Microscopie confocale à balayage laser
Romain Morichon IFR 65 Site St Antoine
Principe microscope confocal
Marvin Minsky
Informaticien et roboticien américain
Créateur de l’intelligence artificielle et le père du confocal (1957)
Structure des plateformes
• Plateformes d'imagerie cellulaire Font partie de l'IFR 65
• Regroupement 15 équipes INSERM, 10 équipes d'accueil P6.
- Plateforme Tenon
- 1 SP1 Leica (1998), 200K€
- 1 SP2 Leica (2004) + Multiphoton (2006), 450K€
- Plateforme St Antoine - 1 SP2 Leica (2012)
- 1 Spinning disk (2008) 350K€
GFP
Principe microscope confocal
Au niveau de l’échantillon
Exemple
Cellule Hela
Epifluorescence Confocal
Microtubule F-Actine Noyaux
Résolution
• Microscopie conventionnelle d
xy= 0,61. /ON
d
xz= 2. /ON
2• Microscopie Confocale d
xy= 0,4. /ON
d
xz= 1,4. /ON
2Gain :
15% en latérale 30% en axiale Exemple : 100X 1,4ON à 488nm
Conventionnelle:
dxy= 210nm dxz= 500nm
Confocale
dxy= 140nm dxz= 350nm
Quelques exemples de confocal
Nikon A1+
Zeiss LSM 710
Olympus FLUOVIEW 1000
Leica SP5
Leica SP5
LASER
AOTF
LASER comme source de lumière
• Source lumineuse monochromatique intense
• Différents types de LASER:
– Ar 457nm, 488nm, 514nm – ArKr 488nm, 568nm, 647nm – HeNe 543nm
– HeNe 633nm
– Diodes 405nm ou 488nm ou 561nm…
Choix des Fluorochromes
Alexa 568 Alexa 568
Alexa 568
514nm
543nm
561nm
Choisir les fluorochromes en fonction des lasers disponibles.
Plus l’excitation sera loin du maximum d’absorption plus l’émission sera
faible.
AOTF
L’interaction entre la lumière et une onde acoustique produit une diffraction de la lumière.
A partir d’une fréquence acoustique
donnée on sélectionne une longueur d’onde.
Possibilité de sélectionner jusqu’à 8 raies et d’en moduler leurs intensités
Laser 1 Laser 2
Laser 3 Laser 4
Laser 5
Leica SP5
AOBS
AOBS vs Dichroique
Permet de supprimer les filtres dichroïques classiques qui ont des caractéristiques fixes et une bande passante faible.
possède une grande flexibilité et une meilleure efficacité
permet de réduire la puissance de laser tout en réalisant des acquisitions plus rapides
permet de contrôler jusqu'à 8 raies lasers de façon séquentielle ou simultanée.
Courbe de transmission
Leica SP5
Système de balayage XY
Système de balayage Z
Balayage XY
12
Effectué par 2 miroirs orientés par des moteurs galvanométriques ou résonnants
Balayage x en continu
Balayage y incrémenté
Vitesse de balayage 200, 400, 800 ou 1000 Hz pour un galvanomètre linéaire et jusqu’à 8000Hz pour un résonnant.
GSI Lumonics OSS 2500
1 2
Uni
Bi
Vitesse de balayage
Balayage Z
• En bougeant l’objectif
– Z drive: grande amplitude, précision 10nm
– Objectif piezo: faible amplitude (400µm), grande précision (n)
• En bougeant la platine
– Piezo: faible amplitude (500µm), grande précision (nm)
– Galvo: grande amplitude (1,5mm), grande
précision (10nm)
Leica SP5
Pinhole
Pinhole
Confocal Non confocal
ouverture du pinhole
d < 0.7AU
Diamètre d’ouverture faible -> Section optique fine
=résolution Z élevée
=Signal récupéré faible
d > 1AU
Diamètre d’ouverture élevé -> Section optique épaisse
=résolution Z faible
=Signal récupéré élevé
Pinhole optimisé pour chaque objectif à 1AU
Leica SP5
Système de détection
Prisme/fente spectrale
PMT
PMT PMT
PMT PMT
PMT
Rendement 40%PMT Photodiode
Rendement 80%
Gain et offset
Gain: Amplifie le signal d’entré -> luminosité de l’image augmentée Offset: Permet d’enlever le bruit fond de l’image
Effet de saturation Épaisseur=0,85µm
Épaisseur=1,35µm
Lut « glow over/under »
Image
Chaque pixel (picture element) a une coordonnée et une valeur d’intensité.
Format de l’image 512x512, 1024x1024, 2048x2048…
Pour du qualitatif -> Intensité codée sur 8 bits (256 niveaux de gris) Pour du quantitatif -> Intensité codée sur 12 bits (4096 niveaux de gris) L’œil ne perçoit que 30 à 40 niveaux de gris
Résolution
La capacité d’un système optique à distinguer deux points distincts.
Combien de pixel ais je besoins pour reproduire l’objet avec la meilleur résolution?
-> Critère de Nyquist
Pas d’échantionnage = r/2,3
Objectifs Longueur d’onde
(nm) ON Rxy
(nm)
Taille du pixel (nm)
Zoom
512x512 1024x1024 2048x2048
63X 500 1,4 160 70 4X 2X 1X
Exemple:
1024X1024 256X256
Moyennage
Sans 2X 8X
Fait la moyenne arithmétique de chaque valeur d’intensité de chaque pixel ÞAmélioration du rapport signal/bruit
Moyennage par ligne utilisé pour expérimentation sur le vivant
Accumulation
Les valeurs d’intensités mesurées sont additionnées pour chaque point de balayage
=> Permet d’augmenter le signal en cas de marquage faible
Sans 2X 4X
Zoom
Zoom 1
Zoom 2
Zoom 4
Une zone plus petite est scannée avec le même nombre de pixels -> la résolution reste constante, Les détails sont augmentés
Multimarquage
Attention au chevauchement de spectres
Acquisition simultanée 488 + 568
a = Anti RF(Alexa 488) b = C12 Bodipi 568
c = Merge
Acquisition séquentielle 488 puis 568
d = Anti RF(Alexa 488) e = C12 Bodipi 568
f = Merge
Acquisition séquentielle si utilisation de 2 fluorochromes proches!
a b c
d e f
PMT 2
Acquisition
sections optiques
Acquisition de 80 images à 200nm d’intervalle en 1024x1024
Projection
Cellule MDCK
Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3 Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire
Reconstruction 3D
Coupe XZ
Coupe XY
Coupe XZ
Cellule MDCK
Vert Alexa 488 marquage de la protéine MDR3
Rouge Iodure de propidium marquage nucléaire
Accumulation apicale de MDR3
Co-localisation
A anti-FLAG M2 Alexa Fluor 546 B anti CD-3 / Alexa Fluor 633 C Merge
Time Laps
-Cellules MA104
-Sonde Calcium MC164 cagée -Sonde desestérifiée dans cellule, devient fluo quand fixée au Ca
-Acquisition toutes les 10 secondes de 5 coupes
Applications
Microscope confocal biphoton
Confinement de l’excitation laser -> pas de pinhole -> moins de photons perdus Grande profondeur d’observation (jusqu’à 300µm)
Pas de photoblanchiement hors du plan focal
GFP : 1 photon à 488nm
2 photons à 960 nm…
Préservation
échantillon Résolution Rapidité Multicouleurs Échantillon épais Microscope
confocal - ++ - ++ +
Microscope
Biphoton ++ ++ - + ++
Spinning disk + ++ ++ + +
Apotome - + - + +
Vidéo
microscope ++ + ++ + +
