ETUDE DE QUELQUES PARAMETRES BIOCHIMIQUES CHEZ LES DONNEURS DE SANG PORTEURS ET NON PORTEURS DU PARASITE DE PALUDISME AU SUD DU BENIN

Texte intégral

(1)Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. REPUBLIQUE DU BENIN . MINISTERE D’ETAT CHARGE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE . UNIVERSITE D’ABOMEY-CALAVI . ECOLE POLYTECHNIQUE D’ABOMEY-CALAVI . DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE. POUR L’OBTENTION DE MASTER PROFESSIONNEL. THEME ETUDE DE QUELQUES PARAMETRES BIOCHIMIQUES CHEZ LES DONNEURS DE SANG PORTEURS ET NON PORTEURS DU PARASITE DE PALUDISME AU SUD DU BENIN Réalisé et présenté par : Augustin KPEMASSE Sous la direction de : Co-Directeur Dr Nicodème W. CHABI Maître-Assistant de Biochimie et de Biologie Moléculaire EPAC/UAC. Directeur de mémoire Pr. Ambaliou SANNI Professeur Titulaire de Biochimie et de Biologie Moléculaire FAST/UAC Jury. Pr Ludovic ANANI Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE Pr Honoré BANKOLE. Dr Julien G. SEGBO i Dr Nicodème W. CHABI. Année Académique : 2011-2012.

(2) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. DEDICACES. Je dédie ce travail à :  A ma petite famille Pour tous les sacrifices, toutes les peines et toutes les privations consenties pour la réussite de ce travail qui est le nôtre. Recevez ici tout mon attachement et que Marie notre Dame de Cana intercède pour nous auprès de son fils Jésus.  A mes parents Léon KPEMASSE et Jeanne DANSOUKPE A l’exemple de la sainte famille, vous m’aviez toujours guidé et soutenu pour la réussite de mes études. Recevez ici le témoignage de toute mon affection et de ma vive reconnaissance pour vos multiples peines. Amour filial.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. ii.

(3) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. REMERCIEMENTS Nos remerciements vont à l’endroit de :  Notre Maître de mémoire Professeur Ambaliou SANNI, Titulaire de Biochimie et Biologie Moléculaire, pour nous avoir permis de manipuler dans son laboratoire. Profondes gratitudes.  A notre Co-maître, Docteur Nicodème W. CHABI, Maître Assistant des Universités. Merci pour la spontanéité avec laquelle vous avez accepté suivre ce travail et un sincère merci pour l’encadrement et votre disponibilité.  Dr Pascal ATCHADE. Sincères remerciements pour avoir toujours joué votre rôle de parrain en nous aidant à avoir l’échantillonnage nécessaire pour ce travail. Profondes reconnaissances.  Tout le personnel des Centres Départementaux de la Transfusion Sanguine au sud du Bénin et du laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire à l’ISBA pour avoir nous accepté dans vos services.  Toutes les autorités à divers niveaux de l’EPAC, nos enseignants et biotechnologistes du département de Génie de Biologie Humaine qui se sont investis pour notre formation.  A mes frères, sœurs, cousins et cousines Ce travail est également le vôtre. Vos prières ne m’ont jamais fait défaut tout au long de mes études. Soyez rassurés de ma gratitude et de mon affection. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. iii.

(4) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. fraternelle. C’est un exemple que vous devez suivre et un repère que vous chercherez à dépasser.  Au couple Judith et Albert HOUNSOU Recevez ici l’expression de ma profonde gratitude pour votre soutien de tous les jours. Puisse Dieu vous bénir et vous garder.  A mes amis Paul BONI, Cyrile BADOU, Eric IDOHOU, Pierre GUINGUINNI, Jérôme DANSOU, Pascal KAGOUA, Ignace HOUNGLOBO, Paul VIDEGLA, Juste OKE, Désiré AZANGBE et leurs épouses. Vous êtes nombreux pour être cités. Soyez remerciés pour tous les efforts consentis à la réalisation de ce travail. Que Dieu reçoive chacune de vos prières et fasse de vous des artisans de paix.  Aux collègues de la troisième promotion de Master professionnel En souvenir des cinq années qui, j’en suis sûr, rappelleront notre vie en groupe et notre esprit d’unité. Je vous remercie et vous souhaite une excellente carrière.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. iv.

(5) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. HOMMAGES A NOS JUGES  Au président du Jury C’est un grand honneur pour nous de vous voir présider notre jury. Nous vous en sommes reconnaissant. Nous avons la certitude de parfaire ce travail avec votre aide et celle du jury que vous avez le mérite de présider. Recevez nos hommages les plus respectueux..  Aux membres du Jury En acceptant de juger ce travail, vous manifestez la volonté de faire avancer la science en général et la Biologie Humaine en particulier. Vos critiques et remarques serviront à améliorer ce travail dans le fond et la forme et ouvriront la voie à d’autres recherches complémentaires dans le domaine. Recevez l’expression de notre profonde gratitude.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. v.

(6) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. LISTE DES ABREVIATIONS WHO. : World Health Organization. PNLP. : Programme National de la Lutte contre le Paludisme. VIH. : Virus de l’Immunodéficience Humaine. FRP. : Faire Reculer le Paludisme. OMS. : Organisation Mondiale de la Santé. OUA. : Organisation de l’Unité Africaine. ELISA. : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. IFI. : Immunofluorescence Indirecte. HRP2. : Histidin-Rich Protein 2. PLDH. : Plasmodium Lactate Deshydrogenase. QBC. : Quantity Buffy-Coat. PCR. : Polymerase Chain Reaction. Hb F. : Hémoglobine F. Hb S. : Hémoglobine S. EDTA. : Ethylenediaminetetraacetic acid. HDL. : High Density Lipoprotein. VLDL. : Very Low Density Lipoprotein. LDL. : Low Density Lipoprotein. DO. : Densité Optique. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. vi.

