Facteurs Myc
Signal calcique
Myc
Nodulation
DMI3
Mycorhization
B
L’information sur la nature du signal initial pourrait parvenir à DMI3 via une voie de signalisation encore inconnue, mais il est tentant de penser que la nature du signal calcique perçu par DMI3 pourrait fournir cette information. On pourrait alors avoir un mécanisme similaire au modèle proposé par Allen & Schroeder (2001), pour expliquer comment un messager universel comme le calcium est capable d’induire une très grande variété de réponses. Dans ce modèle, un décodeur central est capable de distinguer entre des signatures calciques différentes, et d’activer en conséquence une voie de transduction plutôt qu’une autre (Fig51.)(Allen and Schroeder, 2001). Bien que ce modèle n’ait pu être encore vérifié dans aucun système, il existe dans le cas des symbioses racinaires, une observation expérimentale en faveur de cette hypothèse. En effet, l’équipe de Giles Oldroyd à Norwich a récemment présenté des résultats qui montrent l’existence d’un signal calcique dans les cellules racinaires de M. truncatula en réponse à la présence du champignon mycorhizien. Ce signal est clairement différent du calcium spiking observé lors de l’application de facteurs Nod, et est notamment caractérisé par une fréquence d’oscillations plus faible.
En replaçant ce modèle dans le cadre de l’évolution des symbioses racinaires, on aurait pu supposer que les légumineuses avaient développé, à partir d’une CCaMK initialement seulement capable de percevoir une signature calcique de type Myc, une CCaMK capable de reconnaître également une signature calcique de type Nod. Cependant, nos résultats montrent que le gène
OsCCaMK de riz est capable de restaurer à la fois l’aptitude à mycorhizer et à noduler d’un mutant
dmi3 de M. truncatula, et donc qu’une CCaMK d’une espèce non légumineuse est capable de percevoir et transduire efficacement le signal Nod. Si ces données ne vont pas dans le sens d’une acquisition par les CCaMK des légumineuses de la capacité à reconnaître une nouvelle signature calcique, elles n’excluent cependant pas que les CCaMK des légumineuses aient acquis, au cours de l’évolution, l’aptitude à discriminer entre les signatures calciques Nod et Myc, et à y répondre de manière adaptée.
Discussion et Perspectives
109
.1.2 DMI3 un aiguillage entre les voies de signalisation
contrôlant les processus d’organogénèse nodulaire et
d’infection ?
L’existence de mutants, comme rpg, affectés dans le processus d’invasion de la racine par les bactéries mais toujours capables de former des structures de type nodulaire (Arrighi, et al., 2008) ; voir Introduction .3.1.4) ainsi que l’existence des mutants affectés dans le développement nodulaire mais pas dans le processus d’infection (Murray, et al., 2006 ; Murray, et al., 2007) indiquent que ces deux processus peuvent être découplés. L’inactivation du gène DMI3 empêche à la fois l’infection de la racine par les bactéries et la mise en place du nodule. En revanche, l’introduction de la CCaMK du riz chez le mutant dmi3-1de M. truncatula permet de rétablir l’organogénèse nodulaire mais pas le processus infectieux (Godfroy, et al., 2006), et une forme tronquée constitutivement active de la CCaMK induit la formation de nodosités sur les racines de M. truncatula en absence de stimulation symbiotique (Gleason, et al., 2006). L’ensemble de ces résultats suggère que les voies de signalisation contrôlant l’organogénèse nodulaire et le processus infectieux pourraient diverger directement en aval de DMI3.
.1.2.1 DMI3 est nécessaire à l’organogénèse nodulaire
Chez M. sativa et Glycine max (soja), les facteurs Nod seuls sont à même de déclencher l’activation de la division des cellules corticales menant jusqu’à la mise en place du nodule (Stokkermans and Peters, 1994 ; Truchet, et al., 1991). La mise en place du primordium nodulaire, à l’origine de la formation de la nodosité, dépend donc de la perception des facteurs Nod par la plante au niveau de l’épiderme, perception qui fait intervenir DMI3. Cependant les facteurs Nod, molécules partiellement hydrophiles, ne peuvent pas traverser l’épiderme racinaire, mais s’accumulent au niveau de la paroi des cellules épidermiques (Goedhart, et al., 2000). Il a donc été proposé l’existence de signaux intraracinaires émis en réponse à la perception des facteurs Nod par l’épiderme, et permettant le développement du primordium nodulaire au niveau du cortex interne.
