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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Biosciences végétales
JURY
M. Guillaume BECARD -Professeur de l'Université Paul Sabatier, Toulouse - Président Mme. Claudine FRANCHE - Directeur de Recherche IRD, Montpellier- Rapporteur Mme. Vivienne GIANINAZZI-PEARSON - Directeur de Recherche INRA, Dijon- Rapoorteur
M. Eric GIRAUD - Directeur de Recherche IRD, Montpellier- Examinateur
M. Charles ROSENBERG - Directeur de Recherche INRA, Toulouse - Directeur de thèse M. Frédéric DEBELLE - Chargé de Recherche INRA, Toulouse -Directeur de thèse
Ecole doctorale : Biologie, Santé, Biotechnologies
Unité de recherche : Laboratoire des Interactions Plantes/Micro-organismes Directeur(s) de Thèse : M. Charles ROSENBERG et M. Frédéric DEBELLE Rapporteurs : Mme. Claudine FRANCHE et Mme. Vivienne GIANINAZZI-PEARSON
Présentée et soutenue par Olivier GODFROY Le 19 mai 2008
Titre : Etudes génétique et moléculaire de deux gènes
de Medicago truncatula, DMI3 et RPG, contrôlant l'établissement de
THESE
Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PAUL SABATIER – TOULOUSE III
Discipline : Biosciences végétales
présentée par
Olivier GODFROY
Le 19 mai 2008
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JURY
M. Guillaume BECARD, Professeur de l’Université Paul Sabatier, Toulouse, Président
Mme. Claudine FRANCHE, Directeur de Recherche, IRD, Montpellier, Rapporteur
Mme. Vivienne GIANINAZZI-PEARSON, Directeur de Recherche, CNRS, Dijon, Rapporteur
M. Eric GIRAUD, Directeur de Recherche, IRD, Montpellier, Examinateur
M. Frédéric DEBELLE, Chargé de Recherche, INRA, Toulouse, Directeur de thèse
M. Charles ROSENBERG, Directeur de Recherche, INRA, Toulouse, Directeur de thèse
Recherches effectuées au Laboratoire des Interactions Plantes - Microorganismes
UMR CNRS/INRA 2594/441, Chemin de Borde-Rouge, BP52627, 31326
Ce travail a été réalisé en presque quatre ans au LIPM sous la direction de Charles Rosenberg, Frédéric Debellé et Clare Gough. Je tiens à les remercier tous les trois pour le travail d’encadrement qu’ils ont fourni et pour leur soutien et leurs conseils. Ils ont su me laisser l’autonomie dont j’ai besoin tout en répondant présent à chacune de mes sollicitations.
Je souhaite également remercier l’ensemble des personnes qui m’ont aidé au cours de ce travail de thèse. L’équipe cytologie du LIPM mais aussi Alain Jauneau, qui m’ont beaucoup apporté pour la microscopie et la compréhension de ce que j’observais. J’aurais un mot spécial pour Françoise pour son aide quasi quotidienne d’abord, mais aussi pour sa bonne humeur permanente et pour m’avoir recueilli chez elle lorsque je suis arrivé sans logement dans cette ville. Je remercie également les personnes avec qui j’ai pu collaborer, Christophe Roux accompagné de Monique et Daniel, ainsi que Jean-Jacques Bono.
Je souhaite également remercier l’ensemble du laboratoire, à commencer par Jean Dénarié, au commande de l’équipe lors de mon arrivé et dont l’expertise et les conseils m’ont grandement apporté ; Julie Cullimore et l’ensemble de son équipe avec qui nous travaillons et échangeons beaucoup ; et l’ensemble des personnes des différentes équipes et services qui permettent un formidable environnement de travail que ce soit scientifique ou humain.
Durant ces quartes années j’ai vu passer un certain nombre de personnes dans l’équipe et qui ont toutes, avec leurs différences et leurs spécificités, apporté leur touche pour créer une ambiance toujours agréable et conviviale. J’aurais un mot spécial pour Jean-François qui scientifiquement m’a beaucoup appris et dont l’amitié m’a permis de m’implanter sur Toulouse. J’aurai une pensée pour Sandra U., Anne-Marie, Fabienne et Olivier S., qui avec Jean-François m’ont immédiatement intégré dès le premier jour. Mais aussi pour Olivier A., Laurence, Sandra B., présents pendant la majeure partie de ma thèse, et pour Sawsen, Nicolas, Delphine, Dominique qui a eux tous m’ont soutenu pendant la laborieuse traversée du manuscrit. Je n’oublie pas non plus ceux qui n’ont fait que passer Antoine, Florent et surtout Julien que j’ai eu la chance de pouvoir encadrer et qui a eu la politesse de me supporter.
Enfin mon entourage hors du laboratoire, ma famille et mes amis d’enfance qui m’ont permis de penser à autre chose et je suis heureux de les avoir fait bien rire avec l’interminable titre de ma thèse. Je souhaite enfin et surtout remercier celle qui partage ma vie, qui m’a épaulé jour après jour et dont le seul sourire m’a permis d’arriver au bout de ce manuscrit. : Amélie.
Auteur : Olivier GODFROY
Titre : Etude génétique et moléculaire de deux gènes de Medicago truncatula, DMI3 et RPG, contrôlant l’établissement de symbioses racinaires
Directeurs de thèse : Charles ROSENBERG et Frédéric DEBELLE
Résumé
Le gène DMI3 de la légumineuse modèle Medicago truncatula code pour une Calcium and Calmodulin dependent protein Kinase (CCaMK) qui intervient dans les voies de signalisation nécessaires à l’établissement des symbioses mycorhizienne et rhizobienne. Nous avons montré qu’une CCaMK de riz peut restaurer la capacité d’un mutant dmi3 à noduler en présence de rhizobium. Une CCaMK de non légumineuse est donc capable de reconnaître et de transduire le signal calcique induit par les facteurs Nod du rhizobium.
De plus, les résultats de complémentation ainsi que les études d’expression tissulaire de ce gène indiquent que DMI3 est requis tout au long du processus d’infection de la racine par les rhizobium. Ce processus infectieux nécessite également le gène RPG. Par des études d’expression tissulaire, nous avons confirmé que RPG, comme DMI3, est étroitement lié au développement des cordons d’infection, des structures symbiotiques particulières nécessaires à l’infection.
Mots-clés : Medicago truncatula, symbiose rhizobium/légumineuse, symbiose mycorhizienne à arbuscule, signalisation, infection, DMI3, RPG.
Discipline administrative : Biosciences Végétales
Intitulé et adresse du laboratoire : Laboratoire des Interactions Plantes - Microorganismes, CNRS/INRA 2594/441, Chemin de Borde-Rouge, BP52627, 31326 Castanet-Tolosan Cedex.
Author : Olivier GODFROY
Title : Genetic and molecular studies of two Medicago truncatula genes, DMI3 and RPG, that control establishment of root symbioses
Ph. D Supervisor : Charles ROSENBERG et Frédéric DEBELLE
Summary
The DMI3 gene of the model legume Medicago truncatula encodes a Calcium and Calmodulin dependant Protein Kinase (CCaMK) involved in the signalling pathways leading to the establishment of both mycorrhizal and rhizobial root symbiosis. We have shown that a rice CCaMK can restore the nodulation ability of a M. truncatula dmi3 mutant, indicating that a non-legume CCaMK is able to recognize and transduce a calcium signal elicited by the specific Nod Factors produced by the rhizobial symbiont.
Furthermore, complementation experiments and spatial expression studies of DMI3 indicate that the CCaMK is necessary for successful infection of plant roots by rhizobia. This infection process also requires the RPG gene. By spatial expression studies, we confirmed that RPG and DMI3 are both tightly associated with the development of infection threads, which are symbiotic specific structures required for root infection of M. truncatula by rhizobia.
