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Mécanismes de séparation des chromosomes dans
l’ovocyte de souris
Sandra Touati
To cite this version:
Sandra Touati. Mécanismes de séparation des chromosomes dans l’ovocyte de souris. Physiologie [q-bio.TO]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2014. Français. �NNT : 2014PA066443�. �tel-01127597�
Thèse de doctorat de l’Université Pierre et Marie Curie
Sorbonne Universités
Institut de Biologie Paris Seine
Mécanismes de séparation des chromosomes dans
l'ovocyte de souris
Présentée par Sandra TOUATI
Présentée et soutenue publiquement le 26 septembre 2014
Devant le jury composé de :
Pr. Sophie Louvet
Présidente
Dr. Jean Paul Javerzat
Rapporteur
Dr. Thierry Lorca
Rapporteur
Cr. Marie Emilie Terret
Examinatrice
Liste des abréviations
ADN - Acide Désoxyribonucléique
APC/C - Anaphase Promoting Complex/Cyclosome ARNm - Acide Ribonucléique messager
ATP - Adenosine Tri-Phosphate
Bub - Budding uninhibited by benomyl
BubR1 - Budding Unhinibited by Benomyl Related BSA - Bovine Serum Albumin
CCAN - Constitutive Centromere Associated Network CDC - Cell Division Cycle
CDK- Cyclin Dependent Kinase CENP - CENtromeric Protein
CKI - Cycline dependent Kinase Inhibitor
Cks - Cycline dependent Kinase regulatory Subunit CPC - Chromosomal Passenger Complex
CSF - CytoStatic Factor C-Ter - C-Terminale D box - Destruction box
dbcAMP - dibutyryl cyclic AMP DTT - 1-4 Dithiothréitol
Emi1 - Early mitotic inhibitor 1
GV- Germinal Vesicle (enveloppe germinale)
GVBD - Germinal Vesicle BreakDown (rupture de l’enveloppe germinale) INCENP - INer CENtromere Protein
IP - Iodure de Propidium KMN - Knl1-Mis12-Ndc80 LH - Luteinizing hormone Mad - Mitotic arrest deficient
Mam1 – Monopolar microtubule attachments during meiosis 1 MAPK - Mitogen Activated Protein Kinase
MCAK - Mitotic Centromere Associated Kinase MCC - Mitotic Checkpoint Complex
MPF - M phase Promoting Factor Mps1 - Monopolar spindle 1
MTOC - MicroTubule Organizing Center
Myt 1 - Membrane associated and tyrosine/threonine specif 1 NEBD - Nucear Enveloppe Break Down
Noc - Nocodazole N-Ter - N-Terminale
NuMA - Nuclear protein that associates with the Mitotic Appartus P90RSK - p90 Ribosomal S6 Kinase
Pb - Paire de base
PBE - Polar Body Extrusion (expulsion de globule polaire) PCR - Polymerase Chain Reaction
Phase G - Gap
Plk1 - Polo like kinase 1 PP2A - Phosphatase 2A
RCC1 - Regulator of chromosome condensation 1 Rec 8 - Recombination Protein 8
RZZ - Rod-Zw10-Zwilch
SAC - Spindle Assembly Checkpoint (point de contrôle du fuseau) SDS - Sodium Dodécyl Sulfate
Sgo - Shugoshin
Smc - Structural maintenance of chromosome Scc - Sister chromatid cohesion
Sr - Strontium
wt - wild type (sauvage) ZP3 - Zona Pellucida 3
Résumé
Chez la femme, le risque de concevoir un embryon aneuploïde augmente de façon exponentielle dès 35 ans. La majorité de ces aneuploïdies sont dues à de mauvaises ségrégations des chromosomes lors des deux divisions de méiose dans l’ovocyte. Afin de limiter les erreurs de ségrégation, les divisions méiotiques doivent impérativement se dérouler en deux temps et de manière contrôlée.
Lors de la première transition métaphase-anaphase de méiose, les chromosomes homologues se séparent puis une ségrégation des chromatides sœurs se déroule lors de la seconde transition métaphase-anaphase. Afin de permettre ces divisions, les cohésines maintienent les chromatides sœurs liées entre elles et doivent impérativement être clivées en deux temps par la Séparase. Ainsi, il existe un système de protection des cohésines centromériques, composé des protéines Sgo2 et PP2A, permettant de maintenir les chromatides sœurs liées au niveau des régions centromériques en méiose I. En revanche, en méiose II, une perte de protection des cohésines centromériques est indispensable afin de permettre leur clivage.
Un premier aspect de ma thèse a consisté à étudier les mécanismes qui régulent la séparation des chromosomes dans l’ovocyte de souris. J’ai montré que la Cycline A2 joue un rôle essentiel pour la séparation des chromatides sœurs en méiose II. Au contraire, cette protéine doit impérativement être absente des régions centromériques en méiose I afin d’éviter une séparation précoce des chromatides sœurs qui conduirait irrémédiablement à la formation d’un ovocyte aneuploïde. J’ai également montré qu’un inhibiteur connu de PP2A appelé I2PP2A est primordial à la déprotection des cohésines centromériques en méiose II.
Dans un seconde temps, mes travaux de thèse ont visé à étudier le mécanisme de surveillance de la première transition métaphase-anaphase appelé SAC (Spindle Assembly Checkpoint). Il a été montré que l’expression d’une protéine du SAC appelée BubR1 décroît naturellement dans les ovocytes avec l’âge maternel. Afin d’analyser les conséquences de cette diminution, j’ai utilisé une lignée de souris totalement délétée pour la protéine BubR1 spécifiquement dans les ovocytes. J’ai montré que la perte totale de BubR1 entraîne plus de 80% d’aneuploïdies dans l’ovocyte dès la première division de méiose. La méiose I est accélérée et les chromosomes homologues se séparent de façon anarchique. De plus, le fuseau méiotique devient instable et les chromosomes homologues ne sont plus capables
Sommaire
Avant propos ... 1 Introduction ... 4 1 La division cellulaire ... 4 1.1 Généralités ... 4 1.1.1 Le cycle cellulaire ... 4 1.1.2 La division mitotique ... 5 1.1.3 La division méiotique ... 51.2 Différents complexes Cyclines-Cdk régulent le cycle cellulaire ... 6
1.3 Les cyclines A et B : deux acteurs principaux de la division cellulaire ... 6
1.3.1 La Cycline A2 ... 6
1.3.2 La Cycline B1 ... 7
1.3.3 Coordination des Cyclines A2 et B1 pour l’entrée en mitose ... 8
1.4 Dégradation des Cyclines A2 et B1 par le complexe APC/C ... 8
1.4.1 Protéolyse des substrats par l’APC/C ... 8
1.4.2 Dégradation des Cyclines A2 et B1 ... 9
1.5 Autres principales kinases et phosphatases de la division cellulaire ... 11
1.5.1 Les principales kinases de la division cellulaire ... 11
1.5.1.1 Plk1 (Polo-like kinase 1) ... 11
1.5.1.2 Aurora A/B/C ... 11
1.5.1.3 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) ... 12
1.5.1.4 Greatwall ... 12
1.5.1.5 Autres kinases de la division cellulaire ... 13
1.5.2 Les principales phosphatases de la division cellulaire ... 13
1.5.2.1 PP1 (Protein Phosphatase 1) ... 13
1.5.2.2 PP2A (Protein phosphatase type 2A) ... 13
1.5.2.3 Autres phosphatases de la division cellulaire ... 14
2 La maturation méiotique dans l’ovocyte de souris ... 14
2.1 L’ovogénèse ... 14
2.2 La maturation méiotique ... 15
2.3 L’entrée en méiose I ... 16
2.3.1 Régulation de l’activité Cdk1 par l’AMPc ... 16
2.3.2 Régulation des niveaux de Cycline B1 ... 17
2.4 Mise en place du fuseau méiotique et de la bi-orientation des chromosomes homologues ... 18
2.5 Transition métaphase-anaphase en méiose I ... 20
2.6 Entrée et sortie de méiose II ... 21
2.6.1 Généralités sur la méiose II ... 21
2.6.2 Régulation de l’activité MPF lors de l’arrêt CSF ... 21
2.6.3 Séparation des chromatides sœurs en méiose II ... 22
3 Mécanismes de bi-orientation des chromosomes homologues et de la protection des cohésines centromériques en méiose I ... 23
3.1 Les complexes cohésines ... 24
3.2 Assemblage des kinétochores ... 25
3.4 Bi-orientation des chromosomes homologues et mono-orientation des chromatides
sœurs en méiose I ... 27
3.4.1 La mono-orientation par le complexe monopoline ... 27
3.4.2 La mono-orientation par les cohésines et les chiasmata ... 28
3.5 Correction et stabilisation de la bi-orientation des chromosomes homologues par Aurora B/C ... 29
3.5.1 Le complexe CPC dans la correction des attachements ... 29
3.5.2 Mécanisme de stabilisation et de déstabilisation des attachements ... 30
3.6 Rôles de Shugoshin en méiose I ... 32
