Revue frangaise des ScltilGts DE I'EAU,2 ltS83l t89-t38
Mesure de la concentration en ATP dans une polyculture
A T P c o n c e n t r a t i o n m e a s u r e m e n t i n a p o l y c u l t u r e
A . G R A S M I C K * , P . G o R E T * , S . E L M A L E H *
R 6 s u m 6
L a c o n c e n t r a t i o n e n A T p p e u t 6 t r e u n i n d i c a t e u r u i i l , e d e [ ' a t i v i t 6 6 p u r a t r i c e . S a m e s u r e n e u t c e p e n d a n t s e r e v 6 t e r p r o b L 6 m a t i q u e . S . i x m e t h o d e s d r e x t r a c t i o n o n t 6 t 6 t e s t 6 e s s u r u n e c u l t u r e f i x 6 e d 6 n i t r i - f i a n t e : e t t e s s o n t t o u t e s c a u s e d ' e r r e u r s s y s t 6 m a t i q u e s o u b i e n I e s v a t e u r s t u e s n e s o n t p a s s t a b l e s d a n s [ e t e m p s . I L e s t p r o p o s 6 a t o r s d ' e f f e c t u e r [ ' e x t r a c t i o n a u D l , l s o e t d e s t a b i t i s e r p a r [ e t a m p o n g l . y - c i n e / M q E D T A - L a m 6 t h o d e s e r 6 v d t e s e n s i b t e e t s t a b t e a v e c u n e b o n n e r e p r o d u c t i b i L i t 6 -
S u m m a r y
A T P c o n c e n t r a t i o n m a y b e a n u s e f u t i n d i c a t i o n o f b i o l o g i c a I a c t i v i t y . I t s m e a s u r e m e n t h o w e v e r c a n r a i s e s o m e p r o b I e m s . S i x e x t r a c t i o n m e - t h o d s h a v e b e e n t e s t e d o n a f i x e d d e n i t r i f y i n g c u t t u r e : a [ [ i n t r o - d u c e s y s t e m a t i c e r r o r s a n d ( o r ) t h e r e a d v a l u e s a r e n o t s t a b t e . T t h a s t h e n p r o p o s e d t o e x t r a c t w i t h D M S O a n d s t a b i L i z e w i t h g l . y c i n e / M g E D T A b u f f e r . T h i s n e w m e t h o d h a s b e e n f o u n d s e n s i t i v e a n d s t a b t e w i t h a g o o o a c c u r a c y .
I rurRolucr t oru
L ' 6 p u r a t i o n b i o l o g i q u e m e t e n e x t r C m e m e n t c o m p f e x e s a s s o c i 6 e s f e v u r e s , c h a m o i g n o n s .
c e u v r e d e s p o l y c u l t u r e s b a c t 6 r i e n n e s d d ' a u t r e s o r g a n i s n e s - protozoaj_res,
r L a b o r a L o i r e d e G 6 n j e C h i m i q u e d e s S c i e n c e s e t T e c h n i q u e s c u 3 4 0 6 0 f l o n t p e l l i e r C 6 d e x ,
a n n l i n r r 6 a r r x F i n t c e h n n l n p i c s - l l n i r r c r s i f 6 L a n g u e d o c - P l a c e E . B a t a i l l o n -
1 0 n
Sciences de Lteau 2, no7
D a n s c e s c o n d i t i o n s , 1 a m e s u r e d e " l ' a c t i v i t 6 " d e I a c u l t u r e e s t s e u - l e m e n t a p p r o x i m 6 e d 1 ' a i d e d e g r a n d e u r s g l o b a b l e s t e l l e s q u e I a c o n c e n - t r a t i o n e n s o l i d e s o r g a n i q u e s g 6 n 6 r a l e m e n t u t i l i s 6 e d a n s l e c a l c u l d e s u n i t 6 s d ' . 6 p u r a t i o n .
O r , l e d i m e n s i o n n e m e n t e t I e s u i v i d e s u n i t 6 s r e q u i d r e n t u n e 6 v a 1 u a - t i o n p r 6 c i s e d u r 6 a c t i f h a b i t u e l l e m e n t d 6 s i - g n 6 p a r 1 e t e r m e g 6 n 6 r i q u e d e " d 6 c o m p o s e u r s " . C ' e s t p o u r q u o i , d e s t e c h n i q u e s p e r m e t t a n t d e m i e u x c e r n e r 1 ' a c t i v i t 6 1 1 ' u n e c u l t u r e o n t 6 t 6 p r o p o s 6 e s :
a ) I a n u m S r o t a t i o n d i r e c t e d e s m i c r o - o r g a n i s m e s a u m i c r o s c o p e o u e n m i l i e u 9 6 1 o s 6 e s t u n e m a n i p u l a t i o n f a s t i d i e u s e q u i e x i g e u n e b o n n e c l i s p e r s i o n d e s f l o c o n s e t q u i n e p e r m e t p a s t o u j o u r s d e d i s t i n g u e r 1 e s c e l l u f e s v i v a n t e s d e s c e l l u l - e s m o r t e s .
