Mémoire présente. de IœUniversite Laval pour I'obtention du "grade de maitre es sciences ( M.Sc. )

LDENTCFICATION DES RÉSIDUS IMPLIQUÉS DANS LA

CATALYSE CHEZ L~ENDONUCLEASE "HOMMG" CCreI

Mémoire présente

a la Faculté des études supérieures de IœUniversite ^Laval

pour I'obtention

du "grade de maitre es sciences ⁽ M.Sc. )

Département de biochimie

FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GÉME UNIVERsiTl? LAVAL

JANVIER 2000

NatioMC Liitary

1+1

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Les résidus D20 et Kg8 de i'endonucléase "homing" 1-CreI ont été étudiés quant a Ieur implication dans la catalyse. Lcs variants D20& D20E, K98A et K98R ont été générés par mutagénese dirigée, purifiés puis caractérisés. La variant D20A est compIètement inactif mais conserve sa capacité a lier la ^séquence de reconnaissance avec un KD 90 fois plus élevé que celui de l'enzyme sauvage et une affinité similaire en présence &ions

cazÇ

et M~'+. Le maintien de la charge négative chez le ^variant D20E

permet le clivage avec un Rmm Km* d'environ 10' fois plus petit que celui de 1-CreI sauvage et un Ko de 15 fois plus élevé. La charge positive du résidu K98 a été démontrée critique a ia catalyse, comme le montrent les valeurs de kmur Km* des variants K98A et K98R qui sont respectivement 10"et 10' fois plus petites que celle de I'enryme sauvage.

Ces résultats sont en accord général avec la structure cristalIographique de 1 - C i d et Ies

d e s proposés pour D2O et K98 dans le mécanisme de catalyse.

AVANT-PROPOS

Je tiens à remercier mon directew et ma codirectrke, Claude Lemieux et Monique Tunnel pour leur _soutien, ainsi que tous les membres du Iaboratoire. Parmi ceux-ci, j'aimerais adresser des remerciements particuliers à Christian Otis pour raide technique et à Dominique Boudreau pour les figures traitant des structures cristalIographiques Par la même occasion, _j'ofie mes remerciements aux membres de mon comité aviseur, Lindsay EItis et Anne Huietsky, pour la lecture critique de ce document.

vii

LISTE DES TABLEAUX

Page TabIeau 1: Comparaison entre les endonucIéases "homing" et les enymes de

. . ...

restnmon. 9

Tableau II: Compilation des endonucléases "homing" identifiées juqu'à présent.. ^{1 1} Tableau DI: Variants d e lrendonucléase 1-Cd.. ... 1 8 TabIeau N: Mfication des variants de I-CreL ... ^,.... 54

..

Tabieau V: Caractérisation des varÏants de I-CreI. ,.. ....,... 58

LISTE DES ABRÉVIATIONS ARNr = ARN ri'bosomique

C-ter ⁼ C-terminai db = double b~

DSBR = réparation double brin (double strand break repair) IGS ⁼ séquence guide interne (intemal guide sequence)

LSU = grande sous-unité (large subunit) nt = nucIéotide(s)

N-ter ⁼ N-terminai pb = @re de bases

SDS = sodium dodécy I sulfate

SDSA = synthèse dépendante de I'appariement des brins (qmthesisdependent strand annealing )