(7) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. RESUME Le paludisme est l'affection parasitaire due à un hématozoaire du genre Plasmodium transmis à l’homme par la piqûre d’un vecteur, le moustique femelle anophèle. Il occupe la première place des maladies infectieuses sur le plan mondial. Comme certains micro-organismes du sang, le Plasmodium peut être transmissible par la transfusion sanguine d’un donneur infecté à un receveur. Notre étude a pour objectif de rechercher la qualité du sang collecté dans nos centres départementaux de transfusion sanguine. De mai à décembre 2012, 2515 échantillons de sang ont été collectés chez les donneurs bénévoles dans les départements au sud du Bénin. 284 échantillons ont été positifs à la goutte épaisse ; soit 11,3% de parasitémie due au Plasmodium. De ces cas positifs, 58 dont la parasitémie est supérieure ou égale à 100p/µL ont été sélectionnés pour la recherche de certains paramètres biochimiques. 58 autres déclarés négatifs au Plasmodium ont été aussi choisis comme témoins. Les résultats ont révélé qu’il y a un nombre important de donneurs positifs à Plasmodium qui souffrent d’une hypoglycémie (22,4%), hypo-protidémie (37%), hypocholestérolémie vraie. (HDL. 23,3%) et d’une hyperglycémie retrouvée chez les donneurs à Plasmodium négatif (11,2%). La présente étude pourrait alors permettre d’insérer dans le bilan biologique des donneurs, la recherche du Plasmodium et le dosage de quelques paramètres biochimiques en République du Bénin. Mots clés : Donneurs de sang - Plasmodium - paramètres biochimiques. SUMMARY Malaria is the parasitic affection due to a hematozoaire of the Plasmodium transmitted to man by the puncture of a female mosquito, the anopheles. It is the first of the infectious diseases world-wide. As considerable micro-organisms of blood, Plasmodium can be transmitted by the transfusion of the blood donor infected to a receiver. Our study aims to look the quality of blood collected to transfusion in our centers from blood donors. From May to December 2012, 2515 subjects were recruited among blood donors at blood southern centers’s departments of Benin. Their blood is collected and analysed for parasitemia of Plasmodium. 284 samples were declared Plasmodium positive (11,3%). Among those, 58 samples, which parasitemia is higher than 100p/µL were selected for the screening of biochemical parameters. 58 others samples with Plasmodium negative are selected also as controls. The results revealed that there is a significant number of donors with Plasmodium positive who suffer from a hypoglycemia (22,4%), hypo-protidemia (37%), true hypocholesterolemia(HDL 23,3%) and hyperglycemia showed in donors with Plasmodium negative (11,2%). The present study could then allow insert in the biological assessment of the donors, the research of Plasmodium and the proportioning of some biochemical parameters in Republic of the Benin. Key words: Blood donors - Plasmodium - biochemical parameters.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. vii.

(8) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. SOMMAIRE INTRODUCTION I- GENERALITES 1- 1 Le paludisme 1- 2 Le paludisme transfusionnel 1- 3 Quelques effets biochimiques du Plasmodium II- CADRE ET METHODES 2- 1 Cadre 2- 2 Méthode de travail III- RESULTATS ET DISCUSSION CONCLUSION SUGGESTIONS. Réalisé. viii. et. soutenu. par. Augustin. KPEMASSE.

(9) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. INTRODUCTION Le paludisme est l'affection parasitaire due à un hématozoaire du genre Plasmodium transmis à l’homme par la piqûre d’un moustique femelle anophèle vecteur. Quatre espèces de Plasmodium sont pathogènes pour l’homme. Parmi elles, Plasmodium falciparum est l’espèce la plus répandue et la plus dangereuse parce qu’elle peut être responsable des formes mortelles de paludisme. Il occupe la première place des maladies infectieuses sur le plan mondial. En Afrique, on estime à 200 millions le nombre de malades et à un million le nombre d’enfants qui en meurent chaque année, ce qui correspond à un décès toutes les 30 secondes (WHO, 2008). Au Bénin, le paludisme a une prévalence de 36,8% surtout chez les enfants de moins de 5ans (PNLP, 2011). Actuellement, il existe une aggravation du risque lié à cette infection ; ce qui est dû au changement climatique mondial, à la dégradation des services sanitaires, aux conflits armés, au déplacement massif de populations et à l’apparition de souches plasmodiales multi résistantes (Candolfi, 2005). Comme bon nombre de micro-organismes véhiculables par le sang, le Plasmodium peut être transmis. par la transfusion. sanguine d’un donneur. infecté à un receveur. Cependant, si des efforts sont réalisés sur le continent africain vis-à-vis d’agents épidémiques tels que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et les virus des hépatites B et C, les parasitoses sanguines sont encore peu prises en compte dans les stratégies de sécurité transfusionnelle (Tayou et al., 2007). Au Bénin, cette recherche demeure inexistante dans les centres de transfusion sanguine. C’est pourquoi nous avons envisagé d’entreprendre ce présent travail chez des donneurs bénévoles de sang afin de rechercher le. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 1.

(10) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. parasite et d’étudier quelques paramètres biochimiques qui seraient impliqués à son existence dans l’organisme humain. Pour ce faire nous nous sommes fixés comme objectif général d’étudier l’impact du portage ou non de Plasmodium sur quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang et de façon spécifique de: o Déterminer les caractéristiques socio - démographiques des donneurs de sang à goutte épaisse positive au sud du Bénin; o Etablir le profil biochimique des donneurs de sang à travers le dosage de la glycémie, de la protidémie, de la cholestérolémie, des triglycérides et rechercher leur taux d’hématocrite ; o Etablir un lien entre la présence du Plasmodium et les paramètres biochimiques dosés.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 2.

(11) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. PREMIERE PARTIE. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 3.

(12) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. I - GENERALITES 1-1 Le paludisme 1-1-1 Définition Le paludisme venant du mot latin palus, (marécage) est une protozoose due à un hématozoaire du genre Plasmodium. C’est une maladie parasitaire transmise par la piqûre d’un moustique du genre anophèle. Deux milliards de sujets sont exposés à travers le monde et on compte 300 à 500 millions de cas d’affection parmi lesquels 1,5 millions de morts sont enregistrés par an surtout en Afrique Noire (PNLP/Cameroun, 2007). Maladie fébrile, hémolysante et endémique, elle est la troisième cause de mortalité en pathologie infectieuse ou parasitaire. C’est la plus fréquente des fièvres tropicales et demeure la première cause de consultation dans nos formations sanitaires (WHO, 2012). 1-1-2 Historique Le paludisme est l’une des maladies connues depuis la haute antiquité. Le 06 novembre 1880, Charles Louis Alphonse Laveran, un médecin de l’armée française a découvert le parasite responsable de la maladie en examinant des échantillons de sang au microscope en Algérie. Le 18 décembre 1897, le British Medical Journal signalait que Ronald Ross avait découvert des kystes paludéens dans les parois de l’estomac d’anophèle ayant piqué un malade atteint du paludisme (Razakandrainibe, 2007). Marchiafva, Celli et Golgi distinguent en 1898 trois espèces de Plasmodium chez l’homme : Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax (Flamarion, 1995). Une quatrième espèce plasmodiale : Plasmodium ovale est isolée en 1922 par Stephens. Les recherches immunologiques pour obtenir une immunoprophylaxie et une immunothérapie qui, dans l’esprit d’un grand nombre de chercheurs,. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 4.

(13) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. prendront un jour le pas sur la chimiothérapie. Des essais de vaccination chezl’homme sont en cours (Loban, 1999). L’avènement « Faire reculer le paludisme (FRP) » en Afrique lancé par l’OMS en 1998 a contribué à revoir la vision de la lutte contre le paludisme. En effet, à l’issue du sommet d’Abuja sur la problématique du paludisme en 2000, les chefs d’Etats et de gouvernements de l’Organisation de l’Unité Africaine (OUA) ont décidé de donner une nouvelle orientation à la lutte contre le paludisme afin de soutenir l’initiative « FRP ». Le principal objectif issu de ce sommet d’Abuja était de réduire de 50% jusqu’en 2010 la morbidité et la mortalité imputables au paludisme (OMS, 2001). 1-1-3 Epidémiologie et mode de contamination Le paludisme est l’une des maladies transmissibles les plus répandues dans le monde. Sa propagation suppose l’existence de la source et des vecteurs de l’infection, d’une population réceptive et de facteurs climatiques favorables. La reproduction des vecteurs de la maladie s’effectue de façon continue, permettant ainsi une transmission presque permanente du paludisme. Dans les zones d’endémie, les porteurs de parasites apparemment sains servent longtemps de sources d’infection ; car, en l’absence de signes cliniques de la maladie, ils ne suivent pas le traitement. Cependant, chez les adultes immunisés, le pouvoir infectant des gamétocytes paraît être inférieur à celui que l’on rencontre chez les enfants non immunisés (Flamarion, 1994). Dans les conditions naturelles, les agents pathogènes du paludisme sont transmis par les moustiques du genre anophèle. La propagation du paludisme est souvent favorisée par les activités économiques de l’homme notamment par la mise en valeur de nouvelles terres et. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 5.