b ) l e d o s a g e d e c e r t a i n s c o n s t i t u a n t s d e I a c e l l u l e , t e l s q u e I ' a z o t e p r o t 6 i q u e o u l e s a c i d e s n u c l 6 i q u e s q u i s u b s i s t e n t d a n s I e n i l i e u a p r d s l a m o r t d e s c e l l u l e s , n ' a u t o r i s e p a s , n o n p 1 u s , 1 , a d 6 t e r m i n a - t i o n d e l a f r a c t i o n d ' o r g a n i s m e s v i v a n t s .
c ) L a m e s u r e d e l a c o n c e n t r a t i o n e n a d E n o s j - n e t r i p h o s p h a t e ( A T P ) r e f l - 6 t e b i e n 1 ' a c t i v i t 6 m 6 t a b o l i q u e d e s c e l l u l e s d ' a u t a n t p l u s q u e 1 ' A T P p r 6 s e n t d a n s l e m 6 t a b o l i s m e d ' u n e c e l l u f e e s t r a p i d e m e n t 6 1 i . m i n 6 5 I a m o r t d e c e l - l e - c i .
D e c e s t r o i s m 6 t h o d e s , s e u l 1 e d o s a g e d e 1 a c o n c e n t r a t i o n e n A T P p e r - m e t d e r e f l 6 t e r I ' a c t i v i t 6 d e s c e l l u l e s v i v a n t e s e t p a r c o n s 6 q u e n t d ' a p - p r o c h e r a u m i e u x I ' a c t i v i t 6 6 p u r a t r i c e .
c e d o s a g e e s t f o n d 6 s u r I e p r i n c i p e d e f a b i o l u m i n e s c e n c e m i s e n o e u - v r e d a n s d e s a p p a r e i l s p r 6 s e n t s s u r l e m a r c h 6 . L e s p o i n t s l e s p l u s d 6 1 i - c a t s d a n s l a t e c h n i q u e d e m e s u r e r e s t e n t , c e p e n d a n t , I ' e x t r a c t i o n d e 1 ' A T P d u m i f i e u p a r u n s o l v a n t e t l a s t a b i f i s a t i o n d e f a s o l u t i o n o b t e n u e .
N o u s n o u s p r o p o s o n s d e c o m p a r e r d i f f 6 r e n t e s m 6 t h o d e s d r e x t r a c t j - o n e t d e d 6 g a g e r u n e t e c h n i q u e o p t i m a l e d e d o s a g e e n m i l i e u 6 p u r a t e u r .
I - T r c H r u r 0 u E E X P E R I M E N T A L E
1 - 1 P r i n c i p e e t a p p a r e i l l a g e
L e p r i n c i p e d e l a m e s u r e r e p o s e s u r L a b i o l u m i n e s c e n c e q u i 1 6 s u l t e d ' u n e n s e m b l e d e p r o c e s s u s p r o d u c t e u r s d e p h o t o n s . L e r 6 a c t i f e n j e u e s t 1 e c o u p l e l u c i f 6 r i n e - f u c i f 6 r a s e , e x t r a i t d e I a l u c i o l e ( S T R E H L E R ,
l 9 ' 7 O ) , q u i n e r 6 a g i t q u ' e n p r 6 s e n c e d ' A T P ( t l a c E L R o Y e t c R E E l l , 1 9 5 6 ) . L r i n t e n s i t 6 f u m i n e u s e d e - l a l u r n i E r e 6 m i s e e s t p r o p o r t i o n n e l l e d L a q u a n t i t 6 d ' A T P d a n s I e m i l i e u ; 1 ' u t i l i s a t i o n d ' u n p h o t o m u l t i p l i c a t e u r , d a n s u n e c h a m b r e n o i r e , r e f i 6 i u n a m p l i f i c a t e u r p e r m e t d . e m e s u r e r 1 a c o n c e n t r a t i o n e n A T P .
L ' a p p a r e i l u t i l i s 6 p o u r I e s e s s a i s e s t I e l u m i n o m d t r e 1 2 5 0 L K B I n s t r u - m e n t .
