Impact d'une ration contaminée par des mycotoxines de Fusarium sur la réponse immunitaire systémique et mucosale et la possible capacité de compléments antioxydants à rétablir le statut immunitaire de porcelets sevrés

Impact d’une ration contaminée par des mycotoxines de

Fusarium sur la réponse immunitaire systémique et

mucosale et la possible capacité de compléments

antioxydants à rétablir le statut immunitaire de porcelets

sevrés

Mémoire

Michel Lemay

Maîtrise en sciences animales

Maître ès sciences (M. Sc.)

RÉSUMÉ

Ce mémoire cherche à évaluer les effets du déoxynivalénol (DON) sur le système immunitaire systémique et mucosale de porcelets sevrés et d’évaluer la capacité de trois types d’antioxydants à rétablir le statut immunitaire de ces porcelets. Des porcelets ont été nourris avec l’une de six rations expérimentales : un témoin (<0.8 mg/kg de DON); une ration contaminée au DON (3 mg/kg); un traitement contaminé par DON contenant des compléments de vitamines A, C et E; un traitement contaminé par DON contenant un complément de sélénium organique et de levures enrichies en glutathion (GSH); un traitement contaminé par DON contenant un complément de quercétine (provenant d’extrait d’oignons) et un traitement contaminé par DON contenant une combinaison des trois compléments précédents. Des prises de sang ont été effectuées afin de déterminer la concentration de cytokines, d’haptoglobine, la réponse anticorps à l’ovalbumine, les différentes populations de leucocytes et l’activité phagocytaire. Les porcelets ont été euthanasiés après 16 jours de traitements afin de récolter des échantillons de jéjunum et d’iléon. Ces échantillons ont été utilisés afin de mesurer l’expression de certains gènes ayant un rôle immunitaire. La contamination par DON a diminué le pourcentage de cellules de lignées monocytes/macrophages comparé au témoin (P<0.05), a affecté les populations de lymphocytes T helper et de cellules NK ainsi que la concentration d’haptoglobine suggérant un effet immunosuppresseur. Pour les antioxydants, le traitement DON + vitamines a seulement permis de restaurer la concentration d’haptoglobine, le traitement de DON + sélénium-GSH a induit une réponse pro-inflammatoire, en augmentant la concentration d’interleukine 1 (IL-1) et d’interféron-γ (INF-γ) dans le sang tandis que le traitement DON + quercétine a réduit la réaction inflammatoire causée par DON et à partiellement restauré le statut immunitaire des porcelets. Dans l'ensemble, la contamination au DON et les compléments alimentaires en antioxydants ont modulé les fonctions immunitaires de porcelets sevrés alimentés avec des rations contaminées par DON.

ABSTRACT

This paper aimed to evaluate the effects of deoxynivalenol (DON) on systemic and mucosal immune systems of weanling pigs, and to evaluate the capacity of three antioxidant supplements to restore the immune status of these piglets. Piglets were fed with one of six dietary treatments: a control diet (<0.8 mg/kg of DON), a DON contaminated diet (3 mg/kg); a DON contaminated diet supplemented with vitamins A, C, and E; a DON contaminated diet supplemented with organic selenium and a glutathione (GSH) enriched yeast; a DON contaminated diet supplemented with quercetin (from onion extract) and a DON contaminated diet supplemented with a combination of all three previous supplements. Blood samples were taken from the jugular vein to determine cytokines, haptoglobin, antibody response to ovalbumin, different leukocyte populations and phagocytosis activity. Piglets were euthanized after 16 days of treatment for jejunum and ileum sampling. These intestinal samples were used to measure the expression of genes involved in regulation of immune response. The DON contamination lowered the monocyte/macrophage lineage cell population percentage compared to control (P<0.05), it also affected the lymphocyte T helper population, the NK cell population and the haptoglobin concentration suggesting an immunosuppressive effect. For the dietary antioxidant supplement, the DON + vitamin treatment only had an effect on restoring haptoglobin concentration; the DON + selenium-GSH treatment induced a pro-inflammatory reaction by increasing IL-1 and IFN-γ concentration in the peripheral blood and T memory lymphocyte populations while the DON + quercetin treatment reduced the inflammation effect of DON and partially restored the immune status of the piglets fed DON contaminated diet. Globally, DON contamination and dietary antioxidant supplementation did modulate immune function of pigs fed DON contaminated diet. However, further studies are required to determine their potential to mitigate the effect of DON on innate and acquired immunity.

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ ... III

ABSTRACT ... V

TABLE DES MATIÈRES ... VII

LISTE DES TABLEAUX ... XI

LISTE DES FIGURES ... XIII

LISTE DES ABRÉVIATIONS ... XV

DÉDICACE ... XIX

REMERCIEMENTS ... XXI

AVANT-PROPOS ... XXIII

CHAPITRE 1 INTRODUCTION ...1

CHAPITRE 2 REVUE DE TRAVAUX ANTÉRIEURS ...3

1.PRODUCTION PORCINE ET MYCOTOXINES ... 3

2.MYCOTOXINES ... 4

2.1 Toxines de Fusarium ... 5

2.1.1 Zéaralénone ... 5

2.1.2 Trichothecènes ... 6

2.1.2.1 Déoxynivalénol ... 7

2.2 Toxines de Penicillium et d’Aspergillus ... 8

2.2.1 Aflatoxines ... 8

2.2.2 Ochratoxine A ... 9

2.2.3 Citrinine ... 9

3.EFFET DES MYCOTOXINES SUR LES ANIMAUX ... 11

3.1 Croissance ... 11

3.2 Système digestif ... 13

3.3 Système immunitaire ... 14

viii

3.3.2 Fonctionnement du système immunitaire inné ... 17

3.3.3 Fonctionnement du système immunitaire adaptatif ... 18

3.3.4 Particularités immunologiques chez les porcs ... 19

3.3.5 Effet des mycotoxines sur le système immunitaire ... 21

3.3.5.1 Les trichothécènes et Zéaralenone ... 22

3.4 Mode d’action ... 24

3.4.1 Trichothécènes ... 25

4.TRAITEMENTS POSSIBLES ... 26

4.1 Antioxydants ... 26

CHAPITRE 3 IMPACT OF FUSARIUM MYCOTOXINS CONTAMINATED DIET ON PIGLET SYSTEMIC AND MUCOSAL IMMUNE RESPONSE AND THE POSSIBLE CAPACITY OF ANTIOXIDANTS TO RESTORE THE IMMUNE STATUS OF CONTAMINATED WEANLING PIGS ... 29

INTRODUCTION ... 31

MATERIALSANDMETHODS ... 33

Animals and housing ... 33

Experimental Design and Sample Collection ... 36

PBMC and PMN Isolation ... 37

PBMC Counting, Labelling and Determining Subgroup Proportion ... 37

PMN Phagocytosis Capacity Assay ... 41

Measurement of Cytokines, Protein and Specific Antibodies... 41

RNA Purification and Gene Expression ... 42

Statistical analysis ... 45

RESULTS ... 46

Serum Concentration of Immunological Factors ... 46

Ovalbumin Immunization and Phagocytosis Activity ... 47

Leukocyte Populations ... 47

Gene Expression in the Intestinal Tissues ... 48

DON effect on piglet Immunity ... 53

Mycotoxin Effect on Leukocyte Populations and Cytokine Concentration in Blood ... 54

Mycotoxin Effect on Phagocytosis Activity and Antibody Response to OVA Immunization ... 56

Mycotoxin Effect on Immune Related Gene Expression in Intestinal Mucosa ... 57

Effect of Dietary Supplements in Response to the Mycotoxin Effect ... 58

Vitamin Effect ... 58 Se-Glutathion Effect ... 59 Quercetin Effect ... 60 Combine Effect ... 61 CONCLUSION... 62 REFERENCES ... 63 CHAPITRE 4 CONCLUSION ... 77 ANNEXES ... 80 ANNEXE 1 ... 81