SDS-PAGE = éIectrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS

poIyacry Iamide gel electrophoresis) ufc = unite formatrice de colonies

INTRODUCTION

1.1 Les introas du groupe I

Les introns du groupe I sont présents chez les trois règnes biologiques et dans Ies wmpartiments celldaires tels que les mitochondries, les chloroplastes et le noyau Iis possèdent une structure secondaire e s consemée malgré un faible niveau d'homologie de séquence (Larnbowitz et Belfort, 1993). Cette stnicture est impliquée directement dans la réaction d'épissage. Elle consiste en une combinaison de longs et courts segments (L'ARN double brins dénommés P l à P 10 (Lambowitz et Belfort, 1993) (Figure 1). Les éléments P3 a P8 forment le noyau catalytique et les déments P 1 et P 1 O sont appariés aux extrémités des exons fl anquants I'intron Ces dernières hélices vont agir comme séquences guides (ES) en dictant le site d'épissage (Lambowitz et Belfort, 1993). Lautokpissage procède par deux réactions successives de transesténfication et nécessite I'apport de Adg'' (Cech, 1990). La première réaction est initiée par ^une guanosine, qui en attaquant I'atome de phosphore au site 5' d'épissage, fomte un lien phosphodiester avec le premier nucléotide de I'intron L'exon 5' possède maintenant un groupement hydroxyle libre qui anaque l'atome de phosphore de I'exon Y au site d'épissage. La résultante est la ligation des deux exons et I'excision de I'intron (Cech.

1990). Cette réaction e n reproductible ^{in vitro} mais nécessite parfois la présence de protéines suppIémentaïres comme les maturases (Larnbowîtz et Belfort, 1993).

Outre leur structure secondaire caractéristique, les introns du groupe I contiennent sowent ^des ORFs situés pour Ia plupart dans les boucles des héIices conservées. Ces ORFs codent rarement pour des protéines essentielles. IIs renferment plutôt des séquences traduites en protéines qui visent soit a I'épissage des Întrons [es contenant, soit a promouvoir la rnobiIité et la propagation de I'intron (Lambowk et BeIfort, 1993). On les nomne resptiventent les matumes et les endonuciéases "homing" ^(cenaines possèdent Ies deux

Figure ¹ : Structure caractéristique des introns du groupe 1. Les éIéments de stnichnes secondaires conservés sont notés P l à P9, I'élément PI0 étant a I'extrémité 3'. Les séquences conservées sont notées P,

Q,

R, S. Les sites d'épissage en _5' et 3' sont indiqués par les flèches (figure tirée de Cech et coll., 1990).

1.2 La mobilitk des introas du groupe 1

Le premier intron mobile (oméga, o) fut identifié dans ce- allèles de Sacchzromyces cerevisiae à I'intérieur du gène mitochondrid de la grande sous-unité de I'ARN nbosomique ( A N ) . Lorsqu'un allèle contenant I'intron (a+) _était mis en contact avec un allèle sans intron (a-), il y avait gah de I'intron chez ce dernier. La mobilisation de I'intron fut trouvée tributaire de I'expression d'me endonucléase codée par 170RF de I'intron o (Lambowitz, 1989). L'endonucléase "homïng" reconnaît un site spécifique chez I'diele récipiendaire, en bordure de l'insertion de I'intron. Depuis, maints ames exemples de ce phénomène ont été découverts, mais Ie processus de conversion génique demeure incertain. Deux hypothèses ont été retenues: le mécanisme de réparation double brin (DSBR) et la synthèse dépendante de ITappariement des brins (SDSA) (Belfon et Perlman, 1995).

La coupure double brin effectuée par I'endonucléase "homing" génère, dans la plupart des cas, une extrémité 3 W H protubérante de 4 nucléotides. Après dépdatior, des extrémités par des exonucléases 5'-3' et 3'-S', il ^y a alignement de séquence entre les brins receveurs et donneurs homologues. Ainsi, l'extrémité 3' de I'aIIeIe récipiendaire s'insurge dans le duplex donneur d'&on, puis agit comme amorce pour la synthèse et la réparation de I'ADN en formant une boude D. Le processus se termine par la Iigatîon et le clivage des jonctions HoIIiday au moyen d'une résoIvase (BeIfort et Perlman, 1995).