Le développement du nodule à partir de cellules du cortex interne et du pericycle ressemble formtement au processus de formation des racines latérales. Ce processus fait intervenir une balance
La perception des facteurs Nod au niveau de l’épiderme par la voie NFP/DMI/NSP semble engendrer la production de cytokinines qui vont induire au niveau du cortex interne la mise en place du primordium nodulaire. Dans un second temps, la formation des cordons d’infection va permettre l’invasion des cellules du primordium par les bactéries et la mise en place d’une nodosité fonctionnelle.
Discussion et Perspectives
110 hormonale entre auxin et cytokinine suggréant que ces phytohormones puissent jouer un rôle dans le contrôle de la nodulation. L’identification récente, par trois équipes différentes chez M. truncatula et
L. japonicus, d’un récepteur aux cytokinines homologue au récepteur AHK4 d’Arabidopsis et impliqué dans le contrôle de la mise en place du primoridium nodulaire vient de confirmer l’implication des cytokinines au cours de la nodulation. Dans des travaux publiés en 2006, par Gonzalez-Rizzo et collaborateurs, ont montré que l’inactivation de CRE1, l’analogue de AHK4 chez
M. truncatula, conduit à une diminution drastique du nombre de nodules formés (Gonzalez-Rizzo, et al., 2006). De la même, façon Murray et collarobateurs ont rapporté en 2007 le clonage du gène LHK1
du lotier, dont l’inactivation bloque la formation du primoridum nodulaire et donc la formation du nodule, mais n’affecte pas le processu d’infection de la racine par les bactéries (Murray, et al., 2006 ; Murray, et al., 2007). Enfin dans un article lié, Tirichine et collaborateurs (2007) présentent un allèle de ce même gène LHK1 homologue de AHK4 qui conduit à la production d’une protéine à activité constitutive, et le mutant correspondant (snf2) étant capable de former des nodules spontanés en absence de signaux symbiotiques (facteurs Nod ou rhizobium). Tous ces travaux démontrent donc que les cytokinines exercent un contrôle positif sur la mise en place du primordium nodulaire et sur le processus de nodulation.
Il semble donc que la perception des facteurs Nod au niveau épidermique et la transduction du signal Nod via DMI3 déclenche la production de cytokinines, qui vont intervenir au niveau du cortex interne et du péricyle en dessous du site d’infection, pour participer à la mise en place du primordium nodulaire (Fig52. ; Oldroyd, 2007)
.1.2.2 DMI3 est impliquée dans le processus infectieux au cours de la nodulation
Les mutants dmi3 actuellement disponibles sont, à l’exception du mutant snf1-1 du lotier (mutant gain de fonction) (Tirichine, et al., 2006), des mutants nuls présentant un phénotype d’arrêt très précoce des symbioses rhizobienne et mycorhizienne. Ceci révèle le caractère d’absolue nécessité de ce gène pour l’établissement de ces deux symbioses racinaires. En revanche ce type de phénotype peut masquer une éventuelle implication de ce gène dans les étapes symbiotiques plus tardives.
Les résultats obtenus au cours de mon travail de thèse montrent l’implication de DMI3 dans le processus infectieux au cours de la symbiose rhizobienne. L’introduction du gène OsCCaMK chez le mutant dmi3-1 de M. truncatula permet une complémentation de ce mutant pour la transduction du signal facteur Nod (expression symbiotique ENOD11) et l’organogénèse nodulaire, mais conduit à un processus infectieux défaillant, présentant une croissance altérée des cordons d’infection et une non- libération des bactéries dans les cellules de la plante. Ceci suggère donc que le bon fonctionnement de la CCaMK est requis pour la progression du cordon d’infection et la libération des bactéries dans les cellules. De plus, l’étude de l’expression tissulaire de DMI3 montre que ce gène s’exprime tout au long du processus d’infection, au niveau des sites d’infection de la racine et au niveau de la zone d’infection des nodules matures, ce qui renforce cette hypothèse.