Key-words : Medicago truncatula, rhizobium/legume symbiosis, arbuscular mycorrhizal symbiosis, signalling, infection, DMI3, RPG.
Scientific field : Plant Biotechnology
Laboratory : Laboratoire des Interactions Plantes - Microorganismes,
Sommaire
Introduction ... 1
.1 La symbiose mycorhizienne à arbuscules ... 4
.1.1 Partenaires... 5
.1.2 Mise en place de l’interaction symbiotique... 8
.1.3 Echanges de nutriments ... 10
.1.4 Impact écologique de la symbiose mycorhizienne... 14
.2 La fixation biologique de l’azote ... 15
.2.1 Organismes fixateurs et processus de fixation biologique de l’azote... 15
.2.2 Les symbioses fixatrices d’azote... 17
.3 Dialogue moléculaire et signalisation symbiotique... 29
.3.1 Bases moléculaires de l’interaction rhizobium/légumineuses... 30
.3.2 Bases moléculaires de l’interaction plante – champignon ... 47
.4 Contexte de recherche et projet de thèse...51
Première Partie : DMI3, une Protéine Kinase Dépendante du Calcium et de la
Calmoduline, Nécessaire pour l’Etablissement des Symbioses Racinaires ... 53
.1 DMI3 peut-il jouer le rôle d’aiguillage entre les voies de signalisation rhizobienne et mycorhizienne?... 54
.1.1 Article ... 54
.1.2 Conclusion ... 66
.2 Les CCaMK ont-elles un rôle dans l’établissement de la mycorhization chez les non-légumineuses ? ... 67
.2.1 La CCaMK issue du riz complémente le mutant dmi3 vis-à-vis de la mycorhization ... 67
.2.2 Implication de la CCaMK dans l’établissement de la mycorhization chez le riz... 69
.3 Construction d’une forme constitutivement active de DMI3 en vue de l’identification de protéines cibles... 71
.3.1 Stratégie ... 71
.3.2 Méthodologie ... 73
.3.3 Résultats... 74
.4 Implication de DMI3 dans le processus d’infection : Etude spatio-temporelle de
l’expression tissulaire du gène DMI3 ... 75
.4.1 Méthodologie ... 75
.4.2 Résultats... 76
.4.3 Conclusion ... 76
Deuxième Partie : RPG, une Protéine Coiled-coil Requise pour la Croissance Polaire
du Cordon d’Infection... 77
.1 Article ... 78
.2 Localisation subcellulaire de la protéine RPG... 93
.2.1 Méthodologie ... 93
.2.2 Résultats... 97
.2.3 Conclusion ... 98
Discussion et Perspectives ... 99
.1 DMI3 une CCaMK symbiotique ... 102
.1.1 DMI3, un rôle d’aiguillage entre les symbioses ? ... 102
.1.2 DMI3 un aiguillage entre les voies de signalisation contrôlant les processus d’organogénèse nodulaire et d’infection ?... 109
.1.3 Rôle des CCaMK chez les non-légumineuses... 112
.1.4 Les CCaMKs sont-elles impliquées dans des processus autres que symbiotiques ? ... 116
.2 RPG, une protéine contrôlant l’infection ... 120
.2.1 Les RRP, une nouvelle famille de protéines à long domaine "coiled-coil"... 120
.2.2 RPG dans la voie de signalisation des facteurs Nod ... 121
.2.3 Localisation subcellulaire et rôle potentiel de la protéine RPG ... 123
Sommaire
Introduction
Fig1. Les différents types de symbioses mycorhiziennes 4
Fig2. Arbre phylogénétique du règne des champignons 5
Fig3. Schémas décrivant le mécanisme de pénétration du champignon mycorhizien
dans la racine et la formation de l’appareil de pré-pénétration (PPA) 8 Fig4. Le cycle de vie du champignon, un développement indissociable de la
symbiose mycorhizienne 9
Fig5. Transport du phosphate au cours de la symbiose mycorhizienne à arbuscules 11 Fig6. Echanges de composés azotés au cours de la symbiose mycorhizienne 12 Fig7. Echanges de carbone au cours de la symbiose Nostoc punctiforme / Glomus
pyriformis et transposition à la symbiose mycorhizienne à arbuscules 13
Fig8. Mécanismes biochimiques impliqués dans la fixation de l’azote 16
Fig9. Exemples de plantes actinorhiziennes 18
Fig10. Anatomie de Frankia – forme libre 18
Fig11. Structure du nodule actinorhizien 19
Fig12. Dépôts de flavanes dans les lobes nodulaires 19
Fig13. Processus d’infection au cours de la symbiose actinorhizienne 20
Fig14. Classification phylogénique des Légumineuses 22
Fig15. Processus d’infection de la racine et mise en place du nodule chez M.
truncatula 24
Fig16. Schéma montrant le processus d’invasion de la racine, initiation et croissance du cordon d’infection 25 Fig17. Comparaison entre les deux procédés d’invasion de la racine par les bactéries 25 Fig18. Schéma de la structure d’un nodule mature et détail de l’infection des cellules 27
Fig19. Exemples de structures chimiques de flavonoïdes 30
Fig20. Réponses de la plante aux facteurs Nod 33
Fig21. Flux de calcium en réponse aux facteurs Nod 34
Fig22. Imagerie des flux calciques après traitement aux facteurs Nod 34
Fig23.
Etude de l’expression spatio-temporelle du gène ENOD11 au cours de l’établissement de la symbiose rhizobienne à l’aide d’une construction
ENOD11p::GUS
Fig24. Modèle de perception des facteurs Nod et transduction du signal chez M.
truncatula 36
Fig25. La protéine NFP et la famille des LysM-RLK chez M. truncatula 38
Fig26. Schéma de la structure de la protéine codée par le gène DMI2 39
Fig27. Modèle de perception des facteurs Nod au niveau du poil absorbant impliquant les protéines-G et la signalisation lipidique 39
Fig28. Structure et localisation subcellulaire de la protéine DMI1 40
Fig29. Structure de la protéine codée par le gène DMI3 : une protéine kinase dépendante du calcium et de la calmoduline (CCaMK) 41
Fig30. Schéma du processus d’activation d’une CCaMK 41
Fig31. Localisation subcellulaire de la protéine DMI3 et colocalisation avec le calcium spiking 42 Fig32. Schéma du modèle proposé pour la voie de perception/transduction du signal « facteurs Nod » au niveau du poil absorbant 43 Fig33. Les trois gènes DMI sont impliqués à la fois dans l’établissement de la nodulation et de la mycorhization 47 Fig34. Les strigolactones émises par les racines ont une activité biologique sur les champignons mycorhiziens à arbuscules 48 Fig35. Modèle de perception des « facteurs Myc » et de la transduction du signal « Myc » 50
Première Partie
ArtI-Fig1. Two models for the switch between the Nod and mycorrhizal (Myc) signalling
pathways 56
ArtI-Fig2. Sequence alignment of MtDMI3 and OsCCaMK predicted proteins 57
ArtI-Fig3. pMtENOD11-GUS reporter gene expression in response to purified NFs 58
ArtI-Fig4. OsCCaMK induced nodule-like structure 59
ArtI-Fig5. Infection process observed by confocal microscopy 60
Fig36. Trans-complémentation du mutant dmi3 de M. truncatula pour la
mycorhization par le gène homologue du riz : OsCCaMK 68
Sommaire
Fig38. Le domaine kinase seul de la CCaMK de lis présente une activité constitutive 71 Fig39. Principe du cycle de purification d’une protéine par une stratégie
Strep●TagII®/Strep●Tactin® 72
Fig40. Effets de l’introduction de la forme tronquée 1-317 de DMI3 chez M.