I'lesure de La concentration en ATP dans une poLgculture
I - 2 C u l t u r e b a c t 6 r i e n n e
L e s e s s a i s s o n t e f f e c t u 6 s s u r u n e b i o m a s s e d e d 6 n i t r i f i c a t i o n d c e l l u l e s i m m o b i l i s 6 e s s u r d i s 6 e s .
p r 6 1 e v 6 e d a n s u n r 6 a c t e u r p a r t i c u l e s d e s a b l - e f l u i -
1 - 3 T e c h n i q u e s d ' e x t r a c t i o n
D e n o m b r . e u x t r a v a u x o n t 6 t 6 c o n s a c r 6 s d 1 a m e s u r e d e I ' A T P d a n s u n e p o l y c u l t u r e 6 p u r a t r i c e d e p u i s 1 9 7 0 ( P A T T E R S o N e t a L . , I 9 7 O ; BREZOUIK e t P A T T E R S O N , 1 9 7 1 ; C H r r r e t a L . , 7 9 ' 7 3 ; K E E S e t a L . , 1 9 7 5 ; L E V I N e t a L . , l g 7 5 ; T o B r N e L a L . , l 9 7 B ; K U C N E R o H r c z , l 9 7 a ; [ l A R T r N e t a L . ,
L 9 l e ) -
U n n o m b r e i n p o r t a n t d e m 6 t h o d e s d ' e x t r a c t j , o n d e I ' A T P d e s c e l l u l e s y s o n t p r o p o s 6 e s . T o u t e f o i s , p o u r 6 t r e v a l a b f e s , c e s m 6 t h o d e s d o i v e n t C t r e q u a n t i t a t i v e s , r a p i d e s e t p r 6 s e r v e r 1 ' A T P d e t o u t e d 6 g r a d a t i o n , t o u t e n b l o q u a n t I ' a c t i v i t S m 6 t a b o l i q u e , f e s c e l l u l e s .
S i x d e c e s m 6 t h o d e s o n t a i n s i 6 t 6 t e s t 6 e s ; e l l e s s o n t c o n s i g n 6 e s c i - d . e s s o u s ( t a b l e a u 1 ) e t e x p l i c i t 6 e s e n a n n e x e s .
?ebleau 1
Techniques d I ertraction choisies
M6thode I t i l i e u e x t r a c t r a n t R 6 f 6 r e n c e s
B
c
D
D I
E
N a 3 P o 4 + c h l o r o f o r m e
clycine,/Mg EDTA
T R I S / E D T A TCA,/EDTA TCA,/EDTA + 6ther DMSO + MOPS
' r o B I N e t a L . , ( 1 9 7 8 ) T O B I N e t a L . , ( 1 9 7 8 ) L E V r N e t a L . , Q 9 7 5 ) T H ] R E e t a L . , ( 1 9 7 8 ) T H O R E e t a L , , ( 1 9 7 3 ) J A C U B C Z A K e t a L . , ( 1 9 7 8 )
7 - 4 P r 6 p a r a t f o n d e s s o l u t i o n s d d o s e r
L ' 6 c h a n t i 1 1 o n e s t m 6 l a n g 6 a v e c l e m i l i e u e x t r a c t a n t d a n s u n b 6 c h e r . L e s c e 1 l u 1 e s s o n t d 6 t r u i t e s p a r t r a i t e m e n t a u x u l t r a s o n s p e n d a n t 4 5 s e - c o n d e s d u n e l o n g u e u r d ' o n d e d e 1 0 ]-m. Cette technique p r o v o q u e u n e e x c e l l e n t e h o r n o g 6 n i s a t i o n d u m i l i e u e t u n e b o n n e d i f f u s i o n C e I r A T P d a n s l e s o l v a n t . P a r a i l f e u r s , I e t r a i t e m e n t a s s u r e u n d 6 c r o c h a g e c o m p l e t a l u b i o f i l m a d h d r a n t e u n s u p p o r t ( G O R E T , 1982).
1 - 5 E t a l o n n a g e
A v a n t c h a q u e s 6 r i e d e m e s u r e s , u n e c o u r b e d ' 6 t a l o n n a g e e s t t r a c 6 e . P o u r c e , d e u x l y o p h i l i s a t s s o n t u t i l i s 6 s :
1 ) 1 e r d a c t i f l u c i f 6 r i n e - f u c i f 6 r a s e ( L K B ) , r 6 g 6 n 6 r 6 a v e c d ' e a u b i - d i s t i l - l - 6 e s t 6 r i l e c o n s e r v 6 e d - 3 0 o C ;
2 ) 1 ' A T P l y o p h i l i s 6 ( L K B ) , r 6 g 6 n 6 r 6 a u s s i d a n s 1 o . . ' d ' . a . , t i ] I 6 e s t 6 r i ' l e : c € c i f o u r n i t u n e s o l u t i o n m d r e a 1 O - s M v 6 e a - 3 0 ' C .
l o c m 3
b i d i s - c o n s e r -
1 9 2 S c i e n c e s d e L ' e a u 2 , n o 2
L e t r a c 6 e n 6 c h e l l e l o g a r i t h n i q u e d e I a c o n c e n t r a t i o n e n A T P e n f o n c - t i o n d e f i n t e n s i t 6 l u m i n e u s e m e s u r 6 e p a r p o t e n t i o m 6 t r i e e s t f i n 6 a i r e d a n s f i n t e r v a l l e d e c o n c e n t r a t i o n a L l a n t d e 1 O - " M a 1 0 - o r d o n - n 6 e d L ' o r i g i n e d e 1 a d r o i t e a i n s i o b t e n u e d 6 p e n d , t o u t e f o i s , d e s l o t s d e r 6 a c t i f s e t d e 1 ' 6 g e d e l a s o l u t i o n ; 1 ' 6 t a l o n n a g e d o i t d o n c 6 t r e r 6 p 6 t 6 i c h a q u e s 6 r i e d ' e s s a i s .
