Spectrométrie de masse

(1)

Spectrométrie de masse

De la détection de petites molécules à l’analyse structurale de protéines

Cours – Spectrométrie de masse

Rabah Gahoual

Laboratoire Vecteurs pour l’imagerie et le ciblage thérapeutique Faculté de Pharmacie, Université Paris Descartes

rabah.gahoual@parisdescartes.fr

(2)

2

Sommaire

4. Application à l’étude de molécules d’origine biologique 1. Introduction à la spectrométrie de masse

 Principe

 Paramètres utilisés en spectrométrie de masse 2. Instruments de spectrométrie de masse

 Sources d’ionisation / Analyseurs de masse

 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

3. Couplage chromatographie – spectrométrie de masse

 Couplage GC-MS

 Couplage LC-MS(/MS)

(3)

3

• Couplage entre la chromatographie et la spectrométrie de masse présente différents intérêts :

Analyse de mélanges complexes Sensibilité de la détection

• Séparation chromatographique et spectrométrie de masse représente des techniques orthogonales (principes physico-chimique)

cohérence du couplage

Couplages chromatographiques

(4)

4

Couplages chromatographiques

• Spectromètre de masse effectue l’analyse de m/z en continue qui

génère une suite de spectres

(5)

5

Couplages chromatographiques

• Spectromètre de masse effectue l’analyse de m/z en continue qui

génère une suite de spectres

(6)

6

Couplages chromatographiques

• Spectromètre de masse effectue l’analyse de m/z en continue qui

génère une suite de spectres

(7)

7

Couplages chromatographiques

• Spectromètre de masse effectue l’analyse de m/z en continue qui

génère une suite de spectres reconstruction chromatogramme

(8)

8

Couplages chromatographiques

• Différents types de chromatogrammes sont générés à partir des données MS

intensité

m/z

(9)

9

Couplages chromatographiques

intensité

m/z

a) Courant ion total (total ion chromatogram TIC) : représente la somme des intensités des différents m/z détectés

• Différents types de chromatogrammes sont générés à partir des

données MS

(10)

10

Couplages chromatographiques

intensité

m/z

b) Base peak chromatogram BPC : l’intensité du composé le plus abondant à chaque instant

cpd #1 cpd #2

cpd #3

• Différents types de chromatogrammes sont générés à partir des

données MS

(11)

11

Couplages chromatographiques

intensité

m/z

c) Extracted ion chromatogram XIC : un seul m/z considéré

cpd #1 cpd #2

cpd #3

• Différents types de chromatogrammes sont générés à partir des

données MS

(12)

12

Couplage GC-MS

• Chromatographie en phase gazeuse (GC) permet la séparation de composés volatils

Volatilité composé (T

_eb

) Polarité

Sélectivité GC

• Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) apporte différentes caractéristiques

Sensibilité accrue

Identification composé

(13)

13

Couplage GC-MS

• Couplage GC-MS – Principe instrumental

Ligne de transfert maintenue à haute température pour éviter que les composés repassent à l’état liquide entre les deux instruments

(14)

14

Couplage GC-MS

• Couplage GC-MS – Instrumentation

 La source d’ionisation du spectromètre de masse doit être adaptée l’introduction d’échantillon en phase gazeuse

impact électronique (EI)

ionisation chimique (CI)

(15)

15

Couplage GC-MS

• Couplage GC-MS – Instrumentation

Quadripole balaie la gamme de rapport m/z analysée

105 77

51 121 43

m/z

(16)

16

Couplage GC-MS

• Couplage GC-MS – Instrumentation

Thermo Scientific ISQ GC-MS system Analyseur de masse quadripolaire

Agilent 7000D GC-MS system

Triple quadripole (quantification)

(17)

17

Couplage GC-MS

 Les stéroïdes sont des hormones, métabolites du cholestérol

Troubles hormonaux pouvant engendré certains syndromes

Kroneet al, J. Ster. Biochem. Mol. Bio. 121 (2010) 496–504

• Applications – analyse de stéroïdes

(18)

18

Couplage GC-MS

 Analyse de stéroïdes par GC-MS

Estrone

17-β-Estradiol

Testosterone

17-α-Ethynylestradiol

Progesterone

4.6 270

4.6 272

4.7 288

4.8 296

5.2 314

PerkinElmer Elite™ - 1 column (15 m x 0.25 mm ID) Gaz vecteur He (5mL/min)

Temp. injecteur / ligne transfert : 250°C Source MS : impact électronique Gamme m/z : 45 - 320

• Applications – analyse de stéroïdes

(19)

19

Couplage GC-MS

• Applications – analyse de stéroïdes

 Analyse de stéroïdes par GC-MS

M^+.

