Etude de l'expression génique de deux pathologies thyroïdiennes : les adénomes autonomes hyperfonctionnels et les cancers papillaires. THESE

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES FACULTE DE MEDECINE

Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire (IRIBHM)

THESE

En vue de l’obtention du grade de Docteur en Science Biomédicales Présentée et soutenue publiquement par

Sandrine Wattel le 10 octobre 2007

Directeur de Thèse : Dr. Carine Maenhaut Membres du jury:

Pr. Magali Waelbroeck (Présidente) Pr. Laurence Leenhardt

Pr. Marie-Christine Many Pr. Daniel Glinoer Dr. Pierre Heimann Dr. Christos Sotiriou

Etude de l'expression génique de deux pathologies thyroïdiennes : les adénomes autonomes

hyperfonctionnels et les cancers papillaires.

Remerciements

Je commencerai par remercier les différentes personnes qui auront permis la réalisation et l’aboutissement de ce travail. Je continuerai avec quelques mots plus personnels pour ceux qui, d’une façon ou d’une autre, apportent la joie dans ma vie.

Je remercie bien évidemment les professeurs J. E. Dumont et G. Vassart de m’avoir accueillie au sein du laboratoire. Monsieur Dumont, un grand merci pour l’intérêt que vous avez accordé à ce travail et pour le temps que vous y avez consacré.

Carine, je te remercie également pour tout le temps que tu as consacré à ma thèse. Je te suis surtout reconnaissante pour la lecture du manuscrit, ce qui n’était certainement pas toujours du plus facile. Cependant, c’était sans aucun doute une très bonne occasion pour moi de progresser dans le domaine de l’écriture en langue française. Merci aussi pour tes conseils avisés et ta confiance.

Je remercie sincèrement le Professeur Franc qui m’a consacré beaucoup de son temps vers la fin de ma thèse, et sans qui toute la partie sur les tissus-array n’existerait pas. Je remercie également tous les autres collaborateurs qui ont de près ou de loin contribué à l’élaboration de ce travail. Je pense à Hortensia, Vincent, David Venet, Chantal, Monsieur Andry, Madame Thomas, Monsieur Rocmans, Nathalie Hutsebaut, Vanessa Vanvooren, Monsieur Paul Van Hummelen,… et au service de génétique pour m’avoir permis d’employer leur ‘machine taqman’.

Je remercie également tous les membres de l’IRIBHM pour les sourires stimulants échangés au détour des couloirs, pour leur disponibilité et leur bonne humeur. Merci à Jing, Ling, Song, Milutin, Geneviève, Isabelle, Sarah D, Maria, Danielle, Joëlle, Daniel, Christian, Claude, Stéphane, Xavier, Colette, Sandrine P., Thalie, Jacqueline, Hugues, Maxime, Laurence, Audrey, Katia, et tous les autres. Merci à Jingwei de m’avoir tenu compagnie le soir. Mes remerciements vont tout particulièrement aux occupants du bureau C4.124, ceux qui l’ont quitté ‘je pense à Nathalie, Fabrice, Christine’ ainsi que ceux qui y sont encore, Julie, Sandra, Laurent et Nicolas, le grand nouveau. Il y aura toujours régné une ambiance extrêmement sympathique. Je n’oublierai jamais les très bons moments passés dans et hors du bureau, voir du labo… Je pense aussi à Wilma, Sheela, Aline, Sara, Séverine, Tanja, Delphine et David qui ont également contribué à mon plaisir de venir au labo. J’espère sincèrement vous revoir régulièrement et je vous remercie pour tous les bons moments, les discussions de tout genre et les encouragements. Et non Alexandra, je ne t’ai pas oublié. C’était un plaisir pour moi d’avoir fait ta connaissance et j’espère bien te revoir prochainement.

Je tiens tout particulièrement à remercier mes ami(e)s de toujours : Kristina, Ilona, Kristel en Veerle, ik weet dat ik op elk moment op jullie kan rekenen en dat ik deze laatste tijden niet veel voor jullie aanwezig was, maar ik beloof dat we elkaar nu meer zullen zien. Ik waardeer echt ons vriendschap en ben uiterst blij jullie ontmoet te hebben.

Valérie et Claude, à part réécrire le texte en français, je pense exactement la même chose

pour vous. (Claude, je me ferai un plaisir de te faire la traduction.) Je remercie également

Nathalie pour son amitié, sa gentillesse et son aide généreuse. Finalement, je tiens à

remercier Olivier, qui m’a soutenue à plusieurs moments très difficiles et qui était

toujours là pour moi. Je lui en serai toujours reconnaissante. Merci, merci à tous… merci

pour les excellents moments partagés ensembles.

Je tiens également à faire un clin d’œil amical à toute la bande de cousins, tous très sympathiques et avec qui j’ai passé de très bons moments.

Je remercie également mes dernières colocataires, Laura et Claire, qui m’ont connue et parfois aussi subie pendant la rédaction de ma thèse. Je les remercie pour leur discrétion, leur gentillesse et leur soutien lors des moments un peu plus difficiles.

Je remercie finalement toute ma famille. Je veux tout particulièrement remercier mes parents pour leur amour, leur présence, leur soutien et leur confiance. Je remercie François et Sheela, Alexia et Eric et nos deux rayons de soleil Thylia et Enguéran, d’être simplement présent. Je suis heureuse de faire partie de cette famille. Je remercie également tous les autres membres de la famille, qui ont également cru en moi.

Ce travail a été réalisé grâce aux soutiens financiers de la Fondation David et Alice Van

Buren, de la Fondation Rose et Jean Hoguet, de la bourse de la fondation Anspach-

Wiener et du Télévie.

Résumé

La technologie des microarrays est une technique d’analyse d’expression génique à grande échelle qui permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes cellules et différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques (Shena et al, 2000). Dans notre étude nous avons employé cette technique pour mieux comprendre deux pathologies thyroïdiennes: les carcinomes papillaires (PTC) et les adénomes autonomes hyperfonctionnels.

L’étude des profils d’expression génique de 9 carcinomes papillaires thyroïdiens sporadiques et de 13 carcinomes papillaires post-Chernobyl a été effectuée en utilisant les lames commerciales de Perkin- Elmer (comportant 2400 cDNA) et en les comparant à leurs tissus normaux adjacents. Les PTC post- Tchernobyl constituent une population de cancers à cause bien définie puisqu’ils sont directement reliés à l’exposition du même agent mutagène, pendant une même période. L’étude des profils d’expression indique qu’il n’y a pas de signature génique spécifique permettant de distinguer les carcinomes papillaires sporadiques des post-Tchernobyl. La comparaison de ces profils d’expression à celui obtenu avec 13 adénomes autonomes a permis de mettre en évidence une signature de 6 gènes (créatine kinase B, annexine A1, clusterine, métallothionéine 1x, Fc fragment of IgG binding protein et tissue inhibitor of metalloproteinase 1) séparant les carcinomes papillaires malins des adénomes autonomes bénins.

Nous avons également analysé l’expression génique sur des mélanges de tumeurs et de leurs contrôles respectifs sur des lames à 17000 cDNA fabriquées au MAF (VIB Microarray Facility, Leuven). Un mélange de 14 cancers papillaires sporadiques, un mélange de 20 cancers papillaires provenant de la région de Tchernobyl et un mélange de 5 adénomes autonomes ont été analysés par microarray et comparés aux études existantes comme celles effectuées sur les lames Perkin-Elmer ou par d’autres groupes (Huang et al, 2001 ; Wasenius et al, 2003 ; Jarzab et al, 2005 ; Eszlinger et al, 2004).

De ces données microarray ont résulté des listes de gènes sur- et sous-exprimés dans les tumeurs comparées à leurs tissus normaux adjacents. Plusieurs gènes différentiellement exprimés ont déjà été confirmés dans différentes études réalisées aussi bien dans notre laboratoire que dans d’autres. Nous avons confirmé la modulation de plusieurs gènes intéressants par RT-PCR en temps réel (Taqman) ainsi que certaines modulations au niveau protéique (par Western Blot ou immunohistochimie).

L’étude immunohistochimique nous a donné également des informations sur la distribution cellulaire et tissulaire de ces protéines.

La modulation d’expression génique dans ces tumeurs reflète des caractéristiques physiopathologiques connues (comme l’hyperactivité fonctionnelle, la faible augmentation de l’AMPc ou encore la diminution de l’apoptose dans les adénomes autonomes et la dédifférenciation ou l’invasivité dans les carcinomes papillaires), mais elle nous a également permis d’identifier des caractéristiques physiopathologiques jusqu’ici encore inconnues de ces tumeurs (comme la surexpression de la N- cadhérine et la diminution de la cavéoline1, deux marqueurs présumés de malignité, dans les tumeurs bénignes et un changement de population cellulaire aussi bien dans les adénomes autonomes que dans les carcinomes papillaires). Ces études nous ont donc permis de définir des gènes potentiellement importants dans la pathologie des différentes tumeurs étudiées, mais également des nouveaux marqueurs diagnostiques potentiels. Ainsi, l’étude immunohistochimique sur des tissu-arrays nous a permis de confirmer la surexpression de l’annexine A1 dans les carcinomes papillaires et de la créatine kinase B dans les adénomes autonomes et pas dans les autres tumeurs thyroïdiennes étudiées.