Ce mécanisme _de réparation doubk brin (DSBR) (Figure 2B) est fortement appuyé par la coconversion des marqueurs flanquant la séquence intronique de I'aIIèIe donneur (MueIIer et COIL, 1996). Par contre7 la synthése dépendante de l'appariement des brins (SDSA) (Figure 2B) potinait être un mécanîsme possible daris les cas où les jonctions HoIIiday ne sont pas formées _et donc qu'il n'y a pas d'activité résolvase. ni coconveni*on des marqueurs flanquant la séquence donneuse (MueDer et coiI. 1996, Beffort et Perhan,

1995).

des introns de group I et intéine. A) Mécanisme induite p la coupure double brin spécifique la Figure 2: Mécanrcanrsme de mobilité

général. La mobüité de l'introu est ^b

jonction exonique par I'endonucléase "homingl'. Le double brin d'ADN est ensuite réparé par recombinaison homologue avec la séquence de i'intron qui contient un cadre de lecture ouvert codant pour I'endonucléase "homing" (Figure tirw de Cooper et coll., 1995). Dans le cas des intéinesy ü y a traduction des exons et de i'intron pour donner un Iong précurseur protéique a partir duquel htéioe s'excise. L'endonucléase "homingl' obtenue, procède ensuite de la même manière que décrite ci-but. B) Mécanisme DSBR

a

SDSA de la réparation de I'ADN. Après clivage par I'endonucléase intronique (1) et dégradation des extrémités par des exonucléases (2), il y a invasion du dupIex contenant I'inaon par I'extrémité 3' de I'aIIèIe sans I'intron (3). Le mécanisme DSBR ^se fait par la formation d'une boucle D (4) par rapport au mecanÏsme SDSA qui procède par une

"buile" de réplication (4'). La synthése s'exécute dans les dew cas ( 5 et 5'). Dans le mécanisme DSBR, Ies jonctions HoiIiday sont formées (6) puis clivées par le biais dune résolvase (7). Pour le mécanisme SDSk Ie brin nouvellement synthétisé est libéré du duplex contenant I'intron (6') et sert de brin d'ADN gabarit pour la synthèse du brin opposé (7') (Figure tirée de MuelIer et coll., 1996).

lntron du groupe l lnîèine

Gan lnimr, E ~ F t i m ktmn Eacr

A) ADN

f ntron/

lnteine Horning

D'autres éléments génetiques sont rendus mobiles par leur capacité a encoder les endonucléases "homuig" : Ies introns de type iI, Ies intéines, les introns arch-ques et les gènes normaux (Sharma et col1.,1992). Pour les introns de type II, le processus complexe

de mobiIi'té, appelé "retrohoming", implique non seulement l'activité d'une endonucIéase, mais aussi celui d'une m a m e pour l'épissage et d'une activité de tramcriptase inverse Gskes et COU., 1997). Chez les intéines, un long précurseur protéique est obtenu a partir des exons de part et d'autre et de l'inîron te1 queI. L'intéine s'excise par un mécanisme autocatalytique et procède ensuite de la même façon que les endonucléases "homi*ngm encodées par les introns du groupe I (Figure 2 A)) (Cooper et

Stevens, 1995). Enfin, les introns archaiques sont sous la forme boucle-hélice-boucle.

Cette structure secondaire du transcrit sera reconnue par une endoninuclease et I'intron excisé sera subséquemment traduit en une endonucléase "homing" ( Lykke-Andenen et coll., 1997).

La nomenclature des endonucléases "horning" suit celle des enzymes de restriction. Ainsi, trois lettres désignent 1-organisme dans lequel la protéine est présente, la première désignant te genre et Ies deux suivantes, l'espèce. Un c h i f i romain suit, afin de pouvoir distinguer de quelle endonucléase il s'agit a I'intérieur du même organisme.

Pour préciser de quelle façon la protéine est encodée, on ajoute une lettre en suffixe: 1- pour intron, PI- pour intéine et N- pour gène normaux (Belfort et Roberts, 1997).