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 12.1 Caractéristiques immunologiques uniques aux porcs ... 20 Table 14.1 Composition of the control and experiment diets fed to weaned pigs ... 35 Table 14.2 List of antibodies used to allow the enumeration and phenotyping of major leukocyte populations present in blood circulation for four different multicolour cytometry panels. ... 39 Table 14.3 List of antibodies used to differentiate major leukocyte populations present in blood circulation ... 40 Table 14.4 List of genes and sequences of the primers used for real-time PCR ... 44 Table 3.5 Concentrations of interleukin-1β (IL-1), Interferon-γ, (IFN), Tumour necrosis factor-α (TNF), Interleukin-10 (IL-10), Haptoglobin, and Ovalbumin antibodies (AntiOval) in the plasma of weanling piglets fed a naturally DON-ZEA-contaminated diet supplemented with different antioxidant products ... 49 Table 3.6 Proportion of different circulating immune cells in weanling piglets fed a

naturally DON-ZEA-contaminated diet supplemented with different antioxidant products 50 Table 3.7 mRNA expression of circulating immune cells in weanling piglets fed a naturally DON-ZEA-contaminated diet supplemented with different antioxidant products ... 52

LISTE DES FIGURES

Figure 4.1 groupement isovalérate retrouvé chez les trichothécènes de type A ... 81 Figure 4.2 groupement cétone retrouvé dans les trichothécènes de type B ... 81 Figure 4.3 groupement époxyde retrouvés chez les trichothécènes de type C. ... 82

LISTE DES ABRÉVIATIONS

%, pourcentage °C, degré Celsius µg, microgrammes

γδ T cells, Delta-Gamma t lymphocytes β-ME, β-mercaptoethanol

AAC, Agriculture et Agroalimentaire Canada AF, aflatoxine

AFB1, aflatoxine B1 AFB2, aflatoxine B2 AFM1, aflatoxine M1 AFM2, aflatoxine M2

AFPP, Association française de protection des plantes AP-1, activator protein 1

APC, antigen presenting cells

ARNm, acide ribo nucléique messager aW, water activity (activité de l’eau)

BCL-2, B-cell lymphoma-2 BSA, bovine serum albumin CA, canadien

Caco-2, cellules colorectales épithéliales humaines adénocarcinome cDNA, complementary deoxyribose nucleic acid

CMH 2, complexe majeur d'histocompatibilité classe 2 CRP, C-RÉACTIVE PROTÉINE

xvi

CXCR3, chemokine (C-X-C motif) receptor 3 DON, déoxynivalénol

DNA, deoxyribose nucleic acid ELISA, enzyme-linked immunoassay FB, fumonisin

FB1, fumonisin B1 FB2, fumonisin B2

FDA, food and drug administration FITC, fluorescein isothiocyanate

FMLP, Récepteur N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine FMO, full-cocktail-minus-one

FPPQ, Fédération de producteurs de porcs du Québec GMQ, gain moyen quotidien

GPX, glutathione peroxidase

GPX2, glutathione peroxidase 2 (gastrointestinal) GPX3, glutathione peroxidase 3 (plasma)

GPX4, glutathione peroxidase 4 GSH, glutathione

H2O2, peroxyde d’hydrogène

H3F3A, H3 histone family 3A HAPT, haptoglobin

HBSS, Hank’s balanced salt solution IFN, interféron

IFN-γ, interféron - gamma Ig, immunoglobulines IgA, immunoglobulines A

IgD, immunoglobulines D IgG, immunoglobulines G IgM, immunoglobulines M IL, interleukin IL-1, interleukin 1 IL-6, interleukin 6 IL-8, interleukin 8 IL-10, interleukin-10

IL12β, interleukin 12 beta (p40) IL-1β, interleukin 1 beta

kg, kilogramme

LPS, lipopolysaccharides

MAPAQ, Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation MAPK, mitogen-activated protein kinase

mARN, acide ribo nucléique messager MCP-1, monocyte chemotactic protein 1 mg, milligrammes

MMLC, monocyte/macrophage lineage cell NIV, nivalénol

NK cell, natural killer t lymphocytes NO, oxyde nitrique

NOS2, nitric oxide synthase 2 (inducible) NRC, National research council (Canada) OCLN, occludin

O2-, ion superoxyde

xviii

OVA, ovalbumin P, probability

PBMC, peripheral blood monocyte cells PCR, polymerase chain reaction

pH, potentiel hydrogène

PMN, polymorphonuclear neutrophil PRR, pattern recognition receptors RNA, ribo nucleic acid

ROS, réactifs d’oxygènes RPL32, ribosomal protein L32

RPMI, Roswell park memorial institute medium RPS18, ribosomal protein S18

SE, sélénium

SEM, standard error of the mean spp, espèces

T-2, T-2 toxin

TCR, T cell receptors

TGF-β, Transforming growth factor beta TNF, tumour necrosis factor

TNFα, tumour necrosis factor alpha TLR, toll like receptors

DÉDICACE

Je fais mon bout de chemin Même si l’on ne sait rien Sur un bout de parchemin Nous poussons toujours plus loin

REMERCIEMENTS

En tout premier lieu, je souhaite remercier le professeur, Frédéric Guay qui m’a permis de me lancer dans ce projet et qui m’a épaulé tout au long de mon parcours. Son positivisme et sa présence tout au long de ce projet ont été constants et je les ai énormément appréciés.

Ensuite, je souhaite remercier Martin Lessard de m’avoir si bien accueilli à Sherbrooke et toute l’équipe du centre de recherche à Lennoxville. Marie-Ève Tremblay, pour nos moments sur la route et pour son aide précieuse en laboratoire, merci beaucoup. Un gros merci à Karoline Lauzon pour avoir fait la cytométrie à flux et pour m’avoir patiemment expliqué et réexpliqué les protocoles et les analyses de cytométrie à flux. Un autre remerciement à Bich Van Le Thanh, pour son aide avec les porcelets et finalement un autre gros merci à toute l’équipe du département des sciences animales de l’Université Laval.

Je souhaite remercier le Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation (MAPAQ) pour le financement du projet et pour la bourse d’études.

Sur une note plus personnelle, ce projet aura été extrêmement enrichissant et j’en retire beaucoup. Je crois qu’il y a beaucoup de choses que je pourrais dire sur ce que j’ai acquis personnellement et professionnellement tout au long de ce projet, mais ce qui me marque le plus, c’est que je suis mon plus gros obstacle dans un projet. Chaque fois que je revenais sur un passage il ne me convenait plus et suite à des élans de motivations, le peu d’avancement que je pouvais faire en peu de temps me décourageait plus que je ne l’aurais cru. J’ai appris beaucoup grâce à ce projet. Je suis maintenant plus que jamais capable de travailler de façon constante, de ne pas céder devant un nouvel obstacle et j’apprends à apprécier mon travail à la relecture. Ce projet m’aura beaucoup appris et m’a permis de grandir personnellement et professionnellement. Je souhaite donc remercier tous ceux qui m’ont encouragé, qui m’ont épaulé et qui m’ont soutenu tout au long de mon parcours. Mes parents, ma famille et mes amis, vous vous reconnaissez, ce document est aussi un peu le vôtre pour m’avoir encouragé pendant tout ce temps.

AVANT-PROPOS

Ce mémoire est issu de mon projet de maîtrise en sciences animales financé par le Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec (MAPAQ).

Le mémoire contient un chapitre rédigé sous forme d'article scientifique en anglais portant le titre « Impact of Fusarium mycotoxins contaminated diet on piglets systemic and mucosal immune response and the possible capacity of antioxidant to restore the immune status of contaminated weanling pigs ». Je suis l'auteur principal de cet article. Celui-ci a été révisé par les coauteurs Frédéric Guay, mon superviseur de recherche et professeur au département des sciences animales de l’Université Laval, Martin Lessard, chercheur au centre de recherche et de développement sur le bovin laitier et le porc (Lennoxville, QC) et Karoline Lauzon qui a révisé la section méthodologie.

Au niveau des manipulations de laboratoire, Karoline Lauzon a beaucoup aidé pour l’identification des populations de lymphocytes en complétant les analyses de cytométrie à flux et elle m’a aussi montré les protocoles de purification d’ARNm et d’expression de gènes. J’ai partagé les tâches de soins et la manipulation des porcelets avec Marie-Ève Tremblay et Bich Van Le Thanh à l’animalerie de l’Université Laval (Québec, Qc). Marie-Ève Tremblay a aussi préparé les échantillons de plasma sanguin des porcelets suite au prélèvement sanguin. Les analyses statistiques ont été complétées sous la supervision de Frédéric Guay.