L’immunomarquage de ces protéines nous a également aidé à définir la malignité d’une série

d’adénomes atypiques. L’annexine A1 est un marqueur potentiel particulièrement intéressant car cette

protéine n’est fortement exprimée que dans les carcinomes papillaires. Une hypothèse, encore à

confirmer, sur sa fonction dans cette pathologie est décrite dans ce travail. Finalement, nous avons

émis une hypothèse expliquant la raison pour laquelle les réarrangements Ret/PTC mènent à la

formation de carcinomes papillaires, tandis qu’une mutation activatrice de Ras, l’effecteur directe du

récepteur à activité tyrosine kinase Ret, mène à la formation de tumeurs folliculaires.

Liste des abréviations :

AA Adénome Autonome

ADN, -c, -db = Acide DésoxyriboNucléique, complémentaire, double brin ADP Adenosine DiPhosphate

AKAP A-Kinase Anchoring Protein

AMPc 3’,5’-Adénosine Mono-Phosphate cyclique ANXA1 annexin A1

AP-1 Adaptor Protein-1

APC Adenomatosis Polyposis Coli

ARA70 70 kDa androgen receptor coactivator (70 kDa AR-Activator) ARN, -m Acide RiboNucléique, messager,

ATC Anaplastic Thyroid Carcinoma ATF Activating Transcription Factor ATP Adenosine TriPhosphate bFGF basic Fibroblast Growth Factor bHLH basic Helix-Loop-Helix

BIRC5 Baculoviral IAP Repeat-Containing 5 (survivin) C/EBP CCAAT Enhancer Binding Protein

CBP CREB Binding Protein

CDH2 cadherin 2, N-cadherin (neuronal) CDK Cyclin Dependent Kinase

CDKi cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKN1A)

CITED Cbp/p300-interacting transactivator with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain 1 CK19 CytoKeratin 19

CKB Creatine Kinase, brain CLU CLUsterin

CNAP1chromosome condensation-related SMC-associated protein 1 CNG Cyclic Nucleotid Gated channel

CNK Connector enhancer of Kinase suppressor of Ras1 CRE cAMP Responsive Element

CREB CRE Binding Protein CREM CRE Modulator

CTGF Connective Tissue Growth Factor

CTNNB1 catenin (cadherin-associated protein), beta 1 DAB 3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride.

DAG DiAcylGlycerol DIT 3,5-DiIodoTyrosine DOK DOwnstream of Kinase

Duox DUal OXydase (forme nucléotidique, protéique) DUSP DUal SPecificity phosphatise

ECL ElectroChemiLuminescence ECM ExtraCellular Matrix EGF Epidermal Growth Factor

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor ELE1 RET oncogene fusion partner ELKS Rab6-interacting protein 2

EPAC Exchange Protein directly Activated by cAMP ERK Extracellular Regulated Kinase

EST Expressed Sequence Tag FAS Fatty Acid Synthase

FcGBP Fc fragment of IgG Binding Protein FGF Fibroblast Growth Factor

FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor FN1 fibronectin 1

FOXE-1 FOrkhead boX E1 (thyroid transcription factor 2) FRS Fibroblast growth factor Receptor Substrate

FTC Follicular Thyroid Carcinoma

GDNF Glial cell Derived Neurotrophic Factor GDP Guanosine DiPhosphate

GEF Guanine nucleotide Exchange Factor GO Gene Ontology

GPI GlycosylPhosphatidylInositol

Grb2 Growth factor Receptor-Bound protein 2 GRF Growth hormone Releasing Factor GRK G-protein-linked Receptor Kinase 3 GSK3 Glycogen Synthase Kinase 3 GTP Guanosine TriPhosphate GTPase Guanosine TriPhosphatase

H2O2

Peroxyde d’hydrogène ou eau oxygénée

HGFR Hepatocyte Growth Factor Receptor HRP Horseradish Peroxidase

ICER Inducible cAMP Early Repressor IFNγ Interféron gamma

IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1 IGFR Insulin-like Growth Factor Receptor IL- InterLeukine

INSR Insuline Receptor IP Inositol Phosphate IR Insulin Receptor

IRS Insulin Receptor Substrate JNK Jun Kinase

KSR Kinase Suppressor of Ras1

LGALS3 lectin, galactoside-binding, soluble, 3 MAPK Mitogen Activated Protein Kinase MDS MultiDimensional Scaling

MET met proto-oncogene (hepatocyte growth factor receptor) MFAP4 MicroFibrillar-Associated Protein 4

MIT MonoIodoTyrosine ou 3-iodotyrosine MKP MAP Kinase Phosphatase

MMP Matrix MetalloProteinase Mr relative molecular mass MT1X metallothionein 1X

Nck Non-Catalytic region of tyrosine Kinase NCO Nuclear receptor COactivator NGFR Nerve Growth Factor Receptor

NIS Na+/I- Symporteur (sodium iodide symporteur) NOS carcinoma No Other Specificity

NTN neurturin

NTRK1 Neurotrophic Tyrosine Kinase, receptor, type 1 PAI-1 (-2) Plasminogen Activator Inhibitor type 1 (-2) PAX-8 PAired boX gene 8

PBGD porphobilinogen deaminase

PCM PeriCentriolar Material 1 protein

( pericentrin)

PCR, RT- = Polymerase Chain Reaction, Reverse-Transcriptase PCR PDE PhosphoDiEstérase

PDGF Platelet Derived Growth Factor

PDGFR Platelet Derived Growth Factor Receptor PDK1 (-2) Phosphoinositide Dependent Kinase 1 (-2) PE Perkin Elmer

PF4 Platelet Factor 4

PGF Placental Growth Factor PH Pleckstrin Homology

PI(3)K Phosphatydil Inositol 3 Kinase

Pik3r1 (2, 3) Phosphatidylinositol 3-kinase, regulatory subunit, polypeptide 1 (2, 3) PIP2

PhosphatidylInositol-4, 5-bisPhosphate

PIP3

PhosphatidylInositol-3, 4, 5-triPhosphate

PKB Protein Kinase B PKC Protein Kinase C PP2A Protein Phosphatase 2A PPAR Peroxisome Proliferator PSP persephin

PTB PhosphoTyrosine Binding

PTC Papillary Thyroid Carcinoma; sPTC, sporadic PTC; chPTC, PTC from Tchernobyl PTEN Phosphatase and TENsin homolog

PTP1 PhosphoTyrosine Phosphatase 1 RBD Ras Binding Protein

RFG RET Fused Gene RFP Ret Finger Protein

RGS Regulator of G protein Signaling RTK Receptor Tyrosine Kinase RXR Retinoid X Receptor

SAGE Serial Analysis of Gene Expression

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SH-2 (-3) Src Homology-2 (-3)

Shc Src Homologous and Collagen protein

SHIP Src Homology domain-containing Inositol Phosphatases Sos Son Of Sevenless

SRE Serum Response Element Srf Serum Response Factor T3 3, 3’,5’ triiodothyronine

T4 3, 3’,5, 5’ tétraiodothyronine ou thyroxine TBST Tris-Buffered Saline Tween-20 TCF Ternary Complex Factor TFG TRK-Fused Gene Tg Thyroglobulin

TGFβ Transforming Growth Factor β THOX Thyroid OXidase

TIMP Tissue Inhibitor of matrix MetalloProteinase TITF-1 Thyroid Transcription Factor 1

TNFα Tumor Necrosis Factor alpha

TPA 12-O-TetradecanoylPhorbol-13-Acetate TPM3 tropomyosin 3

TPO ThyroPerOxydase

TPR Translocated Promoter Region (to activated MET oncogene) TRE TPA Responsive Element

TRH Thyrotropin Releasing Hormone TRK TyRosine Kinase receptor (A) TSA Tyramide Signal Amplification

TSH Thyroid Stimulating Hormone ou thyrotropine TSHR TSH Receptor

UMP adenoma adenoma with Uncertain Malignant Potential uPA Plasminogen Activator, urokinase

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor VIB Vlaams Instituut voor Biotechnologie WNT Wnt oncogene

WRN werner syndrome gene

Table des matières

I. INTRODUCTION 1

1. Les cascades de transduction de signaux 2 1.1. Les cascades de signalisation intracellulaire 3

1.1.1. La cascade de l’AMPc 3 1.1.2. Voie des phoshatidylinositols 5 1.1.3. Cascade impliquant des récepteurs à activité tyrosine kinase 6