(14) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. par l’irrigation qui crée pour les moustiques un grand nombre de gîtes larvaires artificiels. Selon l’OMS en 2012, les groupes de population les plus spécialement à risque sont:  les jeunes enfants vivant dans des zones de transmission stable qui n’ont pas encore développé une immunité les protégeant contre les formes les plus sévères de la maladie.  les femmes enceintes non immunisées; le paludisme entraîne des taux élevés de fausses couches et peut provoquer des décès maternels.  les femmes enceintes semi-immunisées dans les régions de forte transmission. Le paludisme peut entraîner des fausses couches et un faible poids de naissance chez le nouveau-né, en particulier lors de la première et de la seconde grossesse.  les femmes enceintes semi-immunisées infectées par le VIH dans les zones de transmission stable ont un risque accru de contracter le paludisme pendant toute leur grossesse. En cas d’infection palustre du placenta, ces femmes ont aussi un risque plus élevé de transmettre l’infection à VIH à leurs nouveau-nés.  les personnes vivant avec le VIH/sida.  les voyageurs internationaux en provenance de régions exemptes de paludisme car ils ne sont pas immunisés.  les immigrants venus de régions d’endémie et leurs enfants qui vivent dans des zones exemptes de paludisme et qui retournent dans leur pays d’origine pour y rendre visite à des amis ou à de la famille sont également exposés, car leur immunité a diminué ou disparu. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 6.

(15) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. La contagion accidentelle peut avoir lieu pendant la transfusion sanguine si le sang est prélevé chez des personnes porteuses du parasite. La contagion lors de l’accouchement est aussi possible. Lors du décollement du placenta, pendant la mixtion du sang de la mère et du fœtus ou pendant le passage du fœtus par les voies maternelles en cas de traumatisme obstétrical : déchirure du col utérin ou déchirure périnéale. Pour fixer le niveau d’endémie on se base sur 3 indices : - Indice splénique : nombre de splénomégalies. - Indice plasmodique : nombre de sujets avec des hématozoaires sanguins - Indice immunologique : nombre de sujets à sérologie positive (PNLP/ Cameroun, 2007). Et selon, l’indice splénique, l’OMS a distingué quatre types de foyers endémiques. - Paludisme hypoendémique : l’indice splénique chez les enfants âgés de 2 à 9 ans atteints 10% ; - Paludisme mésoendémique : l’indice splénique chez les enfants de 2 à 9 ans est de 11 à 50% ; - Paludisme hyperendémique : l’indice splénique chez les enfants du même âge est constamment supérieur à 50% et se maintient au même niveau chez les adultes ; - Paludisme holoendémique : l’indice splénique chez les enfants de 2 à 9 ans est constamment supérieur à 75% (Loban, 1999). 1-1-3-1 Cycle biologique du parasite Au cours de son repas sanguin, l’anophèle femelle inocule de la salive contenant des sporozoïtes (10µ sur 1µ). Une demi-heure après l’inoculation, les sporozoïtes pénètrent dans les cellules hépatiques et deviennent des hépatozoïtes. En sept jours pour Plasmodium falciparum, dix jours pour. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 7.

(16) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. Plasmodium vivax, l’hépatozoïte se divise activement déformant la cellule hépatique qui devient le corps bleu avec plusieurs mérozoïtes à l’intérieur. Le schizonte hépatique éclate et libère les mérozoïtes qui iront parasiter les globules rouges. C’est l’amorce du cycle érythrocytaire. Une fois à l’intérieur du globule rouge, le mérozoïte prend le nom de trophozoïte. De forme amiboïde et mobile dans le globule rouge, il grandit ; le noyau s’étire puis se fragmente après segmentation du cytoplasme du trophozoïte. Au bout de 48 heures à 72 heures, le globule rouge est rempli de mérozoïtes accolés les uns aux autres. Il se forme un corps en rosace ou schizonte intra-érythrocytaire mûr. L’hématie hôte éclate et libère un grand nombre de mérozoïtes qui vont parasiter à leur tour des hématies saines. La destruction d’hématies palustres induit l’accès fébrile. Plus ou moins longtemps après l’infestation des hématies, apparaissent dans les globules rouges des gamétocytes mâles et femelles. Une fois ingérés par l’anophèle au cours de son repas sanguin, les gamétocytes mâles et femelles se transforment respectivement en microgamètes et en macrogamètes. La fécondation a lieu entre ces gamètes et aboutit à la formation d’un œuf mobile ou ookinète qui pénètre dans la paroi gastrique du moustique pour se transformer en oocyste mûr rempli de sporozoïtes. Après rupture de l’oocyste, les sporozoïtes libérés vont se loger dans les glandes salivaires de l’anophèle qui devient infectieux. La durée de ce cycle dépend de la température et de l’espèce plasmodiale (Eichner, 2009). Voir figure du cycle à la page suivante.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 8.

(17) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. Figure n°1 : Cycle du plasmodium (PNLP/Cameroun, 2007). Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 9.

(18) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. 1-1-4 Diagnostic biologique du paludisme 1-1-4-1 Diagnostic de présomption Hémogramme L’hémogramme montre une anémie de type hémolytique, normochrome normocytaire ou macrocytaire avec une réticulocytose. On peut retrouver une leucopénie. remplacée. parfois. par. une. hyperleucocytose. modérée. à. polynucléaires neutrophiles et une thrombopénie en rapport avec la séquestration splénique des plaquettes dans le paludisme à Plasmodium falciparum mais aussi lors des accès à Plasmodium vivax et Plasmodium ovale. Les tests immunologiques Les méthodes immunologiques permettent le dépistage sérologique du paludisme (ELISA, IFI…). Tests de diagnostic rapide Il existe trois groupes d’antigènes décelés par les tests de diagnostic rapide actuellement disponibles (Agueh et al., 2010) : - la protéine HRP2 (Histidine-Rich Protein2), spécifique de Plasmodium falciparum - pLDH (Plasmodium Lactate Déshydrogénase) - l’aldolase spécifique du genre Plasmodium.. 1-1-4-2 Diagnostic de certitude Il repose essentiellement sur la mise en évidence des hématozoaires dans le sang et permet d’apporter la certitude parasitologique du diagnostic. Le frottis sanguin Le frottis sanguin consiste à étaler une petite quantité de sang sur une lame en verre, de manière à obtenir un étalement mince et régulier sur toute la. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 10.