Le projet a été présenté sous forme de présentation orale au 51e Colloque de nutrition de l’Est organisé par l’Association de nutrition animale du Canada en 2015. Un autre article sur le même projet a été rédigé par Bich Van Le Thanh. Je suis coauteur de cet article ayant pour titre « The potential effects of antioxidant feed additives in mitigating the adverse effects of corn naturally contaminated with Fusarium mycotoxins on antioxidant systems in the intestinal mucosa, plasma and liver in weaned pigs ». Il porte sur les performances de croissance et sur le statut oxydatif des porcelets. Cet article a été présenté dans la thèse de Mme Le Thanh et a été publié dans la revue «Mycotoxin Research» (Van Le Thanh, Bich, et al., 2016).

CHAPITRE 1

INTRODUCTION

Les mycotoxines sont des molécules toxiques produites par des champignons pathogènes de plantes et causent plusieurs problèmes aux agriculteurs. Pour les agriculteurs, ces molécules représentent un réel problème puisque les récoltes qui sont trop contaminées par des mycotoxines ne sont pas achetées par les producteurs et sont ainsi jetées provoquant des pertes monétaires importantes et beaucoup de déchets alimentaires non souhaitables. Comme la nourriture contaminée par des mycotoxines affecte la santé du bétail et que les porcs sont particulièrement affectés par les mycotoxines, les producteurs porcins préfèrent opter pour une nourriture ne contenant pas de mycotoxines même si le grain contaminé peut être vendu avec un escompte. Considérant toutes les autres dépenses que doivent assumer les producteurs, leur marge de profit est assez mince. Les mycotoxines ont des effets très variés sur les animaux et sont historiquement associées à plusieurs mycotoxicoses ayant causé la mort autant chez des humains que chez des animaux de ferme. Elles peuvent avoir divers effets délétères sur les conditions physiologiques et immunitaires des animaux qui en consomment de fortes de doses de façon chronique.

Il y a beaucoup d’efforts qui sont déployés pour essayer de comprendre le mode d’action des mycotoxines, pour limiter leur croissance en agriculture et pour contrer les effets délétères de celles-ci sur les animaux qui en consomment dans leurs rations alimentaires. Compte tenu des problèmes que certaines mycotoxines apportent à la santé animale et à l’économie de l’industrie alimentaire. Ce mémoire abordera initialement le problème en faisant une revue de littérature des travaux existant sur les mycotoxines les plus connues et poursuivra avec un projet de recherche écrit sous forme d’article scientifique qui tentera de valider les effets du déoxynivalénol sur le porcelet et de résoudre les problèmes reliés à l’ingestion de cette mycotoxine dans l’alimentation porcine grâce à l’utilisation d’antioxydants.

CHAPITRE 2

REVUE DE TRAVAUX ANTÉRIEURS

1. PRODUCTION PORCINE ET MYCOTOXINES

Au Canada, la problématique des mycotoxines (métabolites secondaires de champignons microscopiques) dans l’alimentation animale a été classée comme prioritaire par la Fédération de producteurs de porcs du Québec (FPPQ) et par Agriculture et Agroalimentaire Canada (AAC) (Turgeon et al., 2009). Cette situation est rencontrée, entre autres, dans les pays nordiques comme le Canada ou le nord des États-Unis. À ces endroits, les conditions de température sont tempérées et humides, sont optimales à la croissance de plusieurs champignons producteurs de mycotoxines comme Fusarium

graminearum, qui est un champignon pathogène de plantes affectant surtout les plantes

céréalières. L’impact des mycotoxines sur la production agricole est loin d’être négligeable. En fait, le total des indemnités versées dans le cadre de l’assurance récolte au Québec pour les grains contaminés par la mycotoxine déoxynivalénol (DON) seulement s’élève à plus de 1,3 million de dollars (CA) pour la période de 2005 à 2008 inclusivement (Turgeon et al., 2009).

Il y a plusieurs études qui rapportent des toxicoses et autres effets délétères provoqués par les mycotoxines chez les humains et chez le bétail ayant une ration basée sur la consommation de plantes céréalières (Diaz et Boermans, 1994, Ciegler et Bennett, 1980, Rotter, 1996). Les problèmes reliés aux mycotoxines ont engendré un grand nombre d’études dans plusieurs sphères de la biologie. Ces études nous permettent de mieux comprendre le mode d’action des mycotoxines, leurs effets spécifiques sur les animaux et les traitements potentiels pour contrer leurs effets. Cependant, malgré toutes ces études, il reste beaucoup à apprendre afin de mieux comprendre leurs mécanismes d’action et de contrôler leurs effets sur les animaux (Pestka et al., 2004, Desjardins, 2006, Richard et al., 2003). Les effets des mycotoxines sur les animaux seront couverts dans une autre section de ce mémoire.

4

2. MYCOTOXINES

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires structurellement diversifiés issus de plusieurs classes de champignons filamenteux (Smith et Moss, 1985). Les champignons qui produisent des mycotoxines se divisent en deux groupes. Certains sont pathogènes de plantes et se développent sur les plantes en croissance, alors que d’autres sont des saprophytes se développant sur les grains après la récolte (Placinta et al., 1999). Il existe cependant certains champignons qui se développent autant avant la période de récolte qu’après celle-ci. C’est le cas notamment d’Aspergillus flavus qui se retrouve principalement sur le maïs et produit, entre autres, l’aflatoxine B1 et B2 (AFB1 et AFB2) (Campbell et White, 1995). Les mycotoxines sont donc produites dans les champs lors de la croissance de la plante ou lors du séchage et du stockage des grains après la récolte.

Fusarium spp., Aspergillus spp. et Penicillium spp. sont trois des champignons

mycotoxigéniques les plus extensivement étudiés. Ils proviennent de l’embranchement des deutéromycètes et sont aussi appelés champignons imparfaits (Fungi imperfecti) puisque tous les champignons de ce groupe sont anamorphes, c’est-à-dire qu’ils ne possèdent pas de forme sexuée à ce stade de leur cycle de vie (Smith et Moss, 1985).

Nous pouvons présentement dénombrer plus de trois cents mycotoxines (Bennett et Klich, 2003), provenant principalement de trois espèces de champignons soit Fusarium

spp. (déoxynivalénol, T-2 toxine, fumonisine et zéaralénone), d’Aspergillus spp.

(aflatoxine, citrinine et ochratoxine A) et de Penicillium spp. (ochratoxine A et citrinine). Les mycotoxines énoncées entre parenthèse dans le dernier énoncé retiennent presque toute l’attention puisqu’elles sont régulièrement rencontrées dans le secteur agricole, qu’elles ont été la cause de plusieurs toxicoses humaines et animales répertoriées (Miller et al., 1991, Xu et al., 2006, Richard et al., 2003) et parce que la FDA (Food and Drug Administration) des États-Unis a estimé que la contamination de cultures par aflatoxine (AF), fumonisine et DON aux États-Unis seulement provoquait des pertes économiques annuelles s’élevant à 932 millions de dollars (US) (Placinta et al., 1999).

La croissance des champignons producteurs de mycotoxines nécessite de bonnes conditions d’humidité et de températures qui seront listés dans une prochaine section. Cependant, ces champignons ne produisent des mycotoxines que si les conditions de température et d’humidité sont optimales. L’activité de l’eau (aW) qui est défini comme le quotient de la pression de vapeur dans une substance sur la pression de vapeur de l’eau

pure à une température donnée (Cauvain et Young, 2000)) est très importante pour la production de mycotoxine. Il a été observé que l’influence de l’activité de l’eau est supérieure à celle de la température sur le taux de croissance des champignons. L’effet combiné d’aW et de la température sur la croissance des champignons et sur leur production de mycotoxine est synergique (Magan et al., 2002, Samapundo et al., 2005, Samapundo et al., 2007). Les conditions optimales à la production de mycotoxines pour les espèces de Fusarium sont d’une activité de l’eau variant entre 0,93 et 0,97 ainsi que d’une température variant entre 25°C et 30°C dépendamment des espèces (Marin et al., 1995, Magan et al., 2002, Samapundo et al., 2005). Ces paramètres optimaux sont rencontrés à une activité de l’eau variant entre 0,98 et 0,99 et à une température variant entre 29°C et 33°C pour Aspergillus spp. (Wheeler et al., 1991, Samapundo et al., 2007, Sweeney et Dobson, 1998). Pour Pennicilium spp., ces paramètres varient entre 0,90 et 0,98 pour aW et sont à 30°C pour la température (Adebajo et al., 1994). Il est cependant accordé que ces deux facteurs ne sont pas les seuls facteurs importants à la production de mycotoxines même s’ils y sont déterminants.