1.1.3.1. La voie des MAPKs 6 1.1.3.2. La voie de la PI3K/Akt 8 1.2. Réponse nucléaire : l’exemple des complexes AP-1 9 1.3. Evènements précoces : l’induction de protooncogènes 10

2. Développement du cancer et invasion tumorale 11 2.1. La matrice extracellulaire 13 2.2. L’adhésion cellulaire 15

3. La thyroïde 16

3.1. Généralités 16

3.2. Fonctionnement de la glande thyroïde 16 3.3. Synthèse des hormones thyroïdiennes 16 3.4. Libération des hormones thyroïdiennes 17 3.5. Régulation du métabolisme thyroïdien 17 3.6. Actions de la TSH 18

4. Les pathologies thyroïdiennes 20

4.1. Généralités 20

4.2. Les adénomes autonomes hyperfonctionnels 20 4.3. Les carcinomes thyroïdiens 21 4.3.1. Les carcinomes papillaires 22 4.3.2. Les carcinomes folliculaires 23 4.3.3. Les carcinomes anaplasiques 23 4.4. Les facteurs de risques : les effets des radiations ionisantes 24 4.5. Les altérations géniques des tumeurs thyroïdiennes 24

4.5.1. Réarrangements Ret/PTC et NTRK1 25

4.5.2. Mutations B-Raf 27

4.5.3. Marqueurs moléculaires des tumeurs thyroïdiennes 28

5. Les microarrays 30

II. BUT DU TRAVAIL 31

III. RESULTATS ET DISCUSSION 34

1. Vue globale du travail 35 1.1. Etudes sur lame Perkin Elmer 35 1.2. Etudes sur lame VIB 37 1.3. Etudes Tissu-MicroArray 38 2. L’étude des profils d’expression des carcinomes papillaires thyroïdiens

sporadiques et post-Tchernobyl (article1) 39 3. L’étude de l’expression génique dans les carcinomes papillaires 41 4. Les adénomes autonomes hyperfonctionnels de la thyroïde (article 2) 46 5. La signature moléculaire des adénomes autonomes et des carcinomes papillaires 49

IV. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 55

V. ANNEXES 61

1. Matériel et Méthodes 62

1.1. Solutions 62

1.2. Méthodologie 65

1.2.1. Extraction de l’ARN total 65 1.2.2. La technique des microarrays 65 1.2.3. La RT-PCR en temps réel (Taqman) 67 1.2.4. Les tissu-microarrays ou TMA 68 1.2.4.1. L’immunohistochimie 69 1.2.5. Le Western blot 69

1.2.5.1. Extraction et dosage des protéines 69 1.2.5.2. Séparation des protéines par SDS PAGE 70 1.2.5.3. Transfert des protéines 70 1.2.5.4. Immunodétection 71

2. Gènes différentiellement régulés dans les carcinomes papillaires (lames VIB) 72 2.1. Quelques gènes sous-exprimés dans les PTC 75 2.2. Quelques gènes surexprimés dans les PTC 77

3. Listes des gènes différentiellement régulés sur les lames MICROMAX

(Perkin-Elmer) 80

4. Données préexistantes sur l’expression génique dans les carcinomes papillaires 83

VI. BIBLIOGRAPHIE 85

I. Introduction

1. Les cascades de transduction de signaux

La prolifération cellulaire résulte d’une succession d’évènements régulés par des signaux biologiques pouvant agir positivement ou négativement. Les cellules sont constamment exposées aux hormones, facteurs de croissance, cytokines, interactions avec des cellules voisines ou à des stress chimiques ou physiques. Plusieurs de ces signaux activent des récepteurs membranaires qui, à leur tour, activent des cascades de signalisation recensant des changements au niveau de l’expression génique affectant le métabolisme et le comportement cellulaire. Ces cascades de signalisation doivent être bien contrôlées pour maintenir une homéostasie cellulaire normale, qui interrompue peut changer le comportement cellulaire et provoquer des maladies comme le cancer. Aussi bien la durée que l’intensité du signal est importante et plusieurs mécanismes de rétroaction, amplifiant ou supprimant le signal, existent pour maintenir cet équilibre cellulaire. Il existe plusieurs cascades de signalisation dans une cellule qui peuvent être stimulées par différents effecteurs et qui peuvent également s’influencer l’une l’autre (cross-signalling). Le fonctionnement et la réponse des cascades de signalisation varient généralement selon le type cellulaire.

Il existe des récepteurs transmembranaires ou intracellulaires. On peut distinguer quatre types de récepteurs transmembranaires. Il y a les récepteurs canaux comme le récepteur nicotinique à l’acétylcholine ou les CNGs (Cyclic Nucleotide Gated channel), les récepteurs enzymes comme EGFR, CD45 ou RET, qui possèdent une activité enzymatique intrinsèque. Ce sont généralement des récepteurs à activité tyrosine kinase, serine/thréonine kinase ou phosphatase. Il y a également les récepteurs liés aux protéines G (TSHR, FSHR) et les récepteurs sans activité enzymatique intrinsèque (intégrines, cytokines) (figure I.1.).

On distingue différentes classes de molécules parmi les acteurs de la transduction du signal : les récepteurs qui reçoivent le signal, les seconds messagers (ex : AMPc, GMPc, DAG, IP

, Ca

) qui l’amplifient, les adaptateurs qui le distribuent, et les effecteurs qui induisent la réponse cellulaire (figure I.2.). Le dispositif peut être simplifié quand le signal externe active directement un facteur de transcription (récepteur nucléaire) ou quand le récepteur active directement des protéines effectrices (par exemple par phosphorylation).

Les trois voies de signalisation importantes dans cette étude, car principalement activées dans la cellule thyroïdienne sont la voie des facteurs de croissance/récepteurs à activité tyrosine kinase, la cascade du phosphatidylinositol et la voie dépendante de l’AMP cyclique (AMPc).

Nous présentons d’abord un résumé de nos connaissances actuelles dans le domaine de la

transduction de signaux. Le lecteur averti ou pressé peut donc commencer la lecture p11.

1.1. Les cascades de signalisation intracellulaire

1.1.1. La cascade de l’AMP cyclique

L’activation des récepteurs couplés aux protéines G à 7 domaines transmembranaires conduit à un changement conformationnel, permettant en conséquence une interaction intracellulaire avec des protéines G. Les protéines G sont formées de trois sous-unités. La sous-unité αs contient le site de liaison avec le récepteur, le site de liaison du GTP/GDP et le site de liaison avec l'adénylate cyclase. De leur côté, les sous-unités ß et γ intéragissent elles aussi avec plusieurs protéines effectrices dont elles modulent l’activité (ex. les canaux K

, les phospholipases β et A2, l’adénylate cyclase, ras, la PI3K,…) (Murakami et al., 1999). Il existe de nombreuses isoformes de chacune de ces sous-unités, formant ensemble une grande variété de protéines G dont les effets sont différents (table I.1.) : ouverture ou fermeture d'un canal; activation ou inhibition (par la protéine Gαi) de l'adénylate cyclase ; activation (par la protéine Gαq) ou inhibition d'une phospholipase C; activation ou inhibition d'une phosphodiestérase; activation des protéines de la famille Rho (par la protéine Gα12). Les substances susceptibles d'interagir avec les récepteurs couplés aux protéines G sont extrêmement nombreuses et diverses: petites molécules comme les catécholamines, peptides et polypeptides, molécules odorantes ainsi que l'ion calcium et la lumière, mais également les arrestines qui se fixent aux récepteurs par la face cytoplasmique et les désensibilisent.

Au repos, la protéine G, liée à une molécule de guanosine diphosphate (GDP), est inactive. La liaison d’un ligand à son récepteur spécifique entraîne l’interaction du récepteur avec la protéine G. Celle-ci change de structure pour lier une molécule de guanosine triphosphate (GTP) et dissocier la sous-unité αs (une GTPase) des autres sous-unités de la protéine G (figure I.3.). La sous-unité αs portant le GTP s'associe à l'adénylate cyclase. Cette enzyme produit de l’AMPc suite à l’hydrolyse de l’ATP en présence de Mg

, qui libère du pyrophosphate. Le pyrophosphate est aussitôt hydrolysé par une pyrophosphatase, rendant la réaction irréversible. L'hydrolyse de GTP en GDP entraîne la dissociation de l'αs de la cyclase et sa réassociation aux sous-unités βγ, suite à laquelle la cyclase arrête la production du second messager. Le ligand se dissocie du récepteur et l'état inactif du système est restauré (Hamm, 1998). Des protéines spécifiques peuvent activer ou inhiber la liaison du GTP ou la dissociation du GDP, permettant la régulation de l'activité des protéines G. Les protéines RGS (Regulator of G protein Signaling), par exemple, augmentent l’hydrolyse du GTP rendant la sous-unité α inactive.

