III.1. Matériel
Cette étude à visée descriptive menée dans l’unité de Parasitologie – Mycologie de Béni – Messous d’Alger avait pour objectif essentiel de déterminer le taux de prévalence des protozoaires intestinaux, particulièrement Blastocystis hominis et Entamoeba histolytica/dispar dans les prélèvements de selles réceptionnés au niveau de C.H.U. Beni - Messous.
Concernant les méthodes que nous avons utilisées, elles comportent des limites. C'est ainsi qu'au niveau de ce laboratoire, la mise en culture et le génotypage n'ont pas pu être utilisée. C’est la raison pour laquelle nous n’avons pas précisé les espèces de certains genres telle que Blastocystis, Entamoeba et Cryptosporidium. Les méthodes utilisées nous ont permis de visualiser les formes kystes et très rarement les formes végétatives du fait que les conditions de prélèvements ne sont pas respectés, ou en que les malades arrivent très tard après la défécation ce qu’il fait que les formes végétatives fragiles sont détruites. Ceci constitue un facteur de sous estimation des taux que n’avons trouvés.
III.1.1. Echantillonnage
Notre étude à porter sur 2354 échantillons de selles provenant des sujets non hospitalisés consultant (ou externes) et hospitalisés dans le service de pédiatrie du C.H.U. de Bèni – messous, collectés entre la période du 02/09/2012 jusqu’au 19/12/2013.
Pour définir la répartition des patients selon l’âge, nous avons considéré l’intervalle de 0 à 15 ans pour les enfants et pour les adultes les âges supérieurs à 15 ans et nous avons réalisé le regroupement par tranche de 2 ans chez les enfants et de 10 ans chez les adultes, conformément aux critères établis dans de nombreuses études (MOSTAFI et al., 2011 ; ADOU-BRYN et al., 2001). En faite les âges extrêmes sont 45 jours et 90 ans avec un âge moyen de 23 ans.
La fiche technique de chaque sujet participant à l’étude comprend le nom prénom du malade, le sexe, l’âge, l’origine géographique, l’activité professionnelle, le motif de consultation et le service d’hospitalisation (voire annexe 4).
III.1.2. Conditions de prélèvements
Les prélèvements constituent une étape cruciale pour la qualité des résultats. Le recueil des selles se fait le matin dans un pot en plastique propre et sec à large ouverture.
Certaines précautions sont conseillées avant l'examen parasitologique des selles à savoir:
- Arrêter l'absorption de certains médicaments tels que le charbon, le bismuth, le kaolin, l'huile de paraffine pendant quelques jours avant l'examen.
- Attendre que l'examen ait été pratiqué avant de commencer les pratiques thérapeutiques.
- Ne pas manger de fruits à grains à pépins, ni légumes, car ils peuvent entraîner des confusions avec les parasites et gêner la lecture.
III.2. Méthodologie
III.2.1. Examens parasitologique des selles
L’examen parasitologique des selles standard comporte 3 étapes essentielles; l’examen macroscopique, l’examen microscopique directe et après concentration. Parfois il faut procéder à des techniques de coloration pour bien identifier certaines formes ou espèces de protozoaires.
III.2.1.1. Examen macroscopique
Cet examen nous a permis de noter d'une part la couleur et la consistance des selles, d'autre part l'existence d'éventuels parasites tels que les femelles d’oxyure, les adultes d'ascaris et les anneaux de Tænia.
La consistance des selles est importante à considérer car, c’est généralement, dans les selles liquides que l’on peut trouver les formes végétatives des protozoaires, il faudra dans ce cas, d’une part, traiter rapidement le prélèvement car les formes végétatives sont fragiles et d’autre part procéder à des colorations spécifiques nécessaires à l’identification de certains parasites comme Cryptosporidium sp..
III.2.1.2. Examen microscopique directe
L’examen microscopique direct se fait après dilution des selles dans un verre à pied, un échantillon de selles (environ la taille d’une noisette) prélevé à l'aide d'une baguette en verre est dilué dans de l’eau physiologique, puis examiné au microscopie optique sous divers grossissement (voire annexe 01)
Lorsque les selles sont liquides ou glaireuses, la dilution n'est pas nécessaire.
III.2.1.3. Examen après concentration
Les techniques de concentration ont pour but de mieux séparer les éléments parasitaires, des autres constituants des matières fécales et donc de concentrer les parasites dans un faible volume pour faciliter l’examen microscopique
Il existe plusieurs méthodes de concentrations, telles que, les méthodes physiques de sédimentation (technique de Faust), et de flottaison (Technique de Willis), les méthodes diphasiques qui utilisent deux liquides non miscibles (technique de Bailenger, technique de Ritchie) et les méthodes combinées qui consistent à l’’utilisation successive d’une technique diphasique et d’une technique de flottation, mais ces dernières sont abandonnées pour l’utilisation de produits toxiques (VIVIANE, 2007 ; BOUCHENE, 2012).