Progesterone

M = 341 g.mol^-1

(20)

20

Couplage GC-MS

• Applications – analyse d’explosifs volatiles

Gregory et al, J. Chrom. Sci., 49 (2011)

ZB-5MS ; 5% phenyl-arylene (5 m x 0.25 mm ID) Gaz vecteur He (2.8 mL/min)

Volume d’injection : 1 µL

Source MS : impact électronique

(21)

21

Couplage GC-MS

• Applications – analyse d’explosifs volatiles

Gregory et al, J. Chrom. Sci., 49 (2011)

Limite de détection réduite grâce sensibilité de l’analyse MS

ZB-5MS ; 5% phenyl-arylene (5 m x 0.25 mm ID) Gaz vecteur He (2.8 mL/min)

Volume d’injection : 1 µL

Source MS : impact électronique

(22)

Couplage GC-MS

• Applications GC-MS – Etude impact olfactif de composés

L’utilisation d’un gaz vecteur non toxique sans propriétés olfactives permet la mise en œuvre de ce type d’analyse

(23)

• Applications GC-MS – Etude impact olfactif de composés

Couplage GC-MS

(24)

• Applications GC-MS – Etude impact olfactif de composés

Couplage GC-MS

Agilent GC-olfactometry system

(25)

• Applications GC-MS – Etude impact olfactif de composés

Couplage GC-MS

(26)

26

Couplage LC-MS

• Chromatographie en phase liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse s’est rapidement imposée comme méthode de routine

• Potentiellement tous les modes chromatographiques sont

compatibles à l’utilisation en couplage avec spectrométrie de masse

(27)

27

Couplage LC-MS

• Chromatographie en phase liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse s’est rapidement imposée comme méthode de routine

• Potentiellement tous les modes chromatographiques sont compatibles à l’utilisation en couplage avec spectrométrie de masse

La quasi-totalité des analyses LC-MS réalisée en phase inverse

Sélectivité basée sur la polarité des composés

(28)

28

Couplage LC-MS

• Chromatographie en phase liquide (LC) permet la séparation de

composés non volatiles

(29)

29

Couplage LC-MS

• Couplage LC-MS – Instrumentation

(30)

30

Couplage LC-MS

• Couplage LC-MS – Instrumentation

 La phase mobile est un liquide il est indispensable d’utilisée une source d’ionisation permettant l’émission d’ions en phase gazeuse

électronébullisation / électrospray (ESI)

ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI)

(31)

31

Couplage LC-MS

• Ionisation par électronébulisation / électrospray (ESI)

(32)

32

Couplage LC-MS

• Couplage LC-MS – Instrumentation

 Les solvants composant la phase mobile doivent être suffisamment volatiles pour permettre l’émission des ions en phase gazeuse

FA : acide formique

TFA : acide tri-fluoroacétique

Système H

₂

O / ACN (0.1% FA ou 1% TFA)

Système H

₂

O / MeOH (0.1% FA ou 1% TFA)

(33)

33

Couplage LC-MS

• Couplage LC-MS – Instrumentation

 Les solvants composant la phase mobile doivent être suffisamment volatiles pour permettre l’émission des ions en phase gazeuse

Système H

₂

O / ACN (0.1% FA ou 1% TFA)

Système H

₂

O / MeOH (0.1% FA ou 1% TFA)

FA : acide formique

TFA : acide tri-fluoroacétique

Phases mobiles adaptées chromatographie en phase inverse

(34)

34

Couplage LC-MS

• Couplage LC-MS – Instrumentation

 Intérêts du couplage chromatographie liquide – spectrométrie de masse

Identification d’espèces non séparées par chromatographie

(35)

35

Couplage LC-MS

• Couplage LC-MS – Instrumentation

 Intérêts du couplage chromatographie liquide – spectrométrie de masse

Analyse de mélanges complexes

Identification d’espèces non séparées par chromatographie

quantification simultanée

(36)

36

Couplage LC-MS

• Couplage LC-MS – Instrumentation

Agilent 1120 MSD (HPLC-ESI-IT MS) Analyseur de masse trappe ionique

Thermo TSQ LC-MS/MS system Triple quadripole (quantification)