truncatula 74
Fig41. Etude de l’expression spatio-temporelle du gène DMI3 par une approche gène rapporteur GUS 76
Deuxième Partie
ArtII-Fig1. RPG Phenotype 81
ArtII-Fig2. RPG Phenotype 82
ArtII-Fig3. Predicted primary structure of RPG homologs 83
ArtII-Fig4. Unrooted phylogenetic tree of RPG homologs using the RRP domain 84 ArtII-Fig5. Spatio-temporal analysis of RPG gene expression using the RPG
promoter-GUS fusion 85
ArtII-SI-Fig1. Mapping and map-based cloning of RPG 86
ArtII-SI-Fig2. Complementation of the RPG phenotype 87
ArtII-SI-Fig3. RPG gene structure and regions of the predicted RPG protein 88
ArtII-SI-Fig4. Amino acid conservation between RRP domains 89
Fig42. Stratégie de construction des gènes de fusion RPG-mRFP et RPG-NLS-mRFP
sous la dépendance du promoteur 35S 94
Fig43. Stratégie de construction des gènes de fusion RPG-mRFP et RPG-NLS-mRFP
sous la dépendance du promoteur RPG 95
Fig44. Localisation de la protéine de fusion RPG-mRFP exprimée sous la dépendance
du 35Sp dans les feuilles de N. benthamiana 97
Discussion et Perspectives
Fig45. Schéma de la structure prédite de la protéine IPD3 102
Fig46. Localisation subcellulaire d’IPD3 et interaction in vivo avec DMI3 102 Fig47. L’expression tissulaire de DMI3 et d’IPD3 montre une co-expression des deux gènes au cours des étapes précoces du développement nodulaire 103
Fig48. Des formes de la protéine DMI3 mutées ou délétées au niveau des domaines
régulateurs présentent une activité constitutive 104
Fig49. Activité symbiotique spontanée in vivo des formes tronquées de DMI3 105 Fig50. Schéma des rôles possibles de DMI3 dans les voies de signalisation Nod et Myc 107
Fig51. Modèle d’Allen et Schroeder (2001) 108
Fig52. Le développement du nodule nécessite une communication hormonale entre les tissus 110 Fig53. Caractérisation cytologique de l’interaction plante/G. intraradices chez plusieurs génotypes d’Oryza sativa 113 Fig54. Phénotype résultant de la sous expression («knock down ») du gène CgSymRK par ARN interférent, après inoculation par Frankia 114 Fig55. Phénotype du mutant rpg de M. truncatula et structure de la protéine RPG 120
Fig56. Les domaines d’interactions protéine/protéine de RPG et des autres membres de la famille 121 Fig57. Schéma décrivant la place potentielle de RPG dans la voie de signalisation Nod au niveau du cordon d’infection en croissance 122 Fig58. Données préliminaires de localisation de la protéine RPG marquée par la GFP, expression en système hétérologue en feuille de tabac (N. benthamiana) 123
Sommaire
Introduction
Tab1. Classification simplifiée du règne des champignons (« Fungi ») 6
Tab2. Organismes fixateurs d’azote 15
Tab3. Plantes actinorhiziennes et souches de Frankia identifiées 21
Tab4. Classification des rhizobium 23
Tab5. Diversité des Facteurs de Nodulation 31
Tab6. Gènes de nodulation 32
Première Partie
ArtI-Tab1. pMtENOD11-GUS reporter gene expression induced by OsCCaMK 58
ArtI-Tab2. Nodule formation induced by OsCCaMK 59
Tab7. Résultats des tests de mycorhization des mutants NF8513 et NG2508 du riz 70
Tab8.
Séquences des amorces utilisées pour le clonage a. de la forme tronquée de DMI3
b. du promoteur DMI3p
73
Deuxième Partie
ArtII-Tab1. Expression analysis of RPG and M. truncatula RRP genes by quantitative
RT-PCR 83
ArtII-SI-Tab1. Medicago truncatula RRP genes 89
ArtII-SI-Tab2. Comparison of the exonic structure of RPG homologs in relation with
predictied protein regions 90
ArtII-SI Supplementary Information: PCR reactions and Microscopic methods 91
Tab9.
Séquences des amorces utilisées pour le clonage a. de RPG et RGP-NLS
b. de la mRFP
Introduction
2 Dans leur environnement les organismes vivants sont en interaction permanente les uns avec les autres. Certaines de ces interactions sont stables dans le temps et ont un impact sur le déroulement de la vie de l’un ou des deux organismes impliqués. D’un point de vue étymologique ces interactions peuvent être nommées « symbiose » puisque ce terme provient du grec σύν (syn), « avec », « ensemble », et βιου̃ν (bios), « vivre », et signifie donc « vivre avec », « vivre ensemble ». Cependant, d’un point de vue biologique, on distingue le parasitisme, au cours duquel un seul partenaire tire profit de l’interaction, et le mutualisme où les deux partenaires jouissent d’un bénéfice réciproque. L’usage actuel que nous adopterons tend à réserver le terme symbiose aux interactions à bénéfices réciproques. Ce type d’interaction permet aux organismes d’acquérir de nouvelles fonctions biologiques sans les inventer de novo. Ainsi, il semble que ce genre d’interaction à bénéfice réciproque soit à l’origine de grands bonds évolutifs comme l’acquisition des mitochondries par les eucaryotes et des plastes par les végétaux.
Il existe une très grande diversité de symbioses impliquant tous types d’organismes et différents degrés d’association. Certaines interactions symbiotiques se distinguent par le fait que l’un des partenaires réside, entièrement ou partiellement, à l’intérieur des cellules de l’autre partenaire, d’où leur nom d’endosymbioses. Ces interactions requièrent la mise en place de mécanismes de perception, de reconnaissance et de régulation sophistiqués. Chacun des deux partenaires doit être en mesure de percevoir l’autre et de le reconnaitre en tant qu’organisme symbiotique ; de plus le partenaire dont les cellules sont envahies doit être en mesure de contrôler et de réguler cette infection. Les endosymbioses représentent donc un stade très avancé d’association entre deux organismes et nécessitent la mise en place de processus physiologiques et moléculaires spécifiques.
Dans le règne végétal, parmi les symbioses les plus importantes, on distingue les endosymbioses racinaires formées entre des plantes, vasculaires ou non, et certains micro-organismes telluriques. Ces interactions se caractérisent par la présence dans certaines cellules de la racine de micro-organismes bactériens ou fongiques formant des structures appelées symbiosomes. Les symbiosomes constituent pour la plante de nouveaux « organites » qui sont le site des échanges de nutriments entre les deux partenaires. Au cours de ces interactions, les micro-organismes fournissent au végétal hôte des composés nécessaires à leur croissance (ammoniac synthétisé à partir de l’azote atmosphérique dans le cas des symbioses avec les rhizobium, phosphore dans le cas des symbioses mycorhiziennes). En retour la plante fournit des composés carbonés issus de la photosynthèse.
Ces interactions symbiotiques ont un rôle écologique fondamental. En améliorant l’approvisionnement en minéraux, elles procurent un avantage compétitif aux plantes concernées. Ainsi la composition de la microflore tellurique influe sur la diversité des végétaux en surface (Rillig and Mummey, 2006 ; van der Heijden, et al., 1998). De plus, ces endosymbioses racinaires sont impliquées dans la colonisation des sols pauvres par les plantes dites pionnières et édificatrices. D’un point de vue évolutif, ces endosymbioses racinaires et notamment la plus répandue, la symbiose mycorhizienne (voir .1), sont suspectées d’avoir joué un rôle crucial dans la colonisation des terres en mettant à la disposition des plantes les composés minéraux indispensables à leur croissance et peu disponibles dans les sols primitifs pauvres.
Fig1. Les différents types de symbioses mycorhiziennes
: schémas d’une coupe longitudinale de racines mycorhizéesA, La symbiose mycorhizienne à arbuscules ; B, La symbiose mycorhizienne des Ericoïdes ; C, La symbiose ectomycorhizenne
ap: appressorium ; arb : arbuscule ; hic: hyphes intercellulaires ; man: manchon fongique ; hps: hyphes pré-symbiotiques ; mer: mycélium extra-radiculaire ; mir: mycélium intra-radiculaire ; pl: peloton ; sp: spore ; vs: vésicule.