Il est intéressant de noter que les données présentes dans la littérature suggèrent que d’autres éléments de la voie de perception/transduction des facteurs Nod est active au cours du processus d’infection. L’expression spatio-temporelle des gènes NFP et DMI2 suit précisément le processus d’invasion de la racine (Arrighi, et al., 2006 ; Bersoult, et al., 2005), et il semble qu’il en soit de même pour DMI1 et LYK3 (Limpens, et al., 2005 ; Riely, et al., 2006). De plus, la protéine DMI2 est localisée dans la membrane plasmique des cellules végétales, mais également au niveau de la membrane entourant les cordons d’infection. Enfin, l’inactivation de l’expression des gènes NFP et DMI2 par RNAi empêche la libération des bactéries dans les cellules du nodule. Par ailleurs on sait que les bactéries continuent à produire des facteurs Nod dans les cordons d’infection (Sharma and Signer, 1990). Il ressort donc clairement que les facteurs Nod et la voie de perception/transduction des facteurs Nod sont impliqués dans le déroulement de l’infection, notamment dans la libération des bactéries dans les cellules au niveau de la zone II du nodule.
La voie de signalisation Nod impliquée dans le processus infectieux pourrait donc différer de la voie contrôlant la formation des nodules par l’implication de LYK3 pour la perception des facteurs Nod, mais reposerait ensuite sur la même voie de transduction, impliquant DMI1, DMI2 et DMI3. Le fait que des mutants nsp1 et nsp2, dont les gènes mutés codent pour des facteurs de transcription, soient également affectés pour l’infection suggère que les processus de nodulation et d’infection pourraient ne diverger qu’au niveau des effecteurs.
Discussion et Perspectives
112 Dans le cadre de la symbiose mycorhizienne, le phénotype des mutants dmi3 de M. truncatula
et du riz suggère également une possible implication de DMI3 dans l’infection de la racine par le champignon. En effet, les mutants nuls de dmi3 sont bloqués pour la pénétration du champignon dans les racines, mais le partenaire fongique reste capable de former à la surface racinaire des appressorium, au contraire des interactions incompatibles entre un champignon mycorhizien et une plante non-hôte (comme Arabidopsis). De plus, le mutant NF8513 du riz, qui produit une CCaMK délétée de certaines de ses séquences régulatrices, présente une infection des racines incomplète avec absence de formation d’arbuscules dans les cellules corticales. Ainsi, il semble que DMI3, outre son implication dans le contrôle de l’entrée du champignon mycorhizien dans les racines, participe également au processus qui, chez la plante, contrôle la mise en place de l’arbuscule.
.1.3 Rôle des CCaMK chez les non-légumineuses
• Les CCaMK, des protéines impliquées dans la mycorhization chez les non-légumineuses ? L’implication de DMI3 dans le processus de mycorhization chez les légumineuses et le caractère ubiquitaire de cette interaction suggèrent que les CCaMK sont également impliquées dans la mise en place de la mycorhization chez les non-légumineuses. Cependant au cours de ce travail de thèse, nous avons étudié deux lignées mutantes de riz affectées dans le gène codant pour la CCaMK, et nous n’avons pas pu détecter d’altération du processus de mycorhization. Il est intéressant de constater qu’une équipe américaine a travaillé sur ces mêmes lignées mutantes et a obtenu des résultats différents (Chen, et al., 2007). Dans leurs travaux, Chen et collaborateurs ont montré que dans la lignée NG2508, la protéine kinase n’était pas affectée par l’insertion du transposon dans l’intron 4, alors que l’insertion du Tos17 dans l’intron 3 chez la lignée NF8513 conduit à la production d’une CCaMK délétée des acides aminés 255 à 291. Il en résulte une absence de formation des arbuscules et des vésicules par le champignon mycorhizien, bien que celui-ci soit toujours capable de pénétrer les racines et les cellules végétales (Fig53.). Il serait intéressant de savoir si dans ces conditions le champignon mycorhizien est capable de produire de nouvelles spores et de réaliser son cycle de vie en absence d’arbuscules.
