calcique Fura-2.

1.1 Sonde calcique Fura-2

Le Fura-2/AM

(1-[6-amino-2-(5-carboxy-2-oxazolyl)-5-benzofuranyloxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy) ethane-N, N, N’, N’-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester) est une sonde

calcique double excitation/mono émission. Elle possède deux longueurs d'onde d'excitation dépendantes de la concentration calcique : 340 nm (forme liée au Ca²⁺) et 380 nm (forme libre) ainsi qu'une longueur d'onde d’émission à 510 nm. L'excitation de la sonde à son point isosbestique correspond au croisement des deux longueurs d'ondes d'excitations à 360 nm (Figure 28).

Figure 29 : Spectres d’excitation et d’émission du Fura-2 (Fluorescence Viewer, Synentec)

Le Fura-2 possède 2 longueurs d’onde d’excitation dépendantes de la concentration en Ca²⁺ : 340 nm (forme liée au Ca²⁺) et 380 nm (forme libre). La longueur d’onde d’émission est de 510 nm. Lorsque la sonde est excitée à son point isosbestique (360 nm) correspondant au croisement des 2 longueurs d’onde d’excitation, son absorption sera indépendante de la [Ca2+

]i. Point isosbestique

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1.2 Matériel

La source lumineuse d'excitation est une lampe au Xénon délivrant une lumière de 320 à 680 nm qui permet d'exciter une large gamme de fluorophores associée à un monochromateur Till Photonics Polychrome V permettant de sélectionner la longueur d'onde d'excitation voulue ainsi que la largeur de la bande passante à appliquer. La lumière est transmise du monochromateur vers l'objectif x40 à immersion à huile du microscope inversé Zeiss Axio Observer.D1 pour atteindre l'échantillon. La fluorescence émise par l'échantillon est dirigée vers une caméra Evolve EMCCD (Photometrics), puis les acquisitions sont transmises à l'ordinateur et les informations sont traitées par le logiciel MetaFluor 7.8 (Figure 29).

Figure 30 : Dispositif expérimental de microscopie à fluorescence

Le dispositif expérimental pour la mesure d’entrée calcique médiée par les canaux SOCs est composé d’un microscope inversé Zeiss Axio Observer.D1 (a) relié à un stimulateur électrique (b) et équipé d’une caméra Evolve EMCCD (c), d’un système de perfusion (d), d’un monochromateur TILL Photonics Polychrome V (e) et d’un ordinateur équipé du logiciel MetaFluor 7.8 (f)

a

b

c

d

e

f

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1.3 Mesure de l’entrée SOC par la sonde ratiométrique Fura-2

1.3.1 Principe

La sonde Fura-2 est couramment utilisée pour mesurer l’influx calcique médié par les canaux SOCs dans les cardiomyocytes néonataux et adultes Cette sonde ratiométrique est excitée de manière alternative à 340 et 380 nm et la fluorescence émise est collectée à 510 nm.

1.3.2 Protocole

Tout d'abord, les cellules sont chargées en Fura-2/AM. La forme AcétoxyMéthylesther (AM) est utilisée car c'est uniquement sous cette forme non chargée et hydrophobe que le Fura-2 peut traverser les membranes lipidiques. Il masque les charges négatives des groupements carboxyles de la molécule. Sous cette forme, la sonde est insensible au Ca²⁺, le groupement AM est donc clivé par des estérases endogènes intracellulaires pour libérer la forme carboxylée du Fura-2 qui pourra alors lier le Ca²⁺ intracellulaire. Les cardiomyocytes ventriculaires adultes sont incubés dans un milieu de charge comprenant une solution à 1 mM de Ca²⁺ additionnée de 1 µM de Fura-2/AM dilué dans 20% d'acide pluronique, pendant 15 minutes à température ambiante et à l'obscurité. Les cardiomyocytes néonataux sont quant à eux incubés pendant 30 minutes à 37°C à l’obscurité dans une solution de charge de 1,8 mM de Ca²⁺ additionnée de 2 µM de Fura-2/AM dilué dans l’acide pluronique. Les cellules sont ensuite rincées avec une solution contenant 1,8 mM de Ca²⁺ pour éliminer l’excès de Fura-2. Les cardiomyocytes adultes sont placés dans une chambre reliée à un stimulateur électrique. Un système de perfusion est présent dans le bain pour permettre un changement rapide du microenvironnement qui entoure les cellules d'intérêts. Le débit de perfusion est lent pour ne pas décoller les cellules et pour éviter au maximum les artéfacts lors de l'enregistrement. Pour étudier l'activité des canaux calciques SOCs, une solution contenant 1,8 mM de Ca²⁺ est perfusée puis les cellules sont stimulées électriquement (fréquence 1 Hz, amplitude 20 V, durée 2 ms) pour déterminer les cellules fonctionnelles, ces dernières se contractant en réponse à la stimulation. Le contenu du RS est ensuite vidé par perfusion d'une solution sans Ca²⁺ contenant 10 mM de caféine pour maintenir ouverts les RyR2 et 5 µM de Tg, un inhibiteur irréversible de la pompe SERCA2a, ce qui va entraîner une déplétion complète du RS en Ca²⁺, Ca²⁺ qui sera expulsé par le NCX. Une solution sans Ca²⁺ contenant 10 µM de nifédipine et 5 µM de KB-R7943 est ensuite perfusée pour bloquer respectivement les LTCCs et le NCX. Enfin, une solution contenant 1,8 mM de Ca²⁺ est perfusée permettant ainsi l'entrée du Ca²⁺ dans les cellules via les canaux calciques SOCs ; une augmentation de la fluorescence émise par le Fura-2 est alors observable. En ce qui concerne les cardiomyocytes néonataux, après rinçage pour éliminer le Fura-2, les cellules