2.1

T

F

Les mycotoxines de Fusarium sont diverses et nombreuses. Le groupe des trichothécènes est le plus connu et le plus étudié en raison de l’occurrence importante des mycotoxines de ce groupe en agriculture. De ce groupe, DON, T-2 toxine (T-2) et nivalénole (NIV) sont les trichothécènes les plus connues. Les mycotoxines zéaralénone (ZEA), fumonisine B1 (FB1) et fumonisine B2 (FB2) sont aussi régulièrement rencontrées en agriculture et ont des effets néfastes importants sur les animaux qui en consomment en grande quantité. Dans le cadre de ce projet, les mycotoxines DON et ZEA ont été retrouvés dans le maïs naturellement contaminé qui a été donné aux porcelets. Une attention particulière sera donc portée à ces deux toxines.

2.1.1 ZÉARALÉNONE

La zéaralenone (ZEA) est principalement produite par Fusarium culmorum, F. roseum,

6

mycotoxine est fréquemment rencontrée dans l’orge, le maïs, le blé, le riz et d'autres plantes qui sont souvent destinés à la consommation humaine et animale (Placinta et al., 1999, Macdonald et al., 2005, Zinedine et al., 2007). Le porc et le mouton sont plus sensibles à la contamination de ZEA dans l’alimentation que les rongeurs. De plus, c’est une mycotoxine œstrogénique qui est reconnue pour ses effets sur le système reproducteur porcin (Tiemann et Dänicke, 2007). Pareillement, elle peut être immunotoxique (Luongo et al., 2008, Marin et al., 2011), causer la peroxydation des lipides (Zourgui et al., 2008), induire l’apoptose (Minervini et al., 2006) et altérer la structure de la muqueuse intestinale chez plusieurs animaux et particulièrement chez le porc. Les effets délétères de ZEA sont généralement rencontrés suite à une contamination alimentaire dépassant les 0,2 ppm par kg de masse corporelle (Zinedine et al., 2007). À l’inverse, ZEA possède aussi des effets immunostimulants à faibles doses. En effet, une étude in vitro conduite par Marin et al. (2011) démontre que ZEA peut augmenter la viabilité des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) et l’activité métabolique chez le porc en augmentant la production d’immunoglobuline (Ig).

2.1.2 TRICHOTHECÈNES

Les trichothécènes sont des molécules tricycliques sesquiterpènes qui ont été associés à plusieurs mycotoxicoses humaines et animales par le passé. Bien que la plupart des trichothécènes sont produites par Fusarium, les genres Myrothécium, Stachybotrys,

Trichothécium et Trichoderma peuvent aussi en produire (Gottschalk et al., 2009).

Les trichothécènes sont séparées en quatre « types ». Le type A possède un groupement isovalérate de méthyle en C8 (Annexe 1). Les trichothécènes de type A les plus connues sont les toxines T-2 et HT-2. Les trichothécènes de type B possèdent, quant à elles, un carbonyle (un groupement comportant une double liaison entre un carbone et un oxygène) en C8 ce qui leur confère un groupe cétone (Annexe 1). Les mycotoxines DON et NIV font partie de ce type. Les trichothécènes de type C forment un deuxième groupe époxyde (Annexe 1) en C7-8 ou en C9-10 tandis que les trichothécènes de type D forment une structure macrocyclique. Ces deux derniers types ne sont pas très représentés en agriculture et suscitent donc moins d’intérêt en recherche (Mirocha et al., 2003, Gottschalk et al., 2009).

Toutes les trichothécènes n’ont pas la même toxicité. La variation intrinsèque de la toxicité chez les trichothécènes est en partie due au nombre d'oxygènes que chacune contient. Par exemple, DON est plus toxique avec ses 4 oxygènes que la calonectrine qui n’en possède que 2. Il y a cependant des exceptions à cette tendance puisque T-2 qui possède aussi 4 oxygènes est beaucoup plus toxique que DON dans la plupart des systèmes infectés (Desjardins, 2006, Desjardins et Proctor, 2007).

2.1.2.1 DÉOXYNIVALÉNOL

Historiquement, DON est reconnu comme étant responsable de plusieurs poussées de toxicoses humaines survenues au Japon entre 1946 et 1957 en conséquence de la grande consommation de riz, d’orge et de blé contaminés par DON. Des études réalisées par la suite au Japon sur ces produits agricoles ont pu mener à l’extraction de F.

graminearum et à l’isolation de DON (Marasas et al., 1984).

Le DON est principalement produit par les champignons Fusarium graminearum et

F.culmorum (Dersjant-Li et al., 2003, Hope et al., 2005). Cette mycotoxine est l’une des

plus étudiées à cause de sa fréquence, de sa résistance, mais surtout à cause de ses effets délétères sur les animaux et les humains. Les climats tempérés et humides comme on en retrouve en Europe et en Amérique du Nord sont idéaux à la croissance de plusieurs champignons de type Fusarium spp. Ce faisant, DON est la mycotoxine la plus abondamment retrouvée dans l’orge, le blé et le maïs (IARC, 1993, Binder et al., 2007, Rodrigues et Naehrer, 2012). C’est une toxine qui reste stable durant l’entreposage, qui n’est pas dégradée à haute température, qui est résistante au pH bas et aux procédés de transformations mécaniques comme la mouture (Eriksen et al., 2003, Richard et al., 2003). Comme mentionné plus haut, bien que cette mycotoxine ne soit pas très toxique, son abondance dans les grains céréaliers est un problème pour les humains et les animaux de ferme qui ont une ration principalement composée de blé, de maïs ou d’orge. Les porcs sont lplus sensibles à l’ingestion de DON que les rongeurs, les poulets et les ruminants (Rotter, 1996).

8

2.2

T

P

’A

Les champignons des genres Penicillium et Aspergillus produisent aussi plusieurs toxines dont certaines sont aussi produites par Fusarium spp.(Xu et al., 2006).

Les mycotoxines produites par Aspergillus qui sont les plus étudiés sont les différents types d’aflatoxine avec une emphase sur les aflatoxines B1 et B2. Elles sont produites par

Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. pseudotamarii et A. nomius. Ochratoxine A (OTA) est

quant à elle produite par A. ochraceus, A. orchraceus, A. sulphureus, A. alliaceus,

A.sclerotiorum, A. melleus et plusieurs autres (Kurtzman et al., 1987, Richard et al., 2003).

La citrinine serait aussi produite par certaines espèces d’Aspergillus selon Frisvad (1986) et Kurata et al. (1990).

Plusieurs mycotoxines sont également produites par les espèces de Penicillium. En voici une liste non complète, mais regroupant les mycotoxines les plus connues : citréoviridine (produite par P. otreonigrum), citrinine (P. citrmum), pénitrem A (P.

crustosum), cyclochlorotine, islanditoxine, lutéoskyrine, érythroskyrine (P. islandwum) et

OTA (P. verrucosu et P. nordicum) (Wheeler et al., 1991, Larsen et al., 2001)

2.2.1 AFLATOXINES

Les aflatoxines sont des molécules hétérocycliques et forment une famille de mycotoxines semblables d’un point de vue moléculaire. On en dénombre 18 différentes (Beuchat, 1987). Du lot, les aflatoxines B1, B2, G1, G2 et M1 sont les plus étudiées. La majorité de ces mycotoxines sont identifiées comme des contaminants du maïs, du blé, du riz, d’autres céréales, des pistaches, de certaines épices et du coton. Le lait maternel d’animaux ayant mangé de la nourriture contaminée par des aflatoxines contient des molécules partiellement détoxifiées semblables à l’aflatoxine M1 (AFM1) et à l’aflatoxine M2 (AFM2). La présence de ces contaminants dans le lait commercial ou dans le fromage est d’ailleurs contrôlée dans soixante-neuf pays et est extensivement étudiée (Galvano et al., 1996, Bakirci, 2001, Chang et al., 2002, Shephard, 2009). Ces mycotoxines sont surtout retrouvées en Amérique du Nord, en Amérique centrale, dans le nord de l’Europe, en Russie et dans une plus faible mesure en Asie (Ellis et al., 1991).