(19) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. longueur de la lame. Cette technique permet de conserver la structure des hématies. La lecture des lames s’effectue après coloration au May Grunwald Giemsa ; le cytoplasme des parasites apparaît alors en bleu-violet, le noyau en rose-rouge, le pigment en bleu foncé-noir. Les parasites sont identifiés à l’aide des critères spécifiques à chaque espèce. La densité parasitaire est évaluée en comptant le nombre de globules rouges parasités par champ, rapporté au nombre total d’hématies par champ. La goutte épaisse Elle est réalisée à partir d’une goutte de sang écrasée à l’aide d’un geste circulaire, conduisant à l’éclatement des hématies. Avant coloration au May Grunwald Giemsa, la goutte épaisse doit être séchée à la température ambiante. Les parasites sont observés de manière extracellulaire alors que les globules blancs gardent leur structure. La densité parasitaire est évaluée par rapport au nombre de globules blancs. Elle permet d’apprécier la parasitémie par la connaissance du nombre de parasites par microlitre sur la goutte épaisse. Elle permet également de : - déterminer la charge parasitaire du départ et de suivre l’évolution de la maladie; - évaluer l’efficacité thérapeutique des antipaludiques utilisés; - détecter dans un but épidémiologique, l’apparition des cas de chimiorésistances. Le frottis sanguin et la goutte épaisse peuvent se faire sur le buffy-coat. Ce qui permet de concentrer davantage les parasites au quadruple (Agueh et al 2010). La figure suivante nous montre les différents stades du Plasmodium sur frottis mince.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 11.

(20) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. Figure n°2 :. Plasmodium. à. divers. stades sur. EPAC/2013. l’étalement. mince. (PNLP/Cameroun 2007) Le QBC (Quantitative Buffy-Coat) Ce test réalise une coloration à l’état frais par l’acridine orange des éléments nucléés du sang, séparés en fonction de leur densité par gravimétrie en tube micro capillaire de précision. La lecture s’effectue après excitation par une source lumineuse appropriée (UV). Ce test a prouvé toute son efficacité en pratique, mais nécessite un microscope à fluorescence (Agueh et al., 2010).. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 12.

(21) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. II- LE PALUDISME TRANSFUSIONNEL 2-1 Historique du paludisme transfusionnel Le risque de la transmission du paludisme par transfusion a longtemps été méconnu et sous-estimé. Mais c’est un fait réel qui a son importance à la fois dans les pays endémiques où les femmes enceintes et les enfants sont les plus touchés. C’est en 1911 que Woosley a décrit le premier cas du paludisme posttransfusionnel aux Etats-Unis dû à une transfusion de bras à bras (Candolfi, 2005). L’agent responsable s’avérait être du Plasmodium vivax. Puis dans les années qui suivirent, de nombreux cas de paludisme post-transfusionnel ont été rapportés, dont certains ont abouti à des décès par accès pernicieux. En 1946, en Chine, Chen rapporte 21 cas de paludisme posttransfusionnel et suggère de mettre tous les patients receveurs sous quinine avant la transfusion. Cela a constitué la première méthode de prévention véritable du paludisme post-transfusionnel (Kitchen et al, 2006).. 2-2 La contamination par la transfusion sanguine Comme bon nombre de micro-organismes du sang, le Plasmodium peut être transmis par la transfusion du sang d’un donneur infecté à un receveur. Cependant, si des efforts sont réalisés sur le continent africain vis-à-vis d’agents épidémiques tels que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et le virus des hépatites B et C, les parasitoses sanguines sont encore peu prises en compte dans les stratégies de sécurité transfusionnelle (Tayou et al., 2007). En zone tropicale, le paludisme a pourtant toujours été l’une des principales infections transmissibles par la transfusion. Des études plus récentes, ont confirmé l’importance du risque transfusionnel du paludisme en Afrique. En 2000, au Bénin, une enquête chez 355 candidats au don en bonne santé Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 13.

(22) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. apparente montra la présence du parasite avec une prévalence de 33,5% de cas chez les donneurs (Gazard et al., 2000). En 2005, au Nigéria, 30,2% de 444 donneurs avaient une goutte épaisse positive (Okocha et al., 2005). Le risque transfusionnel de paludisme semble essentiellement lié à l’administration du sang total ou du culot globulaire, le Plasmodium vivant en effet principalement dans le globule rouge (Mungai et al., 2001). Malheureusement les principales indications transfusionnelles en Afrique que sont l’anémie de l’enfant et celle de la femme enceinte, reposent généralement sur le sang total ou le concentré de globules rouges. (Tayou et al., 2007).. 2-3 La sélection clinique du donneur La majorité des pays industrialisés répartissent en deux groupes les donneurs à risque de paludisme : d’un côté, les individus ayant passé leurs premières années de vie en zone endémique et ceux qui y sont nés : de l’autre, les individus vivant ordinairement en zone non endémique mais ayant séjourné, plus ou moins récemment, en zone impaludée. Le premier groupe est exclu du don pour en moyenne trois années ou même plus, selon les pays, définitivement. Les candidats au don appartenant au second groupe sont souvent exclus dès leur retour pour un délai allant de quatre mois à trois ans, sous réserve que leur test sérologique anti-palustre soit négatif après ce délai. Certains pays excluent définitivement ces candidats s’ils ont résidé plus de six mois en zone à risque. Cette stratégie de sélection des donneurs, en fonction d’un facteur de risque individuel associé à des diagnostics sérologiques de plus en plus sensibles, a considérablement diminué le risque de paludisme transfusionnel dans les divers pays européens; mais si ce risque est fortement réduit, il n’est pas totalement écarté (Garraud. et al., 2004). Grâce à la sélection rigoureuse, le taux. d’exclusion des candidats au don après dépistage sérologique spécifique est dans. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 14.

(23) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. une fourchette basse (0,003-0,43%) pour les dons de sang effectués en Europe au cours de l’année 2005 (Hergon et al., 2006). Cette procédure de sélection des donneurs est d’application quasi impossible sur le continent africain, où la prévalence du paludisme est particulièrement élevée et où une sélection stricte des candidats au don réduirait d’au moins un tiers la quantité de sang disponible, déjà très inférieure aux besoins estimés. Dans le questionnaire pré-don, de nombreux centres transfusionnels africains, figurent en bonne place la notion de fièvre récente ou en cours, en vue d’écarter les candidats au don développant une infection fébrile, quelle qu’elle soit la cause (Dodd. et al., 1998). Quant aux autres formes cliniques du. paludisme, qu’il s’agisse de l’accès palustre pernicieux (caractérisé par sa sévérité symptomatique et ses manifestations neurologiques), de la fièvre bilieuse hémoglobinurique, de la splénomégalie tropicale idiopathique et du paludisme viscéral évolutif, elles constituent des critères d’exclusion à travers l’entretien et l’examen médicaux pré-don et surtout par l’auto-exclusion à laquelle est sensibilisé le donneur africain (Schreiber, 1996). On ne peut en revanche tabler sur cette notion d’auto-exclusion chez le sujet impaludé asymptomatique, qu’aucun élément du questionnaire pré-don ne permet d’identifier. La phase d’incubation cliniquement silencieuse est pourtant l’une des périodes pendant lesquelles le sujet peut se présenter pour effectuer un don de sang. Apparemment sain, un tel donneur est contaminant pour le receveur pendant cet intervalle qui sépare la contamination et les premières manifestations cliniques, et varie. de neuf à vingt jours selon les espèces. plasmodiales (avec P.malariae, il pourrait même durer quelques années) (Greenwood et al., 2002). Par ailleurs, le sujet qui vit depuis toujours en zone endémique a pu développer, au fur et à mesure des infestations répétées (par Plasmodium falciparum), un état d’immunité relative : sans présenter de. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 15.