3.6.1 Généralités sur Shugoshin ... 32
3.6.2 Le gardien de la protection des régions centromériques des chromosomes ... 32
3.7 Mécanisme de protection de la cohésine centromérique en méiose I ... 33
3.7.1 Chez la levure ... 33
3.7.2 Chez les mammifères ... 34
4 Le point de contrôle du fuseau chez la souris ... 35
4.1 Généralité sur le SAC ... 35
4.2 Quels sont les signaux reconnus par le SAC ? ... 36
4.3 Le SAC en mitose ... 38
4.3.1 Recrutement des protéines du SAC aux kinétochores ... 38
4.3.2 Le MCC comme inhibiteur de l’APC-Cdc20 ... 38
4.3.3 Les protéines du SAC et la régulation de la prométaphase ... 40
4.3.4 La protéine BubR1 ... 40
4.3.5 L’inactivation du SAC ... 42
4.4 Le SAC en méiose I chez les mammifères ... 43
4.4.1 Existence et robustesse du SAC en méiose I ... 43
4.4.2 Rôles des protéines du SAC en méiose ... 44
4.4.3 Régulateurs du SAC en méiose ... 46
Résultats ... 49
Article 1 : Cyclin A2 is required for sister chromatid segregation, but not separase control, in mouse oocyte meiosis. ... 49
Article 2 : The PP2A inhibitor I2PP2A is essential for sister chromatid segregation in oocyte meiosis II. ... 53
Article 3 : BubR1 is not required for prophase I arrest, but for the meiotic spindle checkpoint and robust kinetochore attachments in oocytes. ... 56
Discussion ... 62
1 L’entrée en méiose dans l’ovocyte ... 62
2 Déprotection des cohésines centromériques et séparation des chromatides sœurs en méiose II ... 64
2.1 Rôle d’I2PP2A dans la séparation des chromatides sœurs en méiose II ... 64
2.2 Rôle de la Cycline A2-Cdk1 dans la séparation des chromatides sœurs en méiose II 65 3 Quels sont les signaux reconnus par le SAC en méiose I ? ... 66
3.4 Quel type de tension est reconnu par le SAC en méiose I ? ... 71
4 Augmentation des aneuploïdies avec l’âge maternel ... 73
4.1 Les cohésines et l’augmentation des aneuploïdies avec l’âge maternel ... 74
4.2 Le SAC et l’augmentation des aneuploïdies avec l’âge maternel ... 74
Bibliographie ... 77
Index des figures
Figure 1. Incidence des trisomies en fonction de l’âge maternel chez l’Homme Figure 2. Origine des trisomies humaines
Figure 3. Les phases du cycle cellulaire et leur point de contrôle
Figure 4. Schéma comparatif de la ségrégation des chromosomes en mitose et en méiose Figure 5. Cyclines et Cdk du cycle cellulaire chez les mammifères
Figure 6. Entrée en phase M chez les mammifères Figure 7. Protéolyse par l’APC/C
Figure 8. Prophase I de l’ovocyte de mammifère Figure 9. Maturation méiotique de l’ovocyte de souris
Figure 10. Régulation de l’activité MPF dans les ovocytes de souris en GV
Figure 11. Bi-orientation des chromosomes homologues en méiose I dans l’ovocyte de souris Figure 12. Transition métaphase-anaphase en méiose I dans l’ovocyte de souris
Figure 13. Régulation de l’activité MPF en métaphase II dans l’ovocyte de souris Figure 14. Le complexe cohésine en mitose et en méiose
Figure 15. Attachement des chromosomes en mitose et en méiose I
Figure 16. Tension générée au niveau des chromosomes en mitose et en méiose I Figure 17. Localisation du CPC au niveau des centromères
Figure 18. Les protéines du SAC en méiose I dans l’ovocyte de souris Figure 19. Recrutement des protéines du SAC aux kinétochores Figure 20. Changement de conformation de Mad2
Hassold et Hunt, Nat Rev Genet, 2001
Figure 1. Incidence des trisomies en fonction de l’âge maternel chez l’Homme
Avant 30 ans, le nombre de grossesses à risque de trisomie est inférieur à 5%. À partir de 35 ans, une augmentation exponentielle du nombre de grossesses à risque est observée. Après 40 ans, plus de 35% des ovocytes fécondés sont aneuploïdes.
Avant propos
En France, un couple sur six est concerné par des problèmes d’infertilité. En moyenne, 24% des femmes n’ont toujours pas développé de grossesse un an après l’arrêt de contraceptifs. Il est estimé que l’infertilité est due dans 40% des cas à la femme, 30% à l’homme, 15% aux deux partenaires et 15% ont des causes inexpliquées.
Les causes d’infertilité féminine sont très variées mais elles ont pour origine principale les troubles de l’ovulation. Ils peuvent être dus à des dérèglements hormonaux (œstrogène, progestérone), à des maladies génétiques, au diabète, à l’obésité, au tabagisme, à des ovaires polykystiques, à une insuffisance rénale ou à une anomalie des glandes surrénales. L’obstruction des trompes est une seconde cause d’infertilité. Elle peut être consécutive à une salpingite (infection des trompes) en général due à la contamination des trompes par des germes sexuellement transmissibles. La taille de la muqueuse utérine, une malformation de l’utérus à la suite notamment de polypes, une glaire cervicale défaillante ou un blocage psychologique sont également des troubles fréquents d’infertilité. Enfin, l’âge maternel est une des causes majeures d’infertilité féminine.
En effet, plus une femme vieillit, plus les risques de développer un embryon avec un nombre erroné de chromosomes sont importants. Chez l’Homme, deux exemplaires de chaque chromosome sont présents dans les cellules somatiques. Lorsqu’une cellule contient un chromosome surnuméraire, on parle de trisomie tandis que la perte d’un chromosome est appelée monosomie. Les seules trisomies viables chez l’Homme sont les trisomies 21, 18 et 13 ainsi que les trisomies sexuelles du chromosome X. Le chromosome sexuel X peut être retrouvé au delà de trois exemplaire (deux chromosomes sexuel Y dans une cellule est létale). La seule monosomie viable est la monosomie du chromosome X, aussi appelé syndrome de Turner (Hassold and Hunt, 2001). Les autres trisomies ou monosomies sont létales et vont conduire à des avortements spontanés (mieux connus sous le nom de « fausse couche ») et par conséquent des problèmes d’infertilité. La corrélation entre l’âge maternel et l’augmentation des trisomies a été établie depuis 1933 (Penrose, 1933). La trisomie viable la plus fréquente est la trisomie du chromosome 21, aussi appelée le syndrome de Down. L’incidence de cette trisomie augmente de façon exponentielle avec l’âge maternel (Figure 1). En effet, une femme de 25 ans a environ 2% de risque de développer un enfant atteint de trisomie 21, tandis que le risque pour une femme de 40 ans augmente à près de 35% (Hassold and Hunt, 2001).
Figure 2. Origine des trisomies humaines
Les trisomies sont majoritairement d’origine maternelle et sont les conséquences de mauvaises ségrégations des chromosomes au cours de la méiose I dans la majorité des cas.
L’évolution des mœurs de notre société explique qu’aujourd’hui l’âge moyen de la première grossesse augmente. En France métropolitaine, dans les années 1970, l’âge moyen de la première grossesse était de 24 ans. Aujourd’hui, cet âge est passé à 29 ans, soit une augmentation de 5 ans au cours des 40 dernières années. Ces vingt dernières années, une augmentation de 70% de cas de trisomie 21 a été observée. Trois facteurs expliquent que de nos jours les femmes aient leur premier enfant de plus en plus tard. Le premier est le développement de la contraception et l’accès à l’interruption volontaire de grossesse. Le second est la généralisation des études supérieures pour les femmes qui leur offre une place croissante sur le marché du travail, ainsi que leur volonté d’avoir un emploi stable avant de fonder une famille. En effet, une parfaite corrélation est observée entre le niveau d’étude de la femme et l’âge moyen de sa première grossesse. Enfin, les familles recomposées sont de plus en plus nombreuses et la moitié des couples recomposés concrétisent leur union par la conception d’un enfant à un âge avancé. Ainsi, l’âge moyen de la première grossesse recule mais l’âge de la ménopause pour une femme reste le même. Les problèmes d’infertilité dus à l’âge de la femme deviennent donc un réel problème de société.