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sont placées dans un système thermostaté à 37°C. Les cardiomyocytes sont ensuite déplétés par injection d’une solution sans Ca2+

contenant 10 mM de caféine et 2 µM de Tg et 10 µM de nifédipine. Comme pour les cardiomyocytes de rats adultes, le Ca²⁺ extracellulaire est réintroduit à une concentration de 1.8 mM, toujours en présence de nifédipine pour bloquer les canaux LTCCs, entrainant l’augmentation de la fluorescence émise par le Fura-2.

1.3.3 Analyse des données

Après réintroduction du Ca²⁺ dans le milieu extracellulaire, l’amplitude du pic de fluorescence (ΔF) est mesurée en calculant la différence (ΔF) entre la fluorescence maximale (F) et la fluorescence basale (F0). La valeur de ΔF est proportionnelle à l’activité des canaux SOCs. Les données sont traitées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software).

1.4 Mesure de l’entrée Mn

(manganèse) par la technique

d’extinction de la fluorescence du Fura-2 par le Mn

1.4.1 Principe

L’entrée SOC peut être mesurée par une technique différente de celle présentée précédemment, basée sur l’utilisation du cation divalent Mn²⁺. Lorsque la sonde Fura-2 est excitée au point isosbestique à 360 nm, son affinité pour le Ca²⁺ est très faible ce qui permet d'enregistrer les variations de fluorescence à 510 nm indépendamment de la [Ca²⁺]i. Le Mn²⁺ est capable de pénétrer dans la cellule via les canaux SOCs, à la place ou en même temps que les ions Ca²⁺. Le Mn²⁺ intracellulaire va alors éteindre la fluorescence du Fura-2.

1.4.2 Protocole SOC (Store-Operated Ca

Entry)

Le protocole est le même que celui présenté en partie 1.3.2 à l’exception de la dernière solution perfusée. Après avoir déplété en Ca²⁺ le RS par la caféine et la thapsigargine pour activer les canaux SOCs, une solution contenant 500 µM de Mn²⁺ est perfusée. Cela permet l'entrée du Mn²⁺ dans les cellules via les canaux SOCs qui va alors éteindre la fluorescence émise par le Fura-2 à 510 nm.

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1.4.3 Protocole ARC (Arachidonate-Regulated Ca

Entry)

Pour étudier l'activité des canaux ARCs activés par l’acide arachidonique dans les cardiomyocytes adultes, le protocole utilisé est le suivant : les cellules sont perfusées à l’aide d’une solution contenant 1,8 mM de Ca²⁺ puis sont stimulées électriquement (fréquence 1 Hz, amplitude 20 V, durée 2 ms) pour déterminer les cellules fonctionnelles. Les canaux ARCs sont ensuite activés par perfusion d’une solution contenant 8 µM d’acide arachidonique puis une solution contenant 8 µM d’acide arachidonique, 10 µM de nifédipine et 5 µM de KB-R7943 est perfusée pour bloquer les LTCCs et le NCX. Enfin, une solution contenant 500 µM de Mn²⁺ est perfusée, permettant l’entrée du Mn²⁺ dans les cardiomyocytes via les canaux ARCs, entrainant l’extinction de la fluorescence d’émission du Fura-2.

1.4.4 Analyse des données

L’intensité de fluorescence est exprimée en pourcentage de fluorescence par minute, en prenant comme base la moyenne des intensités précédant l’application de Mn2+

. La pente linéaire de diminution de fluorescence est ensuite calculée par régression linéaire. La valeur de cette pente reflète alors l’activité des canaux étudiés. Les données sont traitées à l’aide du logiciel GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software).

2) Mesure des transitoires calciques, sparks calciques et de la