Photographies prises 7 semaines après inoculation par G. intraradices. La présence du champignon mycorhizien est révélée par coloration au Bleu Trypan selon une modification du protocole décrit par Koske & Gemma (1989).
A-D, colonisation des racines de la plante sauvage : A, vue d’ensemble d’une racine présentant des hyphes intra-radiculaires formant des arbuscules (B) et des vésicules (C) ; D, détail des ramifications de l’hyphe formant un arbuscule dans une cellule corticale de la plante.
E-G, la colonisation des racines du mutant NF8513 présente toutes les premières étapes de l’interaction plante/champignon avec une colonisation de la surface racinaire par les hyphes sans invasion (E), la formation d’appressorium (F), et la pénétration dans les racines et les cellules corticales de la plante, mais sans que le champignon ne puisse former d’arbuscules au sein des cellules (G).
H, on observe un phénotype similaire à G, chez la lignée OsCCaMKi-2 qui sous exprime le gène
OsCCaMK (lignée obtenue par interférence par ARN).
Discussion et Perspectives
113 L’apparente contradiction entre nos résultats et ceux de l’équipe américaine trouve peut être son origine dans les protocoles expérimentaux. Nous avons notamment utilisé pour l’inoculation un système de nursery au lieu des spores utilisées par Chen et collaborateurs. De plus, la température de culture est différente, Chen et collaborateurs ayant utilisé une chambre de culture à 13 heures de jour à 28°C et 11 heures de nuit à 24°C, alors que nos expériences ont été réalisées avec une période de 16 heures de jour à 24°C et 8 heures de nuit à 20°C. Il est possible que la température plus élevée des tests réalisés aux Etats-Unis ait rendu la protéine mutée instable, ce qui se serait traduit par une altération de la mise en place de la symbiose mycorhizienne, que nous n’avons pu observer dans nos conditions d’expérience.
Il est également intéressant de noter que le phénotype « Myc- » du mutant NF8513 est très tardif alors que les mutants dmi3 de M. truncatula sont très précoces et très stricts. En effet, chez
dmi3-1 (TRV25) et dmi3-2 (T1-5) aucune pénétration du champignon dans les racines n’est observable, alors que chez le mutant NF8513 de riz, le champignon envahit la racine et les cellules corticales. Ceci pourrait s’expliquer par la différence de nature entre les mutations chez le riz et chez
M. truncatula. Chez M. truncatula, les mutations (délétion de 14bp pour TRV25 et mutation ponctuelle pour T1-5) entrainent la formation d’un codon stop dans le domaine kinase (Lévy, et al., 2004) qui conduit à une très faible accumulation du transcrit qui correspond à une protéine inactive (Mitra, et al., 2004). A l’inverse, l’insertion du Tos17 chez NF8513 conduit à une délétion de 111pb qui ne perturbe pas le cadre de lecture. Une telle protéine pourrait présenter une activité résiduelle susceptible d’expliquer le phénotype symbiotique moins sévère que dans le cas du mutant TRV25 de
M. truncatula. Par ailleurs, il est intéressant de noter que cette protéine mutée présente une délétion de 37 acides aminés, parmi lesquels la tyrosine dont l’autophosphorylation participe à l’activation de la protéine. Or, il a été montré chez le lotier et chez M. truncatula que la mutation de ce site d’autophosphorylation induit des réponses symbiotiques spontanées telles que la formation de nodosités en absence de microsymbiote et l’expression symbiotique d’ENOD11 en absence de stimulation par les facteurs Nod (Fig48.A) (Gleason, et al., 2006 ; Tirichine, et al., 2006). Ainsi, il se pourrait que la protéine résultant de l’insertion du Tos17 chez la lignée NF8513 d’O. sativa présente, comme la protéine produite chez le mutant snf1-1 de L. japonicus, une activité constitutive suffisante pour permette la pénétration du champignon dans les racines et les cellules corticale, mais insuffisante pour conduire à la formation d’arbuscules. Il serait intéressant d’introduire le gène
(A) Nodosité non transgénique constituée de lobes multiples, 10 semaines post inoculation (spi). Une racine nodulaire se développe à l’apex de chaque lobe.