Historiquement, les aflatoxines sont reconnues pour avoir causé la mort d’environ 100 000 dindes en Angleterre dans les années 1960. L’ingestion d’aflatoxine d’Aspergillus

flavus qu’on subit ces dindes provenait des arachides contenus dans leur alimentation

(Ellis et al., 1991).

2.2.2 OCHRATOXINE A

Ochratoxine A (OTA) est une mycotoxine qui se retrouve principalement sur des céréales comme l’orge. Elle est aussi retrouvée dans le cacao, le café, dans le vin et dans la viande, particulièrement celle des poulets, de porcs et d’autres animaux qui ont consommé de la nourriture contaminée par OTA (Moss, 2002). Il est reconnu qu’OTA se retrouve principalement en Europe, mais il s’en retrouve aussi en Inde, au Canada et ailleurs dans le monde (Richard et al., 2003). Bien qu’OTA ne soit pas aussi commune que les mycotoxines de Fusarium tel que DON dans les produits alimentaires, elle accapare beaucoup d’attention puisqu’elle est très résistante et peut contaminer des produits longtemps après la récolte comme en témoigne sa présence dans la viande animale.

L’OTA demeure impossible à éradiquer des plantations agricoles. Cependant, il est possible d’en réduire la production grâce à des fongicides, à des levures et à d’autres moyens qui permettent de contrôler les conditions environnantes comme l’humidité et la température (Amézqueta et al., 2009, Bleve et al., 2006).

2.2.3 CITRININE

La citrinine est une quinone de méthane. Elle est non seulement produite par

Penicillium et Aspergillus, mais aussi par Monascus (Li et al., 2003). On la retrouve

naturellement dans plusieurs produits tels le fromage, les raisins, le blé, l’orge, le maïs et d’autres céréales. La répartition géographique de cette mycotoxine est très large. Elle est répandue au Canada, aux États-Unis, en Suède, au Royaume-Uni et dans bien d’autres pays (Abramson et al., 1999, Xu et al., 2006, Richard et al., 2003). La citrinine est

10

considérée comme toxique et agit, comme il en sera question plus bas, sur plusieurs aspects d’un organisme animal qui la consomme.

La citrinine est relativement sensible aux hautes températures. Après une vingtaine de minutes à ébullition dans de l’eau, sa concentration diminue de 50% (Shu et Lin, 2002). Abramson et al., (1999) confirme aussi qu’elle est instable à ces températures et recommande de la chauffer à 130°C afin d’optimiser la détoxification. Par contre, un chauffage trop intense, à 140°C ou à 150°C, peut former des produits encore plus toxiques que la citrinine.

3. EFFET DES MYCOTOXINES SUR LES ANIMAUX

Les mycotoxines ont des effets assez variés sur les animaux et les effets d’une mycotoxine ne sont pas limités à un système en particulier (Richard et al., 2003). Les animaux monogastriques comme les porcs, les chiens, les humains et les rongeurs sont particulièrement affectés par les trichothécènes, par exemple. Les poulets, les dindes et les ruminants sont moins sensibles à ces mycotoxines. Il est reconnu que les bactéries retrouvées dans le rumen des ruminants ont un rôle important dans la détoxification de DON et de plusieurs autres mycotoxines (Rotter, 1996, Desjardins, 2006). Les effets de DON sur le porc sont assez variés, mais ils sont plus ou moins bien définis. Bien qu’il reste encore de la recherche à faire sur le sujet, il est reconnu que DON peut réduire la consommation de nourriture, diminuer la vitesse de croissances des porcelets (Pestka et Smolinski, 2005), altérer les aspects physiologiques de la muqueuse intestinale (Bouhet et Oswald, 2005), augmenter le stress oxydatif de l’animal (Kouadio et al., 2005, Kouadio et al., 2007, Krishnaswamy et al., 2010), altérer la réponse immunitaire à la vaccination (Pinton et al., 2008) et porter atteinte aux fonctions du système immunitaire (Oswald et al., 2003).

3.1

C

Le DON joue un rôle important dans la croissance des animaux d’élevage, surtout chez les porcelets qui sont particulièrement sensibles aux mycotoxines. Même avec une contamination naturelle de 2 mg de DON par kg d’aliment, il est possible d’observer une baisse de consommation alimentaire chez le porcelet. En contraste, le poulet et le veau diminuent leur consommation d’aliments à partir d’une concentration alimentaire de 5 mg de DON/kg et 6 mg de DON/kg respectivement (Trenholm et al., 1984, Friend et al., 1982). Il a aussi été observé qu’une exposition aussi faible que 50 µg de DON/kg de masse corporelle peut entraîner le vomissement chez les porcelets (Pestka et al., 1987). À partir d’une concentration de 12 mg de DON/kg d’aliment, les porcelets tendent à refuser complètement de manger les aliments et à être anorexiques (Forsyth et al., 1977, Abbas et al., 1986).

12

Une expérience réalisée par Chaytor et al., (2011) indique qu’il serait possible qu’une exposition chronique à de faibles concentrations de DON (0,55 à 0,77 mg/kg d’aliment) et d’AF (0.12 à 0.18 mg/kg d’aliment), soit responsable d’une réduction significative du gain de poids chez des porcelets après trois semaines d’exposition.

Au niveau de l’ingestion de nourriture, les porcs soumis à une alimentation contaminée par des mycotoxines comme DON ont tendance à diminuer la quantité de nourriture qu’ils ingèrent. Selon Rotter et al., (1994), la raison principale qui motiverait les porcs à modifier leur prise alimentaire serait pour essayer de diminuer l’effet «irritant» de DON sur leur système digestif. Le même auteur suggère que l’augmentation drastique de sérotonine associé à l’ingestion d’une ration contaminée de DON jouerait aussi un rôle dans la diminution de la prise alimentaire par les porcs (Rotter et al., 1996). De plus, une autre étude conduite sur la toxicité de DON, par administration orale, sur des rats et des souris conclue elle aussi que DON est un irritant gastro-intestinale (Arnold et al., 1986). En raison de l’effet «irritant» de DON, il n’est pas rare de voir des études où les animaux réduisent la quantité de nourriture qu’ils ingèrent, diminuant ainsi la quantité de mycotoxines ingérées par l’animal. Par conséquent, il est rare de voir des lésions causées par l'action abrasive de DON dans le tissu digestif (Chavez et Rheaume, 1986, Friend et al., 1986, Harvey et al., 1989). Dans le cas où il y a eu des lésions intestinales chez le porcelet, l’étude ne semble pas démontrer de lien entre ces lésions et la consommation de mycotoxines (DON et ZÉA) à des concentrations de 2 à 3 mg de DON/kg et entre 0,2 à 0,3 mg de ZÉA/kg (Gutzwiller et al., 2007).

À partir du moment où la concentration de mycotoxines ingérées est assez grande pour causer une diminution du gain moyen quotidien (GMQ) et une diminution de la prise de nourriture journalière chez les porcelets, Gutzwiller et al. (2007) ont observé que la conversion de la nourriture ingérée par ces individus est supérieure à ceux qui ne consomment pas d’aliments contaminés.

Les effets de DON sur la croissance ne sont cependant pas complètement clairs puisque certaines études, comme celles menées par Pinton et al. (2008) et par Rotter et al. (1994), n’observent pas ou observent peu de changement du gain de poids suite à la consommation d’une ration contaminée par DON (2,5 mg/kg de ration et 3,0 mg/kg de ration, respectivement).