2 - CoNpnRA I soN DES TEcHN I ouES o' extRAct r or,t
L e s r 6 s u l t a t s o b t e n u s s u r u n m 6 m e 6 c h a n t i l l o n d e b i o m a s s e t r a i t 6 p a r I e s d i f f 6 r e n t e s t e c h n i . q u e s d ' e x t r a c t i o n s o n t c o n s i q n 6 s d a n s 1 e t a b f e a u 2 .
Tableau 2
Cornparaison des techniques dt ertz'action
I l 6 t h o d e d ' e x t r a c t i o n L u m i n e s c e n c e m e s u r 6 e p a r p o t e n t i o m 6 t r i e , m V ( A ) N a P o + c h l o r o f o r m e
( B ) G L y c i n e / M g E D T A b o u i l l a n t
( C ) T R I S / E D T A b o u i l - I a n t
I n \ T 1 - A / F n T A
( D ' ) TCA,/EDTA + 6ther
(E) DMSO + MOPS
4 7 9 0 1 9 0 0
o o u
490 2 7 6 0 6 9 5 0
L a t e c h n i q u e ( E ) u t i l i s a n t I e D M S O p e r m e t d ' o b t e n i r I a p l u s f o r t e i n t e n s i t 6 L u m i n e u s e ;'ctest d o n c e l l e q u i a p e r r n i s 1 a m e i L l e u r e e x t r a c - t i o n d ' A T P . C e c i c o n f i r m e I e r 6 s u l t a t o b t e n u p a r T O U Z E L e t a L . Q 9 7 9 ) . C e p e n d a n t , I ' e x t r a i t a u D M S O d i 1 u 6 d a n s I e M O P S n ' e s t p a s s t a b l e d a n s I e t e m p s c e q u i s e t r a d u i t p a r u n e c l i m i n u t i o n r a p i d e d e f i n t e n s i t 6 I u m i n e u s e ( f i g u r e 1 ) . D e s e r r e u r s s y s t 6 m a t i q u e s s o n t d o n c p o s s i b l - e s s i l e t e m p s s 6 p a r a n t l e m 6 l a n g e d e s r 6 a c t i f s d e L a m e s u r e i n s t r u m e n t a l e n ' e s t p a s n o r m a l i s 6 .
R e m a r q u e s
a ) L e s m 6 t h o d e s ( B ) et (C) n6cessitent u n e 6 b u l l i t i o n q u i p r o v o q u e d e s p e r t e s d ' e a u ; l e c o m p l 6 m e n t e n e a u d f o u r n i r A 1 ' 6 c h a n t i l - l o n i n t r o d u i t u n e e r r e u r s v s t 6 m a t i q u e .
b ) L e s m 6 t h o d e s ( D ) et (D') sont d d6conseill,er c a r l e t a m p o n T C A e t 1 ' 6 t h e r s o n t d e s i n h i b i t e u r s p o t e n t i e l s d e I a r 6 a c t i o n .
Mesure de La concenty,ation en AI'P dnns une polycultut'e lg!
Ftguz,e 1
EooLution de Ltintensitd Lumineuse dans Le tarps tm€Tnoae b)
3 - f\,lErsooE PRoposEE
D e s m e s u r e s d e l r i n t e n s i t 6 l u m i n e u s e s t a b l e d a n s l e t e n p s o n t 6 t 6 o b t e n u e s i I ' a i d e i l e t a s o l u t i o n E l y c i n e , / M g E D T A . L a g l y c i n e p r 6 s e n t e , e n e f f e t , u n p o u v o i r c o n s e r v a t e u r q u e 1 ' o n p e u t c o u p l e r a u p o u v o i r
complexant du tampon Mg EDTA.
L ' A T P a y a n t 6 t 6 e x t r a i t a u D t r I S O f f ' 6 c h a n t i l l o n e s t d i l u 6 a u 1 / 5 d a n s u n e s o l u t i o n g l y c i n e r / t r t g E D T A a pH 7,5. h f i g u r e 2 m o n t r e I a s t a b i l i t 6 d e I a m e s u r e p e n d a n t p l u s d e 2 0 m n a t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e .
s tabilitd o" ii#iz":" i t d Lumineus e
hdthode E modifi1e)
A b a s s e t e m p 6 r a t u r e ( - 3 O o C ) cette t e c h n i q u e p e r m e t d ' 6 c h a n t i l l o n s p e n d a n t p l u s i e u r s m o i s , s a n s b a i s s e d e l a c o n c e n t r a t i o n e n A T P .