(B) Nodosité sur une racine transformée par le vecteur seul, 10 spi. La morphologie de la nodosité est similaire à celle des nodosités sauvages.
(C) Structure de type nodulaire sur racines transgéniques « knocked down » pour le gène CgSymRK, 10 spi. Les lobes nodulaires sont petits et ne se divisent pas pour former des structures multilobées. (D et E) Sections des nodosités contrôles, sauvages ou transformées par le vecteur vide. Chaque lobe nodulaire présente une trace vasculaire centrale et un parenchyme cortical infecté par Frankia.
(F) Section d’une structure nodulaire observée sur une plante transformée par l’ARN interférent, montrant des cellules infectées peu nombreuses et une accumulation anormale de polyphénols dans l’endoderme.
(G) Agrandissement de la région en D montrant des cellules corticales non infectées et infectées, celles-ci étant hypertrophiées et remplies de Frankia.
(H) Agrandissement de la région en E. Comme dans les nodules non transgéniques, les cellules corticales hypertrophiées sont remplies de Frankia.
(I) Agrandissement de la région en F. Les cellules infectées sont petites et peu nombreuses par comparaison avec celles des nodosités contrôles, sauvages ou transgéniques.
IC, cellules infectées par Frankia; RN, nodule racinaire; NA, apex du nodule; VT, tissu vasculaire; P, gouttes de polyphenol; RH, poil racinaire.
Discussion et Perspectives
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OsCCaMK muté de la lignée NF8513 chez le lotier ou M. truncatula, afin de déterminer sa capacité à induire la formation de nodosités en absence de symbiote.
• Les CCaMK impliquées dans les autres symbioses racinaires ?
L’implication des CCaMK dans la mise en place de la nodulation et de la mycorhization chez les légumineuses, leur implication apparente dans la mycorhization des non-légumineuses, l’absence de protéine de type CCaMK chez Arabidopsis thaliana qui ne forme aucune symbiose racinaire, suggèrent que cette famille de protéine pourrait être impliquée dans l’établissement des symbioses racinaires en général. On peut alors se demander si les protéines de type CCaMK jouent également un rôle dans les mécanismes contrôlant la mise en place d’autres types de symbioses racinaires, comme la nodulation de légumineuses indépendante des facteurs Nod, la nodulation des plantes actinorhiziennes, les ectomycorhizes, ou la mycorhization des Ericacées et des Orchidées. Ces symbioses ont été jusqu’ici relativement moins étudiées du point de vue de leurs mécanismes moléculaires et les gènes symbiotiques mis en évidence dans le cas de la symbiose rhizobienne et/ou mycorhizienne constituent de bons candidats à tester pour un rôle éventuel dans les autres symbioses racinaires.
La symbiose actinorhizienne
Les similitudes qui existent entre les symbioses rhizobium/légumineuses et actinorhizienne (l’implication de bactéries fixatrices d’azote, la mise en place d’un nouvel organe et l’infection intra- cellulaire…) suggèrent que des mécanismes communs pourraient exister. Toutefois, les récentes données de séquence montrent une différence notable entre ces deux symbioses, puisqu’elles indiquent l’absence de gènes nod chez Frankia (Normand, et al., 2007b). Les travaux récemment publiés par Gherbi et collaborateurs (2008) montrent que le gène CgSymRK, homologue de MtDMI2,
est impliqué dans la mise en place de la symbiose actinorhizienne (Gherbi, et al., 2008). En effet, l’inactivation de CgSymRK dans les racines de Casuarina glauca par RNAi entraine la formation de nodules actinorhiziens non fonctionnels, dont le développement a avorté et qui présentent très peu de cellules infectées (Fig54.). De plus, l’introduction de CgSymRK dans le mutant symrk-10 du lotier