3.2

S

Le système digestif a comme fonctions principales d’absorber les nutriments et de défendre l’organisme contre des infections par la muqueuse gastro-intestinale. Les porcelets naissent avec un système gastro-intestinal immature ce qui rend leur système digestif vulnérable à différentes infections ou à différentes expositions à des agents biochimiques (Lunney, 1994, Gaskins et Kelley, 1995). Par exemple, les mycotoxines sont reconnues pour causer différents effets néfastes au tissu épithélial intestinal. Il a été démontré, par une étude in vitro sur des cellules Caco-2 différenciées humaines, que les jonctions serrées et la résistance trans-épithéliale de ces cellules épithéliales sont affectées de façon dose dépendante par le DON (De Walle et al., 2010). La même étude avance que l’altération de la barrière intestinale serait une conséquence de la capacité de DON à inhiber la synthèse protéique et donc la synthèse de claudin-4, une protéine transmembranaire importante pour les jonctions serrées. Chez les porcelets, l’ingestion de DON et de FB réduit l’expression d’E-cadhérine, une glycoprotéine assurant l’adhérence intercellulaire (Bracarense et al., 2012). La même étude démontre que la hauteur des villosités intestinales est réduite et qu’il y a une augmentation des lésions intestinales chez les porcelets de 10 kg de masse corporelle ce qui pourrait rendre les animaux plus susceptibles à des infections par des pathogènes entériques. Des résultats similaires ont aussi été observés par Lessard et al. (2015) qui rapporte une diminution de l’expression d’ARNm de claudine-4 et d’OCLN dans la muqueuse intestinale de porcelets nourris avec une ration contaminée par DON (3,5 mg/kg). De plus, DON n’affecte pas seulement les cellules épithéliales, leurs jonctions et les villosités intestinales, il affecte aussi la consommation et l’absorption de certains nutriments (Awad et al., 2007, Kolf-Clauw et al., 2009).

Avant d’entamer la section concernant les effets des mycotoxines sur le système immunitaire, il semble important de noter que quelques études suggèrent que les effets délétères de DON sur le système immunitaire soient en partie dus à la réduction de la prise alimentaire ce qui en ferait un effet non spécifique de l’ingestion de DON (Rotter, 1996, Germolec, 2004, Marin et al., 2006, Grenier et al., 2011). Cette observation implique que les effets attribués à DON, dans les études impliquant la consommation de ration contaminée par DON, ne sont pas toujours directement liés à son effet toxique, mais ils

14

pourraient être expliqués par l’effet de DON sur la consommation alimentaire (Forsyth et al., 1977, Rotter et al., 1994, Goyarts et al., 2005).

3.3

S

Le système immunitaire a comme fonction principale de reconnaître les agents infectieux, de contenir ou de supprimer l’infection, de réguler la réponse immunologique et de protéger l’organisme contre une réinfection par le même agent pathogène. Ce système arrive à remplir ces fonctions grâce à l’action combinée de deux systèmes de défense : le système inné qui agit en premier et rapidement et le système acquis ou adaptatif qui peut-être plus lent à répondre, mais qui permet de reconnaître tout corps étranger. Lors d’une infection par un micro-organisme pathogène, certains mécanismes de défense naturelle préexistants dans l’organisme atteint sont utilisés afin de mettre un terme à une menace en quelques minutes. Ces mécanismes font tous partie du système immunitaire inné et ce n’est que lorsque ces mécanismes sont contournés que le système immunitaire adaptatif est requis (Janeway et al., 2009). Avant de parler de l’effet des mycotoxines sur le système immunitaire, il y aura une section dédiée aux effecteurs les plus importants du système immunitaire.

3.3.1 LES EFFECTEURS DU SYSTÈME IMMUNITAIRE

Les effecteurs du système immunitaire varient d’une espèce à l’autre. Cependant, le système immunitaire des humains et des porcs sont très semblables et comme le porc est régulièrement utilisé comme modèle pour tester des réactions immunologique chez les humains (Meurens et al., 2012), la section présente comportera quelques références portant sur le système immunitaire humain s’appliquant aussi à l’immunologie porcine (Rothkötter et al., 2002, Gerner et al., 2015). Ceci étant dit, le système immunitaire a un mode de fonctionnement complexe et nécessite plusieurs cellules et molécules différentes afin de pouvoir remplir son rôle dans l’organisme. Les cellules principales de l’immunité sont produites dans la moelle osseuse sous la forme de progénitures lymphoïdes ou myéloïdes communs non différenciés (Bailey, 2009, Janeway et al., 2009). Ces leucocytes

immatures se différencient généralement dans le sang ou sur des sites infectieux spécifiques suite à des signaux inflammatoires et ont chacun des rôles spécifiques :

- Les macrophages sont des phagocytes mononucléaires issus d’une lignée de cellules monocytes qui ont une longue durée de vie et qui contribuent principalement à défendre les tissus épithéliaux comme les poumons et le tractus gastro-intestinal en phagocytant des agents infectieux. Ils participent aussi à l’inflammation, sécrètent des protéines de signalisation, éliminent les déchets métaboliques et peuvent présenter des antigènes afin d’activer les lymphocytes T. Ces cellules peuvent être identifiées chez les porcelets grâce aux marqueurs d’anticorps CD172+ CD14+ SLA-DR CD16+, qui sont des clusters de différenciation reconnus (Summerfield et McCullough, 2009, Summerfield et al., 2003).

- Les neutrophiles sont des phagocytes polynucléaires qui ont une courte durée vie et qui se retrouvent principalement dans le sang. Ils sont les plus nombreux lors de la réponse immunitaire innée.

- Les mastocytes sont les protecteurs des muqueuses, mais ils sont surtout reconnus pour être responsables des réponses allergiques.

- Les basophiles et les éosinophiles sont moins bien connus, mais semblent être impliqués dans la défense contre des pathogènes trop volumineux pour les macrophages et les neutrophiles.

- Les cellules dendritiques sont des cellules qui font de la phagocytose et de la macropinocytose de façon continuelle afin de capter des antigènes solubles, des particules virales et des bactéries avec leurs longs prolongements dirigés. Leur rôle principal est de présenter les antigènes des cellules ingérées et des molécules co-stimulatrices à leur surface afin de procéder à la stimulation et à la prolifération des lymphocytes T. Elles peuvent aussi sécréter des cytokines. Les cellules dendritiques et plus largement les cellules présentatrices d’antigènes (APC) peuvent être identifiées chez les porcelets grâce aux marqueurs d’anticorps CD172+SLA-DR+ (CD) (Summerfield et McCullough, 2009, Summerfield et al., 2003).

Les lymphocytes se différencient dans le sang et sont activés dans les ganglions lymphatiques et ont chacun des rôles spécifiques :

16

- Les lymphocytes B (cellules B) sont dits naïfs (marqueurs d’anticorps CD21+CD25+) (Piriou-Guzylack et Salmon, 2008) lorsqu’ils sont dans le système en général et ils sont effecteurs (marqueurs d’anticorps CD21+CD25-SLA-DR+) (Piriou-Guzylack et Salmon, 2008) lorsqu’ils se lient spécifiquement à un antigène. À ce moment, ils prolifèrent et se différencient en plasmocytes qui produisent des immunoglobulines (Ig) qui ont des récepteurs identiques à ceux de la cellule B effectrice.

- Les cellules NK (natural killer cell) sont utiles autant au niveau du système immunitaire inné en tant que tueuses de cellules anormales qu’au niveau du système immunitaire adaptatif. Les cellules NK peuvent quant à elles être identifiées grâce aux marqueurs d’anticorps CD16+CD8+ (Piriou-Guzylack et Salmon, 2008).

- Les lymphocytes T jouent plusieurs rôles cruciaux dans la réponse immunitaire adaptative. Un lymphocyte T naïf devient effecteur de la même façon que la cellule B. Lors de l’activation des lymphocytes T naïfs en cellule T effectrices, elles peuvent se différencier en trois sous-populations. Les cellules T cytotoxiques, reconnues par les marqueurs d’anticorps CD4-CD8a+ (Piriou-Guzylack et Salmon, 2008), libèrent des molécules effectrices vers les cellules qui présentent des antigènes afin de les tuer. Elle peut aussi devenir une cellule T auxiliaire (ou helper en anglais), reconnus par les marqueurs d’anticorps CD4+CD8a- (Piriou-Guzylack et Salmon, 2008) qui fournit des signaux aux lymphocytes B et aux macrophages afin de les rendre plus actives et efficaces. Finalement, elle peut être régulatrice, reconnue par les marqueurs d’anticorps CD4+CD8a+ (Piriou-Guzylack et Salmon, 2008) et contrôler la réponse immunitaire en supprimant l’activité des autres lymphocytes.

- Les cellules gamma-delta (γδ) jouent un rôle complémentaire dans la réponse immunitaire en reconnaissant des antigènes différents à la majorité des cellules immunitaires grâce à leurs TLR de type delta et gamma. (Takamatsu et al., 2006). Elles font partie des premières lignes de défense de la réponse immunitaire innée et sont principalement présentes dans la réponse immunitaire des cellules (Wen et al., 2011). Les cellules γδ peuvent être identifiées chez les porcelets grâce aux marqueurs d’anticorps gd+CD4+ (Piriou-Guzylack et Salmon, 2008).