I a c o n s e r v a t i o n 1 a v a l e u r 1 u e d e
1 9 4 Sciences de Lteau 2, no2
L a m 6 t h o d e q u e n o u s p r o p o s o n s p e r m e t d o n c d ' e x t r a i r e l a p l u s g r a n d e q u a n t i t 6 d ' A T P e t 1 a s o l u t i o n o b t e n u e r e s t e s t a b l e p e n d a n t d e t r d s l o n g u e s p 6 r i o d e s d b a s s e t e m p 6 r a t u r e .
L e m o d e o p 6 r a t o i r e c o n s e j . I l 6 e s t d 6 c r i t c i - d e s s o u s .
3 - 1 T e c h n i q u e d e d o s a g e
1 ) U n 6 c h a n t i l t o n d e 1 c m 3 d u m i l i e u d a n a l y s e r e s t m 6 l a n g 6 9 c r n 3 d e D M S O d a n s u n b 6 c h e r d e 2 5 c m r .
2 ) L a s u s p e n s i o n o b t e n u e s u b i t u n t r a i t e m e n t a u x u l t r a s o n s p e n d a n t 4 5 s . d 1 a l o n g u e u r d ' o n < l e d e 1 0 l - t r n . O n e n p r 6 l d v e a l o r s u n v o l u m e d e 1 c m 3 q u i e s t d i s s o u s d a n s 4 c m 3 d e t a m p o n g l y c i n e / l ' l g E D T A a p H 7 , 5 .
3 ) L a m e s u r e d e l a c o n c e n t r a t i o n e n A T P e s t a l o r s e f f e c t u 6 e o u b i e n 1 ' 6 c h a n t i l l o n o b t e n u p e u t s u b i r u n e c o n g 6 l a t i o n e n p r 6 v i s i o n d e m e s u r e s u l t 6 r i e u r e s g r o u p 6 e s . L a v a l e u r d e I a c o n c e n t r a t i o n e n A T P d a n s I a s u s p e n s i o n d ' o r i g i n e , e x p r i m 6 e e n m o l e p a r l i t r e , e s t o b t e n u e e n m u l t i p l i a n t f e r 6 s u l t a t p a r 5 0 , c e f a c t e u r c o r r e s p o n - d a n t a u x d i t u t i o n s s u c c e s s i v e m e n t e f f e c t u 6 e s -
3 - 2 , R e p r o d u c t i b i I i t 6 d e I a m e s u r e
U n 6 c h a n t i l l o n d e b i o r n a s s e e s t p r i s d u r 6 a c t e u r d e d 6 n i t r i f i c a t i o n p u i s d i v i s 6 e n q u a t r e s o u s - 6 c h a n t i 1 l o n s s u r l e s q u e l s p l u s i e u r s e x t r a c - t i o n s d e 1 ' A T P s o n t e f f e c t u 6 e s ( f i q u r e 3 ) .
Figut,e 3
T e c h n i q u e d ' , 4 c h a n t i l L o n n a g e
L e s r 6 s u l t a t s d . e c e s m e s u r e s s o n t c o n s i g n 6 s a u t a b l e a u 3 .
6 s s r f 5 u l t a t s m e t t e n t e n 6 v i d e n c e u n 6 c a r t r e l a t i f s u r l e s m e s u r e s d e I ? , v a l e u r t o u t - d - f a i t a c c e p t a b l e .
L ' e x p 6 r i e n c e m o n t r e , t o u t e f o i s ' q u ' i I e s t s o u h a i t a b l e d ' e f f e c t u e r a u m o i n s t r o i s m e s u r e s s u r c h a q u e 6 c h a n t i 1 1 o n .
il I
I u.nlfliii',,,
il
E c h a n t i I I o n
Llesure de La concentration en ATP dans une oolucultuz,e 1 9 5
I A D L C A U J
ReproductibiLitd des mesures
M e s u r e s d e I ' i n t e n s i t 6
obtenus a
l m i n e u s e e n p a r t i r d e s 4
m V s u r 1 e s d i f f e r e n t s s o u s - 6 c h a n t i l l o n s I
2 3
1 2 0 1 3 0 1 4 2 t 5 4
1 2 0 1 2 2 1 3 0 1 3 0
t44 t47
1 5 4 1 5 5
1 3 2 1 3 3 1 4 8 1 4 8 1 5 6
126 129 129
1 3 9 1 3 9 1 3 9 1 4 9 1 4 9 1 5 1
val,eur moyenne
1 3 8 1 1 I n c e r t i t u d e relative
8 8 t29
1 4 0 152
Cot'rctus I otrt
L a m d t h o d e d ' e x t r a c t i o n d ' A T F , o u r n d t h o d e d e J A C U B C Z A K e t a L . ( 1 9 7 8 ) , b a s 6 e s u r f ' u t i l i s a t i o n d u D I { S O a 6 t 6 a n 6 l i o r 6 e p a r 1 ' u t i l i s a t i o n d u
tampon stabilisateur glycine/l'(g EDTA.