Dix types d’adénylate cyclases différentes, présentant une structure similaire et exprimées dans différents tissus à partir de gènes différents, ont actuellement été identifiés. Chaque type possède son propre schéma de régulation mais est activé par la sous-unité αs de la protéine Gs. La plupart des cyclases sont inhibées par la sous-unité αi de la protéine Gi et certaines sont activées ou inhibées par les complexes βγ de Gs ou de Gi. Leur activité peut être également modulée par le calcium, les PKCs et/ou les PKAs.

L’AMPc est dégradé en 5’AMP par des AMPc phosphodiestérases (PDE). L'action des

phosphodiestérases nécessite la présence de Mg

intracellulaire et elle peut dans certains cas

être activée par le Ca

. Les différentes familles de PDEs (minimum 11) présentent des

affinités différentes pour l’AMPc et le GMPc. Il existe des phosphodiestérases spécifiques de

l'AMPc ou du GMPc et d'autres non-spécifiques. Les isoformes de PDE4, activées dans les

adénomes autonomes hyperfonctionnels de la thyroïde (Persani et al., 2000) suite à leur phosphorylation par la PKA (MacKenzie et al., 2002), régulent la durée et l’intensité du signal induit par l’AMPc par un rétrocontrôle négatif. Il existe une vingtaine d’isoformes de PDE4 issus de 4 gènes différents (A,B,C et D) (Conti et al., 2003) et chaque isoforme a son microenvironnement spécifique. Comme pour les adénylates cyclases, l’activité des phosphodiestérases peut être modulée par le calcium et/ou par l’activation d’un récepteur spécifique (Goraya et al., 2004). Selon le récepteur et le type cellulaire, un certain type d’adénylate cyclase et de phosphodiestérase seront activées.

Les effecteurs de l’AMPc sont principalement la protéine kinase A (PKA, AMPc- dépendante), les protéines Epac, des canaux ioniques CNGs et des phosphodiesterases (PDE) :

La PKA est une sérine/thréonine kinase contenant deux sous-unités catalytiques et deux sous- unités régulatrices. La liaison de l’AMPc aux sous-unités régulatrices de la PKA libère les deux sous-unités catalytiques de celle-ci par modification conformationnelle, les rendant actives (figure I.4.). Les kinases activées stimulent alors une série de protéines par des phosphorylations en cascade, pour moduler de manière directe les fonctions cellulaires.

L’activation ou l’inhibition des protéines cibles entraîne en aval la modulation de la transcription de gènes régulant la prolifération et la différenciation cellulaires. Les sous-unités catalytiques de la PKA peuvent également migrer vers le noyau ou elles phosphorylent et activent des protéines nucléaires de la famille CREB : CREB (Cyclic AMP Response Element-Binding protein), CREM (CRE Modulator) ou ATF-1 (Activating Transciption Factor) (Quinn., 2002; Servillo et al., 2002). Cette famille de facteurs de transcription appartient au groupe des protéines à domaine basique et à tirette à leucine (leucine zipper). Le domaine basique permet la liaison aux séquences d’ADN du type CRE (Cyclic AMP Response Element), et le domaine à tirette à leucine permet la formation de complexes homo- ou hétérodimériques avec d’autres protéines de la même famille. Tous les gènes régulés par l’AMPc contiennent une ou plusieurs séquences de type CRE dans leur promoteur. CREB lie, après phosphorylation par la PKA sur la Ser

, les facteurs de transcription de base par l’intermédiaire de l’acétylase CBP/p300 (CREB Binding Protein), un co-activateur de plusieurs facteurs de transcription (Lalli et al., 1993). CREB peut également être phosphorylé et activé par d’autres kinases que la PKA (Richards, 2001), par exemple en réponse à l’activation des voies PKC et MAPK. Certaines phosphatases, phosphodiestérases et protéines Gα inhibent cette voie de signalisation, ainsi que les facteurs de transcription inhibiteurs CREM (Cyclic AMP Response Element Modulator) (Lalli et al., 1993), CREB-2 et ICER (Inducible cAMP Early Repressor). L’ICER (un isoforme de CREM) ne possède pas de site de phosphorylation par la PKA, mais est transcrit à partir d’un promoteur inductible par l’AMPc et est donc fortement induit par l’AMPc (Molina et al., 1993; Rosenberg et al., 2002).

Il existe deux types de sous-unités régulatrices de la PKA ayant des affinités différentes pour

l’AMPc et localisées dans des compartiments subcellulaires différents. L’enzyme du type RI

prédomine dans le cytoplasme tandis que celle du type RII est associée aux structures

cellulaires et aux organelles principalement par l’intermédiaire des AKAPs (A-Kinase

Anchoring Protein), une famille spécialisée de protéines d’échafaudage (Wong et Scott,

2004). Les AKAPs peuvent aussi lier d’autres protéines impliquées dans la cascade de

l’AMPc, comme les PDEs (phosphodiesterases) et les substrats de la PKA, rassemblant ainsi

ces protéines dans des microcompartiments dynamiques et modulant ainsi la réponse à

l’AMPc. Les différences d’action, dues en partie à des augmentations du taux d’AMPc dans ces microcompartiments dynamiques différents, conduisent à l’activation par la protéine kinase A (PKA) de cibles moléculaires différentes. Le rôle des phosphodiestérases (PDE) apparaît déterminant dans cette organisation subcellulaire subtile des signaux AMPc et GMPc (Baillie et al., 2005).

Il y a quelques années, le groupe de J. Bos a mis en évidence l’existence de deux nouvelles protéines liant l’AMPc, et régulées par celui-ci : EPAC1 et EPAC2 (Exchange Protein directly Activated by cAMP) (Bos, 2003). Ces protéines possèdent respectivement un et deux domaines de liaison à l’AMPc à leur extrémité amino-terminale et un domaine GEF (GTP Exchange Factor) à leur extrémité carboxy-terminale. Elles activent la petite protéine G Rap1 (figure I.4.). Il existe quatre isoformes de Rap dans les cellules de mammifères jouant un rôle essentiel dans l’attachement cellulaire et la migration (Bos et al., 2003; Caron., 2003; Hattori et Minato., 2003). Rap1 pourrait également avoir un rôle inducteur ou répresseur dans la prolifération et la différenciation cellulaire et activer la voie des MAPKs en fonction du type cellulaire (De, V et al., 2007; Hattori et Minato., 2003; Pizon et al., 1999; Tsygankova et al., 2001; Vossler et al., 1997). Dans la thyroïde de chien, l’activation de Rap1 ne serait cependant pas suffisante pour induire la prolifération (Dremier et al., 2002).

En fonction du type cellulaire, l’AMPc peut contrôler la prolifération, la différenciation, la fonction, la sécrétion ou l’adhésion cellulaire (Tasken et Aandahl, 2004). L’AMPc stimule la prolifération dans les cellules somatotrophes hypophysaires, les cellules épithéliales mammaires, les kératinocytes, les mélanocytes, les thyrocytes, les cellules de Schwann et celles de la lignée de fibroblastes de souris Swiss3T3 (Roger et al., 1995). Par contre, il inhibe la prolifération des fibroblastes, des lymphocytes, des macrophages (Vairo et al., 1990) et des astrocytes (Richards, 2001; Roger et al., 1995).

L'AMPc peut également moduler les propriétés de certains canaux ioniques par interaction directe. C'est par exemple le cas pour les CNG (Cyclic Nucleotid Gated channel) qui régulent l’influx de cations dans le cytosol en réponse à l’AMPc. L'activation ou la modulation des canaux par l'AMPc se fait via l'interaction avec un domaine de liaison aux nucléotides cycliques (CND) (Kaupp et Seifert, 2002).

1.1.2. La voie des phospatidylinositols

Le récepteur activé couplé à une protéine G

conduit à la stimulation (des isoformes β1, β2 et β3) de la phospholipase C, spécifique des phosphoinositides membranaires, qui hydrolyse le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP

) en diacylglycérol (DAG) et inositol-1,4,5- triphosphate (IP

), deux second messagers impliqués dans la transduction de signaux intracellulaires (Singer et al., 1997) (figure I.5.). Il existe plusieurs espèces de phospholipases C : les phospholipases C ß, activées par des récepteurs couplés aux protéines G (Exton, 1997) ; les phospholipases C γ, activées par des récepteurs à activité tyrosine kinase (Carpenter et Ji, 1999) et les phospholipases C δ, activées par l'IP

. L’IP

peut être phosphorylé par des kinases spécifiques formant de l’IP

, de l’IP

ou de l’IP

qui peuvent également participer à la signalisation.