(24) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. symptomatologie clinique évocatrice de paludisme, il peut présenter une parasitémie très faible et doit être considéré comme un porteur asymptomatique susceptible de contaminer des receveurs s’il donne son sang. Face à de telles situations, l’entretien et l’examen étant inopérant, le dépistage de l’infection ne peut se reposer que sur des tests biologiques. 2-4 La qualification biologique du don de sang Le diagnostic biologique du paludisme effectué en pré-don, s’il est systématique dans la plupart des pays industriels chez les donneurs à risque, reste embryonnaire en Afrique, malgré le caractère endémique de la maladie. Les outils diagnostics disponibles sont directs et d’autres indirects (Nahlen et al., 2002). La mise en évidence directe du parasite peut se faire sur une goutte épaisse après coloration au Giemsa ; cette technique permet de quantifier les parasites présents dans le sang en petite quantité. Pour mieux mettre en exergue les parasites chez les donneurs qui sont asymptomatiques, cette goutte épaisse se fait sur le buffy-coat afin de les trouver même s’ils sont très rares (Agueh et al., 2010). De nombreux laboratoires des centres de transfusion sanguine des pays industrialisés. préfèrent. recourir. à. un. outil. diagnostic :. le. test. immunochromatographique, technique simple détectant, soit directement des antigènes du Plasmodium contenus dans le sang du donneur, soit indirectement des anticorps sériques spécifiques. La PCR (Polymerase Chain Reaction) a une légitimité dans la sécurité transfusionnelle vis-à-vis du risque de transmission de Plasmodium. En effet, un donneur de sang impaludé et asymptomatique peut ne pas être identifié par l’entretien pré-don. Cependant, il peut avoir une parasitémie trop faible pour être Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 16.

(25) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. accessible aux tests directs, et la sécurité basée sur un examen biologique indirect n’est pas complète en raison de l’existence de fenêtre sérologique. Dès lors, un dépistage génomique parasitaire pourrait être un recours dans les pays de haut niveau endémique d’autant plus que la technique apparaît plus sensible que les méthodes conventionnelles avec des sensibilités comprises entre 0,001 et 30parasites par microlitre (Berry et al., 2005). Les contraintes d’utilisation de la PCR la rendent cependant inaccessibles à la plupart des centres de transfusion sanguine africains et son emploi requiert un coût trop élevé pour les stratégies de sécurité transfusionnelle en Afrique qui dépendent quelques fois des aides des organismes internationaux. Au demeurant, la PCR peut être remplacée par l’examen microscopique d’une goutte de sang par un technicien expérimenté. Une étude a d’ailleurs montré une sensibilité de 95% et une spécificité de 100% de la goutte épaisse par rapport à la PCR (Swan et al., 2005). Enfin, l’altération de l’hémogramme, de la fonction rénale, hépatique ou cardiaque participe indirectement au diagnostic biologique et au pronostic de la maladie.. Un. nombre. significatif. de. donneurs. présente. des. profils. hématologiques pouvant être associés à des pathologies sous-jacentes telles que le paludisme. Ces anomalies ne sont cependant pas toujours détectées en routine par les banques de sang africaines. L’anémie, assez fréquente chez les candidats au don de sang en Afrique, est sans doute le premier élément indirect de suspicion d’un paludisme chez un donneur vivant en zone endémique, avant les autres parasitoses et les désordres nutritionnels. Au Cameroun une prévalence de 31% de donneurs anémiés fut observé en 2005 et 2006, 16,5% de donneurs avaient un taux d’hémoglobine en faveur d’une anémie ; dans la même série une thrombopénie, autre témoin indirect de paludisme, existait dans 15,9% des cas (Rajab et al., 2005).. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 17.

(26) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. 2-5 La prévention du paludisme transfusionnel Pour prévenir le paludisme transfusionnel, le dépistage des donneurs parasités associe l’entretien pré-don à un ou plusieurs tests de dépistage. La destruction du parasite dans la poche de sang ou le traitement antipaludéen chimioprophylaxique du donneur ou du receveur sont des mesures peu utilisées mais qui ont fait l’objet d’investigation en Afrique. L’introduction de sulfadoxine-pyriméthamine dans la poche de sang est un. moyen de. prévention recommandé par certains auteurs. L’efficacité de cette méthode a été évaluée en 2005 sur 90 dons de sang dans les conditions usuelles de prélèvement, d’analyse et de conservation (Ali et al., 2005). La dose de 180µg/L, habituellement bien tolérée chez les malades, s’est révélée hautement létale pour les parasites (99% de destruction dans les 24 heures de stockage) sans altérer les constituants du sang. Dans une autre étude la quinine a témoigné de la même efficacité (Ali et al., 2006). L’administration d’une chimioprophylaxie anti-palustre au receveur est plus souvent effectuée en raison de la simplicité de la méthode. Les principaux médicaments utilisés sont l’amodiaquine, la quinine, la sulfadoxinepyrémithamine ou des combinaisons à base de dérivés de l’artémisinine. Une dose curative est administrée au receveur par voie orale ou parentale. Le coût des tests de dépistage a été comparé au Kenya à celui de la chimioprophylaxie chez le receveur : 0,03 dollars US contre 1,4 à 6 dollars US pour le traitement anti-palustre du receveur en fonction du type de médicament utilisé (Tayou et al., 2006). Les moyens généraux que sont la lutte anti-vectorielle et le vaccin contre le paludisme qui est en expérimentation auraient pourtant un impact direct sur le risque transfusionnel du paludisme.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 18.

(27) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. III-. EFFET. DU. PARAMETRES. PLASMODIUM. BIOCHIMIQUES. SUR DE. EPAC/2013. QUELQUES. L’ORGANISME. PORTEUR DU PARASITE 3- 1 Métabolisme du glucose Les mérozoïtes, libres dans le plasma pendant quelques instants, doivent pénétrer dans un érythrocyte. Pour ce faire, il leur faut de l’énergie; ils utilisent alors le glucose du milieu externe en passant par la glycolyse qui est la dégradation du glucose en pyruvate : c’est la phase anaérobie de l’oxydation du glucose. Elle se retrouve chez presque tous les organismes. Mais le sort du pyruvate dépend des conditions dans lesquelles se trouve le parasite à savoir : aérobiose ou anaérobiose. La glycolyse se déroule en deux phases : la première qui est due à la transformation du glucose aux trioses phosphates (3-phosphate glycéraldéhyde) Durant cette phase, nous avons une consommation de deux molécules d’ATP. La deuxième phase ; c’est la transformation des trioses phosphates au pyruvate. Alors, le bilan énergétique de la glycolyse se résume en la consommation de deux molécules d’ATP respectivement durant la 1ère et la 3ème réaction. Durant la 1ère et la 2ème phase, nous avons la formation de quatre molécules d’ATP respectivement entre la 7ème et la 10ème réaction. La transformation d’une molécule de glucose en deux molécules de pyruvate s’accompagne d’un gain de deux molécules d’ATP. De plus, au niveau de la réaction 6 c’est-à-dire la transformation du glycéraldéhyde 3 phosphate en 1-3 biphospho glycérate, il y a formation de NADH : 2 molécules de NADH réduit.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 19.