C
mer hic manA
sp arb ap mer mir vs hps spB
pl ap mer mir hps.1 La symbiose mycorhizienne à arbuscules
Le terme mycorhize, « mukes » : champignon et « rhiza » : racine, désigne l’interaction entre les racines d’une plante et un champignon du sol. Ce type de symbiose se retrouve de façon ubiquitaire dans les environnements naturels puisqu’on estime que plus de 90% des familles de plantes terrestres possèdent au moins un représentant capable de mycorhizer. Il existe différents types de mycorhizes, en fonction de la morphologie de l’interaction, caractérisés par une interaction superficielle (ectomycorhize) ou interne (endomycorhize).
Les ectomycorhizes se rencontrent principalement chez les arbres et arbustes et impliquent une très grande variété de champignons Basidiomycètes, Ascomycètes ou Zygomycètes. Au cours de l’interaction, le partenaire fongique forme un manchon d’hyphes autour de certaines racines, et s’insinue entre les cellules de l’épiderme et du cortex externe sans jamais pénétrer les cellules végétales. A l’inverse, les endomycorhizes sont caractérisées par la présence de structures fongiques à l’intérieur de certaines cellules de la plante hôte. En fonction de la morphologie de l’appareil fongique intracellulaire, on différencie plusieurs types d’endomycorhizes. Dans le cas des mycorhizes des Ericacées et des Orchidées, l’hyphe du champignon (Ascomycète ou Basidiomycète) forme un peloton à l’intérieur d’une cellule. Alors que dans le cas de la symbiose mycorhizienne à arbuscules, le champignon (Gloméromycète) développe à partir des hyphes intercellulaires, des structures intracellulaires très ramifiées, les arbuscules. Dans les deux cas, pelotons ou arbuscules, ces structures intracellulaires sont le site des échanges de nutriments entre les deux partenaires (Fig1. ; pour revue : (Smith and Read, 1997)
Ces trois grands types de symbioses mycorhiziennes, ectomycorhize, mycorhize des Ericacées et mycorhize à arbuscules, ont des répartitions géographiques différentes en fonction de la latitude, de l’altitude et de la nature des sols. La symbiose mycorhizienne à arbuscules est de loin la plus universelle.
A
B
Fig2. Arbre phylogénétique du règne des champignons
(A) et détail du phylum desGlomeromycota(B), établi à partir de la petite sous-unité de l’ADN ribosomique D’après Schussleret al., 2001
.1.1 Partenaires
• Les plantes hôtes
La symbiose mycorhizienne à arbuscules a été observée pour la quasi totalité des plantes chez lesquelles elle a été recherchée. Ainsi des plantes appartenant aux angiospermes, aux ptéridophytes, certains gymnospermes, et même les gamétophytes de certaines plantes inférieures (lycopodes et mousses) sont capables de mycorhizer. Il est couramment admis qu’au moins 60% des espèces de plantes terrestres sont capables d’établir ce type de symbiose. Cependant, compte tenu de la faible part des plantes étudiées par rapport au nombre total d’espèces il est difficile de donner un chiffre précis. Plusieurs auteurs ont réalisé des compilations des données issues de la littérature (Harley and Harley, 1987 ; Newman and Reddell, 1987 ; Smith and Read, 1997 ; Trappe, 1987).
L’universalité de cette symbiose provient vraisemblablement de son ancienneté. Les données paléontologiques et moléculaires suggèrent que les premières plantes terrestres, à l’origine des taxons actuels, étaient capables de mycorhizer. Il a en effet été retrouvé des fossiles d’Aglaophyton, plante datant du Dévonien inferieur (autour de 410 MA), présentant des structures arbusculaires dans leur racines (Remy, et al., 1994). De plus, des fossiles présentant toutes les caractéristiques des champignons mycorhiziens à arbuscules ont été retrouvés dans des sols datant de l’Ordovicien moyen (460 – 455 MA) (Redecker, et al., 2000). Le gain nutritif apporté par cette symbiose à la plante a vraisemblablement joué un rôle fondamental dans la réussite de la colonisation des terres émergées. Cependant, un certain nombre de plantes actuelles ont perdu, au cours de l’évolution, la capacité à établir ce type d’interaction. Les plantes de la famille des Brassicacées notamment, dont fait partie
Arabidopsis thaliana, ont perdu toute capacité à établir la symbiose mycorhizienne à arbuscules.
• Les champignons mycorhizien à arbuscules
Les partenaires fongiques impliqués dans la symbiose mycorhizienne à arbuscules appartiennent à l’ancien ordre des Glomales (Zygomycètes) et sont aujourd’hui regroupés dans le phylum des Glomeromycota ou Gloméromycètes (Fig2. ; Tab1.) (Hibbett, et al., 2007 ; Schussler, et al., 2001 ; Schwarzott, et al., 2001).
Tab1. : Classification simplifiée du règne des champignons (« Fungi »)
Règne Fungi Phylum Chytridiomycota Phylum Neocallimastigomycota Phylum Blastocladiomycota Phylum Microsporidia Phylum Glomeromycota Classe Glomeromycètes Ordre Archaeosporales Ordre Diversisporales Ordre Glomerales Ordre Paraglomerales Champignons mycorhiziens à arbuscules Sous-phylum Mucoromycotina * Sous-phylum Entomophthoromycotina * Sous-phylum Zoopagomycotina * Sous-phylum Kickxellomycotina * Sous-règne Dikarya Phylum Ascomycota Phylum BasidiomycotaD’après Hibbett et al., 2007
La première classification des ces champignons était basée principalement sur la morphologie des spores. Le développement d’outils moléculaires ces dernières années a fait évoluer cette classification et il semble que certains embranchements soient polyphylétiques (Redecker and Raab, 2006 ; Schwarzott, et al., 2001). Actuellement, moins de 200 espèces ont été décrites dans ce phylum et toutes vivent en interaction symbiotique avec les racines de plantes terrestres sauf une, Geosiphon pyriformis, qui forme une endosymbiose avec une cyanobactérie du genre Nostoc (bactérie photosynthétique et fixatrice d’azote) (Gehrig, et al., 1996). Ces champignons ont la particularité d’être des symbiotes obligatoires. Ils tirent l’essentiel de leurs ressources en carbone de leur partenaire phototrophe (voir .1.3), et sont donc incapables de compléter leur cycle de vie en absence de relation symbiotique. Le développement de ces champignons se divise en trois phases (1) la germination des spores et la pénétration dans la plante hôte, (2) le développement d’hyphes intra-radiculaires, la formation d’arbuscules et l’établissement des échanges de nutriments et, (3) le développement d’un mycélium extra-radiculaire et la formation de nouvelles spores à ce niveau (Fig4.). Ces champignons sont cœnocytiques à tous les stades de leur développement ; les spores, comme les autres organes, sont donc polynucléées et présentent de plusieurs centaines à plusieurs milliers de noyaux.