Les actions des deux seconds messagers, DAG et IP

, sont complémentaires. Le DAG est un

activateur de la protéine kinase C (PKC) membranaire laquelle comporte plusieurs molécules

de cystéine et des atomes de zinc. Sa localisation membranaire fait suite à l’action préalable de l’IP

. L’action de l’IP

provoque une élévation de la concentration cytoplasmique de calcium qui se lie à la protéine kinase C. Cette association provoque la translocation de la PKC vers la membrane où elle devient accessible au DAG qui est son ligand activateur limitant (figure I.5.). La PKC stimule, par phosphorylation de résidus sérine/thréonine, divers substrats protéiques (Raf-1, MEKK, EGFR, I

B) (Burgering et Bos, 1995) jouant un rôle important dans le contrôle de la croissance cellulaire, la prolifération et la différenciation.

Le PIP

peut être phosphorylé par la PI3-K (phosphatidylinositol 3-kinase) en PIP

(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate), un messager secondaire notamment impliqué dans la survie cellulaire (Rameh et Cantley, 1999) (voir plus loin).

1.1.3. Cascade impliquant des récepteurs à activité tyrosine kinase

1.1.3.1. La voie des MAPKs

La liaison des effecteurs (EGF, HGF,…) à leurs récepteurs à activité tyrosine kinase entraîne dans la majorité des cas la dimérisation ou la stabilisation de dimères préexistants et l’autophosphorylation de la partie cytoplasmique de ces récepteurs sur plusieurs résidus tyrosines (Shaw et Cantley, 2006). Ces résidus tyrosine phosphorylés servent de site de recrutement pour différentes protéines adaptatrices contenant le domaine SH2 ou PTB comme Grb2, qui à leur tour recrutent d’autres effecteurs. Par un domaine SH3, certains de ces effecteurs peuvent lier des domaines riches en prolines. Grâce à ces deux domaines et la phosphorylation de protéines en aval, la transduction du signal intracellulaire est possible.

Grb2, dépourvu d’activité enzymatique, peut ainsi recruter la protéine Sos à la membrane. Sos est une GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) qui effectue l’échange de GDP par du GTP au niveau de la protéine Ras, localisée à la surface interne de la membrane cellulaire (Buday et Downward, 1993) (figure I.6.). Cette liaison avec du GTP rend la protéine Ras active et apte à interagir avec un grand nombre d’effecteurs contenant le domaine RBD (Ras Binding Domain), incluant la protéine Raf de la voie de signalisation des MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases). Il existe trois protooncogènes Ras, codant pour quatre protéines de 21kDa, H-Ras, N-Ras, K-Ras4A et K-Ras4B. L’activité GTPase (Guanine Nucleotide Triphosphatases) de Ras est stimulée par une protéine GAP (GTPase-Activating Protein), qui augmente la vitesse d’hydrolyse du GTP, ramenant Ras dans un état inactif.

30% des cancers humains ont une mutation activatrice de Ras. Ce taux monte à 90% dans le cancer pancréatique et à 50% dans le cancer du côlon. BRaf est également mutée dans une grande variété de cancers et jusqu’à 66% dans les mélanomes malins (Hilger et al., 2002).

Il existe trois familles principales de MAPK, les ERK1/2 et ERK5 (Extracellular signal- Regulated Kinase) et celles appartenant aux deux voies de stress, les SAPK (Stress Activated Protein Kinase)/JNK (c-jun NH2-terminal Kinase) et p38. L’activation de ces différentes voies dépend du type cellulaire et du signal extracellulaire impliqué.

Raf est une sérine/thréonine kinase (MAPKKK) contenant trois membres (C-raf, A-raf et B-

raf) et qui est activée par la protéine Ras (figure I.7.). Elle active par phosphorylation les

protéines MEK1 et MEK2 (MAPKK, MKK ou ERKK) avec l’aide de deux protéines d’échafaudage, CNK (connector enhancer of kinase suppressor of Ras1) et KSR (Kinase Suppressor of Ras1) (Shaw et Cantley, 2006). MEK1 et MEK2 activent à leur tour, par phosphorylation sur résidus thréonine et tyrosine, les membres de la famille ERK, respectivement ERK1 (p44

) et ERK2 (p42

) (Ono et Han, 2000; Roux et Blenis, 2004). Ces MAPKs activées peuvent phosphoryler d’autres protéines kinases, mais également des facteurs de transcription dans le noyau (comme Elk-1, c-Ets-1, c-Ets-2, srf, AP-1, c-jun, c- fos, SAP-1/2, ATF-2, c-myc) et ainsi moduler la transcription de leur gènes cibles (Treisman, 1996) codant pour des protéines impliquées dans la croissance cellulaire, l’angiogénèse, la formation de métastases, la résistance aux thérapies anti-cancereuses, et dans l’entrée dans le cycle cellulaire et donc la prolifération (Roux et Blenis, 2004). La protéine Akt peut phophoryler le résidu Ser

de BRaf, qui permet la liaison de la protéine 14-3-3, maintenant BRaf dans une configuration inactive. Ce résidu peut être déphosphorylé par les phosphatases PP1 et PP2A réactivant BRaf (Chong et Guan, 2003).

Les voies ERK1/2 et ERK5 régulent principalement la prolifération cellulaire par l’activation de protéines du cycle cellulaire en réponse aux hormones, facteurs de croissance, cytokines, agents transformants et carcinogènes (Nishimoto et Nishida, 2006). La voie ERK1/2 peut également réguler les protéines du cytosquelette et le métabolisme (Hilger et al., 2002). ERK5 régule la transcription de gènes impliqués dans la survie cellulaire et la quiescence indispensables pour l’angiogénèse et la fonction des cellules T (Sohn et al., 2005).

Les JNK (via MKK4 et MKK7) et p38MAPK (via MKK3 et 6) sont activées par des stress environnementaux, comme les UV ou les chocs thermiques, ainsi que par les cytokines inflammatoires et, dans certains types cellulaires, par des facteurs de croissance et hormones via leurs récepteurs couplés aux protéines G. Leurs fonctions principales sont la stimulation de la biosynthèse des cytokines, la réponse inflammatoire et l’apoptose, mais elles sont également impliquées dans la prolifération, la fonction cellulaire (Johnson et Lapadat., 2002), l’induction de l’expression de molécules d’adhérence et dans la migration des cellules endothéliales induite par le VEGF (Rousseau et al., 2000). Ces trois cascades de MAPKs sont reliées entre elles à différents niveaux (cross-signalling) rendant cette signalisation encore plus complexe (Schaeffer et Weber, 1999; Schwartz et al., 2002).

Les voies de signalisation des MAPKs, dont la durée et l’amplitude de l’activation sont cruciales pour avoir l’effet physiologique souhaité, sont régulées par des protéines phosphatases. Il existe 4 familles de tyrosine phosphatases, les récepteurs phosphatases classiques, les non-récepteurs phosphatases classiques, les phosphatases à double spécificité et les phosphatases à faible M

(Stoker, 2005). Plusieurs phosphatases à double spécificité, nommées DUSP pour ‘DUal SPecificity’, peuvent déphosphoryler différemment les enzymes des voies MAPK, JNK et p38. Les DUSPs sont divisées en 3 groupes selon leur emplacement subcellulaire. Ainsi les DUSP 1, 2, 4 et 5 sont exclusivement exprimées dans le noyau, tandis que les DUSPs 6, 7 et 16 sont exprimées préférentiellement dans le cytoplasme et les DUSPs 8, 9 et 10 dans les deux compartiments (Theodosiou et Ashworth, 2002). La cellule peut ainsi réguler la signalisation des voies des MAPKs en employant judicieusement différentes combinaisons de phosphatases (mono- ou dual specificity) pour aboutir à une réponse physiologique donnée. Par exemple, MKP2 (DUSP2, PAC1) agit sur les MAPKs et JNKs, tandis que M3/M6 déphosphoryle les JNK et p38, et DUSP1 (aussi nommée CL-100 ou MKP1) agit sur les trois enzymes (Ellinger-Ziegelbauer et al., 1997; Neel et Tonks, 1997).

Les Ser/Thr phosphatases individuelles comme PP2A et les Tyr phosphatases comme PTP1

peuvent également réguler l’activité des différentes MAPKs par déphosphorylation de résidus spécifiques (Alessi et al., 1995; Hunter, 1995; Keyse, 1995). Une dérégulation de l’expression des phosphatases DUSP a été identifiée dans plusieurs pathologies telles que la maladie d’Alzheimer et certains cancers (Ducruet et al., 2005).