(28) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. Donc le bilan énergétique final dépend de la ré-oxydation. Et le bilan énergétique global lors de la glycolyse est de 38 ATP. Or le parasite a besoin de cette énergie pour sa pénétration dans les érythrocytes et se multiplier. C’est ce phénomène qui crée une hypoglycémie chez l’hôte. Le même phénomène se passe au niveau des protéines et des lipides (PNLP/Cameroun, 2007). 3-2 Le Plasmodium dans le globule rouge La présence sur la surface du globule rouge de récepteurs spécifiques est indispensable pour que le mérozoïte puisse reconnaître sa cellule hôte. Ces récepteurs sont, dans le cas de P. vivax, des antigènes de groupes sanguins (glycoprotéines Duffy) et pour P. falciparum, des glycophorines (acide sialique en particulier). Grâce à la présence de ligands, le mérozoïte adhère d'abord par une quelconque partie de sa surface, puis il s'oriente de manière à ce que son pôle antérieur, qui est porteur des organites de pénétration, arrive en contact avec la paroi globulaire. Le contenu des rhoptries est alors déversé sur la membrane externe du globule rouge, provoquant l'invagination de celle-ci. A l'endroit de la jonction, de courts filaments sont visibles, unissant la surface de l'érythrocyte, riche à cet endroit en protéines intra-membranaires et la surface du mérozoïte. En ce qui concerne sa pénétration, le mérozoïte est aspiré par une invagination de la membrane globulaire qui forme une vacuole "parasitophore" dans l'érythrocyte. Celle-ci se referme derrière le parasite. Dans ce processus, le rôle du cytosquelette (chaînes permettant la cohérence et l'élasticité de la membrane érythrocytaire: spectrine, actine, ankyrine) est évidemment important. A l'intérieur du globule rouge parasité, la fabrication du supplément de membrane (bicouche lipidique) requis pour former la vacuole parasitophore au moment de la pénétration entraîne un besoin accru en lipides. Cette membrane. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 20.

(29) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. est très différente de la membrane globulaire externe: pas de particules intramembranaires, pas de protéines du cytosquelette, il y a une croissance forcée accompagnant l'accroissement de taille du parasite. D’où les modifications du métabolisme des lipides dans l’infection plasmodiale. P. ovale, P. vivax et P. malariae sont restrictifs dans le choix de leur cellule hôte. Les deux premiers ont une nette prédilection pour les réticulocytes et P. malariae préfère les globules rouges âgés de sorte que les parasitémies dépassent rarement 1 à 2%. P. falciparum, au contraire, envahit des globules rouges de tous âges et peut atteindre des parasitémies très élevées. C’est ce qui explique sa virulence par rapport aux autres espèces. Par ailleurs, le Plasmodium ingère plus de 80% de l'hémoglobine de sa cellule hôte par pinocytose et par l'action du cytostome. L'utilisation de l'hémoglobine, grâce à des protéases très spécialisées actives en milieu acide, n'est pas complète. La globine est scindée en acides aminés, utilisés au même titre que des acides aminés importés du plasma pour la synthèse protéique du Plasmodium. L’hème libéré de la molécule est aussitôt oxydé en protoporphyrine ferrique toxique et inhibitrice des protéases dans le cytoplasme du parasite. Une polymérisation intervient in situ sous l’influence de l’hème-polymérase produisant un matériel cristallin insoluble, l’hémozoïne ou pigment malarien qui précipite dans le cytoplasme du parasite au cours de la maturation. Les hémoglobines anormales, HbF impliquée dans les thalassémies et HbS causant la drépanocytose, seraient plus difficilement utilisables par P. falciparum au cours de son développement érythrocytaire. La schizogonie serait perturbée et la virulence du parasite s'en trouverait diminuée.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 21.

(30) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. Le Plasmodium absorbe également des acides aminés importés du plasma à travers la membrane globulaire dont la perméabilité augmente. De plus, il est capable d'en synthétiser lui-même, à partir des éléments les plus simples, comme les atomes de carbone du CO2. Certains auteurs ont prétendu que la malnutrition protéique grave serait "protectrice", le Plasmodium privé de certains métabolites essentiels freine alors sa multiplication (Wery, 1992). Le transport du glucose en provenance du plasma est accéléré au niveau, à la fois, de la membrane érythrocytaire (dont la perméabilité est par ailleurs augmentée) et de la membrane plasmatique du parasite grâce à une abondance de protéines assurant un transport actif du dextrose. Le Plasmodium fabrique une quantité importante de membranes, entourant les mitochondries, noyaux, cytostome, vacuoles alimentaires, rhoptries. La source des acides gras semble être le plasma: le globule parasité a en effet une teneur nettement augmentée en lipides. Vu l'importance du métabolisme des lipides dans l'infection plasmodiale, des investigations sont en cours pour déterminer l'importance éventuelle de l'avitaminose A sur la gravité du paludisme. Cette vitamine liposoluble ne pourrait-elle pas jouer un rôle dans la défense contre l'infection et conférer une protection contre les chocs oxydatifs qui l'accompagnent? D’autre part, les lipides de basse densité joueraient un rôle important dans le métabolisme des plasmodies au cours de cette phase du cycle, d’où l’hypothèse avancée que l’infection paludéenne protégerait contre les taux élevés de cholestérol plasmatique.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 22.

(31) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. DEUXIEME PARTIE. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 23.

(32) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. II- CADRE ET METHODES 2-1 Cadre Cette étude s’est déroulée dans: - Les centres départementaux de la transfusion sanguine de l’Atlantique Littoral, du Mono Couffo et de l’Ouémé Plateau où nous avons eu à effectuer les prélèvements chez les donneurs de sang. Cette opération de collecte a été financièrement et administrativement appuyée par Monsieur ATCHADE Pascal car les mêmes prélèvements sont utilisés par ce dernier pour une autre étude scientifique. - Le laboratoire de biochimie et de biologie moléculaire du Professeur SANNI Ambaliou sis à l’ISBA pour les différentes manipulations. 2-2 Méthode de travail 2-2-1 Nature de l’étude et type de population Il s’agit d’une étude transversale prospective à but comparatif réalisée chez 2515 donneurs de sang bénévoles au sud du BENIN de Mai à Décembre 2012. Elle a regroupé deux bras de populations à savoir : - les donneurs de sang bénévoles non parasités par le Plasmodium et ; - les donneurs de sang bénévoles parasités par le plasmodium. 2-2-2 Echantillonnage La taille de notre population était constituée de 2515 prélèvements de donneurs de sang chez qui nous avons recherché la présence ou non de. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 24.