(37)

37

Couplage LC-MS

• Applications

C₁₈column (30 mm x 30 mm ID)

Mobile phase A : H₂O (0.1% acetic acid)

Mobile phase B : H₂O (0.1% acetic acid) / MeOH (25/75) Source MS : ESI ; analyseur : quadripôle

(38)

38

Couplage LC-MS

• Applications

Lattefet al, Am. Pharm. Rev., Jan 2015

(39)

39

Couplage LC-MS

• Applications

 Données MS permettent d’obtenir une quantification fiable et robuste sans séparation chromatographique complète

Lattefet al, Am. Pharm. Rev., Jan 2015

(40)

40

Introduction tandem MS

• La mesure directe du rapport m/z possède ses limitations : un exemple

Glycine 57.0

Alanine 71.1

Serine 87.1

Proline 97.1

Valine 99.1

Threonine 101.1

Cysteine 103.1

Leucine 113.2

Isoleucine 113.2 Asparagine 114.2 Aspartic acid 115.1

Glutamine 128.1

Lysine 128.2

Glutamic acid 129.1 Methionine 131.2

Histidine 137.1

Phenylalanine 147.2

Arginine 156.2

Tyrosine 163.2

Tryptophan 186.2

G-L-S-E-T-W-D-D-H-K = 1186.5 Da

K-H-D-D-W-T-E-S-L-G = 1186.5 Da

• Les acides aminés possèdent des masses molaires différentes pourtant l’aspect combinatoire peut induire des confusions

(41)

41

• Possibilité d’induire la fragmentation des molécules étudiées afin d’obtenir des informations supplémentaires sur l’analyte

Entrainer la rupture des liaisons par un apport d’énergie

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

(42)

42

Entrainer la rupture des liaisons par un apport d’énergie

• Possibilité d’induire la fragmentation des molécules étudiées afin d’obtenir des informations supplémentaires sur l’analyte

Fragmentation lors de l’ionisation (fragmentation in source)

Fragmentation après sélection (Tandem MS ou MS/MS)

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

(43)

43

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

• La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) consiste à induire la fragmentation des composés afin de déterminer le rapport m/z des fragments

Obtention d’informations supplémentaires

• En MS/MS, la fragmentation n’a pas lieu dans la source d’ionisation

Tandem in space MS

(44)

44

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

mesure m/z fragmentation mesure m/z fragments

(45)

45

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

ions parents ions fils

ions précurseurs ions produits

(46)

46

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

ions parents ions fils

permet de relier le rapport m/z de la molécule aux fragments

ions précurseurs ions produits

(47)

47

Fragmentation CID (MS/MS)

• Collision-induced dissociation (CID)

La fragmentation est provoquée par le collision entre l’ion parent et une molécule de gaz rare (azote, helium)

(48)

48

Fragmentation CID (MS/MS)

• La fragmentation CID permet d’atteindre des énergies de collisions allant de quelques eV jusqu’à une dizaine eV

• L’énergie de fragmentation peut-être adaptée en ajustant

 Énergie cinétique de l’ion parent

 Pression de gaz de collision

• Plusieurs collisions consécutives accumulation de l’énergie

(49)

49

Fragmentation CID (MS/MS)

• Fragmentation CID est le mode le plus communément utilisé en MS/MS

 énergie adaptée à large panel applications

 mise en œuvre et entretien

• Généralement l’état de charge (z) des fragments obtenus

 Égal à l’état de charge de l’ion parent

 État de charge (z -1)

(50)

50

Structure des protéines

• Fragmentation des peptides

acide aminés 1 acide aminés 2 acide aminés 3

La fragmentation CID d’un peptide génère presque exclusivement des ions y et b

Extrémité N-terminal

Extrémité C-terminal

(51)

Analyzing Biomolecular Interactions by Mass Spectrometry. Jeroen Kool and Wilfried Niessen Eds., 378pp, Wiley-VCH 2015 51

Fragmentation CID (MS/MS)

• Fragmentation CID de peptides

• La fragmentation CID d’un peptide génère presque exclusivement des ions y et b

• Fragmentation progressive de la chaine peptidique permettant le séquençage Séquençage de novo

(52)

52

Annotated MS–MS spectrum of the [Glu1]-fibrinopeptide [amino-acid sequence: EGVNDNEEGFFSAR], acquired on a Waters Q–TOF 2 instrument and processed using Waters BioLynx® software, part of the MassLynx suite. In the top spectrum the b-series are annotated, the bottom one the y-series.