3.3.2 FONCTIONNEMENT DU SYSTÈME IMMUNITAIRE INNÉ

Les premières lignes de défense du système immunitaire inné sont les surfaces épithéliales. Ces surfaces sont tenues entre elles par des jonctions serrées formant ainsi une barrière physique contre l’infection. Certaines surfaces épithéliales peuvent aussi sécréter des enzymes antibactériennes comme des lysozymes dans les larmes ou de la phospholipase A dans la salive. De surcroit, la flore normale des tissus épithéliaux sont aussi des barrières importantes contre les micro-organismes pathogènes qui voudraient infecter un mammifère (Bailey, 2009). Les pathogènes qui réussissent à entrer dans l’organisme sont, pour la plupart, reconnus par les macrophages qui contribuent principalement à défendre les tissus épithéliaux comme les poumons et le tractus gastro-intestinal en phagocytant des agents infectieux. Les macrophages qui reconnaissent un pathogène induisent la sécrétion de cytokines, de chimiokines et d’autres agents inflammatoires dans l’organisme ce qui a pour effet d’amorcer une réaction d’inflammation par l’organisme. Les pathogènes sont aussi phagocytés par les neutrophiles qui sont attirés dans le tissu infecté à partir du sang en réponse aux signaux des agents inflammatoires. Suite à la phagocytose, la lyse des pathogènes est conduite par l’acidification du phagosome (vacuole contenant le pathogène), par la libération de lysosomes et par la production de produits toxiques tels que des peptides antimicrobiens, du peroxyde d’hydrogène (H2O2), de l’oxyde nitrique (NO) et l’anion superoxyde (O2-) (Janeway et al., 2009, Mair et al., 2014). La reconnaissance des agents pathogènes se fait à l’aide de plusieurs récepteurs appelés PRR (pattern recognition receptors). Les « motifs » de reconnaissance comme les parois bactériennes Gram positives ou Gram négatives sont répétés et présents chez beaucoup d’agents infectieux. Les récepteurs de lectines liant le mannose, les récepteurs-éboueurs reconnaissants des lipoprotéines et des polymères anioniques, les récepteurs de types TLR (toll like receptors) qui reconnaissent les lipopolysaccharides bactériens ne sont que quelques exemples des récepteurs de reconnaissance retrouvés à la surface des macrophages (Oswald et al., 2003, Janeway et al., 2009).

L’inflammation peut être amorcée, comme indiqué plus haut, par plusieurs cellules immunitaires, dont les macrophages qui induisent la sécrétion d’agents inflammatoires dès la reconnaissance d’un pathogène. L'inflammation possède trois rôles principaux dans la protection de l’organisme. Elle attire des cellules effectrices comme les neutrophiles, les

18

monocytes et les lymphocytes afin de combattre l’infection, elle induit la coagulation sanguine dans les tissus infectés comme barrière physique à l’expansion de l’infection et elle déclenche le processus de réparation du tissu. Ces trois rôles de l’inflammation ne peuvent être accomplis que grâce à certaines molécules qui sont spécialement conçues pour activer et contrôler l’inflammation (Wyns et al., 2015, Mair et al., 2014). Ces molécules, les cytokines et les chimiokines, entre autres, sont des protéines sécrétées par plusieurs cellules immunitaires ou encore par les cellules endothéliales d’un tissu infecté. Les chimiokines attirent les cellules du système immunitaire inné comme les neutrophiles et les monocytes et à l’aide des cytokines activent le processus d’inflammation. Les cytokines modifient l’adhérence des leucocytes aux tissus endothéliaux dans le foyer infectieux ce qui permet aux leucocytes et aux lymphocytes recrutés par les chimiokines de pénétrer le tissu plus facilement (Janeway et al., 2009). D’autres molécules de l’inflammation provoquent la dilatation et l’augmentation de la perméabilité des vaisseaux sanguins pour augmenter le flux sanguin et ainsi apporter plus d’effectifs du système immunitaire à l’endroit de l’infection. Ces modifications locales sont la cause des rougeurs, de la chaleur et du gonflement observés lors d’une inflammation (Oswald et al., 2003, Janeway et al., 2009).

3.3.3 FONCTIONNEMENT DU SYSTÈME IMMUNITAIRE ADAPTATIF

Lorsque le système immunitaire inné est débordé ou contourné, les pathogènes se répliquent dans l’organisme infecté et le système immunitaire adaptatif entre progressivement en jeu. Les cellules présentatrices d’antigènes (les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules B) jouent un rôle important à l’amorçage de ce système puisque les cellules T ne peuvent être activées que par la présentation d’un antigène qui leur est spécifique par l’une de ces cellules présentatrices (Gerner et al., 2015). Les chimiokines et les molécules d’adhérence comme l’intégrine font passer les cellules T du sang vers les tissus lymphoïdes d’où ils peuvent rencontrer des cellules présentatrices d’antigènes. Lorsqu’une cellule T est activée par la présentation d’un antigène qui lui est spécifique, elle passe alors par l’expansion clonale. Les lymphocytes T ainsi clonés retournent dans le système sanguin et migrent vers le foyer infectieux. La reconnaissance spécifique des cellules T effectrices combinée au reste des effectifs du système immunitaire est suffisante pour mettre un terme aux infections causées par un pathogène.

Finalement, suite à une infection, le système immunitaire produit des cellules B et T mémoires afin de répondre rapidement et efficacement à une réinfection (Janeway et al., 2009).

3.3.4 PARTICULARITÉS IMMUNOLOGIQUES CHEZ LES PORCS

Bien que l’immunologie au sein des mammifères soit bien conservée, certains traits immunologiques y diffèrent. Les traits uniques aux porcs sont très semblables aux spécificités immunologiques des autres membres du taxon des ongulés (super-ordre polyphylétique regroupant plusieurs animaux, dont ceux qui marchent sur leurs ongles (sabots)). Ces spécificités immunobiologiques aux porcs ont été extensivement étudiées (Lunney, 1994, Gaskins et Kelley, 1995) et la plupart sont dues à des lacunes immunitaires importantes chez les porcelets naissants (Pond et Mersmann, 2001). Voir le Tableau 2.1 pour une liste de ces caractéristiques immunologiques

Certains animaux placentaires, comme les rongeurs et les lagomorphes, obtiennent certains anticorps avant même leur naissance via le placenta qui provient de la mère. Cependant, la paroi placentaire des porcs ne permet pas ce type de transferts. Les porcelets se retrouvent donc sans immunoglobulines spécifiques ce qui les rend vulnérables à n’importe quel pathogène (Kim, 1975). Bien que les lymphocytes B, T et NK soient retrouvés dans l’organisme assez tôt pendant la gestation (à 20 jours, 40 jours et 45 jours respectivement), ils ne sont pas exposés à des pathogènes et ne sont donc pas prêts à faire face à une maladie infectieuse à la naissance (Šinkora et Butler, 2009).

20

TABLEAU 12.1 CARACTÉRISTIQUES IMMUNOLOGIQUES UNIQUES AUX PORCS

Source : adaptation du tableau retrouvé en page 704 de (Pond et Mersmann, 2001) *Ces caractéristiques ne sont pas totalement uniques aux porcs.

Caractéristiques Spécificités

Lymphocytes T cd4/cd8 doubles positifs

Les porcs ont un pourcentage de Lymphocyte T CD4+ et CD8+ élevé

Cytokine IFN-γ La cytokine IFN-γ n'est pas seulement produite par les cellules

T et les cellules NK, mais aussi par la trophectoderme (couche de cellules externe de la morula).

Gène IL-1 Les porcs ont deux gènes 1β. Ils sont nommés 1β1 et

IL-1β2. Récepteur Fc

(Fragment

cristallisable) CD16

Ces récepteurs ont un patron de distribution et des caractéristiques biochimiques différentes.

Structure et circulation des ganglions lymphatiques*

Le cortex d’un ganglion lymphatique est situé en son centre tandis que la médulla est située en périphérie; les lymphocytes qui quittent les ganglions entrent directement dans le sans et non dans les vaisseaux lymphatiques.

Récepteur fMLP* Les neutrophiles n'expriment pas de récepteurs fMLP.