(33) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. Plasmodium. C’est après cette étape que nous avons constitués les deux bras de notre population en tenant compte de certains critères. 2-2-2-1 Sélection des cibles Les personnes qui ont été incluses dans la présente étude ont rempli les conditions pour être donneurs de sang sans distinction de sexe, de conditions socioculturelles, socioéconomiques et ont répondu aux critères ci-après : Critères d’inclusion - Les donneurs de sang bénévoles non parasités par le Plasmodium (Groupe 1) : o Etre donneur de sang bénévole ; o Etre testé négative pour la goutte épaisse lors de l’étude. - Les donneurs de sang bénévoles parasités par le plasmodium (groupe 2) : o Etre donneur de sang bénévole ; o Etre dépistée positive pour la goutte épaisse lors de l’étude ; o Avoir une densité parasitaire supérieure ou égale à 100p/µL; o Pas de distinction de l’espèce plasmodiale. Critère de non inclusion - Avoir une densité parasitaire inférieure à 100p/µL ; - les critères de non qualification au don de sang à savoir : o Avoir une pathologie transmissible; o Avoir une au moins des constantes physiques anormale; o Avoir fait une vaccination qui date de trois mois.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 25.

(34) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. Ainsi au total l’étude proprement dite a porté sur 116 personnes soit 58 témoins (Groupe 1) et 58 cas dont la goutte épaisse est supérieure ou égale à 100 p/µl (Groupe 2) pour le dosage de quelques paramètres biochimiques : glycémie, protidémie, cholestérolémie totale, cholestérolémie HDL et triglycérides. Notons par ailleurs que sur les 2515 donneurs, nous avons obtenu 284 personnes dont la goutte épaisse était positive. 2-2-3 Démarche technique 2-2-3-1 Confection du frottis et de la goutte épaisse Sur chaque échantillon de sang pris sur anticoagulant EDTA, nous confectionnons un étalement mince long (2/3 de la longueur d’une lame porteobjet) et une goutte épaisse. L’étalement mince sert à déterminer l’espèce plasmodiale après que les parasites ont été observés sur la goutte épaisse et permet de compter facilement les globules rouges parasités. o Le matériel et les réactifs sont en annexe. o Technique Le frottis sanguin est réalisé sur la même lame que la goutte épaisse. La technique de confection et de coloration des lames se trouvent en annexe. o Lecture des lames Après coloration et séchage, nous faisons la lecture à l’objectif 100X à immersion. Nous comptons de façon simultanée les globules blancs et les parasites sur la goutte épaisse et l’espèce plasmodiale est identifiée sur le frottis sanguin. Nous passons alors au calcul de la densité parasitaire (DP), selon l’OMS, en utilisant la formule :. Avec Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 26.

(35) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. X : nombre de parasites comptés Y : nombre de leucocytes comptés N : nombre de leucocytes comptés dans un mm3 de sang. La valeur normale du nombre de globules blancs par mm3 oscillant entre 4000 et 8000, l’OMS a alors adopté N = 6000 et standardisé le calcul de la densité parasitaire qui revient à :. C’est donc cette formule que nous avons adoptée au cours de la lecture des lames. Pour une goutte épaisse positive, il nous faut compter 200 leucocytes et pour déclarer une lame de goutte épaisse négative, il faut compter au moins 500 leucocytes.. 2-2-3-2 Dosages biochimiques 2-2-3-2-1 Dosage de glycémie à la glucose-oxydase  Signification clinique Le glucose est la principale source d’énergie pour le corps humain. Le glucose d’origine alimentaire est converti soit en glycogène pour être stocké au niveau du foie, soit en triglycérides pour être stocké dans les tissus adipeux. La glycémie est régulée par l’action de deux hormones antagonistes : l’insuline et le glucagon. Le dosage du glucose sanguin est utilisé pour dépister des affections du métabolisme des hydrates de carbones telles que : le diabète, l’hypoglycémie néonatale et des pathologies pancréatiques.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 27.

(36) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013.  Principe Glucose oxydase. Glucose + O2. Acide gluconique + H2O2 Peroxydase. 2H2O2 + Phénol + 4-AAP. Quinonéimine + 4H2O. 4AAP = Amino-4-antipyrine  Réactifs Réactif : R Etalon à 1g/l Contrôle ELITROL Eau distillée  Mode opératoire Tubes. Blanc. Calibration. Réactifs Réactif. 1000µL. Eau distillée. 10µL. Etalon. 1000µL. Dosage. Dosage. contrôle. échantillon. 1000µL. 1000µL. 10µL. Sérum contrôle. 10µL. Echantillon. 10µL. Mélanger et incuber pendant 10min au bain-marie à 37°c avant de lire la densité optique au spectrophotomètre à 500nm. Le calcul de la concentration est fait en suivant la formule : x C étalon Valeurs normales : (0,70 – 1,10) g/L Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 28.

(37) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. 2-2-3-2-2 Dosage des triglycérides  Signification clinique Les triglycérides constituent 95% des graisses stockées dans les tissus et leur principal rôle est de fournir de l’énergie aux cellules. Ils sont synthétisés d’une part dans l’intestin à partir des graisses de l’alimentation et d’autre part dans le foie à partir des saccharides ingérés, puis sont transportés dans le sang par les chylomycrons et les lipoprotéines de très basse densité (VLDL). Des taux élevés de triglycérides conduisent à des risques importants d’athérosclérose. Ils peuvent être dus à des maladies telles que : hyperlipoprotéinémie, déficit d’activité lipase, déficit en apolipoprotéine.  Principe Les triglycérides sont hydrolysés en glycérol + acide gras. Le glycérol libéré réagit avec la glycérol kinase et la glycérol-3-phosphate oxydase en libérant de l’eau oxygenée par la réaction de Trinder. Lipoprotéine lipase. Triglycérides + H2O. Glycérol + Acides gras Glycérol kinase. Glycérol + ATP. Glycérol-3-phosphate + ADP GPO. Glycérol-3-phosphate + O2. H2O2 + DHA-P Peroxydase. H2O2 + 4-AAP + p-Chlorophénol. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. Quinonéimine. 29.

(38) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. Mode opératoire Tubes Réactifs. Dosage Blanc. Réactif. 1000µL. Eau distillée. 10µL. Etalon. Calibration 1000µL. contrôle 1000µL. Dosage 1000µL. 10µL. Contrôle. 10µL. Echantillon. 10µL. Mélanger, incuber au bain-marie à 37°C pendant 8min et lire à 500nm Valeurs normales : (0,60-1,60) g/L 2-2-3-2-3 Dosage de cholestérol  Signification clinique Le cholestérol est à la fois apporté par l’alimentation et synthétisé par le corps humain, principalement dans les cellules hépatiques et intestinales. Il entre dans la composition des membranes des organites et des cellules animales. Le cholestérol est également un précurseur métabolique des acides biliaires, de la vitamine D et des hormones stéroïdiennes. Il circule en associant à des lipoprotéines HDL, LDL, et VLDL. Son dosage permet de dépister une hypercholestérolémie. Les fortes concentrations en cholestérol sont associées à un risque élevé d’accident vasculaire et d’apparition d’athérosclérose. Le rapport LDL/HDL entre en ligne de compte dans l’évaluation des risques vis-à-vis des maladies cardio-vasculaires.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 30.