1.1.3.2. La voie de la PI3-kinase/Akt

La protéine Ras peut également stimuler les PI3-Kinases (figure I.8A.). Les PI3-Kinases appartiennent à une famille d'enzymes qui phosphorylent les lipides inositols des membranes en position 3 du groupe inositol (Wymann et Pirola, 1998). Elles phosphorylent spécifiquement deux substrats: le phosphatidylinositol-4-phosphate (PI

P) et le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI

P2) générant ainsi respectivement du phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate (PI

P2) et du phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PI

P3) (figure I.8B.). Les phosphatidylinositols PI

P2 et PI

P3 sont absents à l'état normal dans les cellules quiescentes. Ils sont formés suite à un stimulus extracellulaire et sont rapidement dégradés par des phosphatases, notamment PTEN, SHIP-1 et SHIP–2. PTEN (Phosphatase and TENsin homolog) déphosphoryle le PI

P2 et PI

P3 respectivement en PI

P et PI

P2, substrats de base, tandis que les phosphatases SHIP (Src Homology domain- containing Inositol Phosphatases) déphosphorylent le 5-phosphate du PI

P3 pour obtenir du PI

P2 (Martelli et al., 2006). Le rôle de SHIP dans l’atténuation du signal dépendant de la PI3K n’est cependant pas bien connu. Les PI3K sont impliquées dans les voies de signalisation qui régulent la prolifération, la différenciation, le ‘ruffling’ membranaire, l’organisation du cytosquelette, la prévention de l’apoptose, le transport de glucose et le traffic vésiculaire (Wymann et al., 2003).

Il existe 3 grandes classes de PI3K chez les mammifères, mais seuls les membres de la classe I

sont impliqués dans les cancers (Shaw et Cantley, 2006). Les PI3-Kinases de la classe I

forment un complexe hétérodimérique composé d'une sous-unité catalytique de 110 kDa (p110) et d'une sous-unité régulatrice/adaptatrice de 85 kDa (p85). Au moins 5 protéines adaptatrices sont générées suite à l’expression d’épissages alternatifs de 3 gènes, Pik3r1, Pik3r2 et Pik3r3. La sous-unité p85 contient un domaine SH3, deux domaines SH2 et des motifs riches en résidus proline et s'associe à des tyrosines phosphorylées de récepteurs possédant une activité tyrosine kinase (PDGFR, EGFR, INSR, HGFR, IGF1R et NGFR) au niveau d'un motif consensus p-Y-X-X-M. Cette interaction aide à la localisation de la PI3K à la membrane. Cette sous-unité ne possède pas d’activité catalytique contrairement à la sous- unité p110, mais peut aider à la stabilisation de cette dernière (Martelli et al., 2006). La sous- unité catalytique p110 est donc associée aux RTK (récepteurs à tyrosine kinase) par la sous- unité p85, mais peut également lier directement la protéine Ras active, contribuant à son activation (Shaw et Cantley, 2006).

L’association de la PI3K aux tyrosines phosphorylées du récepteur induit une modification

conformationnelle de la protéine, ce qui active la sous-unité catalytique. Les lipides

membranaires ainsi phosphorylés jouent le rôle de second messager et servent de point

d’ancrage à deux protéines kinases: la phosphoinositide-dependent kinases (PDK1) et la

serine/thréonine kinase (AKT/PKB). L’interaction au niveau membranaire d’AKT avec le

PIP

par le domaine PH (Pleckstrin Homology domain) permet ses phosphorylations

activatrices (sur Thr

) par la PDK1 (Phosphoinositide Dependent Kinase 1) et (sur Ser

)

par une kinase (PDK2) encore mal identifiée, mais qui serait probablement un complexe

incluant mTOR (Sarbassov et al., 2005) (figure I.8A.). Il existe trois membres de la famille

Akt : Akt1, Akt2 et Akt3, issus de trois gènes différents. AKT inhibe l’apoptose et active des

facteurs de transcription (CREB, E2F, NF

B,…) permettant l’expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire, la différenciation et la survie cellulaire (Martelli et al., 2006). AKT phosphoryle également des protéines impliquées dans le métabolisme (Shaw et Cantley, 2006). La protéine PTEN, en déphosphorylant les lipides membranaires, est l’antagoniste d’AKT et induit son inactivation suite au décrochage d’AKT des lipides déphosphorylés.

PTEN est un suppresseur de tumeur souvent inactivé dans les cancers. La PI3K peut également activer la GTPase Rac, par lequel Ras induit en partie la transformation oncogénique (Shields et al., 2000).

Une troisième classe d’effecteurs important de Ras est constituée des membres de la famille des GEFs (GDP-GTP exchange factors) pour la petite GTPase Ral : RalGDS, RGL et RGL2/Rlf (Shields et al., 2000). La contribution des autres effecteurs de Ras chez les mammifères (Nore1, Rin1, AF-6, p120 GAP et NF1) est moins évidente, mais pourrait contribuer à la diversité d’action de Ras (Shields et al., 2000).

1.2. Réponses nucléaires : l’exemple des complexes AP-1

L'activation de plusieurs voies de signalisation aboutit à la formation de complexes protéiques AP-1 (Activator Protein-1). Les protéines AP-1 sont composées de dimères (homodimères ou hétérodimères) formés à partir de 3 protéines Jun (Jun B, c-Jun et Jun D) et/ou de 4 protéines Fos (cFos, Fos B, Fra-1 et Fra-2).

Ces protéines font partie de la superfamille des facteurs de transcription à domaine b-zip, comportant une région basique de fixation à l’ADN et un domaine de dimérisation de type tirette à leucines. Les acides aminés situés entre les leucines déterminent les associations entre les différentes protéines de cette famille : les dimères stables Jun/Fos ou les dimères moins stables Jun/Jun (Schuermann et al., 1991), les homodimères Fos/Fos n’existant pas. Les dimères AP-1 lient une séquence spécifique de l’ADN de consensus 5’-TGACTCA-3’

appelée TRE (TPA ou 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Responsive Element) présente

dans la région régulatrice de plusieurs gènes impliqués dans la croissance cellulaire comme

l’Il-2, TGF-β, c-Jun ou encore la cycline D1 (Angel et Karin, 1991), la prolifération, la

différentiation, l’apoptose et l’oncogenèse (Shaulian et Karin, 2001). Il a également été

montré que les protéines Jun et Fos peuvent se fixer sur l’ADN au niveau des sites

palindromiques dits CRE (Cyclic AMP Response Element), de séquence 5’-TGACGTCA-3’,

normalement reconnus par les protéines de la famille CREB/ATF (CREB, ATF1, ATF2 ou

CREBBP-1, ATFa, CREBBP-2, ATF3, ATF4 et ATF6) (Hai et Curran, 1991). Les membres

de cette famille, mais également NFκB et Smad, ainsi que les membres de la famille Maf

appartenant aux facteurs de transcription à domaine b-zip (c-Maf, MafB, MafA, MafG/F/K et

Nrl) et c/EBP, peuvent hétérodimériser avec les protéines Jun et ainsi augmenter le nombre de

combinaisons possibles (Benbrook et Jones, 1990). Les différents dimères ont des affinités

variables pour les séquences d’ADN, ce qui donnerait une spécificité d’action différente pour

chaque dimère (Hai et Curran, 1991).

1.3. Evènements précoces : l’induction de protooncogènes

Les protooncogènes des familles myc, fos (c-Fos et FosB, mais pas Fra1 et Fra2) et jun codent pour des oncoprotéines qui peuvent également agir individuellement comme facteur de transcription jouant un rôle important dans la régulation de la prolifération et la différentiation. Dans un grand nombre de cellules, leur expression est rapidement et transitoirement activée par les stimuli mitogènes et semble jouer un rôle dans la transition G0- G1 du cycle cellulaire. Ces gènes sont désignés comme des ‘early-response genes’ (egr) car ils sont induits avant la phase de synthèse d’ADN (Curran et Morgan, 1987).

La séquence régulatrice du gène c-fos contient un élément du type SRE (Serum-Response

Element), appelé ainsi car elle est capable d’être activée par plusieurs facteurs de croissance

trouvés dans le sérum. Les MAPKs, activées par phosphorylation dans le cytoplasme, peuvent

entrer dans le noyau où elles phosphorylent le complex TCF (Ternary Complex Factor) qui

peut alors se lier à deux molécules SRF (Serum Response Factor) (figure I.7.). Ce complexe

trimérique reconnaît la séquence génomique SRE dans le promoteur de certains gènes comme

celui de c-fos, et active leur transcription (Treisman, 1994; Vickers et al., 2004). TCF peut

ainsi réguler la prolifération et probablement la protection contre l’apoptose (Vickers et al.,

2004).

2. Développement du cancer et invasion tumorale

Une tumeur est par définition une excroissance (un amas de cellules) provoquée par une prolifération anormale de certaines cellules proliférant plus rapidement que les cellules voisines. Elle peut être bénigne ou maligne. Les cellules cancéreuses sont des cellules qui ont échappé aux mécanismes normaux de la division cellulaire. Dans ce processus déréglé, les cellules changent souvent de structure, on dit alors qu'elles se dédifférencient et peuvent former des métastases. La capacité d’invasion est une caractéristique unique aux cellules tumorales malignes. Mais si une cellule tumorale possède toute une série de caractéristiques qui permettent de la définir (table I.2.), elle est aussi issue d’un tissu normal dont elle conserve parfois des propriétés. Plus elles sont dédifférenciées, plus le pronostic d’évolution de la tumeur est mauvais.