Hormis l’observation de zygospores chez Gigaspora decipiens (Pawlowska, 2005 ; Tommerup and Sivasithamparam, 1990), il est admis que les Gloméromycètes possèdent une reproduction asexuée et ce probablement depuis plus de 400 MA. La question du maintien de ces espèces sur une échelle de temps si longue en absence de tout échange génétique posait problème. Au cours des années 1990-2000, il a été montré, chez ces champignons, l’existence d’une diversité génétique inter et intra-spécifique très importante, ainsi qu’un polymorphisme entre les noyaux au sein d’une même spore (Hosny, et al., 1999 ; Kuhn, et al., 2001 ; Lanfranco, et al., 1999 ; Vandenkoornhuyse, et al., 2001). Le ou les processus aboutissant à ce phénomène d’hétérocaryose sont encore en cours d’investigation. Toutefois, il est possible que pendant plusieurs millions d’années sans recombinaison entre génomes, une accumulation d’erreurs se soit produite. La multiplicité des génomes au sein d’un individu permettant une complémentation fonctionnelle, l’accumulation des ces erreurs n’aurait pas eu de conséquence. De plus, il a été démontré l’existence de phénomènes d’anastomose chez les Gloméromycètes (Giovannetti, et al., 1999). Au cours de ce processus deux hyphes fongiques entrent en contact, fusionnent et établissent ainsi une continuité cytoplasmique. Il en résulte la formation d’un seul hyphe renfermant les noyaux des deux hyphes « parents ». La fusion de deux mycéliums
Introduction
7 d’origines distinctes permet ainsi de mélanger dans un même hyphe des patrimoines génétiques de deux individus. Au cours d’une période d’évolution aussi longue, cela peut engendrer des individus multinucléés présentant une diversité génétique entre les noyaux. Ce type de « reproduction » parasexuelle ne permet pas un mélange des patrimoines génétiques mais une juxtaposition de patrimoines. Les mécanismes permettant la cohabitation de ces différents programmes génétiques au sein du même organisme ne sont, actuellement, pas connus.
• La spécificité d’hôte
La symbiose mycorhizienne à arbuscules ne présente pas, au contraire d’autres endosymbioses, une spécificité d’hôte nette. Une plante donnée peut être mycorhizée par différentes espèces de champignons n’appartenant pas obligatoirement au même genre. De la même façon, une espèce de champignon est généralement capable de mycorhizer une grande variété de plantes n’appartenant pas au même taxon. De plus, il a été montré qu’un même individu fongique est capable de mycorhizer simultanément deux plantes adjacentes d’espèces différentes (Newman, et al., 1994). Cependant, ces conclusions sont issues de travaux réalisés en conditions contrôlées, en utilisant le plus souvent un couple unique plante/champignon. Il n’est donc pas exclu qu’en conditions naturelles, certains champignons ne colonisent que certaines espèces. De plus, il est à noter que, même en conditions de laboratoire, l’efficacité de la symbiose peut varier d’un couple de partenaires à l’autre. Ainsi, certains champignons se développeront plus dans certaines espèces de plantes, et ce probablement parce que la plante est plus à même de recevoir l’espèce considérée. De la même façon, le transfert de nutriments est affecté par la nature des symbiotes et le bénéfice que peut retirer la plante de la mycorhization varie selon l’espèce du champignon.
L’absence de spécificité stricte peut s’expliquer par le caractère obligatoire de la symbiose pour ces champignons. Pour assurer sa multiplication, l’individu est contraint d’établir une relation symbiotique avec les plantes de son environnement immédiat, ce qui favorise un large spectre d’hôte. Il a été suggéré que l’hétérogénéité des matériels génétiques des champignons mycorhiziens soit l’un des facteurs assurant le large spectre d’hôte à ces organismes, en permettant une diversité dans les systèmes de reconnaissance et de signalisation entre partenaires (Reinhardt, 2007).
Fig3. Schémas décrivant le mécanisme de pénétration du champignon
mycorhizien dans la racine et la formation de l’appareil de pré-pénétration
(PPA)
J : contact entre le champignon et une cellule épithéliale de la racine au niveau de l’appressorium (ap)
K: au contact du champignon, le noyau (n) de la cellule végétale migre à la surface de la racine, à proximité de l’appressorium
L : en migrant vers la face basale de la cellule, le noyau entraîne la formation d’une structure tubulaire riche en cytosquelette et en réticulum endoplasmique : l’appareil de pré-pénétration (PPA)
M: un hyphe du champignon (hp) traverse la cellule végétale et pénètre la racine par l’intermédiaire du PPA
Code couleur : vert, microtubules ; rouge, micro-filaments d’actine ; blanc, réticulum endoplasmique D’après Genre et al., 2005 ap ap hp n n n n
Introduction
8
.1.2 Mise en place de l’interaction symbiotique
• Pénétration du champignon dans les racines
L’infection des racines d’une plante par le champignon peut se faire par deux voies distinctes. L’infection dite primaire se fait à partir d’hyphes fongiques pré-symbiotiques issus d’une spore en germination. L’infection dite secondaire implique, quant à elle, le mycélium extra-radiculaire d’un champignon ayant déjà envahi le système racinaire d’une plante hôte. Ce type d’infection secondaire peut se faire entre les racines du même système racinaire ou entre les systèmes racinaires de deux plantes différentes.
Dans le cas de l’infection primaire, les spores germent sous l’effet de facteurs environnementaux et émettent un tube germinatif. Les hyphes pré-symbiotiques issus de ce tube germinatif présentent de nombreuses ramifications. Leur croissance peut se faire en absence de plante hôte, mais dans ce cas, le développement spatial et temporel est limité. La présence de la plante hôte favorise la ramification des hyphes, active et oriente leur croissance. Cette ramification abondante favorise la rencontre entre le champignon et la plante et constitue donc une étape cruciale pour le développement de ces champignons qui sont des symbiotes obligatoires. Un certain nombre de travaux ont montré l’existence d’un dialogue moléculaire à distance entre les deux partenaires, au cours duquel, il est clair que le champignon reconnait la présence d’un hôte potentiel (voir .3.1).
Au contact de la racine, le champignon forme une structure particulière, l’appressorium. Il s’agit d’un renflement de l’hyphe qui permet un contact étroit entre la cellule fongique et les cellules épidermiques de la racine. Bien que l’on ne sache rien du dialogue moléculaire qui s’établit à ce moment, il est certain qu’un mécanisme de reconnaissance crucial pour la poursuite de l’infection se met en place à ce stade. L’appressorium est le point d’entrée du champignon dans la racine.
La pénétration de l’hyphe dans la plante se fait généralement à travers la cellule épidermique sous-jacente à l’appressorium. Des études microscopiques ont permis de mettre en évidence la formation, dans la cellule végétale en contact avec l’appressorium, d’une structure spécifique permettant le passage du champignon à travers la cellule (Fig3.) (Genre, et al., 2005). Cette structure, appelée « appareil de pré-pénétration » (PPA, « PrePenetration Apparatus »), est transitoire, tubulaire et traverse la cellule de l’extérieur vers l’intérieur de la racine. En utilisant la microscopie confocale,
d
e
f
Fig4. Le cycle de vie du champignon, un développement indissociable de la symbiose
mycorhizienne
Le développement d’un champignon mycorhizien à arbuscules débute par la germination d’une spore et le développement d’un mycélium pré-symbiotique présentant des ramifications importantes en présence de la plante hôte (c). Au contact de la racine, ce mycélium pré-symbiotique forme une structure différenciée, l’appressorium, qui est le site d’entrée du champignon dans la racine (d). A partir de ce point d’entrée, le champignon développe un mycélium intraradiculaire, essentiellement intercellulaire (e), qui forme au sein des cellules corticales des structures très ramifiées, les arbuscules (f). Les arbuscules sont le site des échanges de nutriments entre les deux symbiotes. En parallèle à l’invasion de la racine, le champignon développe un mycélium extraradiculaire, au niveau duquel les nutriments sont prélevés dans le sol pour être fournis à la plante. C’est également au niveau du mycélium extraradiculaire que de nouvelles spores sont formées (g).
Introduction
9 Genre et collaborateurs ont observé que le noyau de la cellule végétale, en position basale au repos, migre rapidement vers le haut de la cellule à proximité immédiate de l’appressorium. Puis le noyau retourne en position basale en entrainant derrière lui la formation d’un pont cytoplasmique traversant la cellule. Ce pont présente une accumulation de microtubules, de microfilaments d’actine et de réticulum endoplasmique. C’est seulement une fois cette structure formée que le champignon pénètre la cellule par l’intermédiaire de ce tube. Cependant il arrive que l’hyphe s’insinue dans l’espace séparant deux cellules épidermiques. Dans ce cas, c’est la cellule de la couche inférieure qui est traversée et qui développe ce même appareil (Reinhardt, 2007).