1.3 Le, endonucléases "homing"

Les endonucléases "horning" ont une activité semblable aux enzymes de outiI bien connu de la biologie rnoIécuIaire. Par contre, on remarque que leur

rôIe et certaines ~aracténs-tiques leur sont propres (TabIeau 0. Par exemple, Ies enzymes de restrîction om pour rôle de protéger les ceIIdes hôtes contre 17uitmsÏon d'ADN

&ranger. A cette fin, ces dernières sont équipées d'un système de modification, qui par le biais d'une activité méthyltransferase, prévient la destruction de leur génome et dirige ['action de I'endonucléase vers I'ADN des bactériophages potentiels (Pingoud et kItsh

1997). Les endonucIéases "homingIf, quant à eIIes, initient un processus de recombinaison qui mène B la propagation de I'htron dans L'espèce. Toutefois, iI n'a pas été démontré clairement que Ia présence de cet inûon procure un avantage évolutif a ITorgauisme (E3eifort et Roberts, 1997)-

On peut aussi noter maintes différences en ce qui a trait aux sites de reconnatnnatssance respectifs des deux types &endonucIéases+ Premièrement, la taille de cette séquence est plus imposante chez les endonucléases "homing" (12 à 40 pb), que

chez les enzymes de restriction (3 à 8 pb) (Mueller et coll., 1993). En second Iiey les endonucléases "horning" tolèrent un certain niveau de dégénérescence dans leur site de reconnaissance. De plus, ce dernier est de type pdindromique chez les endonucléases de restriction. Les endonucléases "homing" possédent généralement une grande asymétrie dans leur séquence spécifique (Belfort et Roberts, 1997).

Les endonucléases introniques sont représentées dans les trois règnes biologiques, c'est-à-dire chez Ies archaeobactéries, les eubactéries et les eucaryotes, oii elles peuvent être encodées par le génome nucléaire? mitochondriai ^OU chioroplastique. Par opposition, les enzymes de restriction sont présentes chez les bactéries et certains virus eucaryotiques (Belfort et Roberts, 1997).

La même variabilité s'observe pour la forme active adoptée par les endonucléases introniques. En effet, eIIes sont observées sous forme monornérique, homodi-merique ou même n~nucléoprotéique, 17ARN faisant partie intégrale du site cataiytiique (Beffort et Roberts, 1997). Pour les enymes de restriction, la fonne active est habituellement i'homodimére. MaIgré ces différences, l'activité cataiytique des endonucléases "horningw nécessitent le ~ g ? comme cofacteur, Ie même que chez les enzymes de restriction

(Muekr et COU., 1993). ce qui mggère un mécanisme catdytique semblable.

On peut diviser les endonucléases "homÏngW en ^qyatre familles sdon Ie motif en acides aminés consemé présent chez chacune d'eIles: LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H et

Tableau 1. Comparaison entre les endonucléases "homing" et les enzymes de restriction.

(Tableau tiré de BeIfon et Roberts, 1997)

Caraaen'stiques Endonucléase "homing" Enzymes de restriction Motifs protéiques conservés i. LAGUDADG Aucun motif précis

ii. G I Y X G iii. H-N-H

iv. His-Cys

Cofacteur

MC-

M ~ =

Séquence de reconnaissance a Longue ( 12-40 pb) a Courte (3-8 pb)

b. Asymétrique b. Symétrique et asymétrique c. ToIerante a de légères c. Spécifique

mutations

la boîte H i e s (BeIfort et Roberts, 1997). Puisque ces motifs sont bien conservés, ils auraient un r6Ie possible dans la catalyse et/ou la reconnaissance. Les endonucIéases comportant _{le motif} de type LAGLIDADG sont les mieux connues suite aux travaux effectués entre autres sur 17endonucIéase PISceI. L'importance du motif LAGLiDADG fiit étudiée par Ie remplacement du dernier résidu aspartate du motif conserve, présent en deux copies, par des résidus alanines. Tous les mutants liaient leur séquence de reconnaissance avec la même affinité que le type sauvage. Néanmoins, chacune de ces substitutions éliminait 17activité catdytique chez L'endonucléase "homing" (Gimble et Stephens, 1995). Des résultats semblables ont été obtenus pour les résidus homologues de

1-Cie[, lors dune analyse génétique (Seligman et colI., 1997). Un rôle additionnel fut atûiiue a ce motif, puisque les structures cristailographiques de ces deux endonucléases

"homing" ont révélé que les six premiers résidus du motif agissent dans le repliement des structures de i-Crel et de Pi-Scei (Heath et COIL, 1997: Duan et cotl., 1997).