Analyzing Biomolecular Interactions by Mass Spectrometry. Jeroen Kool and Wilfried Niessen Eds., 378pp, Wiley-VCH 2015

Fragmentation CID (MS/MS)

(53)

53

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

• Tandem MS – identification de peptides

1530.774

ESI-MS/MS (CID) (m/z 1677.822 ; 1+)

796.451

(54)

54

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

• Tandem MS – identification de peptides

1530.774

ESI-MS/MS (CID) (m/z 1677.822 ; 1+)

796.451

(55)

55

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

• Tandem MS – identification de peptides

1530.774

ESI-MS/MS (CID) (m/z 1677.822 ; 1+)

796.451

Glycine G 57.0

Alanine A 71.1

Serine S 87.1

Proline P 97.1

Valine V 99.1

Threonine T 101.1

Cysteine C 103.1

Leucine L 113.2

Isoleucine isoL 113.2

Asparagine N 114.2

Aspartic acid D 115.1

Glutamine Q 128.1

Lysine K 128.2

Glutamic acid E 129.1

Methionine M 131.2

Histidine H 137.1

Phenylalanine F 147.2

Arginine R 156.2

Tyrosine T 163.2

Tryptophan W 186.2

(56)

56

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

• Tandem MS – identification de peptides

1530.774

ESI-MS/MS (CID) (m/z 1677.822 ; 1+)

796.451

Glycine G 57.0

Alanine A 71.1

Serine S 87.1

Proline P 97.1

Valine V 99.1

Threonine T 101.1

Cysteine C 103.1

Leucine L 113.2

Asparagine N 114.2

Glutamine Q 128.1

Lysine K 128.2

Methionine M 131.2

Histidine H 137.1

Arginine R 156.2

Tyrosine T 163.2

Tryptophan W 186.2

(57)

57

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

• Tandem MS – identification de peptides

1530.774

ESI-MS/MS (CID) (m/z 1677.822 ; 1+)

Glycine G 57.0

Alanine A 71.1

Serine S 87.1

Proline P 97.1

Valine V 99.1

Threonine T 101.1

Cysteine C 103.1

Leucine L 113.2

Asparagine N 114.2

Glutamine Q 128.1

Lysine K 128.2

Methionine M 131.2

Histidine H 137.1

Arginine R 156.2

Tyrosine T 163.2

Tryptophan W 186.2

M (FNWYVDGVEVHNAK) = 1676,795 Da

796.451

(58)

58

Fragmentation CID (MS/MS)

EVQLVESGGGLVQPGGSLR

19 acides aminés ; M = 1880.9956 Da

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTK

63 acides aminés ; M = 6655.2857 Da

• L’énergie mise en jeu en CID est limitée => limite la taille des peptides fragmentés

(59)

59

Sommaire

4. Application à l’étude de molécules d’origine biologique 1. Introduction à la spectrométrie de masse

 Principe

 Paramètres utilisés en spectrométrie de masse 2. Instruments de spectrométrie de masse

 Sources d’ionisation / Analyseurs de masse

 Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

3. Couplage chromatographie – spectrométrie de masse

 Couplage GC-MS

 Couplage LC-MS(/MS)

(60)

Caractérisation par analyse MS

3

Analyse proteins intactes

• Glycoformes

• Aggregation

• Complexes prot./prot. (ligand)

(61)

61

• L’analyse MS de protéines entières permet d’étudier la structure tertiaire / quaternaire

• Permet également d’évaluer la pureté d’un échantillon => ex. contamination par d’autres protéines

Intéressant pour un contrôle rapide

Analyse de protéines entières

(62)

62

Analyse de protéines entières

• L’analyse de protéines entières peut être réalisée selon deux conditions

 Conditions dénaturantes

 Conditions pseudo-native (native MS)

Adapted from Kean University Biochemistry course

(63)

63

• Spectres de masse ESI-MS de protéines montre plusieurs états de charge

• Un échantillon peu complexe peut être injecté directement dans instrument MS

Analyse de protéines entières

Lysozyme 2 µM (H₂O/ ACN ; 0.1% formic acid) ESI-MS (TOF MS)

Injection directe : 5 µL/min

• Analyse MS uniquement (no MS/MS) permet de calculer la masse de la protéine

(64)

64

• Pour déterminer la masse exacte on considère 2 états de charge consécutifs

(m/z)