On constate donc que la pénétration du champignon dans les tissus végétaux se fait de façon extrêmement contrôlée et requiert une participation active de la plante, qui met en place des réponses spécifiques.
• Développement intra-radiculaire et formation de l’arbuscule
Une fois l’épiderme traversé, les hyphes fongiques se développent à l’intérieur de la racine. On différencie alors quatre types d’hyphes intra-radiculaires : (1) les hyphes intracellulaires qui forment généralement des boucles et traversent les cellules des différentes couches du cortex ; (2) les hyphes intercellulaires qui croissent entre les cellules et envahissent rapidement la racine ; (3) les hyphes intra- ou intercellulaires hypertrophiés qui forment des vésicules riches en lipides et en cytoplasme ; et (4) les hyphes intracellulaires très ramifiés, les arbuscules (Wilcox, 1996).
Les arbuscules représentent l’organe essentiel de la symbiose, ils permettent un contact très étroit entre les deux partenaires et constituent le site d’échange des nutriments entre les deux partenaires (voir .1.3). La formation des arbuscules résulte de la pénétration dans une cellule corticale d’un hyphe intercellulaire qui se ramifie en branches de plus en plus fines pour occuper l’ensemble de la cellule (Fig4.). L’intégrité de la membrane plasmique de la plante est conservée au cours de la formation de l’arbuscule dans la cellule mais sa composition est modifiée, et on l’appelle parfois la membrane du symbiosome. Les cytoplasmes des deux partenaires restent séparés par leurs membranes plasmiques respectives et par l’espace intercellulaire qui est rempli d’une matrice non fibrillaire issue des parois cellulaires des deux partenaires. Le processus de formation des arbuscules est un processus
dynamique, ces structures sont transitoires (une semaine au maximum), leur formation et leur dégénérescence sont continues au cours de la symbiose. De plus, il semble que la dégradation de l’arbuscule requière une participation active de la cellule corticale.
• Développement extra-radiculaire
Au cours de l’interaction, le champignon croît également hors de la racine et développe un réseau tridimensionnel d’hyphes dans le sol autour du système racinaire de la plante hôte. A partir de ce mycélium extra-radiculaire le champignon peut infecter de nouvelles racines de la même plante ou non. C’est également au niveau de ce mycélium que sont formées les spores qui assurent la reproduction et la dissémination du champignon.
.1.3 Echanges de nutriments
Au cours de l’interaction, les deux partenaires échangent des nutriments, le champignon fournit à la plante des composés minéraux, potassium, calcium, magnésium, cuivre, azote, eau, mais surtout phosphore. Le champignon tire du sol les minéraux qu’il fournit à la plante, le réseau mycélien extra-radiculaire constituant une zone d’interface avec le sol. L’étendue tridimensionnelle de ce réseau permet la prospection d’un volume de sol considérablement plus important que celui accessible par le seul système racinaire de la plante hôte. Ce mécanisme nécessite de transporter les minéraux prélevés du mycélium extra-radiculaire au mycélium intra-radiculaire d’où ils sont délivrés à la plante au niveau de l’arbuscule.
En échange, la plante fournit au champignon des composés carbonés issus de la photosynthèse. Le mycélium extra-radiculaire est incapable de prélever les composés carbonés nécessaires à partir de son milieu, et c’est donc le mycélium intra-radiculaire qui absorbe depuis la plante la quasi-totalité des composés carbonés nécessaires au champignon. Ainsi, cohabitent dans le champignon un flux de minéraux du mycélium extra-radiculaire vers la plante et un flux de carbone de la racine vers le mycélium extra-radiculaire.
Fig5. Transport du phosphate au cours de la symbiose mycorhizienne à arbuscules
(A) Représentation schématique d’une racine mycorhizée. n La plante absorbe le phosphate directement dans le sol au niveau des poils absorbants (Rh, « root hair »), grâce aux transporteurs Pht1;1 et Pht1;2 ; ceci crée une zone d’épuisement du phosphate en gris (Dz, « depletion zone »). o Au cours de la symbiose le champignon absorbe le phosphate au niveau du mycélium extraradiculaire (Hn, « hyphal network ») grâce à des transporteurs de phosphate spécifiques (GvPT, GiPT). p Le phosphate prélevé du sol est mis à disposition de la plante, qui l’absorbe au niveau des arbuscules (B) grâce au transporteur Pht1;3.
Sp, « spore » ; Gt, « Germ tube » ; In, « Infection network » ; Ap, « appressorium » ; Ia, « intracellular arbuscules » ; Rhy, « runner hypha » ; PCW, « plant cell wall » ; FPM, « fungal plasma membrane » ; FCW, « fungal cell wall » ; IM, « intercellular matix » ; PPM, « plant plasma membrane ».
• Le phosphore
Le transfert de phosphore a été démontré en utilisant du phosphate radiomarqué au 32P
(Jakobsen, et al., 1992). En 1995, Harrison et van Buuren ont identifié un transporteur de phosphate chez Glomus versiforme (GvPT). Ce transporteur de la famille Pht1 est un symporteur Pi/H+ à haute
affinité, localisé au niveau du mycélium extra-radiculaire de G. versiforme (Harrison and van Buuren, 1995). GvPT, ainsi que ses homologues identifiés chez G. intraradices (GiPT) et G. mosseae
(GmosPT), sont probablement impliqués dans l’absorption du phosphate par le champignon depuis le sol. Une accumulation de phosphate dans la vacuole, sous forme de polyphosphate, a été montrée au niveau des hyphes extra-radiculaires (Solaiman, et al., 1999). Les polyphosphates sont des polymères d’au moins trois phosphates inorganiques présents de façon ubiquitaire chez tous les organismes et impliqués dans un grand nombre de processus dont le transport de phosphate. Il semble que le phosphate inorganique acquis au niveau du mycélium extra-radiculaire du champignon soit polymérisé sous forme de polyphosphate et transporté via la vacuole jusqu’au mycélium intra-radiculaire. Les phosphatases spécifiquement exprimées par le champignon dans la racine pourraient jouer un rôle dans la dégradation des polyphosphates et la libération du phosphate inorganique dans l’espace intercellulaire au niveau de l’arbuscule (Javot, et al., 2007b). L’absorption de ce phosphate par la plante implique très probablement, également, des transporteurs de la famille Pht1. En effet, des études d’expression génique menées sur une grande variété de plantes (luzerne, lotier, riz, pomme de terre, tomate, blé, maïs, trèfle…) ont permis de révéler une modification de l’expression des transporteurs de cette famille au cours de la mycorhization. Certains gènes sont exprimés exclusivement au cours de l’interaction avec le champignon (Javot, et al., 2007b). C’est le cas du gène MtPT4 de M. truncatula qui code un transporteur de type Pht1 localisé au niveau de la membrane entourant l’arbuscule et qui semble donc impliqué dans l’acquisition symbiotique du phosphate (Harrison, et al., 2002)(Fig5.)(Rausch and Bucher, 2002). De plus, l’équipe de Maria Harrison a récemment démontré que la mutation de ce transporteur chez M. truncatula induit une accumulation de polyphosphate dans l’arbuscule. Dans la même étude, il a été montré l’implication du phosphate dans le contrôle de la mycorhization. En effet, chez le mutant mtpt4, la sénescence de l’arbuscule est accélérée, indiquant que le phosphate joue un rôle de signalisation au cours de la symbiose (Javot, et al., 2007a).
Fig6. Echanges de composés azotés au cours de la symbiose mycorhizienne
Le champignon absorbe les ions nitrate (NO3-) et ammonium (NH4+) présents dans le sol par l’intermédiaire du mycélium extraradiculaire (n). Au niveau de ce mycélium, le métabolisme du champignon stocke l’azote prélevé sous forme de glutamine (o) et l’exporte vers le mycélium intraradiculaire sous forme d’arginine (p). Dans la racine, l’arginine est soit utilisée pour le métabolisme du champignon (q), soit dégradée en ammonium puis exportée vers la plante par l’intermédiaire d’un transporteur (AMT) (r).