Pour le motif GIY-YIG, les études effectuées avec I'endonucléase intronique 1- Tevl du phage T4 démontrent l'importance du motif conserve pour la cata-se. L ' e q m e

possède deux domaines: le domaine en C-terminal renferme une région essentielle à la reconnaissance et le domaine en N-terminal posséderait l'activité catalytique. Les deus triades du motif GIY-YIG sont séparées par I O ou I I résidus d'acides aminés a une portÏon de séquence située de part et d'autre est également fort conservée. Or. la substitution d'un résidu arginine conservé dans cette séquence inactive totalement l'enzyme (Derbyshire et coll., 1997). 11 est a noter que contrairement aux autres

endonucléases "horning", 1-Ta1 génère une extrémité protubérante de 2 nucléotides en 3'OH (Mueller et coll., 1995).

Les deux demien motifs, H-N-H et la boîte His-Cys, sont présents chez une petite fiaction des endonucléases "homingt' caractérisées _jusqu'à maintenad Notre laboratoire a tenté d'en savoir plus sur le motif conservé H-N-H- La mutagénèse dirigée du premier tésidu histidme de ce motic vers une alanine, prévient la liaison de i'enzyme à

Tableam IL CompÏIation des endonucléases "horning" identifiées ^jusqu'a présent (tire de Belfort et Roberts, ^- - - - . - I f 997l - ,

Nom Organismea Règne Localisation FamiiIe

A A, nidulum Eucaryote Mitochondrie _LAGLIDADG

C eugametos

C. hunticolu C. palldostignra C.pallidostg??tu

C. reinbdtii

C. smitfiii Di. idridis Di. mobilis

B. subtih phage SPO 1

B. subtzlis phage SP82

L. factis

N. andersuni sp.

andersoui

Pyb. Organotophum P h Polycephalum S .capenris

S. cerevisiae S. cerevisiae S. cerevzsiue S. cerevisiae Sc cerevisiue

S, cerevzsiae

S, cerevisiae E coli phage T4 E. col1 phage T4 E coli phage RB3

PF p. GB-D S. cerevtsiae T, litoraiis Tl liturals S cerevisiae S, cerevisicre S, uvrnum

E. coli phage T4

Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Archeobactérie Eubactérie Eubactérie Eubactérie Eucaryote Archeobactérie Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eubactérie Eubacterie Eu bactérie

Archeobactérie Eucaryote Archeobactérie Archeo bactérie Eucaryote Eucaryote Eucaryote Eubactérie

Chioropïaste C hioroplaste Chloroplaste Chloroplaste ChIoroplaste Mitochondrie Noyau

Chromosome Phage

Phage

Chromosome Noyau

Chromosome Noyau

Mitochondrie Mitochondrie Mitochondrie Mitochondrie Mitochondrie Mitoc hondne Mitochondn'e Mitochondrie Phage

Phage Phage

Chromosome Chromosome Chromosome Chromosome Mitochondrie Noyau

Phage

LAGLIDADG LAGLIDADG LAGLIDADG LAGLIDADG LAGLIDADG LAGLlDADG His-Cys LAGuDAIXi H-WH

H-N-H H-N-H His-Cy s LAGLJDADG His-Cy s LAGLIDADG LAGLIDADG LAGLIDADG LAGLTnADG LAGLIDADG H-N-H

H-N-H

LAGLDADG

GIY-YIG GiY-WG K-N-H

LAGLDADG LAGLIDADG LAGLIDADG LAGLIDADG LAGLJDADG LAGLIDADG LAGLLDADG GIY-MG N-Tm11 E coli phage T4 Eubactérie Phage GE-YIG

a ~ s p m g i l C ~ ; B. Bucifft(s; C, Chllllllydomo~; Di, Didymium; De. D e s u I ~ o c ~ ~ ~ t ( ~ ; E,