₁

= ⁽ ⁾

(m/z)

₂

= ^{( [} ^] ⁾

(M/z)₁ Z

z = 9

m = 14312.8 Da

(M/z)₂ Z - 1

Analyse de protéines entières

• Analyse MS uniquement (no MS/MS) permet de calculer la masse de la protéine

(65)

65

• Spectres de masse ESI-MS de protéines montre plusieurs états de charge

Analyse de protéines entières

9 +

10 +

11 +

8 +

7 +

• Analyse MS uniquement (no MS/MS) permet de calculer la masse de la protéine Identification de la protéine

m_exp = 14312.8 Da m_th = 14307 Da

(66)

66

• Analyse de protéines entières est généralement réalisée par injection directe

 Caractérisation d’isoformes

Glycoformes d’anticorps monoclonaux

Analyse de protéines entières

(67)

67

• Analyse MS d’anticorps monoclonaux (trastuzumab)

Analyse de protéines entières

49+ 48+

Masse moléculaire importante (148 kDa) => états de charge élevés

50+

(68)

68

Analyse de protéines entières

Pour chaque état de charge, on observe le signal de quatre glycoformes de l’anticorps

49+ 48+

50+

49+ 48+

50+

(69)

69

Analyse de protéines entières

Identification des différentes glycoformes de trastuzumab

49+ 48+

50+

Glycoforme identification M_th (Da) M_exp (Da)

Trastuzumab + (G0F/G0F) 148056.5 148058.8

(70)

70

• Analyse MS d’anticorps monoclonaux

Analyse de protéines entières

Possibilité d’évaluer la distribution des glycoformes en utilisant l’intensité du signal MS

49+ 48+

50+

(71)

71

Analyse de protéines entières

• L’analyse de protéines entières peut être réalisée selon deux conditions

 Conditions dénaturantes

 Conditions pseudo-native (native MS)

Adapted from Kean University Biochemistry course

(72)

72

Analyse MS en conditions natives

• Analyse MS en conditions natives offre la possibilité d’étudier des complexes non-covalents

• Requiert des conditions specifiques (purification, tampon non denaturant)

 Sensibilité réduite par rapport aux conditions dénaturantes

• Caractérisation de la protéine dans un état le plus proche possible par rapport échantillon

 Caractérisation de complexes prot./prot. ou prot./ligand

(73)

73

• Les spectres de masse obtenus en conditions natives sont différents

Conditions dénaturantes Conditions natives

 ex. Myglobine (17 kDa)

Analyse MS en conditions natives

(74)

74

21+

4070.3

0 10000

8000

6000

4000

2000

3885.4

4273.9

4498.9

Absoluteintensity(u.a.)

β-ring homodimer M_theo = 85 456.0 Da

Conditions :β ring sample (1 µM in 50 mM ammonium acetate pH 7)

Deconvoluted mass : 85,457.6 ± 1.8 Da

Detection du complexe protéine/protéine en conditions natives

Analyse MS en conditions natives

(75)

75

• Identification complexes β ring – P14 complexes avec different stoichiometries

3000 ³⁵⁰⁰ ⁴⁰⁰⁰ ⁴⁵⁰⁰ ⁵⁰⁰⁰ ⁵⁵⁰⁰ ^{6000 m/z}

Intens.

1000

800

400

200

0 1200

600

18+

3 profiles obtained

β ring

(M_calc = 85456 ± 1.1 Da)

β ring + 1 pep. cpx (M_calc = 86242 ± 1.5 Da)

β ring + 2 pep. cpx (M_calc = 87028 ± 0.8 Da)

• Mixture of pseudomonas β-ring 0,3 µM + 1,1 µM P14 peptide (785 Da)

Analyse MS en conditions natives

(76)

Caractérisation par analyse MS

3

Analyse niveau peptide

• Séquence acides aminés

• Glycosylations

• Modif. post-translational

(77)

77

Principe peptide mapping

• La caractérisation de protéines par peptide mapping se base sur la digestion de la protéine étudiée suivie d’une analyse LC-MS(/MS)

Alterlaar A.F.M. et al, Nat. Rev. Gen.2013, 14, 35-48

Digestion protéolytique

Protéine intacte Mélange peptides

Délivre une analyse poussée de la structure primaire de la protéine étudiée

(78)

78

Digestion protéolytique

• Les enzymes protéolytiques permettent la digestion (= découpage) au niveau d’acide aminés de manière spécifique