Indépendamment de l’âge maternel, il est estimé qu’environ 20% des ovocytes chez la femme sont naturellement aneuploïdes, c’est à dire qu’ils possèdent un nombre erroné de chromosomes. Une femme a chaque mois une seule chance de créer un embryon à partir de son unique ovocyte ovulé. En comparaison, chez l’homme, des millions de spermatozoïdes sont utilisables chaque mois et l’aneuploïdie dans les spermatozoïdes n’excède pas 2%. Plus de 95% des aneuploïdies viables chez l’Homme sont dues à de mauvaises séparations des chromosomes dans l’ovocyte (Figure 2). Après fécondation par le spermatozoïde, un embryon aneuploïde est formé, conduisant à des problèmes de fertilité. L’ovocyte et le spermatozoïde ne sont pas égaux face à l’aneuploïdie. Cela s’explique par le fait que les ovocytes sont créés au cours de la vie fœtale chez la femme, tandis que les spermatozoïdes sont créés en continu chez l’homme dès la puberté. Les ovocytes sont donc des cellules créées des dizaines d’années avant leur utilisation. Plus une femme souhaite avoir un enfant tardivement, plus ses ovocytes seront de mauvaise qualité et risquent d’avoir un nombre erroné de chromosomes.
Afin d’étudier l’aneuploïdie en fonction de l’âge, la souris est un bon modèle. Ce mammifère se reproduit rapidement, son élevage est simple et des lignées de souris transgéniques peuvent être réalisées. De plus, comme chez l’Homme, le nombre d’aneuploïdies augmente avec l’âge maternel (Chiang et al., 2012).
3
Au cours de ma thèse, j’ai cherché à comprendre les mécanismes qui permettent d’obtenir un ovocyte de qualité au moment de la fécondation ; c’est à dire un ovocyte avec un nombre adéquat de chromosomes. Plus précisément, j’ai étudié comment sont régulées et contrôlées les séparations des chromosomes lors des divisions cellulaires dans l’ovocyte de souris.
Figure 3. Les phases du cycle cellulaire et leur point de contrôle
Le cycle cellulaire est composé de quatre phases appelées G1, S, G2 et M. Ces phases sont contrôlées par différents checkpoints qui permettent de retarder le passage à la phase suivante tant que la précédente n’a pas été accomplie correctement. !"#$%&'()*+ ,-+.-/#0-+ !"#$%&'()*+,#+ 12&3($04')+ !"#%&'()*++ ,#+56+
4
Introduction
1 La division cellulaire
1.1 Généralités
1.1.1 Le cycle cellulaire
Le cycle cellulaire est un procédé permettant à une cellule de grandir et de se diviser. Chez les mammifères ils se décomposent en deux phases principales : l’interphase et la division cellulaire qui permettent de transmettre le contenu du matériel génétique aux cellules filles nouvellement formées. L’interphase est la phase de croissance de la cellule. Elle est subdivisée en trois phases : G1 (G pour Gap), S (phase de synthèse de l’ADN) et G2. Durant la phase G1, la cellule croît et synthétise de nombreux ARNm et protéines. La cellule entre ensuite en phase S, les deux brins d’ADN complémentaires se séparent et leurs séquences sont dupliquées. Il existe deux types de division cellulaire (phase M), la mitose qui a lieu dans les cellules somatiques et la méiose spécifique des cellules germinales (Figure 3). La mitose est un processus au cours duquel la cellule mère diploïde (46 chromosomes chez l’Homme) va donner naissance à deux cellules filles diploïdes parfaitement identiques (46 chromatides chacune) dont le matériel génétique va être répliqué au cours de la phase S. La méiose a lieu uniquement dans les cellules germinales c’est à dire les ovocytes et les spermatozoïdes. Au cours de ce processus, une cellule diploïde (46 chromosomes) va donner naissance à des cellules filles haploïdes (23 chromatides chacune) après deux divisions cellulaires (méiose I et II) sans phase S intermédiaire. Après la fécondation, l’union des deux gamètes va donner un embryon diploïde (46 chromosomes).
Plusieurs points de contrôle régulent l’ordre et la durée des différentes phases du cycle cellulaire, empêchant ainsi le passage à l’étape suivante tant que la précédente n’a pas été correctement achevée. Ces points de contrôle surveillent des étapes clés du cycle cellulaire comme les défauts de réplication de l’ADN ou des erreurs de ségrégation des chromosomes. Ils permettent de laisser suffisamment de temps à la cellule pour corriger les erreurs avant de passer à l’étape suivante (Elledge, 1996). En fin de G1, il existe un point de contrôle de la croissance cellulaire qui vérifie la taille de la cellule et la quantité de protéines formées. Tant que la qualité de la cellule n’est pas bonne, elle reste arrêtée en stade dit quiescent (G0). Au cours de la phase S, le point de contrôle de la synthèse d’ADN permet de vérifier que l’ADN
+!
Figure 4. Schéma comparatif de la ségrégation des chromosomes en mitose et en méiose
(a) A chaque cycle cellulaire, une division mitotique est réalisée afin de répartir équitablement les chromatides sœurs dans deux cellules filles diploïdes.
(b) En méiose, deux divisions successives sans synthèse d’ADN intermédiaire sont réalisées afin d’obtenir quatre cellules haploïdes.
Marston et Amon, Nat Rev, 2004
(a)
+
5
a été correctement répliqué. Enfin, le point de contrôle de la division cellulaire en phase M est également appelé SAC (Spindle Assembly Checkpoint). Le SAC est retrouvé en mitose comme en méiose I. Son but est de retarder la division cellulaire tant que tous les chromosomes ne sont pas prêts à être séparés. Une partie de ma thèse a consisté à étudier le SAC en méiose I, ainsi je reviendrai en détail sur son rôle dans la partie 4.
1.1.2 La division mitotique
La division mitotique peut être subdivisée en cinq phases : la prophase, la prométaphase, la métaphase, l’anaphase et la télophase. Elle débute par la prophase, étape au cours de laquelle les chromosomes se condensent. Ces chromosomes sont constitués de deux chromatides sœurs liées entre elles par des structures appelées cohésines. La prométaphase est caractérisée par la rupture de l’enveloppe nucléaire et la formation du fuseau mitotique constitué de microtubules. En métaphase, les chromatides sœurs sont capturées par les microtubules du fuseau au niveau de complexes protéiques appelés kinétochores, situés au niveau de la chromatine centromérique. Les chromosomes sont alors alignés au niveau de la plaque métaphasique. Lors de l’anaphase, les chromatides sœurs sont séparées et tirées de part et d’autre de la cellule par le fuseau. En télophase, une membrane nucléaire est reformée autour de chaque lot de chromatides séparées qui se décondensent. La mitose s’achève par une cytocinèse permettant la séparation des deux cellules filles néo-formées (Marston and Amon, 2004) (Figure 4a).
1.1.3 La division méiotique
La division méiotique permet de générer des cellules haploïdes différenciées à partir de cellules germinales diploïdes. Chez les mammifères, au cours de la vie fœtale, un stock de cellules germinales est mis en place chez la femelle lors de l’ovogénèse. A partir d’une ovogonie diploïde, la méiose permet de générer un ovocyte haploïde. Contrairement à la mitose où une seule division par cycle cellulaire a lieu, la division méiotique est très particulière car deux divisions s’enchaînent successivement sans synthèse d’ADN intermédiaire. Au cours de ces divisions méiotiques appelées méiose I et II (MI et MII), les cinq phases mitotiques sont en partie conservées mais la séparation des chromosomes est très différente. En effet, l’ovogonie est à un stade diploïde avec deux chromosomes homologues (un chromosome dit paternel, l’autre maternel) possédant chacun deux chromatides sœurs. Avant la première division, les chromosomes homologues échangent du matériel génétique par recombinaison homologue. Ces échanges permettent à la fois un brassage génétique
+!
Figure 5. Cyclines et Cdk du cycle cellulaire chez les mammifères
Les cyclines D, E, A et B sont essentielles à la progression du cycle cellulaire. En phase M, les Cyclines A et B liées à Cdk1 sont essentielles au bon déroulement de la mitose. !7$3()#+89:+ !,%6+ !7$3()#+8+ !,%;+ !7$3()#+<+ !,%;+ !7$3()#+=+ !,%>9?+
6
indispensable à la survie de l’espèce et le maintien des chromosomes homologues attachés ensemble. La première division méiotique est dite réductionnelle car elle sépare les chromosomes homologues. Au cours de la seconde division, les chromatides sœurs sont séparées selon une division équationnelle, similaire à une mitose. Chez la femelle, ces divisions sont asymétriques et donnent naissance à des cellules filles de tailles différentes : l’ovocyte et les deux petits globules polaires (Terret and Wassmann, 2008) (Figure 4b).