Entre les deux états bénins et malins, il existe des lésions qui possèdent les caractéristiques de la bénignité mais qui ont un potentiel de progression vers le cancer. Ainsi, dans la thyroïde, les tumeurs à potentiel de malignité incertaine ou adénomes atypiques sont difficiles à classer en tant que bénignes ou malignes.

Le processus de carcinogénèse comporte trois étapes: l’initiation, la promotion et la progression. Les oncogènes, qui stimulent la croissance et la division cellulaire et inhibent la différenciation, peuvent être activés par translocation, délétion ou multiplication chromosomique, ou mutations et transformer une cellule normale en une cellule à prolifération incontrôlable. Les mutations initiatrices de tumeurs (par substitution, délétion ou insertion) peuvent être héréditaires ou somatiques. Deux classes de gènes, les proto- oncogènes comme ras et les gènes suppresseur de tumeur comme p53, Rb ou PTEN peuvent jouer un rôle important dans l’induction de cancers. Les mutations oncogéniques, où le proto- oncogène devient oncogène, sont généralement phénotypiquement dominantes et font proliférer la cellule malgré la présence d’un allèle normal (Hahn et Weinberg, 2002). Ce sont des mutations ‘gain de fonction’. Les suppresseurs de tumeurs codent généralement pour des protéines qui, d’une façon ou d’une autre, inhibent la prolifération cellulaire. Puisqu’un seul allèle est suffisant pour contrôler cette prolifération cellulaire, les deux allèles doivent être perdus ou inactivés pour promouvoir le développement du cancer. Ces mutations ‘perte de fonction’ sont donc récessives. Plusieurs altérations génétiques successives sont nécessaires pour le développement d’un cancer (progression tumorale). Il a été proposé par R. Weinberg que la transformation requiert l’acquisition d’au moins six propriétés (Hanahan et Weinberg, 2000):

1) Indépendance vis à vis des signaux stimulant la prolifération 2) Insensibilité aux signaux inhibiteurs

3) Abolition de l’apoptose

4) Capacité proliférative illimitée 5) Capacité de susciter l’angiogenèse 6) Acquisition d’un pouvoir invasif

Le développement d'un cancer est le résultat d'une combinaison entre l'activation des voies

favorisant la prolifération cellulaire et l'inhibition de signaux diminuant le potentiel

prolifératif des cellules. En réponse aux signaux extérieurs, la cellule normale met en place un

programme de prolifération, ainsi que toute une gamme de réponses fonctionnelles

(métabolisme, sécrétion, migration, forme, polarité de la cellule, etc.), voire de mort cellulaire programmée. L’activité constitutive de certaines voies de signalisation suite à des mutations géniques dans des oncogènes envoie constitutivement des messages de survie et de prolifération aux cellules concernées et rend les facteurs de croissance inutiles.

L'indépendance aux signaux de croissance peut provenir de différentes altérations moléculaires.

La cellule tumorale peut acquérir une autocrinie, c’est-à-dire qu’elle synthétise les facteurs de croissance (PDGF, EGF, IGF-I, IGF-II, TGFα), les hormones thyroïdiennes ou les cytokines auxquels elle est sensible. Elle peut aussi acquérir une indépendance vis-à-vis de la matrice extracellulaire ou des cellules voisines. Les contacts avec la matrice extracellulaire (MEC) sont altérés, ce qui est la première condition avant l’acquisition de la capacité d’envahir les structures voisines. Ce changement de stimulus et d’expression de protéines à la surface des cellules, ainsi que la modification du fonctionnement de nombreuses voies de signalisation peut favoriser l’acquisition de propriétés tumorales telles que l’angiogénèse ou la capacité d’invasion. Pour former une métastase, les cellules tumorales doivent également être capables de proliférer et doivent devenir insensibles aux inhibitions de contact.

L’angiogénèse est un phénomène hautement régulé par des facteurs activateurs ou inhibiteurs.

Dans des conditions physiologiques, de très nombreux facteurs négatifs ne permettent l’expression des facteurs angiogéniques que dans des situations particulières (embryogenèse, inflammation, cicatrisation, menstruation).

L’angiogénèse comporte plusieurs étapes comprenant la dégradation de la membrane basale des capillaires et de la matrice extracellulaire environnante (notamment par des metalloprotéinases matricielles (MMPs) et d’autres protéases sécrétées par les cellules tumorales ou originaires du stroma, tissu conjonctif assurant le soutien et la nutrition de la tumeur), puis la migration de cellules endothéliales vers la tumeur où elles vont se mettre à proliférer, et enfin la formation de nouveaux canaux et embranchements, créant ainsi une nouvelle membrane basale (Fidler, 2002; Heissig et al., 2003). Les tumeurs humaines sécrètent des facteurs angiogéniques induisant la prolifération et la chimiotaxie des cellules endothéliales. Le processus de néoangiogénèse résulte d’un déséquilibre entre facteurs proangiogéniques (bFGF, TNFα, VEGF, angiogenine, PDGF, HGF, PGF, IL-8, stromélysine1, collagénase I et IV) et facteurs antiangiogéniques (angiostatine, endostatine, PAI1, PAI2, TIMP1 et 2, interférons α et β, PF4, thrombospondine) (Takeda et al., 2002).

L’acquisition des propriétés invasives et migratoires par les cellules épithéliales transformées

s’accompagnent de changements morphologiques caractéristiques. Le processus métastatique

implique une série d’étapes consécutives, qui incluent le détachement cellulaire de la tumeur

primaire, la migration à travers la MEC, la dégradation de la paroi vasculaire, la pénétration et

la survie dans la circulation sanguine, l’adhésion à des cellules endothéliales distantes, la

pénétration dans un nouveau tissu avec un nouvel environnement et finalement la

prolifération des cellules métastatiques en collaboration avec le stroma local. La tumeur

initiale ou la micrométastase doit ensuite développer un réseau vasculaire et éviter la réponse

immunitaire pour lui permettre de dépasser le diamètre critique de 1mm (Fidler, 2002). La

prolifération cellulaire simple n’est pas suffisante pour former une tumeur. En effet, celle-ci a

également besoin d’un environnement adéquat riche en cellules inflammatoires (stroma

inflammatoire), facteurs de croissance et de survie, et agents endommageant l’ADN

(Coussens et Werb, 2002).

La formation des métastases est en fait un processus très inefficace. Très peu de cellules qui quittent la tumeur primaire arriveront à former des métastases cliniquement visibles. Une fois implantées dans le nouvel environnement, certaines cellules vont mourir, d’autres proliférer et induire l’angiogénèse, donnant naissance à une tumeur volumineuse. Certaines cellules cancéreuses vont rester dans un état de latence et sont responsables de l’apparition de métastases tardives.

L’augmentation du risque d’apparition de cancer dans les états inflammatoires chroniques est bien caractérisée. Les cellules cancéreuses usurpent le processus inflammatoire, en employant les mêmes outils (molécules d’adhésion, cytokines et chimiokines) et les mêmes voies que les leucocytes migrant vers des sites d’inflammation éloignés. Les cellules inflammatoires trouvées dans les tumeurs contribueraient plus à la croissance, à l’invasion tumorale et à l’immunosuppression qu’à une réponse anti-tumorale. Elles sont de puissants promoteurs de tumeurs, produisant un environnement favorable pour leur croissance, facilitant l’instabilité génomique et la formation de nouveaux vaisseaux (Coussens et Werb, 2002; Dranoff, 2002;

Lu et al., 2006). Alors qu’une inflammation normale produit des cytokines anti- inflammatoires peu après les pro-inflammatoires pour arrêter le processus d’inflammation, ces tumeurs cancéreuses se comportent comme ‘des plaies qui ne se guérissent pas’ (Coussens et Werb, 2002) et le processus d’inflammation perdure.

Toutes les tumeurs ne forment pas de métastases, puisqu’il faut que certaines cellules cancéreuses acquièrent des mutations génétiques spécifiques. Une signature d’expression génique spécifique aux tumeurs capables de métastaser et indépendante du tissu tumoral a été proposée par le groupe de Golub (Ramaswamy et al., 2003). Cette signature pourrait permettre de prévoir si le cancer a le potentiel de métastaser. Une signature permettant la distinction entre un mauvais et un bon pronostic a également été identifiée dans le cancer du sein ('t Veer et al., 2002).

Une expression flexible et dynamique des molécules d’adhésion, de facteurs de croissance, de facteurs impliqués dans la mobilité, de protéases et de leurs inhibiteurs, doit donc être acquise par les cellules tumorales malignes (Bussemakers et Schalken, 1996).

