Reconstitution en fausses couleurs de la concentration intracellulaire en calcium dans un poil absorbant suite au traitement aux facteurs Nod (10nM) (forte concentration en rouge ; faible en bleu) (1 image/seconde).
A : flux rapide de calcium : l’élévation de la concentration en calcium commence au niveau de l’apex du poil et diffuse vers le noyau ; il s’agit de l’entrée dans la cellule d’ions Ca2+ du milieu extracellulaire.
B : représentation d’un pic de calcium formé au cours du « calcium spiking », l’élévation de la concentration débute au niveau du noyau et diffuse ensuite dans le reste de la cellule ; des stocks intracellulaires en calcium doivent être sollicités pour ces mouvements.
Introduction
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al., 1996). Ces phénomènes, qui se déclenchent pour une concentration en facteurs Nod de l’ordre du nanomolaire, traduisent un influx de calcium à l’apex du poil absorbant accompagné par un efflux d’ions chlore et potassium (Felle, et al., 1996 ; Gehring, et al., 1997). Ces flux ioniques au niveau de la membrane plasmique sont suivis, une dizaine de minutes plus tard, par des oscillations périodiques de la concentration intracellulaire de calcium. Ces oscillations, appelées « calcium spiking », sont localisées dans le noyau et dans le cytoplasme entourant le noyau. Elles sont régulières et peuvent perdurer plusieurs heures (Ehrhardt, et al., 1996) ; elles requièrent pour se former une concentration en facteur Nod bien plus faible que pour l’influx rapide, de l’ordre du picomolaire. Ainsi deux réponses calciques se mettent en place dans le poil en réponse aux facteurs Nod, premièrement une entrée d’ions Ca2+ depuis l’extérieur créant "une vague" de calcium qui diffuse de la membrane vers
l’intérieur de la cellule, puis dans un deuxième temps "des vagues" successives d’ions calcium provenant de stocks intracellulaires et diffusant du noyau vers le reste de la cellule (Fig21. et Fig22. ; (Shaw and Long, 2003).
Quelques heures après l’ajout de facteurs Nod sur les racines, on observe des réponses de la plante au niveau tissulaire. Les facteurs Nod induisent un arrêt de la croissance apicale des poils absorbants, ce qui conduit à un gonflement de l’apex. Il se forme alors un nouveau site de croissance proche de l’extrémité du poil (de Ruijter, et al., 1998) entrainant un phénomène de branchement des poils absorbants (« root hair branching »). Il semble que ces déformations soient accompagnées par un réarrangement du cytosquelette du poil (Cárdenas, et al., 1998 ; Miller, et al., 1999). Ce phénomène de branchement des poils est observé lors de l’application de facteurs Nod purifiés. Au cours de l’infection par les rhizobium les facteurs Nod sont produits au niveau de la microcolonie bactérienne et la réorientation de la croissance qui est engendrée permet le recourbement du poil et l’enfermement des bactéries dans la poche d’infection.
Après quelques jours, les facteurs Nod induisent la dédifférenciation de certaines cellules corticales, initiant ainsi la mise en place du primordium nodulaire (Yang, et al., 1994). Parallèlement à cela, il a été observé que l’ajout de facteurs Nod influe sur le transcriptome racinaire, et induit en quelques heures l’expression de certains gènes de nodulines précoces (Fig20.)(Downie and Walker, 1999). Parmi ces gènes, le gène ENOD11 code pour une petite protéine riche en proline présentant des similitudes avec des protéines pariétales. L’étude de l’expression tissulaire de ce gène par l’intermédiaire du gène rapporteur de la β-glucuronidase (GUS), a révélé une activation très précoce
B
Fig23. Etude de l’expression spatio-temporelle du gène ENOD11
au cours de
l’établissement de la symbiose rhizobienne à l’aide d’une construction ENOD11p::GUS
A, 18h après inoculation par S. meliloti, les racines latérales montrent une coloration GUS épidermique au niveau de la zone de susceptibilité (barre=900μm)
B, 3 jours après inoculation, une coloration corticale est observée au niveau des sites d’infection abortifs (flèches) ; au niveau des jeunes nodules en développement le gène ENOD11 s’exprime dans les tissus corticaux mais également au niveau du primordium nodulaire (barre=250μm) C, 3 semaines après infection, la coupe longitudinale d’un nodule fixateur montre une coloration GUS au niveau de l’apex correspondant au méristème et à la zone d’infection (barre=200μm) D’après Journetet al., 2001
Introduction
35 au cours de l’établissement de la symbiose rhizobienne (Fig23.) (Journet, et al., 2001). Ainsi, ce gène
ENOD11 a été utilisé comme marqueur de la mise en place de la symbiose.
.3.1.3 Perception et transduction du signal NOD
Pour déclencher ces réponses chez la plante hôte les facteurs Nod doivent être perçus physiquement par les cellules de la racine par l’intermédiaire de récepteurs. De plus, l’information sur la présence dans l’environnement de la racine des facteurs Nod et donc du micro-symbiote, doit être transmise aux différents effecteurs qui mettront en place les réponses moléculaires et cellulaires nécessaires à l’établissement de la symbiose.
• Les plantes modèles pour l’étude des relations symbiotiques
La compréhension des mécanismes de perception et de transduction du signal Nod nécessitait le développement d’approches génétiques et génomiques. Or la plupart des légumineuses cultivées sont mal adaptées à ce type d’approche (allogamie, polyploïdie, grands génomes…).
Deux espèces de légumineuses ont donc été choisies simultanément comme modèles pour l’étude des symbioses : Medicago truncatula (luzerne annuelle) et Lotus japonicus (lotier) (Cook, 1999 ; Stougaard, 2001). L’intérêt du choix de deux plantes modèles réside dans la différence de type de nodulation de ces organismes. M. truncatula produit des nodules dits « indéterminés » car à croissance continue, alors que L. japonicus produit des nodules « déterminés » dont la croissance s’arrête une fois la nodosité formée.
Le caractère diploïde et autogame de ces deux espèces, la possibilité de les cultiver en laboratoire, leurs cycles de vie relativement courts (environ 3 mois de graine à graine) et les techniques de transformation disponibles (par Agrobacterium rhizogenes et A. tumefaciens) ont permis le développement d’approches génétiques. La construction de populations de mutants (EMS, rayons-γ, fast-neutrons, insertion de transposons) ainsi que des banques d’EST (« Expressed Sequence Tag ») et des puces à ADN recouvrant un large spectre de conditions physiologiques, ont été réalisées afin de faciliter ces études génétiques et de développer des moyens d’études transcriptomique puis
NFP DMI1 Division des cellules corticales DMI2 DMI3 NSP1 NSP2 Expression des gènes de nodulines Nodulation « Root hair swelling» « Root hair branching » Flux ioniques rapides Calcium spiking Formation du cordon d’infection Libération des bactéries