1.2 Différents complexes Cyclines-Cdk régulent le cycle cellulaire
La coordination du cycle cellulaire se fait par l’intermédiaire de complexes Cyclines-Cdk. Les Cdk (Cyclin dependent kinase) sont les sous-unités catalytiques permettant de phosphoryler sur des résidus sérine-thréonine de nombreux substrats essentiels à la progression du cycle cellulaire. Les Cdk sont régulées par des phosphorylations et des déphosphorylations activatrices ou inhibitrices ainsi que par des interactions avec des inhibiteurs de Cdk (Cki). Les Cyclines sont les sous-unités régulatrices des Cdk. Elles sont régulièrement synthétisées et dégradées ; ainsi leur concentration varie au cours du cycle. Chez la levure Saccharomyces pombe (S.pombe), il a été montré que la Cycline Cdc13 liée à la Cdk Cdc2 est suffisante pour réguler l’intégralité du cycle cellulaire (Fisher and Nurse, 1996). En revanche, chez les mammifères, de nombreuses combinaisons Cyclines-Cdk permettent le bon déroulement du cycle cellulaire. La Cycline D-Cdk4/6 est impliquée dans la croissance de la cellule en G1. La Cycline E-Cdk2 contrôle l’entrée en phase S et permet d’induire la synthèse d’ADN. La Cycline A-Cdk2 est impliquée dans la progression de la phase S et la Cycline A-Cdk1 contrôle en G2 les évènements qui permettent l’entrée en division cellulaire. Enfin, la Cycline B-Cdk1 permet la progression de la division cellulaire (Murray, 2004) (Sanchez and Dynlacht, 2005) (Figure 5).
1.3 Les cyclines A et B : deux acteurs principaux de la division cellulaire
Une certaine redondance entre les Cyclines a été observée. Néanmoins chez les mammifères, les deux Cyclines primordiales à la division cellulaire sont les Cyclines A et B (Sullivan and Morgan, 2007). Il existe deux isoformes de la Cycline A appelées A1 et A2 et trois isoformes de la Cycline B appelées B1, B2 et B3.
1.3.1 La Cycline A2
Dans les cellules somatiques de mammifère, la Cycline A2 est exprimée de la phase S jusqu’en début de mitose. En phase S, la Cycline A2 est liée à la sous unité kinasique Cdk2 et
en phase G2 à Cdk1. La Cycline A1 est exprimée uniquement dans la lignée germinale mâle ainsi en méiose dans l’ovocyte de souris, seule la Cycline A2 est exprimée (Winston et al., 2000). En prophase de mitose, la Cycline A2 est localisée principalement dans le noyau puis elle est dégradée en prométaphase (den Elzen and Pines, 2001; Geley et al., 2001; Jackman et al., 2002). La Cycline A2 est essentielle à l’entrée en mitose car elle permet l’activation de la Cycline B-Cdk1 (De Boer et al., 2008; Fung et al., 2007; Gong et al., 2007). Elle permet également la condensation des chromosomes et la stabilisation des attachements des chromosomes au fuseau en début de prométaphase (Gong and Ferrell, 2010; Kabeche and Compton, 2013).
Dans l’ovocyte de souris, la Cycline A2 a été observée en prophase I et en métaphase II, lui suggérant un rôle dans la reprise de la méiose et lors de la seconde transition métaphase-anaphase (Winston et al., 2000). De plus, la délétion de Cdk1, mais pas de Cdk2, dans l’ovocyte de souris entraîne une stérilité ce qui suggère que seule la Cycline A2-Cdk1 aurait un rôle dans l’ovocyte (Adhikari et al., 2012b). Dans l’ovocyte de xénope, il a été montré que la Cycline A est nécessaire à l’entrée en méiose I et l’activation du MPF (Roy et al., 1991). Une partie de ma thèse a consisté à déterminer le rôle de la Cycline A2 en méiose dans l’ovocyte de souris.
1.3.2 La Cycline B1
La Cycline B1 est un des régulateurs clés du cycle cellulaire et plus précisément de la mitose et de la méiose qui, associé à la sous unité kinasique Cdk1, forme le MPF (Maturation Promoting Factor). Ses rôles en mitose et en méiose sont maintenant bien établis. En mitose, la Cycline B1 est localisée dans le cytoplasme et pénètre dans le noyau environ 5 min avant sa rupture, ce qui est corrélé avec l’activation de Cycline B1-Cdk1 (Gavet and Pines, 2010). Les fluctuations de l’activité Cycline B1-Cdk1 contrôlent l’entrée et la sortie de mitose et de méiose I et II. Son activité permet la phosphorylation d’un certain nombre de substrats nécessaires au déroulement de la mitose et de la méiose notamment la condensation des chromosomes et l’assemblage du fuseau. A la transition métaphase-anaphase, la dégradation de la Cycline B1 induit la chute d'activité du MPF (Cdk1 étant par conséquent inactif). Cette diminution d’activité du MPF est indispensable à la séparation des chromosomes puis à la sortie de la division cellulaire. En méiose, la néosynthèse de la Cycline B1 est nécessaire à l’entrée en méiose II et l’activité MPF reste élevée jusqu’à la fécondation (Terret and Wassmann, 2008).
Cyc A Cyc B1 Cdk1 @6?6+ A6B+ @6>+ " Wee1 Myt1 Myt1 PP2A-B55 Cyc B1 Cdk1 @6?6+ @6?6+ A6B+ A6B+ @6>+ @6>+ Cdk1 "
C12DECF+
ECF+D+0$4.+
+!
Figure 6. Entrée en phase M chez les mammifères
Le pré-MPF est rendu actif par déphosphorylation des résidus Thr14 et Tyr15 par la phosphatase Cdc25. Pour cela, PP2A-B55 doit être inactivée afin que Cdc25 puisse être phosphorylée et rendue active. Au contraire, les kinases Myt1 et Wee1 doivent être inhibées par la phosphorylation de Plk1. La phosphorylation de Wee1 par la Cycline A2-Cdk1 est également essentielle à l’entrée en mitose. La Cycline B1-Cdk1 permet d’amplifier son propre signal d’activation en phosphorylant Cdc25, Myt1 et Wee1B.
Plk1 Cyc B1 Cdk1 @6?6+ A6B+ @6>+ " " " Myt1 Myt1 " " Cdk1 Wee1 Wee1 " Plk1 PP2A-B55
1.3.3 Coordination des Cyclines A2 et B1 pour l’entrée en mitose
La transition entre les phase G2 et M est un moment clé de la division cellulaire où les Cyclines A2 et B1 s’entraident pour débuter cette phase de division. C’est à ce moment précis du cycle que le MPF doit devenir actif pour permettre l’entrée en mitose. Pour se faire, la Cycline B1 doit être synthétisée et Cdk1 doit être activée. Sous forme inactive, Cdk1 est phosphorylée sur ses résidus Thr14 et Tyr15 par les kinases inhibitrices Wee1 et Myt1. L’entrée en mitose repose sur un équilibre entre activités kinases et phosphatases qui aboutit à la déphosphorylation de ces deux résidus inhibiteurs (Thr14, Tyr15) par la phosphatase Cdc25 et à la phosphorylation activatrice de son résidu Thr161 par CAK (Cdk activating kinase) (Fung and Poon, 2005). La Cycline B1-Cdk1 elle-même permet d’activer Cdc25 et d’inhiber Wee1 afin d’amplifier l’activation du MPF. Une autre kinase appelée Plk1 (Polo-like kinase 1) phosphoryle également Cdc25 et Wee1 afin de permettre l’entrée en mitose (Toyoshima-Morimoto et al., 2002). De plus, la phosphatase PP2A-B55 qui permet le maintien de Wee1 et Myt1 sous forme active et Cdc25C, sous forme inactive en G2, doit être inactivée par l’intermédiaire de la kinase Greatwall afin d’autoriser les phosphorylations de ses substrats (Castilho et al., 2009; Mochida et al., 2009; Vigneron et al., 2009) (Figure 6).
Chez les mammifères, la Cycline A2 permet également l’entrée en mitose en agissant au niveau des inhibiteurs de Cdk1 en prophase. En effet, la Cycline A2-Cdk1 inhibe Wee1 en phosphorylant la T239 permettant l’activation du MPF (Fung et al., 2007; Li et al., 2010). Ainsi lors de l’entrée en mitose, la Cycline A2-Cdk1 joue un rôle primordial dans l’activation du MPF.