Pour mieux comprendre les phénomènes impliqués dans la carcinogénèse, nous décrirons la structure et la fonction de la matrice extracellulaire (ou MEC) et l’adhésion cellulaire plus en détail.

2.1. La matrice extracellulaire (MEC)

La MEC, dont fait partie la membrane basale, constitue l’espace entre les pôles basaux des cellules polarisées et est le premier obstacle à l’invasion. La membrane basale est constituée de laminine, de collagène de type IV, de fibronectine et d’héparane sulphate protéoglycane et joue un rôle primordial dans la morphogénèse, la différenciation cellulaire, l’architecture tissulaire et l’adhérence cellulaire.

La matrice extracellulaire contient un ensemble de macromolécules : polysaccharides

(essentiellement des glycosaminoglycanes), protéines fibreuses, protéines de structure (les

collagènes, l’élastine), plusieurs facteurs de croissance et protéases (Rohrbach et al., 1993) et des protéines d’adhésion (laminine, fibronectine). Dans la plupart des organes, le collagène est le constituant principal de la MEC. Il est produit et sécrété par les cellules du stroma, notamment les fibroblastes. Le collagène, représentant environ 30% des protéines de l’organisme humain, apporte la structure et la résistance nécessaire pour l’organisation des cellules qui forment le tissu. Il sert entre autre de support pour l’adhésion cellulaire, peut lier des facteurs de croissance dans un état latent et moduler la fonction cellulaire via des récepteurs, notamment ceux de type intégrine (Borel et Maquart, 1998). Les protéoglycans (chondroïtine, héparan et kératane sulphate ou encore glycosaminoglycanes) contribuent à la fibrillogénèse du collagène (Danielson et al., 1997; Vogel et al., 1984), à l’hydratation des tissus et à la résistance aux forces de pression et d’étirement, mais également aux interactions cellule-matrice ou à l’approvisionnement de facteurs de croissance et de cytokines. Ces dernières fonctions leur donnent la capacité d’intervenir dans la modulation des comportements cellulaires comme la différenciation, la migration, la prolifération et la transmission de signaux, ou encore la régulation de la morphogénèse (Alexopoulou et al., 2006; Cruet et al., 1999; Gallo et al., 1996; Hubmacher et al., 2005).

La MEC est donc importante dans l’architecture et le maintien de la structure cellulaire et tissulaire et l’homéostasie. Elle est également le support mécanique sur lequel reposent les cellules dans l’organisme pour assurer la cohésion des tissus (Hubbell, 2003). Sa structure évolue dynamiquement en fonction des évènements physiologiques et pathologiques.

La dégradation protéolytique de la MEC se fait par des protéases et plus particulièrement par des sérines protéases (uPA, urokinase type plasminogen activator et tPA, tissue-type plasminogen activator), des cystéines ou aspartyl (cathepsines) protéases et par des metalloprotéinases de la matrice (MMPs), enzymes liant le zinc à activité endopeptide. Il existe plus de 20 MMPs humaines différentes, catégorisées selon leur spécificité dans la dégradation des protéines de la matrice extracellulaire : collagénases (MMP-1 et MMP-13), gélatinases (MMP-2 et MMP-9), stromélysines (MMP-3, MMP-10, MMP11 et MMP-18) et matrilysines (MMP-26). Il existe également des MMPs qui régulent négativement la dégradation de la MEC (ex : MMP8 et MMP19). La plupart des MMPs ne sont pas exprimées constitutivement par les cellules normales mais seulement après induction par des cytokines et des facteurs de croissance lors de la cicatrisation ou de l’inflammation. Elles sont alors produites par des cellules inflammatoires et stromales (Stetler-Stevenson et Yu, 2001). Leur activité est inhibée par des antagonistes endogènes appelés TIMP (Tissue Inhibitor of MetalloProteinases) et par d'autres protéines comme l'α2-macroglobuline. Il a été observé que les tumeurs avec un mauvais pronostic exprimaient souvent des taux élevés de TIMP-1 et –2 (Gomez et al., 1997). Les TIMPs peuvent induire l’angiogénèse tumorale (par induction de VEGF) (Yoshiji et al., 1998), la survie des cellules tumorales et la croissance tumorale (Hayakawa, 1994; Jiang et al., 2001). Les MMPs jouent également un rôle critique dans le développement tumoral (aussi bien dans la progression que dans la régression de la tumeur) et l’angiogénèse (Heissig et al., 2003), ce qui suggère que le taux d’expression des différents MMPs et de TIMPs peut influencer la progression d’une tumeur.

Certains composants de la MEC libérés par le processus de dégradation peuvent exercer une

action stimulatrice ou inhibitrice sur les cellules. Ainsi des fragments de collagène XV

(endostatine) ou de collagène IV (arrestine, tumstatine, canstatine) sont parmi les plus

puissants inhibiteurs de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales.

2.2. L’adhésion cellulaire

L’adhésion cellulaire est un processus multiple qui inclut le contact cellule – matrice, le contact homotypique cellule – cellule et le contact hétérotypique cellule – cellule (figure I.9.).

Il permet le maintien de la structure tridimensionnelle des tissus, la formation de complexes signalétiques ainsi que la morphogenèse. Il existe quatre familles de récepteur d’adhésion : les intégrines, les cadhérines, la superfamille des immunoglobulines – CAM (Cell Adhesion Molecule) ainsi que les sélectines. La perte de contact entre cellules épithéliales ou entre la cellule et la matrice extracellulaire est essentielle pour le détachement d’une cellule tumorale de la tumeur primaire (Tawil et al., 1996). Etant donné que les cadhérines (ex. CDH2) sont mentionnées à plusieurs endroits dans ce travail, nous décrirons celles-ci plus en détails.

Les cadhérines sont une famille de protéines transmembranaires impliquées dans l’interaction cellule–cellule homophylique (Wheelock et Johnson, 2003). Plus d’une centaine de protéines ont été identifiées appartenant à cette famille dont les principales sont la N- cadhérine, E-cadhérine, P-cadhérine,… La portion extracellulaire d’une cadhérine interagit en présence de calcium avec la portion extracellulaire d’une autre cadhérine sur la cellule voisine (figure I.10.). Les cadhérines se localisent au niveau membranaire dans les jonctions adhérentes où elles sont liées par leur portion cytoplasmique au cytosquelette d’actine par l’intermédiaire des caténines. Les caténines (α- β- et γ-caténine) assurent un rôle de transmission de signaux. La β-caténine lie une région de 30 acides aminés se trouvant dans la partie C-terminale du domaine cytoplasmique de la cadhérine. L’α-caténine se lie à la β- caténine, qui lie à son tour directement l’actine ou indirectement par l’intermédiaire de protéines comme l’α-actinine et la vinculine. Les cadhérines interviennent dans l’embryogénèse, la régulation de la morphogénèse, la formation des tissus, mais également dans plusieurs mécanismes de signalisation régulant le comportement cellulaire, la reconnaissance cellulaire, le maintien de l’intégrité tissulaire et la différenciation cellulaire.

Etant donné leur importance dans la reconnaissance cellulaire, dans l’adhésion et dans la signalisation, les altérations dans leur expression sont corrélées avec la carcinogénèse. La perte d’expression de la E-cadhérine (Epithelial-cadherin) est associée à une perte de cohésion tissulaire et un gain d’invasivité. La perte des caténines peut amener le même résultat. Par ailleurs, la protéine APC (Adenomatous Polyposis Coli, un suppresseur de tumeur), impliquée dans les cancers colorectaux, interagit normalement avec la β-caténine libre pour réguler sa dégradation. Lors d’une perte ou d’une mutation de APC, la β-caténine s’accumule et peut agir comme facteur de transcription et ainsi réguler l’expression de gènes comme c-myc, c- jun, cycline D1,… Ainsi, l’implication des cadhérines-caténines dans la progression tumorale est également observée au niveau de la survie et de la croissance néoplasique (Meyer et Hart, 1998).

Les cellules endothéliales forment aussi un type unique de jonction cellulaire contenant des

N-cadhérines, localisées de façon dispersée sur la surface des cellules, et des VE-cadhérines,

localisées dans les jonctions. Il a été proposé que la N-cadhérine induit un état d’adhésion

dynamique dans les cellules tumorales. Ceci permet la dissociation des cellules de la masse

tumorale, ainsi que des interactions avec des composants endothéliaux et du stroma, par des

interactions homophiliques avec la N-cadhérine exprimée par les cellules endothéliales

(Hazan et al., 1997; Tran et al., 1999). Cette adhésion de la N-cadhérine à l’endothélium

permettrait aux cellules cancéreuses d’entrer et de sortir de la vasculature. Elle serait ainsi

responsable de la formation de métastases des cellules cancéreuses (Hazan et al., 2000).