Immunoglobuline D (IgD)*

Les porcs n'ont pas d'isotype pour cette immunoglobuline.

Complexe majeur d'histocompatibilité classe 2 (CMH 2)*

Le CMH classe 2 est exprimé sur les lymphocytes T naïfs.

Lymphocytes T γδ* Les CD4 et CD8 doubles négatifs exprimés par les récepteurs

de lymphocytes T γδ sont une sous-population majeure dans le sang périphérique des porcelets.

Afin de donner une chance aux nouveau-nés, le colostrum, un lait maternel sécrété dans les premières heures suivant la parturition, fournit une grande quantité d’IgA, d’IgG et d’IgM. Il contient aussi un apport important de macrophages, de neutrophiles et de lymphocytes (Tuboly et al., 1988). Bien que la sécrétion de colostrum ne soit pas une spécificité porcine, il a une importance cruciale puisque le porcelet n’a aucun moyen de répondre rapidement à une infection avant qu’il n’en boive.

Le lait maternel normal fournit aussi une part d’immunoglobulines A, G et M. Ces Ig deviennent absolument indispensables à l’immunité de ces jeunes qui sont exposés à plein de nouveaux pathogènes. Malgré cela, la plupart des paramètres immunitaires sont faibles chez les porcelets jusqu’à la période de sevrage (à l’âge minimum de 28 jours selon Worobec et al. (1999)) où la plupart des réactions immunitaires sont présentes et effectives (Pond et Mersmann, 2001).

L’activité des cellules NK chez les nouveau-nés est très faible, et cela jusqu’à deux à trois semaines. Cela indique que leur immunité non spécifique est plus faible, les premières semaines de leur vie (Yang et Schultz, 1986, Cepica et Derbyshire, 1984).

3.3.5 EFFET DES MYCOTOXINES SUR LE SYSTÈME IMMUNITAIRE

Les mycotoxines ont des effets variés sur le système immunitaire et plusieurs revues sur les mycotoxines couvrent déjà ce sujet (Yang et al., 2000, Pestka et al., 2004, Oswald et al., 2003, Richard et al., 2003). Une première observation d’importance est l’ambivalence des mycotoxines. En effet, il sera question, plus bas, d’effets immunostimulants des mycotoxines lorsque leur concentration est faible et d’effets immunosuppressifs lorsque ces mêmes mycotoxines se trouvent dans l’organisme en plus grande concentration (Pestka et al., 2004). Cet effet des mycotoxines peut être néfaste pour la santé des animaux les rendant plus vulnérables à des infections par des agents infectieux. Cependant, l’effet ambivalent peut profiter aux animaux d’élevages comme dans le cas où des souris préalablement contaminées avec une faible dose de T-2 puis infectées par Listeria monocytogenes ont un taux de mortalité 50% plus bas que celle qui n’ont pas été préalablement contaminés par T-2 (Corrier et al., 1987).

22

3.3.5.1 LES TRICHOTHÉCÈNES ET ZÉARALENONE

Une exposition chronique à DON chez le porc montre une régulation négative de la transcription des facteurs immunologiques dont principalement certains facteurs pro-inflammatoires. En effet, la concentration de facteurs inflammatoires comme les cytokines Interleukine - 1β (IL-1β), Interleukine - 8 (IL-8) et Facteur de nécrose tumorale α (TNFα) est comparable à la normale en début de la contamination au DON, mais elle diminue fortement (24%, 51% et 25% respectivement) lorsque le traitement s’étend sur une durée de plusieurs semaines (45 jours et plus) (Becker et al., 2011).

L’effet de DON sur un organisme est dose-dépendant. C’est-à-dire que sous un certain seuil de contamination, le système immunitaire n’est pas affecté ni stimulé. Par exemple, Becker et al. (2011) en ont fait la démonstration montrant que DON commence à percevoir de l’effet sur les cytokines des porcs qu’à partir du moment où les doses de DON administrées dans la ration alimentaire ont été augmentées passant de 1,2 mg/kg à 2,0 mg/kg au 42e jour d’expérimentation.

Les trichothécènes peuvent activer ou inhiber la prolifération cellulaire selon leur concentration dans un organisme donné (Pestka et al., 1994). Cette observation est partagée par plusieurs autres études qui soutiennent que l’effet de DON et d’autres trichothécènes sur la prolifération des lymphocytes est dépendant de la concentration de mycotoxine ingérée (Miller et Atkinson, 1986, Hughes et al., 1989). Par exemple, une étude in vitro avec du sang de porcelet faite par Marin et al. (2006) illustre qu’à basse concentration (0,01-1 µg de DON/ml), DON stimule la prolifération de lymphocyte dans le système sanguin périphérique. À moyenne concentration (100-1000 µg de DON/ml) de DON cependant, la prolifération des lymphocytes est fortement inhibée. Dans le même ordre d’idée, la réponse immunitaire des lymphocytes chez des porcelets vaccinés à l’OVA et contaminés par 2,5 mg de DON/kg de ration alimentaire est biphasique. C’est-à-dire que la prolifération des cellules lymphocytaires spécifiques est accentuée dans un premier temps avec une augmentation de 80% par rapport au témoin après le 21e jour et diminuée par la suite de -20% par rapport au témoin après le 35e jour (Pinton et al., 2008). Il y aurait donc un effet spécifique de la concentration de DON, mais aussi de la durée d’exposition à DON sur la réponse immunitaire.

Bien que ce ne soit pas spécifiquement précisé dans la littérature, le DON semble commencer à avoir un impact négatif sur le système immunitaire et plus particulièrement

sur la prolifération des lymphocytes à partir de 1,5 à 2 mg de DON/kg de ration alimentaire (Richard et al., 2003). Toutefois, certaines études n’ont pas montré de changement au niveau de la prolifération lymphocytaire et d’autres paramètres immunitaires avec des contaminations au DON variant de 0,8 à 9 mg/kg de ration alimentaire (Accensi et al., 2006, Tiemann et al., 2006). De même, l’Association française de Protection des Plantes (AFPP) (2006) mentionne que la prolifération lymphocytaire non spécifique n’est pas altérée par la consommation de DON dans une ration.

L’effet de ces toxines sur la prolifération cellulaire serait une conséquence de l’induction de l’apoptose dans les tissus contaminés par les trichothécènes (Pestka et al., 1994, Pestka et al., 2004). Comme pour la prolifération cellulaire, les trichothécènes peuvent avoir un effet inhibiteur ou stimulant sur l’apoptose des cellules B, T, sur les macrophages et sur la production d’IgA dépendamment de la dose et du type de trichothécène (Yang et al., 2000, Pestka et al., 1994). Comme il a été mentionné plus haut, toutes les trichothécènes ne sont pas aussi toxiques et ainsi l’induction de l’apoptose demande différentes concentrations de mycotoxines. In vitro, l’apoptose des lymphocytes augmente considérablement chez le porc soumis à des concentrations de 0,01-0,1 µg de DON/ml (Marin et al., 2006) tandis que la contamination à la satratoxines a causé des réponses apoptotiques modérées et élevées à partir de seulement 0,005 à 0,001 µg/ml (Yang et al., 2000).

Il est connu que la quantité d’immunoglobuline de type A et G augmente avec l’âge de l’individu. Les porcelets qui ont consommé des aliments contaminés avec DON ont une augmentation de la concentration d’IgA plasmique plus prononcée que ceux qui sont nourris avec une ration non contaminée (Pinson-Gadais et al., 2006). Pinton et al., (2008) ont calculé cette augmentation de la concentration d’IgA à 46,7% par rapport aux animaux témoin. Par contre, les concentrations d’immunoglobuline G et M ne seraient pas influencées par une ration contenant du DON chez le porc (Pinson-Gadais et al., 2006, Pinton et al., 2008). L’augmentation d’IgA spécifique à l’ovalbumine, après un vaccin pour cette protéine, a elle aussi augmenté de façon importante chez des porcs ayant consommé de la nourriture contaminée par DON (160% versus 47% d’augmentation pour les contrôles). Cependant, la concentration plasmique d’IgG spécifique et non spécifique à l’ovalbumine n’a pas subi d’augmentation significative (Pinton et al., 2008).

Deux cytokines semblent principalement atteintes par l’effet de DON sur l’expression des ARNm. L’expression de TGF-β et IFN-γ est sensiblement plus faible dans les