1.4 Dégradation des Cyclines A2 et B1 par le complexe APC/C
Les complexes Cyclines-Cdk sont régulés par phosphorylation au niveau de la Cdk, mais la synthèse et la dégradation des Cyclines au cours de la division cellulaire sont essentielles pour moduler la quantité de MPF produit. La dégradation des Cyclines A et B en mitose et en méiose est régulée par l’APC/C.
1.4.1 Protéolyse des substrats par l’APC/C
La dégradation des Cyclines A2 et B1 dépend de leur ubiquitination. La réaction d’ubiquitination fait intervenir trois enzymes appelées E1, E2, E3. E1 est l’enzyme activatrice qui permet le transfert du résidu ubiquitine à l’enzyme de conjugaison E2. E2 catalyse avec l’ubiquitine ligase E3 la formation de chaînes d’ubiquitine au niveau de résidus lysine des substrats. Les substrats peuvent ainsi être adressés au protéasome 26S afin d’être dégradés.
Figure 7. Protéolyse par l’APC/C
L’APC/C est une E3 ubiquitine ligase qui permet l’ubiquitination de ses substrats après liaison à un co-activateur. Une fois ubiquitinilés, les substrats vont être dégradés par l’intermédiaire du protéasome.
L’APC/C (Anaphase Promoting Complex / Cyclosome), que je nommerai par la suite APC, est une E3 ubiquitine ligase composée de 15 à 17 sous unités selon les espèces. Les substrats de l’APC possèdent dans leur séquence une D-box ou une KEN-box (Pfleger and Kirschner, 2000). Une fois ubiquitinée, les substrats sont reconnus et dégradés par le protéasome (Figure
7).
L’APC peut s’associer avec deux types d’activateurs appelés Cdc20 ou Cdh1 qui vont se lier aux séquences D-box ou KEN-box sur les substrats à dégrader (Kraft et al., 2003). Pour être actif en prométaphase et métaphase, l’APC et Cdc20 doivent être phosphorylés par Cdk1 et Plk1. A ce stade de la mitose, Cdh1 est inactif car la phosphorylation par Cdk1 l’inhibe. Après l’anaphase, Cdk1 est inactivée par la dégradation des Cyclines et Cdh1 est activée par l’intermédiaire de la phosphatase Cdc14 (Kramer et al., 2000). Le complexe APC-Cdh1 est alors formé et Cdc20, qui possède un domaine KEN-box, est dégradé par l’intermédiaire de l’APC-Cdh1. Un autre niveau de régulation de l’APC-Cdc20 est réalisé par le SAC qui empêche la dégradation de certains substrats de l’APC-Cdc20 comme la Cycline B tant que tous les chromosomes ne sont pas correctement alignés le long de la plaque métaphasique (Musacchio and Salmon, 2007).
1.4.2 Dégradation des Cyclines A2 et B1
L’APC-Cdc20 permet la dégradation des deux cyclines A2 et B1. Elles possèdent chacune un domaine D-box dans leur partie N-Terminale (N-Ter) qui leur permet d’être reconnue par l’APC Cdc20 et dégradée (Geley et al., 2001). Dans les cellules de mammifères, la délétion de la partie N-Ter de ces cyclines entraîne leur stabilisation. Après expression de la Cycline A2 stable, un blocage du cycle cellulaire en anaphase est observé tandis que l’expression de la Cycline B1 stable conduit à un arrêt en métaphase ou anaphase selon son niveau d’expression (Chang et al., 2003; den Elzen and Pines, 2001; Geley et al., 2001). Dans l’ovocyte de souris, la dégradation dépend aussi de l’APC-Cdc20. L’expression de la forme stable de la Cycline B1 entraîne un arrêt du cycle en métaphase I. Ce résultat suggère que la dégradation de la Cycline B1 est essentielle à la séparation des chromosomes en méiose I (Herbert et al., 2003). Les phénotypes liés à l’expression de la Cycline A2 stable dans l’ovocyte de souris ont été étudiés au cours de ma thèse, je détaillerai ces phénotypes dans la partie résultats.
En mitose, bien que ces deux Cyclines soient dégradées par l’APC, la Cycline A2 est dégradée en prométaphase avant la Cycline B1. La Cycline B1 doit être dégradée uniquement lors de la transition métaphase-anaphase afin d’éviter une séparation précoce des chromatides
10
sœurs ; pour cela, le SAC inhibe l’APC-Cdc20 jusqu’en métaphase (den Elzen and Pines, 2001; Geley et al., 2001). Le mécanisme qui permet de dégrader la Cycline A2 avant la Cycline B1 est longtemps resté inconnu. Trois hypothèses étaient possibles. La première a été suggérée chez la drosophile et suppose qu’il existerait deux populations distinctes d’APC-Cdc20, l’une sensible au SAC et nécessaire à la dégradation de la Cycline B1 et la seconde insensible au SAC et nécessaire à la dégradation de la Cycline A2 (Raff et al., 2002). La deuxième hypothèse est que la Cycline A2 serait recrutée directement par l’APC indépendamment de Cdc20 ; elle serait donc insensible à l’inhibition du SAC. La troisième hypothèse est que la Cycline A2 serait capable de se lier à Cdc20 avec plus d’affinité que les protéines du SAC. Deux récentes études dans les cellules de mammifères vont dans le sens de ces deux dernières hypothèses. Les résultats observés sont différents si la Cycline A2 est sous forme libre ou sous forme liée à Cdk. La première étude montre que la Cycline A2-Cdk1 sous forme liée serait dégradée par l’APC-Cdc20 par l’intermédiaire des Cks (Di Fiore and Pines, 2010). La seconde étude montre que la Cycline A2 libre serait dégradée directement par l’APC grâce à la protéine Apollon (Kikuchi et al., 2014). Les Cks sont des protéines qui régulent l’activité des Cdk. Liées aux Cdk, les Cks permettent d’augmenter l’activité des Cdk lorsqu’elles sont phosphorylées (McGrath et al., 2013). L’étude de Di Flore.B et al., montre que la Cycline A2 est capable de se lier directement à la Cdc20 avec plus d’affinité que les protéines du SAC. Pour que la dégradation de la Cycline A2 ait lieu, la présence des Cks liées à la Cdk est indispensable car elles permettent l’interaction entre la Cycline A2-Cdk-Cdc20 et l’APC. L’étude de Kikuchi et al., montre que la Cycline A2 libre est capable d’interagir avec l’APC indépendamment de Cdc20 par l’intermédiaire de la protéine Apollon. Apollon est une ubiquitine de conjugaison (E2) dont la déplétion chez la souris entraîne une létalité embryonnaire (Lotz et al., 2004). Cette étude montre que Apollon peut se lier à la Cycline A2 libre et à l’APC permettant l’ubiquitination de la Cycline A2 par l’APC indépendamment de Cdc20. En effet, Apollon se lie à la Cycline A2 en début de prométaphase. La délétion de Apollon induit une accumulation de la Cycline A2 libre et un retard de l’anaphase. Ces deux études indiquent comment la Cycline A2 est dégradée en prométaphase, néanmoins il serait essentiel de montrer que la Cycline B1-Cdk1-Cdc20 n’est pas capable de se lier à l’APC par l’intermédiaire des Cks en début de prométaphase et que la Cycline B1 libre n’interagit pas avec Apollon.
1.5 Autres principales kinases et phosphatases de la division cellulaire
Outre les Cyclines-Cdk, d’autres kinases sont essentielles lors de la division cellulaire afin de phosphoryler des cibles spécifiques. Ces kinases sont nécessaires à la condensation et la bi-orientation des chromosomes ou encore la mise en place des centrosomes et du fuseau. Après la séparation des chromosomes, de nombreux substrats doivent être déphosphorylés pour permettre la sortie de mitose ou de méiose. L’activité des phosphatases est également importante pour maintenir les ovocytes arrêtés en prophase de méiose I où l’activité Cdk1 est basse.