(39) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013.  Principe Cholestérol estérase. Cholestérol estérifié + H2O. Cholestérol + Acide gras Cholestérol oxydase. Cholestérol + O2. cholest-4-èn-3-one +H2O2 Peroxydase. 2H2O2 + Phénol + 4-AAP. Quinonéimine + 4H2O2.  Mode opératoire. Tube blanc Réactif. 1000µL. Eau distillée Etalon. Tube étalon Tube contrôle. Tube dosage. 1000µL. 1000µL. 1000µL. 10µL 10µL. Sérum contrôle Echantillon. 10µL 10µL. Mélanger, incuber au bain-marie à 37°C pendant 8min et lire à 500nm Valeurs normales : (1,60-2,60) g/L 2-2-3-2-4 Dosage du cholestérol HDL  Signification clinique La molécule du cholestérol HDL a pour mission d’assurer la purification du cholestérol depuis les membranes cellulaires. De nombreuses études épidémiologiques ont confirmé le rôle antiathérogène de cette fraction Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 31.

(40) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. conduisant à la notion de "bon cholestérol”. Le cholestérol HDL représente par conséquent un élément d’appréciation du risque athéromateux lorsqu’il existe un déséquilibre des rapports cholestérol total/cholestérol HDL.  Principe Les lipoprotéines de faible densité (LDL et VLDL) sont spécifiquement précipitées par l’acide phosphotungstique en présence d’ions magnésium. Après centrifugation, le cholestérol lié aux lipoprotéines de haute densité (HDL Cholestérol) est dosé dans le surnageant.  Mode opératoire  Précipitation Dans un tube à hémolyse, introduire Sérum. 500µL. Réactif A. 50µL. Mélanger au vortex et laisser au repos pendant 10min puis centrifuger à 4000 t/min pendant 15min.  Réaction Dans un tube à hémolyse, introduire : Réactif B : 1000µL Surnageant :. 50µL. Mélanger, lire la DO après 5min d’incubation à 37°C ou après 10min à température ambiante. Mesurer à 500nm Valeurs normales : ≥ 0,4 g/L. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 32.

(41) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. 2-2-3-2-5 Dosage des protéines totales  Signification clinique Dans le plasma humain, l’albumine représente 50 à 60% des protéines totales ; la fraction protéique restante est composée principalement de globulines (alpha1, alpha2, bêta et gamma). La majorité des protéines plasmatiques sont synthétisées par le foie, à l’exception des immunoglobulines. L’augmentation du volume plasmatique ou sa diminution induit respectivement des hypo protéinémie ou hyper protéinémie mineures. Pour un volume plasmatique normal, les taux anormaux en protéines totales s’observent uniquement en cas de désordre affectant la concentration en albumine ou en immunoglobulines. Ainsi, une insuffisance protéique sévère (malabsorption, mal digestion, apport alimentaire insuffisant), les maladies rénales et hépatiques peuvent entraîner une hypo protéinémie. Si la concentration en protéines totales est inférieure à 40g/L, des œdèmes peuvent être observés. Une hyper protéinémie peut être observée par exemple en cas d’hyper immunoglobulinémie (myélome, infection).  Principe Les protéines sériques forment un complexe coloré en présence de sel de cuivre en milieu alcalin. Protéine + Cu2+. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. complexe coloré. 33.

(42) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013.  Mode opératoire Tube blanc. Tube étalon. Tube contrôle. Tube dosage. Réactif. 1000µL. 1000µL. 1000µL. 1000µL. Eau distillée. 10µL. Etalon. 10µL. Contrôle. 10µL. Echantillon. 10µL. Mélanger et lire à 548nm après une incubation de 12min. Valeurs normales : (62 – 82) g/L. 2-2-4 Analyses des données L’analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel Excel de Microsoft.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 34.

(43) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. TROISIEME PARTIE. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 35.

(44) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. III - RESULTATS Notre échantillonnage est basé au départ sur 2515 prélèvements de sang de donneurs bénévoles sur lesquels la recherche des parasites du Plasmodium a été faite dans les trois départements au sud du Bénin. Suite à ce travail préliminaire, 58 échantillons positifs au Plasmodium falciparum à densité supérieure ou égale à 100p/µL ont été sélectionnés pour le dosage des paramètres biochimiques et 58 échantillons négatifs comme témoins. Nos différents résultats sont consignés sur les graphes ci-après.. 3000 2515 2500. 2231. 2000 1500 1000 500. 284 (11,3%). 0 GE +. GE -. TOTAL. Histogramme 1: Répartition des donneurs de sang en fonction du Plasmodium. Il ressort de ce graphe que sur les 2515 donneurs de sang, 284 cas de goutte épaisse sont confirmés ; soit une prévalence de 11,3% chez les donneurs de sang bénévoles.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 36.

(45) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin. EPAC/2013. Tableau1 : Répartition par sexe des donneurs porteurs et non porteurs du Plasmodium au sud du Bénin. MASCULIN. FEMININ. TOTAL. Positifs. 232 (9,2%). 52 (2,1%). 284 (11,3%). Négatifs. 1772 (70,5%). 459 (18,2%). 2231 (88,7%). Total. 2004 (79,7%). 511(20,3%). 2515 (100%). Il ressort de ce tableau que la population des donneurs est plus masculine. Soit (79,7%) d’hommes contre (20,3%) de femmes.. 70 59. 60 44 (37,9%). 50 40. hypo. 31. 26 (22,4%) 28. 30 20 10. 18. normo. (15,5%). hyper. 13. 9. 4. 0 GLY GE -. GLY GE +. total. Histogramme 2 : Etat glycémique des donneurs de sang bénévoles au sud du Bénin De ce graphe, il ressort que 37,9% des donneurs de sang sont hypoglycémiants. Ce qui est plus prononcé chez les donneurs à goutte épaisse positive ; soit 22,4% contre 15,5% chez les donneurs à goutte épaisse négative.. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 37.

(46) Etude de quelques paramètres biochimiques chez les donneurs de sang porteurs et non porteurs du parasite de Plasmodium au Sud du Bénin 90. EPAC/2013. 82 (70,7%). 80 70 60 50 40. hypo. 43 (37%). 39(33,7%). normo 29. 30 20. 15. 10. hyper. 14 4. 5. 1. 0 PRO GE -. PRO GE +. TOTAL. Histogramme 3 : Répartition des donneurs en fonction du dosage de la protidémie Cet histogramme montre que 70,7% de notre échantillonnage est en hypo protidémie. Par ailleurs cette hypo protidémie est légèrement plus remarquée chez les donneurs à goutte épaisse positive soit 37%. 120. 111. 100 80 60. 57. 54. normo hyper. 40 20 1 (0,9%). 4 (3,4%). 5 (4,3%). 0 CHOL GE -. CHOL GE+. TOTAL. Histogramme 4 : Répartition des donneurs de sang en fonction du cholestérol total. Réalisé et soutenu par Augustin KPEMASSE. 38.