• A partir d’un échantillon contenant un ou plusieurs protéines, on génère un mélange de peptides

(79)

79

Digestion protéolytique

Enzyme name P4 P3 P2 P1 P1' P2'

Arg-C - - - R - -

Asp-N - - - - D -

- - - F or Y not P -

- - - W not M or P -

CNBr - - - M - -

LysC - - - K - -

Proteinase K - - - A,E,F,I,L,T,V,W or Y - -

Glu-C - - - E - -

Trypsin - - - K or R not P -

Chymotrypsin

• Il existe plusieurs dizaines d’enzymes qui diffèrent en terme de spécificité et cinétique de réactions notamment

(80)

80

Digestion protéolytique

Enzyme name P4 P3 P2 P1 P1' P2'

Arg-C - - - R - -

Asp-N - - - - D -

- - - F or Y not P -

- - - W not M or P -

CNBr - - - M - -

LysC - - - K - -

Proteinase K - - - A,E,F,I,L,T,V,W or Y - -

Glu-C - - - E - -

Chymotrypsin

• Il existe plusieurs dizaines d’enzymes qui diffèrent en terme de spécificité et cinétique de réactions notamment

(81)

81

Digestion protéolytique

 Hydrolyse en C-terminal des acides aminés basiques lysine (K) et arginine (R)

(82)

82

Digestion protéolytique

Séquence du granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

MAPTRSPITV TRPWKHVEAI KEALNLLDDM

PVTLNEEVEV VSNEFSFKKL TCVQTRLKIF

EQGLRGNFTK LKGALNMTAS YYQTYCPPTP

ETDCETQVTT YADFIDSLKT FLTDIPFECK

KPGQK

N-term. C-term.

(83)

83

Digestion protéolytique

Séquence du granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

MAPTRSPITV TRPWKHVEAI KEALNLLDDM

PVTLNEEVEV VSNEFSFKKL TCVQTRLKIF

EQGLRGNFTK LKGALNMTAS YYQTYCPPTP

ETDCETQVTT YADFIDSLKT FLTDIPFECK

KPGQK

N-term. C-term.

(84)

Peptide mapping workflow

In-solution tryptic digestion Peptide mixture analysis LC-MS/MS

Amino acid sequence characterization

PTMs hot spots characterization

Glycosylations (structure)

• Primary structure characterization workflow based on bottom-up proteomics strategy

69

(85)

85

Analyse LC-MS/MS

• Séparation du mélange de peptides par chromatographie en phase inverse

• Conditions analytiques permettent généralement l’analyse d’un mélange peu complexe en moins de 30 min

(86)

86

Analyse LC-MS/MS

• Peptide mapping de protéines par LC-MS/MS

696 697 698 699 700 701 702 703 704 705

697,4504

698,4528 696,3999

0 100%

50%

200 300 400 500 600 700

0%

50%

100%

460,2757 260,1950

147,1124

331,2361

559,3439 696,4076

K I A E V H

MS measurement (theoretical value 969.4039) Corresponding fragmentation MS spectra

• La caractérisation est basée sur l’analyse simultanée de la masse du peptide ainsi que de ces produits de fragmentation (MS/MS)

(87)

87

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

• Tandem MS – identification de peptides

1530.774

ESI-MS/MS (CID) (m/z 1677.822 ; 1+)

Glycine G 57.0

Alanine A 71.1

Serine S 87.1

Proline P 97.1

Valine V 99.1

Threonine T 101.1

Cysteine C 103.1

Leucine L 113.2

Asparagine N 114.2

Glutamine Q 128.1

Lysine K 128.2

Methionine M 131.2

Histidine H 137.1

Arginine R 156.2

Tyrosine T 163.2

Tryptophan W 186.2

M (FNWYVDGVEVHNAK) = 1676,795 Da

796.451

(88)

• MS/MS amino acid sequence characterization (trastuzumab)

70 variable domain

complementarity determining region constant domain

identified peptides

LC-MS/MS peptide mapping

Identification LC-MS/MS de l’ensemble des peptides générés par la digestion d’une protéine thérapeutique permet de confirmer sa séquence d’acides aminés

(89)

LC-MS/MS peptide mapping

Variable domain retraced on 120/120 AAs for the HC

Variable domain retraced on 105/107 AAs for the LC

L’exploitation des spectres MS/MS permet de déduire de manière précise l’enchainement d’acides aminés

71