L a t e c h n i q u e p r o p o s 6 e a s s u r e 1 a m e i f l e u r e e x t r a c t i o n d ' A T P p a r r a p - p o r t a u x a u t r e s m 6 t h o d e s t e s t d e s ( T o B I N e t a L . ( 1 9 7 8 ) , L E V I N e t a L .
( 1 9 7 5 ) e t T H O S E e t a L . ( 1 9 7 8 ) ) , t o u t e n p e r m e t t a n t t ' o b t e n t i o n d e m e s u - r e s s t a b f e s d a n s l e t e m p s -
L a c o n c e n t r a t i o n e n A T P 6 t a n t a p r i o r i 1 a n e i l l e u r e - D r e u v e d e l r a c t i - v i t 6 c e l f u l a i r e , t l e s a p p f i c a t i o n s i m p o r t a n t e s d e c e t t e m 6 t h o d e s o n t p r 6 v i s i b l e s . P o u r n o t r e p a r t , n o u s e n v i s a g e o n s d e c o r r 6 l e r , d a n s u n e 6 t u d e s y s t 6 m a t i q u e , 1 a c o n c e n t r a t i o n e n A T P , n e s u r 6 e p a r c e t t e m 6 t h o d e , a l - a v i t e s s e d ' 6 p u r a t i o n d . a n s u n r 6 a c t e u r c o n t i n u , a u x c o n c e n t r a t i o n s e n m a t i 6 r e v o l a t i l e e t i 1 ' 5 q e d e I a c u l t u r e n o t a n u n e n t .
S c i e n c e s d e L ' e a u 2 , n o 2
Arunrxe 1
C o m p o s i t i o n e t p r 6 p a r a t i o n d e s t a m p o n s u t i l i s € s T a m p o n T R I S / E D T A
D i s s o u d r e 6 , 0 6 g d ' h y d r o x l z n 6 t h y l a m i n o m 6 t h a n e ( t p . t S : ref. I q E R C K 8 3 8 2 ) e t O , 3 ' 7 2 g d r a c i d e 6 t h y l d n e d i a m i n e t 6 t r a a c 6 t i q u e ( e n t a : r 6 f . M E R C K 8 4 1 8 ) d a n s 1 ' e a u d i s t i l l 6 e . A j u s t e r A p H 7 , 7 5 a v e c i l e t ' a c i d e a c 6 t i q u e e t c o m p l 6 t e r i 5 O O c m 3 a v e c 1 ' e a u d i s t i l l 6 e ( v 6 r i f i e r 1 e p H ) .
C e t a m p o n e s t u t i l i s 6 p o u r I a d i l u t i o n d e s 6 c h a n t i l l o n s e t d e l a g a m m e 6 t a 1 o n .
S o l u t i o n d ' e x t r a c t i o n T C A / E D T A
D i s s o u d r e 1 0 g d ' a c i d e t r i c h l o r a c t i q u e ( T C A : r6f. l , t E R C K 8 0 7 ) e t O , 7 4 9 g d ' E D T A ( M E R C K 8 4 1 8 ) d a n s 1 0 0 c m 3 c l ' e a u d i s t i l l 6 e .
T a m p o n 1 1 . 0 . P . S .
D i s s o u c l r e 2 , 0 8 3 g d ' a c i d e m o r p h o l i n o p r o p a n e s u l f o n i q u e ( M O P S : r6f.
S I G I \ 1 A 1 2 5 4 ) d a n s l r e a u a l i s t i t t 6 e . A j u s t e r d p H 7 , 4 a v d c d e 1 a s o u d e e t c o m p l 6 t e r i 1 I a v e c d e l ' e a u d i s t i l l 6 e .
DIISO
D i m 6 t h y l s u l f o x y d e ( r 6 f - M E R C K 2 9 3 7 ) - p r e t a 1 ' e m p l o i .
Remarque : garder cette solution i la temp6rature ambiante car elle se
s o l i d i f i e r a p i d e m e n t .
T a m p o n l t l a , P 0 u
D i s s o u d r e 1 , 6 3 9 q d e p h o s p h a t e t r i s o d i q u e ( N a g P O q ) d a n s I ' e a u d i s t i l - 1 6 e a p r E s a v o i r a j u s t 6 I e p H e l l , 7 a v e c d e l a s o u d e .