1.5.1 Les principales kinases de la division cellulaire 1.5.1.1 Plk1 (Polo-like kinase 1)
Plk1 également appelée Polo chez la drosophile ou Cdc5 chez la levure S.cerevisiae possède une activité sérine-thréonine kinase au niveau de sa partie N-Ter. Au niveau de sa partie C-Terminale (C-Ter), elle possède un domaine PBD (Polo Box Domain) qui lui permet d’interagir avec ses substrats (Elia et al., 2003). Sa localisation varie au cours de la division cellulaire. Plk1 est associée aux centrosomes en prophase, puis s’enrichit au niveau des kinétochores en prométaphase. Après l’anaphase, Plk1 se localise au niveau du fuseau central avant de s’accumuler au niveau de la midzone en télophase (Petronczki et al., 2008). Au cours de la division cellulaire, Plk1 est tout aussi importante que les Cyclines-Cdk car elle intervient dans de nombreux processus. En absence de Plk1, les cellules ne sont pas capables de former un fuseau bipolaire. A la place, les chromosomes mitotiques se retrouvent attachés au sein d’un fuseau monopolaire. Plk1 est donc essentielle à la mise en place des centrosomes (Gonzalez et al., 1998). Plk1 est également nécessaire en mitose pour la dissociation des cohésines au niveau des bras des chromosomes en prophase (Losada et al., 2002), pour la phosphorylation de l’APC/C (Anaphase Promoting Complex/Cyclosome) (Kraft et al., 2003), pour la stabilisation des interactions kinétochores-microtubules (Elowe et al., 2007) et pour la sortie de mitose avec la cytocinèse (Wolfe et al., 2009). En méiose I, la localisation de Plk1 est similaire à la mitose, elle se localise au niveau des kinétochores pendant la prométaphase et disparaît en métaphase I mais son rôle en méiose I n’est pas connu (Wei et al., 2009).
1.5.1.2 Aurora A/B/C
Les kinases Aurora sont une famille de sérine-thréonine kinases essentielles à la division cellulaire. Chez les mammifères, il existe trois Aurora kinases (Aurora A, B et C) qui partagent des homologies de séquence au niveau de leur domaine kinasique central (Nigg,
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2001). Aurora A se localise au niveau des centrosomes et des pôles du fuseau mitotique. Elle est requise pour la maturation des centrosomes et l’assemblage du fuseau bipolaire. Aurora B est un membre du CPC (Chromosome Passenger Complex). Elle est essentielle aux interactions kinétochores-microtubules, à la ségrégation correcte des chromosomes et la cytocinèse (Earnshaw and Carmena, 2003; Ruchaud et al., 2007). Son rôle dans le CPC sera traité plus en détail dans la partie 3. Aurora C est exprimée uniquement dans les ovocytes et les spermatozoïdes (Tang et al., 2006). Dans l’ovocyte de souris, Aurora B et Aurora C se localisent au niveau des kinétochores en prométaphase I et sont nécessaires à l’alignement des chromosomes le long de la plaque métaphasique, à l’attachement kinétochores-microtubules, à la séparation des chromosomes en méiose I et à la cytocinèse (Balboula and Schindler, 2014; Yang et al., 2010).
1.5.1.3 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase)
Les MAPK sont une famille très conservée de sérine-thréonine kinase qui interviennent dans de nombreux processus du cycle cellulaire, notamment en mitose et en méiose. Elles agissent sous forme de cascade de phosphorylations de trois kinases appelées MAPKKK, MAPKK, MAPK qui s’active après stimulation extracellulaire à la membrane. MAPKKK phosphoryle et active MAPKK qui à son tour phosphoryle et active MAPK. La dernière MAPK pourra alors phosphoryler ses cibles intracellulaires. Chez les mammifères, la division cellulaire fait intervenir la voie Mos/MEK/ERK. En méiose, dans l’ovocyte de souris, l’activité des MAPK augmente après l’entrée en méiose jusqu’à la métaphase I puis stagne de la métaphase I jusqu’à la métaphase II. La voie Mos-MAPK est essentielle au maintien de l’arrêt des ovocytes en métaphase II. Puis cette voie est inhibée après la fécondation, son activité doit diminuer afin de permettre la transition métaphase II-anaphase II.
1.5.1.4 Greatwall
Greatwall est une sérine-thréonine kinase dont la mutation ou la déplétion entraîne un retard de la transition G2/M, des problèmes de condensation des chromosomes ainsi qu’une sortie prématurée de phase M (Yu et al., 2004). Son homologue humain est la protéine MAST-L dont la déplétion conduit également à un arrêt des cellules en G2. Greatwall permet de moduler l’activité du MPF au niveau des phosphorylations inhibitrices et activatrices de Cdk1 par l’intermédiaire de la phosphatase PP2A-B55 (Vigneron et al., 2009). Pour cela, Greatwall phosphoryle Arpp19 et ENSA (α-Endosulfine) afin de permettre leur liaison avec
PP2A-B55. PP2A-B55 est alors inhibée autorisant l’entrée en phase M (Gharbi-Ayachi et al., 2010).
1.5.1.5 Autres kinases de la division cellulaire
D’autres kinases telles que Mps1 ou Bub1 sont impliquées dans la bi-orientation des chromosomes lors des divisions cellulaires ou dans la stabilisation des interactions kinétochores microtubules. Ces protéines sont également essentielles au point de contrôle du fuseau en mitose et en méiose. Leur rôle sera développé plus précisément dans la partie 4 consacrée au point de contrôle du fuseau.
1.5.2 Les principales phosphatases de la division cellulaire 1.5.2.1 PP1 (Protein Phosphatase 1)
PP1 est une sérine-thréonine phosphatase qui permet de déphosphoryler les substrats phosphorylés par les kinases telles qu’Aurora B. Les mammifères ont trois isoformes de PP1 (α, β, γ
)
et PP1 se lie à la majorité de ses substrats grâce à un motif SILK ou RVxF. PP1 est impliquée dans la cytocinèse et la décondensation des chromosomes (Ceulemans and Bollen, 2004). Un de ses rôles principaux en mitose est d’éteindre le SAC en déphosphorylant les cibles d’Aurora B au niveau des kinétochores. PP1 est également essentielle dans les ovocytes de souris pour l’arrêt en prophase I, puis elle est inhibée par Cdk1 lors de la reprise de la méiose I (Wang et al., 2004).1.5.2.2 PP2A (Protein phosphatase type 2A)
PP2A est une autre sérine-thréonine phosphatase jouant un rôle clé au cours de la division cellulaire. PP2A est composée de trois sous unités : une sous unité d’ancrage (A), une sous unité de régulation (B) et une sous unité catalytique (C). Parmi une large variété de sous unité B, les familles B55 (B) et B56 (B’) interviennent dans de nombreux processus en mitose et en méiose. PP2A-B55 est essentielle à la régulation du MPF lors de l’entrée en phase M et la déphosphorylation de ses substrats lors de la sortie de mitose (Lorca and Castro, 2013). En mitose, PP2A-B56 se localise au niveau des kinétochores où elle joue un rôle majeur dans la stabilisation des interactions kinétochores-microtubules en contrebalançant les phosphorylations de Aurora B (Foley et al., 2011). Elle est également impliquée dans le maintien de la cohésion au niveau des régions centromériques des
14
chromatides sœurs (Kitajima et al., 2006; Riedel et al., 2006). Dans l’ovocyte de souris, PP2A-B56 est également localisée au niveau des kinétochores en méiose I et II. Au cours de ma thèse, j’ai participé à l’étude du rôle de son inhibiteur I2PP2A dans l’ovocyte. Le rôle de PP2A dans la cohésion des chromatides sœurs en méiose sera développé plus précisément dans la partie 3.
1.5.2.3 Autres phosphatases de la division cellulaire
Les phosphatases Cdc25 et Cdc14 sont nécessaires à l’entrée en division cellulaire chez les mammifères pour réguler le complexe Cycline B-Cdk1. Cdc14 est aussi essentielle à la sortie de phase M où elle joue notamment un rôle dans la stabilisation des interactions kinétochores-microtubules en anaphase, la déphosphorylation des substrats du MPF, l’activation de l’APC-Cdh1 et la cytocinèse chez la levure (Cho et al., 2005). Chez les mammifères, les fonctions de Cdc14 ne sont pas clairement définies.
2 La maturation méiotique dans l’ovocyte de souris
Les mécanismes et les acteurs moléculaires de la division cellulaire sont généralement conservés entre la mitose et la méiose. Néanmoins, certains mécanismes ont été étudiés exclusivement en mitose. Ainsi je ferai des analogies entre la mitose et la maturation méiotique.
2.1 L’ovogénèse
Un mécanisme propre aux cellules germinales et plus précisément à l’ovocyte est l’ovogénèse. Ce processus permet d’aboutir à la formation d’un ovocyte et la méiose fait partie de ce processus. Les cellules germinales primordiales apparaissent dans la partie caudale de l’embryon c’est à dire dans une zone éloignée des futures gonades. Elles migrent ensuite le long du pédicule allantoïdien, traversent le tube digestif, le mésentère dorsal puis viennent coloniser les gonades embryonnaires. Pendant la migration, les cellules se multiplient fortement par divisions mitotiques puis une fois un stock créé, elles mettent un terme à leur division. Après cette phase de prolifération, les ovogonies subissent leur dernière phase S et entrent en prophase de première division de méiose au cours de la vie embryonnaire. La prophase I de l’ovocyte peut être subdivisée en quatre phrases. En phase leptotène, les chromosomes homologues se condensent. En phase zygotène, les chromosomes
+!