Ia séquence de reconnaÏssance de L'enzyme sauvage, œ qui suggère que ce résidu joue un r61e clé dans la fonction de 1-CmoeI (M. Drouin, C. Lemieux et UTurmeI, ^résultats non- publiés). Enfin, la boîte His-Cys est composé de trois résidus cystéine et deux résidus histidine dans une région conservée couvrant une trentaine d'acides aminés. La structure de 1-PpoI associée à sa séquence de ceconnaissance a été déterminée à 1,8

A

de résolution (FIick et coll., 1998). Les résidus histidine et cystéine conservés de l'homodimère ont été trouvés responsables de la liaison de deux ions 2nZ" dans chacun des monomères. Ces structures sous forme de doigts de zinc seraient impliquées dans fa stabilisation de la structure de 1-PpoL En outre, le résidu H98, conservé chez les trois endonucléases introniques, aurait possiblement un ^r6le dans la catalyse.

1.4 L'endonuclhe int rouique 1-CreI

i'endonucléase 1-( ?el est présente chez C 'Idum_r,Jo~omonus r~~p~hurdt~r ^et possède une seule copie du motif conservé LAGLIDADG. L'intron du groupe I qui l'encode est situé ^à I'inténeur du gene 23s de I'ARNr dans le génome chloroplastique. Deux copies de ce gène, sous forme de répétitions inversées, sont présentes dans chaque molècule d'ADN chloropIastique, ces dernières étant au nombre vanable de 60 a 80 par chloroplaste (Aliet et Rochaix, 1979). En 1985, Rochaix et coll. ont trouvé un cadre de lecture ouvert dans I0intron et ont suggéré que ce dernier pourrait ètre traduit en un po lypeptide de 163 acides aminés. 11 faudra attendre en 199 1 pour que Dünenberger et Rochaix démontrent [*activité endonucléase "homing" de 1-CmI. L'étude démontre que Iorsque le cDNA du gene 23s est inch a un site ectopique a l'intérieur du génome

~hlompla~que, tous les transformants acquièrent une noweIle copie de I'intron à cette position. De p l y en utilisant un système d'expression in vivo chez E. colt à ['aide de deux plasmides, I'un exprimant Ie cadre de lecture ouvert de Iïntron ribosomique et I'am contenant le substrat cDNA du gene 23S, 11s mettent en évidence la linéarisation du plasmide contenant Ie site de coupure putafif, après induclion de I'expression du cadre de iecîure O w e n Le site de cIivage est identifié comme étant a la jonction des exons.

Figure 3: Séquence de reconnaissance de 1-CreL La position d'insertion de I'intron est indiquée par le symbole

v

^et l'endroit de clivage par un trait noir. Le cIivage double brin de I'ADN laisse une protubérance en 3'4H de 4 nt Les bases où l'on rem- une symétrie de part et d'autre du site de coupure sont en caractère gras tandis que celles considérées importantes pour la reconnatnnatssance du substrat par l'enzyme sont ombragées.

La portion de séquence protégée par ICA, selon des expériences de protection à la DNaseI, est soulignée de tiret (Wang et coll., 1997).