Nous avons opté pour la technique de Ritchie modifiée pour sa simplicité, sa facilité d’exécution et son efficacité, de plus, elle ne demande que des réactifs disponibles, à la portée de tous.
- Méthode de Ritchie modifiée
La technique de Ritchie modifié par ALLEN et RIDLEY (1981) est une technique de sédimentation basée sur le coefficient de partage des particules suivent leur densité, les éléments dont la balance hygro - Hydrophile penche vers les groupements hydrophiles vont être dans la phase aqueuse et descendre vers le culot et les groupements dont la balance penche vers les groupements lipophile vont se diriger vers l’éther (MERAD, 2011).
C'est une méthode qui consiste à :
- mélanger dans un verre à pied, une noisette de selles dans environ 10 volumes de solution de formol à 10% (la quantité de solution formolée dépend de la consistance de la selle) jusqu'à l'obtention d'une solution homogène
- verser le mélange dans un tube conique à centrifugation, environ 2/3 du volume ; - ajouter un tiers du volume total en éther ;
- boucher le tube et agiter vigoureusement pendant une minute, jusqu'à obtention d'une émulsion homogène ;
Ether Débris
Phase aqueuse
Culot - centrifuger à 1500 tours pendant 2 à 3 minutes.
On obtient quatre phases à savoir : une couche éthérée chargée de graisses, une couche épaisse formée de débris lipophiles, une couche aqueuse constituée par le liquide de dilution et le culot contenant les parasites.
Fig. 12 Différenciation de quatre couches obtenues après application de la technique de Ritchie modifiée
- Eliminer le surnageant (les 3 premières couches supérieures) en retournant le tube avec délicatesse et on ne gardant que le culot.
- Prélever une goutte du culot sur une lame porte objet, poser la lamelle et observation au microscope à l'objectif G.x10 puis à l'objectif G.x40 pour identifier les éléments parasitaires présents.
III.2.2. Techniques de colorations
Les techniques de coloration sont de deux types, les colorations extemporanées (ou temporaire) entre lame et lamelle et les colorations permanentes
Les premières, à savoir les colorations extemporanées sont effectuées systématiquement après la dilution fécale, il suffit de mettre sur la lame une goutte de suspension fécale avec une goutte de colorant. La techniques qui nous avons utilisée est la technique du MIF (Merthiolate-Iode-Formol) et le Lugol.
Les secondes, à savoir les colorations permanentes, sont pratiquées après confection d’un frottis fécal, sont indispensables pour l’identification de Cryptosporidium spp., il existe un grand nombre de techniques de coloration. La technique utilisée dans notre étude est la technique de coloration de Ziehl Nelsson modifiée qui permet d’observer les oocystes de Cryptosporidium spp. (BOUCHENE, 2012 ; VIVIANE, 2007).
Il a noté que la technique de Zeihl Neelsen modifiée par HENRIKSEN et POHLENZ, en 1981, est réalisée après confection d’un frottis du culot obtenu à partir de la méthode de Ritchie modifié est faite par la manière suivante :
Confectionné à partir d’un culot de Ritchie - Séchage ;
- fixation pendant 5min au méthanol ;
- coloration dans la fuchsine phéniquée pendant 1 heur à froid ; - rinçage à l’eau de robinet ;
- différenciation dans un bain d’acide sulfurique à 2% pendant 20 secondes en agitant ; - rinçage à l’eau de robinet ;
- contre coloration pendant 5 min dans du vert malachite à 5%.
- rinçage et séchage puis lire observation à G. x100,
- les oocytes de Cryptosporidies apparaissent en rouge sur un fond vert (fig. 13).
III.3. Etude statistique
Les données des résultats d’analyses parasitaires sont traités avec le logiciel Excel et les tests de corrélation, tels le teste de Chi 2 et celui de l’A.F.C. Par l’appui du logiciel Statistica version 6.0, ces tests nous ont permis de calculer : les fréquences des variables (protozoaires, signes clinique, consistance des selles) et le seuil de signification « p » entre les différentes espèces de protozoaires intestinaux. Et ce en fonction de certains paramètres tels que l’âge, le sexe, consistance des selles et l’absence et la présence des signes cliniques. Les interprétations sont basées sur les valeurs de p dans un intervalle de confiance (IC) de 95 % (p < 0,05 Significatif ; p > 0,05 Non Significatif).