Figure 8. La prophase I de l’ovocyte de mammifère
La prophase I peut être subdivisée en différentes phases appelées leptotène, zygotène, pachytène et diplotène qui aboutissent à la recombinaison des chromosomes homologues paternels et maternels entre eux. Au cours de ce
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homologues paternels et maternels vont s’apparier sur toute leur longueur grâce à la mise en place du complexe synaptonémal qui permet de maintenir les chromosomes homologues ensemble. Au stade pachytène, des cassures doubles brins de l’ADN permettent un échange de matériel génétique entre les chromosomes homologues paternels et maternels. C’est à ce stade qu’a lieu le brassage génétique primordial à la diversité de l’espèce. Après dissociation du complexe synaptonémal, les chromosomes homologues restent liés entre eux uniquement au niveau des chiasmata. C’est à ce stade, dit diplotène, que les ovocytes restent arrêtés en prophase I afin de permettre l’accumulation d’ARNm maternels et de protéines (Figure 8). Ces ovocytes sont appelés ovocytes primaires ou ovocytes I. Les ovocytes resteront arrêtés à cette phase jusqu’à la puberté pour certains et jusqu’à la ménopause pour d’autres. Ce stock décroît tout au long de la vie. Chez la femme, à 6 mois de vie fœtale, la quantité de cellules germinales avoisine les 7 millions. A la naissance, il n’en reste déjà plus que 2 millions. Cette quantité continue de chuter et à la puberté, environ 300 000 cellules germinales persistent dans les ovaires ; seulement 300 à 400 seront ovulées au cours de la vie chez l’Homme. Après stimulation hormonale, la maturation méiotique reprend jusqu’en métaphase II avant que l’ovocyte soit ovulé. Les ovocytes restent bloqués en métaphase II chez les vertébrés (et en métaphase I pour de nombreux invertébrés comme l’ascidie).
2.2 La maturation méiotique
Les ovocytes de mammifère ont la particularité d’être bloqués en prophase I. Ils sont morphologiquement caractérisés à ce stade par la présence d’une vésicule germinative (GV) et par un réseau de microtubules. In vivo, chez les mammifères, la reprise de la méiose s’effectue après stimulation hormonale par la LH (Luteinizing Hormone). Le premier événement morphologique visible est la rupture de l’enveloppe nucléaire ou GVBD (Germinal Vesicle Break Down). La première division méiotique est très longue ; elle dure 8 à 9 heures chez la souris. Au cours de la prométaphase I, les chromosomes se condensent et le fuseau méiotique se met en place autour des chromosomes au centre de la cellule. Une fois les attachements microtubules-kinétochores stabilisés et les chromosomes alignés le long de la plaque métaphasique, le fuseau migre vers le cortex de l’ovocyte. L’anaphase I a lieu, menant à la ségrégation des chromosomes homologues et à l’expulsion du premier globule polaire (PBE : Polar Body Extrusion). Cette division est asymétrique avec la formation d’une grosse cellule (l’ovocyte) et d’une petite (le globule polaire). L'ovocyte entre ensuite en méiose II puis reforme son fuseau de division en position sous-corticale et se bloque en métaphase II. Ce blocage est levé par la fécondation, qui induit la reprise de la méiose et aboutit à
Figure 9. Maturation méiotique de l’ovocyte de souris
Au cours de la maturation méiotique, deux divisions cellulaires se succèdent sans synthèse d’ADN intermédiaire. Dans l’ovaire, les ovocytes sont arrêtés en prophase I (stade GV) jusqu’à la reprise de la méiose qui est caractérisée par la rupture de l’enveloppe germinale (GVBD). A la première transition métaphase-anaphase, l’expulsion d’un globule polaire est observable (GP1 ou PBE1). Les ovocytes sont ensuite arrêtés en métaphase de méiose jusqu’à la fécondation qui permet l’expulsion du second globule polaire (GP2 ou PBE2).
Méiose I
Méiose II
fécondatio
n
16
l'expulsion du second petit globule polaire après séparation des chromatides sœurs en anaphase II (Perry and Verlhac, 2008; Terret and Wassmann, 2008) (Figure 9).
2.3 L’entrée en méiose I
L’arrêt en méiose I et sa reprise sont essentiellement contrôlés par l’activité du MPF. Ce processus repose sur un équilibre entre la synthèse et la dégradation de la Cycline B1, ainsi que l’activation ou l’inactivation de la kinase Cdk1.
2.3.1 Régulation de l’activité Cdk1 par l’AMPc
Les ovocytes restent arrêtés au stade diplotène de prophase I durant plusieurs mois chez la souris et plusieurs dizaines d’années chez l’Homme. L’arrêt en GV dépend du niveau de l’AMPc (Adénosine 3’5-monophosphate) ; un taux élevé d’AMPc maintient l’arrêt en prohpase. En effet, in vitro, la reprise de la méiose a lieu simplement en isolant l’ovocyte des cellules folliculaires qui l’entourent. Leur entrée spontanée en méiose est inhibée par l’ajout de dbcAmp (dibutytyl cAMP) dans le milieu de culture permettant ainsi, une reprise de la méiose de façon synchronisée, une fois le dbcAmp éliminé du milieu de culture (Cho et al., 1974). Une forte quantité d’AMPc dans l’ovocyte permet de maintenir la PKA (Protéine Kinase A) dans un état actif. Les principaux substrats de la PKA sont la phosphatase Cdc25B et la kinase Wee1B c’est à dire les régulateurs de Cdk1. La PKA permet l’activation de Wee1B dans le noyau en la phosphorylant sur sa Ser15 (Han et al., 2005; Han and Conti, 2006). En parallèle, l’activité phosphatase de Cdc25B est inhibée et la PKA empêche sa translocation dans le noyau (Oh et al., 2010; Pirino et al., 2009; Zhang et al., 2008). Ainsi, le MPF est maintenu dans un état inactif empêchant la reprise de la méiose. Myt1 est nécessaire pour inhiber Cdk1 au niveau cytoplasmique mais sa régulation par la PKA n’a pas été démontrée (Oh et al., 2010).
La stimulation hormonale par la LH induit la reprise de la méiose ainsi que l’ovulation de l’ovocyte. Pour cela, les cellules folliculaires qui entourent l’ovocyte ne produisent plus de facteurs EGF-like inhibant la phosphodiesterase PDE3A. Celle-ci est alors capable d’hydrolyser l’AMPc en 5’AMP diminuant ainsi le niveau d’AMPc (Vaccari et al., 2009). La conséquence directe est la diminution de l’activité PKA conduisant à la translocation de Cdc25B dans le noyau et la translocation de Wee1B dans le cytoplasme. Cdk1 est actif et la reprise de la maturation méiotique a lieu (Zhang et al., 2008) (Figure 10).
En comparaison chez le xénope, le pic de LH induit la sécrétion de progestérone par les cellules folliculaires (Haccard et al., 2012). La progestérone permet alors l’inhibition de la
Holt and Jones, Dev Biol, 2013
Figure 10. Régulation de l’activité MPF dans les ovocytes de souris en GV Dans l’ovocyte de souris, l’inhibition du MPF se fait à deux niveaux afin de maintenir l’arrêt des ovocytes en GV. La PKA permet d’inhiber l’activité Cdk1 en activant Wee1B et en inhibant Cdc25B. L’APC-Cdh1 permet de dégrader la Cycline B1 afin de garder sa concentration faible en GV.
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formation d’AMPc. Dans l’ovocyte de souris, les cellules folliculaires sécrètent des facteurs EGF-like qui permettent de maintenir un arrêt en GV tandis que dans l’ovocyte de xénope, les cellules folliculaires sécrètent de la progestérone qui permet la reprise de la méiose.