Tampon 91y/lIg EDTA
D i s s o u d r e O , 7 5 g d e g l y c i n e e t 1 , 5 8 g d e ! 1 9 E D T A a i a n s u n l i t r e d . r e a u d i s t i l l 6 e . A v a n i d ' a v o i r c o m p l 6 t d :
. a j u s t e r d p H 1 0 a v e c d e 1 a s o u d e p o u r d o n n e r 1 e t a m p o n d ' e x t r a c t i o n ( 6 b u f liti-on) ;
. o u a j u s t e r d p H 7 , 5 p o u r f o r m e r I e t a m p o n s e r v a n t d e d i l u a n t a p r d s I ' e x t r a c t i o n a u D M S O .
Mesuv,e de La eoncenttation en ATP dans une oolucultuy,e 1 9 7
B )
Ar'rruexE 2
l l l e t h o d e s d r e x t r a c t i o n s u r I e s b o u e s o u d e s s 6 d i m e n t s
A ) N a : P 0 , - + c h l o r o f o r m e ( t o g t t ' t e t a L . , 1 9 7 8 )
D a n s u n b 6 c h e r , i n t r o c l u i r e 1 c m 3 d e b o u e p u i s 9 c m 3 d e N a 3 p O 4 e t 3 c m ' d e c h l o r o f o r m e . A g i t e r o u u l t r a s o n n e r 4 5 s e c o n d e s a 1 0 Un.
C e n t r i f u g e r a 3 0 0 0 r . p . m . L e s u r n a g e a n t p o u r r a 6 t r e d i l u 6 a v e c 0 , 5 i
5 cm' de tampon gly/Mg EDTA.
G 1 y / l 4 g E D T A b o u i l l a n t ( T O B I N e t a L . , 1 9 7 8 )
D d p o s e r 4 c m 3 d e b o u e s d a n s 2 6 cm3 de tampon Sly/Ntg EDTA bouillant l - a i s s e r b o u i l - l i r 1 5 m i n u t e s . C o m p l 6 t e r a p r d s l ' 6 b u 1 l i t i o n e t f i f t r e r .
c ) T R r s / E D T A ( L E V r N , 1 9 7 s )
Mdlanger 1 cm3 de boues avec 9 cm3 de tampon TRIS/EDTA bouillant et
l a i s s e r b o u i l l i r 9 0 s e c o n d e s . C o m p l 6 t e r a u v o l u m e i n i t i a l , f i l t r e r o u c e n t r i f u g e r .
D ) T C A / E D T A ( T H O P . E , 1 9 7 8 )
M 6 l a n g e r 4 c m 3 d e b o u e s a v e c a c m 3 d e T C A / E D T A , a g i t e r q u e l q u e s m i n u t e s . A v a n t d e f a i r e I e d o s a g e , d i l u e r 5 0 f o i s d a n s u n e s o l u t i o n t a m p o n d e p H 7 , 5 a 7 , 7 5 car TCA est inhibiteur d e l a r 6 a c t i o n l u m i n e s - c e n t e .
D ' ) T C A / E D T A + e x t r a c t i o n d l ' 6 t h e r ( T H o R E , 1 9 7 8 )
M 6 l a n g e r 4 c m 3 d e b o u e s e t 3 c m 3 d e T C A / E D T A , a g i t e r q u e l q u e s m i n u - t e s . E x t r a i r e T C A p a r 3 e x t r a c t i o n s a l r 6 t h e r : i n t r o d u i r e l e s 7 c m ' o b t e n u s d a n s u n e a m p o u l e i d 6 c a n t e r , y a j o u t e r 1 4 c m 3 d ' 6 t h e r , a g i t e r u n e m i n u t e , l a i s s e r r e p o s e r , s 6 p a r e r 1 ' 6 t h e r e t r e c o n n e n c e r d e u x f o i s . E n f i n , c h a s s e r J - e r e s t e d ' 6 t h e r c o n t e n u d a n s l a p h a s e a q u e u s e p a r b u l - l a g e d r a i r p e n d a n t q u e l q u e s m i n u t e s e t d i l u e r 5 f o i s d a n s d u t a m p o n T R I S / E D T A .
E ) D M S 0 ( , : R f U n C Z n C e t a L , , 1 9 7 8 )
D a n s u n t u b e o u u n p e t i t b 6 c h e r , i n t r o d u i r e 1 c m 3 d e b o u e s e t 9 c m 3 d e D l l S O , u l t r a s o n n e r 4 5 s e c o n d e s . P r 6 l - e v e r 1 c m 3 d ' e x t r a i t e t l e d i l u e r d a n s 4 c m " d e t a m p o n M O P S . L i r e d e s u i t e o u c o n g e l e r .