D’après Govindarajuluet al., 2005
n
o
p
q
r
• L’azote
Govindarajulu et collaborateurs (2005) ont montré en utilisant des radio-isotopes le transfert d’azote du champignon vers la plante. Ils ont utilisé un système développé par St Arnaud et collaborateurs (1996) basé sur la culture in vitro de racines excisées de carotte (Daucus carota L.) dans des boîtes bi-compartimentées. L’un des compartiments contient un milieu supplémenté en sucre (saccharose) sur lequel les racines se développent et le second contient le même milieu mais dépourvu de sucre sur lequel le mycélium extra-radiculaire du champignon mycorhizien (ici, G. intraradices) peut se développer ; ce second compartiment peut être supplémenté en minéraux marqués afin de suivre le transfert de nutriments du champignon vers la plante. De cette manière, Govindarajulu et collaborateurs (2005) ont pu montrer une accumulation d’acides aminés (glutamate et arginine) libres marqués au 15N dans le mycélium extra-radiculaire de G. intraradices poussant sur un milieu
contenant 15NO3- ou 15NH4+. Ils ont montré que l’arginine synthétisée dans les hyphes
extra-radiculaires à partir des minéraux extraits du substrat est exportée vers le mycélium intra-radiculaire vraisemblablement via la vacuole. Au niveau de la racine, l’arginine est dégradée et l’azote est relargué sous forme d’ammonium assimilable par la plante. L’implication de l’arbuscule dans la captation de l’ammonium symbiotique par la plante n’a pas encore été démontrée. De plus, le transporteur nécessaire à l’importation des ces ions NH4+ dans la cellule végétale n’a pas été identifié
(Fig6.).
Il est intéressant de noter les similitudes qui existent entre nutrition phosphorée et azotée. Le phosphate comme le nitrate ou le nitrite prélevés du sol sont transportés vers la racine par la vacuole sous une forme de stockage (polyphosphate ou arginine) qui est dégradée pour que les minéraux soient mis à disposition de la plante sous forme ionique. Une ancienne étude menée par résonance magnétique nucléaire sur un champignon ectomycorhizien suggère que l’arginine se trouve dans la vacuole sous forme liée à un composant inconnu suspecté d’être du polyphosphate (Martin, 1985).
Fig7. Echanges de carbone au cours de la symbiose
Nostoc punctiforme
/
Glomus
pyriformis
et transposition à la symbiose mycorhizienne à arbuscules
Les hexoses issus de la photosynthèse chez la cyanobactérie (ou la plante) sont exportés au niveau de l’interface entre les deux partenaires par un mécanisme inconnu. Le champignon absorbe ces composés grâce à un transporteur spécifique des hexoses : MST1
chez Glomus pyriformis. D’après Schussleret al., 2006
• Le carbone
L’observation de flux significatifs de carbone au cours de la symbiose mycorhizienne (Bago, et al., 2000 ; Ho and Trappe, 1973) suggère le passage de sucres, vraisemblablement des hexoses, issus de la photosynthèse de la plante vers le champignon. Le transport du carbone vers le mycélium extra-radiculaire se fait là aussi sous des formes de stockage, le glycogène mais aussi et surtout les tri-acyl-glycérol (TAGs), très abondants dans les Gloméromycètes. Ces TAGs, qui peuvent être stockés au sein de la racine dans les vésicules (voir .1.2), sont utilisés, après exportation, dans le mycélium extra-radiculaire comme source de carbone pour le métabolisme fongique (Bago, et al., 2000). En utilisant la symbiose entre Geosiphon pyriformis, un champignon du phylum des Gloméromycètes et Nostoc punctiforme, une cyanobactérie fixatrice d’azote atmosphérique, Schüßler et collaborateurs (2006)
ont identifié le premier transporteur de sucre d’un Glomale : GpMST1 (Schussler, et al., 2006). Il s’agit d’un co-transporteur hexose/H+ qui présente une très forte affinité pour le glucose et semble pouvoir
transporter du mannose ou du galactose mais pas de fructose (un pentose). Dans le cas de la symbiose mycorhizienne l’implication de l’arbuscule n’a pas été formellement établie. Cependant, la localisation de la protéine GpMST1 au niveau de la membrane du symbiosome (membrane fongique entourant les bactéries), comme cela est suspecté par l’équipe d’Arthur Schüßler, apporterait un argument en ce sens (Fig7.)
Ainsi, les flux de nutriments entre la plante et le champignon nécessitent des processus métaboliques complexes au cours desquels les nutriments sont convertis en formes de stockage pour être exportés. Bien que ces formes de stockage et certains transporteurs spécifiques aient été identifiés, il reste encore beaucoup de questions, notamment sur les mécanismes de régulation de ces échanges. Il semble en effet que l’augmentation de la disponibilité en sucre augmente le transfert de phosphate du champignon vers la plante (Bucking and Shachar-Hill, 2005). De la même façon, une disponibilité en azote importante réduit le transfert de carbone vers le champignon et influe sur l’expression du gène de transporteur de phosphate du champignon (Olsson, et al., 2005).
Introduction
14
.1.4 Impact écologique de la symbiose mycorhizienne
La symbiose mycorhizienne joue un rôle crucial dans la nutrition minérale des plantes. Par exemple, le phosphate inorganique PO4- présent dans le sol est souvent chélaté à des cations
métalliques tels que le fer ou l’aluminium, ce qui le rend très peu mobile. Il se forme ainsi une zone très pauvre en phosphate autour des racines et des poils absorbants des plantes. L’interaction avec un champignon mycorhizien permet d’augmenter le volume de sol accessible à la plante. Il en va de même pour les autres composés minéraux transportés par le champignon, y compris l’eau, permettant une meilleure résistance des plantes mycorhizées au stress hydrique. Cependant, l’interaction avec le champignon a un coût puisque la plante lui fournit des sucres issus de la photosynthèse. Ainsi, le caractère bénéfique de la symbiose mycorhizienne pour la plante dépend de cet équilibre entre profits de nutrition minérale et coûts en photosynthétats.
Depuis quelques années il est devenu évident qu’en milieu naturel les champignons mycorhiziens forment des réseaux qui connectent entre elles des plantes voisines, parfois d’espèces différentes. Le développement de ces réseaux crée un pool commun de nutriments et de substrats carbonés qui peuvent circuler d’une plante à l’autre via le champignon mycorhizien. Cependant l’équilibre de la balance bénéfice/coût de la symbiose dépend du couple plante/champignon et de l’état physiologique de la plante. Ainsi au sein d’un réseau, les plantes ne profitent pas d’échanges équilibrés, certaines tirant un profit important et d’autres pouvant subir une perte énergétique. Ainsi, l’existence de ces réseaux mycéliens a un impact déterminant dans les relations et la compétition entre plantes au sein d’un même environnement, et influe, par là même, sur la composition de la flore de surface (Selosse, et al., 2006).