2.3.2 Régulation des niveaux de Cycline B1
Lors de l’arrêt en GV, l’inactivation de Cdk1 est essentielle mais la Cycline B1 doit également être régulée par dégradation afin de garder une activité MPF basse. Ainsi, pour maintenir l’arrêt en GV, la Cycline B1 doit être dégradée en permanence par l’intermédiaire de l’APC (Holt et al., 2013b; Reis et al., 2006). En GV, l’APC est lié à son co-activateur Cdh1 (Figure 10). Une étude montre que la protéine BubR1 (connue comme protéine du SAC) jouerait un rôle dans la régulation de l’APC-Cdh1. En effet, sa déplétion par morpholinos entraîne une entrée spontanée des ovocytes en méiose. La diminution de BubR1 dans l’ovocyte a pour conséquence une diminution de Cdh1. Ces résultats suggèrent qu’en absence de BubR1, la quantité d’APC-Cdh1 formée diminue, permettant ainsi une accumulation de Cycline B1. Les ovocytes ne sont alors plus capables de maintenir leur arrêt en GV (Homer et al., 2009). Néanmoins, au cours de ma thèse, j’ai obtenu des résultats contradictoires avec l’étude de Homer et al., qui seront développés dans la partie résultat. La phosphatase Cdc14B régule également l’APC-Cdh1. En effet, les ovocytes déplétés pour Cdc14B entrent spontanément en méiose I tandis que la surexpression de Cdc14B crée un retard pour l’entrée en méiose I. Ce délai est corrigé lorsque Cdh1 est délétée dans les ovocytes surexprimant Cdc14B (Schindler and Schultz, 2009). Ces résultats suggèrent que Cdc14B joue un rôle dans l’arrêt en GV en activant Cdh1. Enfin, lors de la reprise de la méiose, l’APC-Cdh1 doit être inhibé. La réduction de Emi1 (Early Mitotic Inhibitor 1) par injection de morpholinos dans l’ovocyte retarde l’entrée en méiose I tandis que sa surexpression entraîne une entrée spontanée des ovocytes en méiose due à l’accumulation de Cycline B1 (Marangos et al., 2007). Ces résultats suggèrent que Emi1 permet d’inhiber l’APC-Cdh1 pour que la Cycline B1 puisse s’accumuler dans l’ovocyte autorisant l’entrée en méiose.
L’arrêt en GV repose sur un équilibre entre synthèse et dégradation des substrats de l’APC. La Sécurine et la Cycline A2 sont d’autres substrats connus de l’APC présents dans les ovocytes en GV et peuvent rentrer en compétition avec la Cycline B1. Ainsi la surexpression de ces substrats dans l’ovocyte peut modifier l’équilibre des dégradations par l’APC-Cdh1 et provoquer l’entrée en méiose en diminuant la dégradation de Cycline B1. Il a été démontré que la surexpression de la Sécurine conduit à l’accumulation de Cycline B1 et
l’entrée spontanée des ovocytes en méiose. De la même façon, la surexpression d’une forme non dégradable de la Cycline B1 entraîne également une entrée spontanée des ovocytes en méiose. Au contraire, la déplétion de la Sécurine conduit à une forte dégradation de la Cycline B1 empêchant l’entrée en méiose (Marangos and Carroll, 2008). Ces résultats suggèrent que la surexpression ou la délétion des substrats de l’APC entraîne une dérégulation de la dégradation de la Cycline B1. Cet équilibre est primordial pour contrôler l’entrée en méiose.
2.4 Mise en place du fuseau méiotique et de la bi-orientation des chromosomes homologues
Le but de la méiose I est de séparer correctement les chromosomes homologues de façon à ce qu’une copie de chaque chromosome reste dans l’ovocyte et la seconde copie soit expulsée dans le globule polaire. L’activité Cycline B1-Cdk1 s’accumule en GV afin de permettre la reprise de la méiose et la rupture de l’enveloppe nucléaire. Elle continue de s’accumuler en prométaphase I permettant la condensation des chromosomes et la mise en place du fuseau méiotique (Adhikari et al., 2012a).
En mitose, la formation du fuseau est guidée par deux centrosomes, chacun composé de deux centrioles, qui sont les centres de nucléation des microtubules à partir de la gamma-tubuline. Il s’agit d’un composant essentiel à la nucléation des microtubules. Les centrosomes permettent de promouvoir la formation rapide d’un fuseau bipolaire où les chromatides sœurs vont s’aligner au niveau de la plaque métaphasique. Les chromatides sœurs sont capturées par les microtubules qui parcourent le cytoplasme à la recherche de chromosomes. Ce mécanisme est appelé « recherche et capture » (Gadde and Heald, 2004). En méiose I, chaque chromosome est attaché aux microtubules émanant des pôles opposés du fuseau. Pour plus de simplicité, le terme chromosome homologue bi-orienté (attachement correct) ou mono-orienté (attachement incorrect) est employé en méiose I. Dans l’ovocyte de mammifère, il n’y a pas de centrosomes et le mécanisme de « recherche et capture » est insuffisant dans un grand cytoplasme (Wollman et al., 2005). Ainsi la formation du fuseau et la bi-orientation des chromosomes en méiose I suivent un processus différent de celui employé en mitose. A la place des centrosomes, des microtubules associés à des moteurs moléculaires sont nucléés un peu partout dans le cytoplasme. Il s’agit de MTOC (Microtubule Organizing Centers) et environ 80 sont présents dans le cytoplasme de l’ovocyte de souris en début de prométaphase I. Les MTOC sont composés de gamma-tubuline libre dans le cytoplasme qui est capable de générer des microtubules relativement courts et instables. A GVBD+3H, les MTOC fusionnent en une « boule » de
Kitajima and Ellenberg, 2011, Cell
Figure 11. Bi-orientation des chromosomes homologues en méiose I dans l’ovocyte de souris
En début de prométaphase I, les chromosomes homologues ne sont pas organisés et le fuseau bipolaire n’est pas formé. Puis les chromosomes homologues s’alignent progressivement le long de la plaque métaphasique tandis que le fuseau méiotique se met en place. En métaphase, les chromosomes sont bi-orientés et attachés de façon stable au fuseau méiotique. Au cours du processus de bi-orientation, les chromosomes homologues subissent plusieurs phases de corrections des mauvais attachements avant de former un attachement stable.
microtubules à proximité des chromosomes et vont créer des protrusions multipolaires. Puis deux pôles principaux vont émerger et se séparer de part et d’autres des chromosomes homologues grâce à des moteurs moléculaires permettant d’allonger le fuseau. Ces pôles sont peu focalisés, ce qui donne au fuseau de méiose I une forme caractéristique de tonneau (Schuh and Ellenberg, 2007). Les chromosomes sont des composants essentiels à l’assemblage des microtubules. En effet, un gradient Ran-GTP autour des chromosomes permet de déclencher l’assemblage des microtubules et leur organisation en fuseau en absence de centrosome. Ce gradient est généré grâce au facteur d’échange GDP-GTP appelé RCC1 localisé au niveau des histones H2A et H2B. RCC1 est phosphorylée et activée par Cycline B1-Cdk1. Ce phénomène est appelé l’effet chromatine ; il permet la concentration de Ran-GTP autour des chromosomes afin de permettre la nucléation locale des microtubules à proximité des chromosomes (Terret and Wassmann, 2008).
Les chromosomes subissent ensuite des mouvements de fortes amplitudes liées à l’élongation du fuseau. Les chromosomes oscillent tout le long du fuseau jusqu’à ce que les chromosomes homologues soient attachés de façon bipolaire. Ces mouvements d’oscillation sont générés par les forces exercées par les microtubules (Brunet et al., 1999). Il a été montré que les premiers attachements des kinétochores sont de manière générale incorrects et que plus de 80% des chromosomes subissent au minimum trois séries de corrections d’attachement avant d’être bi-orienté (Kitajima et al., 2011). Ainsi, au cours de la bi-orientation les mauvais attachements doivent être régulièrement corrigés par l’intermédiaire du CPC et d’Aurora B/C. La complexité du processus de bi-orientation des chromosomes pourrait expliquer la forte quantité d’aneuploïdie observée dans les ovocytes.
Après cette phase très dynamique, les chromosomes sont bi-orientés et les attachements stabilisés le long de la plaque métaphasique (Kitajima et al., 2011) (Figure
11). Les kinétochores d’un même chromosome sont reliés à plusieurs microtubules appelés
fibres kinétochoriennes. La stabilisation des attachements kinétochores-microtubules est principalement dépendante de Cdk1 et d’Aurora B/C dont le rôle sera développé plus en détail dans la partie 3. La concentration de Cycline B1-Cdk1 dans l’ovocyte augmente de façon continue au cours de la prométaphase et permet ainsi une stabilisation progressive des attachements. En effet, l’utilisation d’un inhibiteur de Cdk1 en prométaphase I empêche la stabilisation des attachements. Au contraire la surexpression de la Cycline B1 en début de prométaphase I induit la stabilisation précoce des attachements kinétochores-microtubules (Davydenko et al., 2013). Dans les deux cas, cela aboutit à des erreurs de séparation des chromosomes en anaphase I. La stabilisation progressive des attachements