1 9 8 Sciences de L'eau 2, noz
R E r E n e r u c e s B I B L T o G R A P H r o u E S
B R E Z O N I K P . L . , P A T T E R S O N J . w . , A c t i v e d sfudge ATP : effects of envi-romental stress. J, of the San'i,l;ary Engineering
Dioisian - Proceedtng of the ASCE 5A6,
1 9 7 1 , D 6 c e m b e r , 4 1 3 - a 2 4 .
c H r u s . Y . , K A o I . c . , E R r c K s o N L . E . , F A N L . T . , A T P p o o l - s i n a c t i v e d s l u d g e . J . W . P . C . F . , 1 9 7 3 , 4 5 , 1 7 4 6 - 1 7 5 8 . G O R E T P . , S u i v i d e I ' a c t i v i t 6 b a c t 6 r i e n n e d a n s u n m i l i e u b i o l o g j - q u e p a r 1 e d o s a g e
de lrATp. Rappart dtlngdnionat, ISfM,
1 9 8 2 , c 6 n i e C h i m i q u e a p p l i q u 6 a u x B i o -
+ a n h n a l n a i a e I l q T T M ^ n f ^ a l l i a r
J A K U B C Z A K E . , L E C L E R C H . , E t u d e c r i L i q u e d e s n 6 t h o d e s d ' e x t r a c t i o n d e 1 ' A T P b a c t 6 - r i e n n e e n v u e d e s o n d o s a g e p a r l m i n e s - c e n c e . R e g a t ' d s s u r L a B i o c h i n i e , 1 9 7 a , 2 , 1 4 .
K E E S V . , L E W E N S T E I N A . , B A C H O F E N R . , A T P I D o l s i n a c t i v e d s l u d g e . E u r o p e a n J . A p p L . I 4 r c r a b i a l o g a , 1 9 1 5 , 2 , 5 9 - 6 4 .
K U C N E R O W I C Z F., A T P als p a r a m e t a v o o r a k t i e f s l i b s y s t e m e n . T h d s e U n i v e r s i t d d e c a n d - B e l g i q u e , 1 9 7 8 .
L E V I N G . V . , S C H R O T J . R . , H E S S w . C , , M e t h o - d o l o g y f o r a p p l i c a t i o n o f a a l e n o s i n e t r i - p h o s p h a t e d e t e m i n a t i o n i n w a s t e w a t e r t r e a t m e n t , E n o i r o m e n t a l S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , 1 9 7 5 , 9 , 1 0 , 9 6 1 - 9 6 5 .
M a c E L R O Y w . D . , G R E E N t . , A r c h . B i o c h e n . B i o p h y s . , 1 9 5 6 , 6 4 , 2 5 7 - 2 - 1 1 .
M A R T I N G . , N A I { S A N G H O , V I T R A C O . , R E I N B o L D M . , U t i l i s a t i o n d e I ' a d d n o s i n e t r i p h o s p h a t e d a n s l e s p h 6 n o m d n e s d ' 6 p u - r a t i o n b i o l o g i q u e . M i s e a u p o i n t d ' u n e t e c h n i q u e d ' e x L r a c t i o n e t d e d o s a g e d e 1 ' A T P d a n s l e s b a u e s a c t i v d e s . L ' e a u e t
L t l n d u s t r i e , 1 9 - 7 9 , 3 2 , 4 6 - 5 3
P A T T E R S O N J . W . , B R . E Z O N I K P . L . ,
P U T T i A I ' 1 H . D . , M e a s u r e m e n t a n d s i g n i f i c a n c e o f a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e i n a c t i v e d s l u d g e . E n x i T a m e n t a l S c i e n c e a n d f e c h - n o l o g y , 1 9 7 0 , 4 , 7 , 5 6 9 - 5 7 5 .
S T R E H L E R B . L - , M e t h o d e n d e r E n z l m a t i s c h e n A n a l y s e i n H . U . B E R C M E Y E R , V e r l a g C h i n i e , V e t n h e i n , 1 9 7 0 , v o l . 9 , p . 2 0 3 6 .
T H o R E A . , B i o l m j - n e s c e n d e a s s a y : e x t r a c - L i o n o f A T P f r o m b i o t o g i c a l s p e c j n e n s . R e p o r t o f S u e d i s h N a t i o n a l d e f e n s e r e s e a r c h I n s t L t u t e , S u n d b y b e r g , s w e d e n - 1 9 7 8 .
T O B I N R . S . , R Y A N J . F . , A F G H A N 8 . K , , A N i m p r o v e d m e t h o d f o r t h e d e t e m i n a t i o n o f a d 6 n o s i n e t r i p h o s p h a t e i n e n v i r o n m e n t a l s a n p l e s . W a t e r R e s e a r c h , 1 9 7 a , v o l . 1 2 , - 1 8 3 - 1 9 2 .
T O U Z E L J . P . , M o R F A U X J . N . , F l e s u r e d e f ' A T P d e s b o u e s a c t i v d e s , v a l i d i t 6 e t l i m i t e e n 6 p u r a t i o n b i o l o q r q u e . l r i b . d u C E B E D E A U , 1 9 7 9 , o o 4 3 3 , 4 a 1 - 4 9 2 .