Micro-organismes libres
Archaebactéries Methanosarcina, Methanococcus
Eubactéries
Anaérobies Clostridium, Desulfovibrio, Desulfotomaculum
Anaérobies facultatives Klebsiella, Erwinia, Enterobacter
Microaérobies Azospirillum, Aquaspirillum, Arthrobacter
Aérobies Azotobacter, Beijerinckia, Derxia
Photosynthétiques Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Chromatium
Cyanobactéries Anabaena, Calothrix, Nostoc
Systèmes symbiotiques
Rhizobium - Légumineuses
A croissance rapide Pisum, Trifolium, Vicia, Medicago, Lotus
A croissance lente Arachis, Glycine, Vigna
Rhizobium-non Légumineuses Parasponia
Symbiose actinorhizienne Alnus, Casuarina, Myrica
Associations Cyanobactéries -
Angiospermes Gunnera
Gymnospermes Agathis, Cycas, Macrozamia
Ptéridophytes Azolla
Bryophytes Anthoceros, Blasia, Caricula
Lichens Collema, Lichina, Peltigera
Introduction
15
.2 La fixation biologique de l’azote
.2.1 Organismes fixateurs et processus de fixation
biologique de l’azote
L’azote, composant des molécules organiques, est l’un des principaux nutriments nécessaires au développement des organismes vivants. La réduction de l’azote atmosphérique (N2, gaz inerte
composant 78% de l’atmosphère) en ammonium (NH4+), forme assimilable par les plantes, constitue
donc l’une des voies métaboliques les plus importantes avec la fixation du CO2.
• Les organismes fixateurs d’azote
La capacité à fixer l’azote atmosphérique se retrouve exclusivement chez certains procaryotes (bactéries et archées) dans des genres phylogénétiquement très éloignés (bactéries photosynthétiques sulfureuses, Firmibacteria, actinomycètes, cyanobactéries et toutes les subdivisions des protéobactéries, archées méthanogènes). Elle concerne des organismes hétérotrophes aérobies (Azotobacter…), anaérobies facultatifs (Klebsiella…), anaérobies stricts (Clostridium…), des organismes photosynthétiques anoxygéniques (Rhodobacter…) ou oxygéniques (Anabaena…) et des chemolithotrophes (comme Leptospirillum ferrooxidans). Ces organismes colonisent des habitats différents sous forme libre (sols, eau, air…) ou en interaction avec des organismes eucaryotes, par simple association (notamment dans la rhizosphère) ou en symbiose (Tab2.) (Dixon and Kahn, 2004 ; Dixon and Wheeler, 1986).
• Mécanisme moléculaire de la fixation
La fixation de l’azote est une réaction de réduction de l’azote moléculaire N2 en ammoniac
NH3 (ou NH4+). L’équation de la réaction chimique est :
Glutamine synthétase Glutamine – Oxoglutarate aminotransférase aminotransférase Protéine Fe Protéine MoFe
ProtéineRed FeOx MoFeRed N
2+ 8H+
3 2
16ATP 16ADP + 16Pi
e -Glutamate Glutamine Glutamate Oxoglutarate NH4+ + ATP ADP + Pi NADPH +H+ NADP+ α-cétoacides acides aminés azote fixé
B
Fig8. Mécanismes biochimiques impliqués dans la fixation de l’azote
A, mécanisme moléculaire de la réduction de l’azote atmosphérique en ammoniac par la Nitrogénase
B, cycle Glutamine Synthétase/Glutamine – Oxoglutarate Aminotransférase (GS-GOGAT) qui permet l’assimilation de l’azote fixé dans le métabolisme de la cellule
Introduction
16 Cette réaction est catalysée par une métallo-enzyme : la nitrogénase, synthétisée par tous les organismes fixateurs d’azote. Cette enzyme est un complexe associant un homodimère donneur d’électrons ATP-dépendant, la protéine-Fe (codée par le gène nifH) et un hétérotétramère associant deux sous-unités α et β de la protéine-MoFe (codées par les gènes nifD et nifK respectivement) possédant le site catalytique. Afin de fournir les électrons nécessaires à la réduction de l’azote moléculaire, la nitrogénase fonctionne avec des cofacteurs protéiques : la ferrédoxine chez les bactéries symbiotiques (cofacteur à NAD ou NADP), ou la flavodoxine chez les bactéries libres (cofacteur à FAD) (Peters and Szilagyi, 2006) (Fig8.A).
• La fixation en condition symbiotique
Un fois fixé en ammoniac, l’azote atmosphérique est transféré chez le partenaire eucaryote sous une forme qui varie en fonction du couple de partenaires : ion ammonium, acides aminés… Chez la plante, l’azote est généralement intégré aux acides aminés via le cycle Glutamine Synthétase/Glutamine – Oxoglutarate Aminotransférase (GS-GOGAT) (Fig8.B).
• Optimisation de la fixation de l’azote
La fixation de l’azote est un mécanisme très coûteux en énergie, elle consomme 16 moles d’ATP par mole d’azote réduit. Seule la respiration aérobie possède un rendement de production énergétique suffisant pour assurer la fixation de l’azote. Cependant, la nitrogénase est une enzyme particulièrement sensible à l’oxygène. Ce gaz induit, en effet, une inhibition définitive de la protéine et régule négativement les gènes liés à la fixation de l’azote chez les bactéries. Ainsi, dans le cas des symbioses nodulaires les plus évoluées, le partenaire végétal assure aux micro-symbiotes un environnement tel que la pression partielle en oxygène permet une respiration microaérobie et un fonctionnement optimal de la nitrogénase.
.2.2 Les symbioses fixatrices d’azote
Au cours de l’évolution, certaines plantes ont mis en place des associations symbiotiques avec ces micro-organismes de façon à pallier la faible disponibilité de l’azote dans les sols. Il existe plusieurs types de symbioses fixatrices d’azote, certaines, qui ne seront pas détaillées dans cette introduction, impliquent des cyanobactéries. Ces bactéries à Gram-négatif qui vivent en colonies filamenteuses (trichomes), sont photosynthétiques et diazotrophes, et peuvent interagir avec des plantes de différents embranchements tel que des ptéridophytes (symbiose entre Azolla, fougère aquatique, et Anabaena), des gymnospermes tropicaux de la famille des cycadales (symbiose Cycas –
Nostoc), ou des angiospermes (Gunnera – Nostoc) (Dixon and Wheeler, 1986 ; Duhoux and Nicole, 2004). Les cyanobactéries sont également impliquées dans des symbioses avec des champignons Ascomycètes ou Basidiomycètes pour former des Lichens.
Cependant les principales symbioses fixatrices d’azote sont les symbioses nodulaires. Il en existe deux types, la symbiose actinorhizienne qui implique des bactéries filamenteuses du genre
Frankia et la symbiose rhizobium/légumineuses. Ces deux symbioses sont caractérisées par la formation d’un nouvel organe au niveau des racines, le nodule ou nodosité, à l’intérieur duquel certaines cellules sont envahies par les micro-symbiotes fixateurs d’azote. Le nodule est un organe dont le rôle et l’origine sont exclusivement symbiotiques. La mise en place de cet organe, développé
de novo et facultatif pour la survie de la plante, requiert un programme d’organogénèse induit par la présence du micro-symbiote.
Fig9. Exemples de plantes
actinorhiziennes
2.1, Alnus glutinosa ; 2.2, Coriaria
sp. ; 2.3, Elaeagnus sp. ou olivier de Bohème ; 2.4, Myrica gale ; 2.5, plantation de Casuarina glauca; 2.6, fruits de Casuarina glauca ; 2.7,
Gymnostoma ; 2.8, tiges chlorophylliennes de Gymnostoma
sp. ; 2.9, fleurs mâles de
Gymnostomasp.
D’après Duhoux and Nicole, 2004
B
A
s
C
D
Fig10. Anatomie de
Frankia
– forme
libre
A: colonie de Frankia sur gélose, la bactérie filamenteuse développe des hyphes de façon radiale autour de la spore (s) (x200) ; B: sporange de Frankia
(x1300) ; C: diazo-vésicules à l’extrémité d’hyphes végétatifs de Frankia (barre = 5μm) ; D: image en microscopie électronique, vésicule symbiotique de
Frankia, le cytoplasme homogène est septé par des invaginations de la membrane riche en hopanoïdes (tête de flèche) participant à la protection de la nitrogénase contre l’oxygène (barre = 1μm).
A et B, d’après Duhoux and Nicole, 2004 ; C, d’après Benson and Silvester, 1993 ; D, d’après Berg, 1994