Des travaux ultérieurs ont mené à la cartographie plus précise du site de coupure dans le substrat de 1-CreI. IL se situe à 5 pb en aval du site Ginsemon de l'intron nrr le b~ codant L'extrémité résultante porte une protuberance en 3'-OH de 4 nucléotides, teUe que retrouvee chez les autres endonucléases "homing" de type LAGLIDADG étudiées préalablement (Figure 3) (Thompson et coll., 1992). En outre, Ies résultats démontrent que la taille de la séquence de recomaissatlce est d'au plus 24 pb. En 1993, Diinenberger et Rochaix ont publié indépendamment des resdtats similaires sur la position exacte du site de clivage, en précisant que la longueur minimale de la séquence de recom*ssance est de 19 pb et que I'enzyme tolère des mutations simples et même doubles a I'intérieur de celle-ci (Rochaix et Dmenberger, 1993).

Par la suite, le mécanisme de recombinaison chloroplastique chez Chiamydomonas reinhordrii fit en partie élucide (Dùrrenberger et coll., 1996). Tel que mentionne auparavant, la coupure double brin produite par [-Ciel e n nécessaire à la propagation de I'intron chez l'organisme.

1.5 CaractCNation biochimique de 1-CreI uuvage

La caractérisation de 1-CreI et de son substrat ont révélé pIusiem caractéristiques de Senryme. Wang et coll. (I997) ont pun*fié puis testé I'activité de 1 - C i d en fai'sant varier les conditions telles la concentration en ions, la température et le pK La taille de 1- CreI en soiution fut évaiuée a 36 kDa par chromatographie d'exclusion, confimiam la forme dimerique en solution L'enyme p t d k e fut aussi testée pour sa stabilité à 37T.

Ces essais démontrent que I'enzyme est relativement instable en soIution ^avec seulement 20% d'activité résÏdue1Ie après 40 minutes d'incubation Si on additionne Ie cofacteur

MC

durant la période d'incubation, cette valeur chute à 10%. Par _contre* le simple ajout d'ADN cible ou non-cible dans la soIiibion de pré-incubation prévient de façon miportante I'inactivation, avec 90% de I'activité de départ préservée aprés 70 miautes d'incubation Chez I-SceI, L'ajout d'ADN plamidique contenant un site de recodssance

muté améliore la stabilité de i'enqme en soIution. Néanmoins, aucun effet notable n'est remarqué avec de I'ADN non-spécifique (Monteiihet et colL, 1990).

Dans les mesures d'activité, une caractéristique intéressante de 1-CreI a été mise en évidence: i'enryme ne relâche pas ses produits de coupure. Elle reste fortement attachée a c e m i , de sorte qu'il faut employer un agent dénaturant comme le SDS afin d'évaluer quantitativement son activité. Ce phénomène a déjii été observé chez plusieurs autres endonucIëases "homing". En effet, il a été démontré que 1-TwII, IScei, PISceI et I-Ceul partagent cette propriété (Loizos et coll., 1996; Pemn et coll., 1993; Wende et coll., 1996; Lemieux et COIL, résultats non-pubIiés). iI _a été suggéré qu'il puisse s'agir d'un mécanisme prévenant la dégradation _des extrémités par les exonucléases, pour ainsi promouvoir la réparation subséquente de l'ADN (Loizos et coII., 1996).

En ce qui concerne les conditions optimales pour l'activité de 1-CreI, Ie ''M~ fut trouvé essentiel au clivage du substrat. Toutefois, la liaison spécifique de l'enzyme à l'ADN se fait en I'absence du cofacteur. Cette propriété est aussi partagée par un bon nombre d'enzymes de restriction et d'endonucIéases "homing" (Pingoud et Jeltsh, 1997;

Vipond et coII., 1995). Les concentrations optimales de M~~~ se situent entre 5 et 10 rnM.

Lorsque Ia concentration dépasse la ^borne supérieure, on observe un certain degré d'inhibition de I'enyme. D'ailleurs, iI en va de même pour l'ajout d'ions monovalents.

Le NaCI en très faible quantité améliore subtilement Ie niveau d'activité de 1-CreI. Par contre, il devient un inhibiteur efficace à pIus haute concentration. Le même phénomène est observé chez 1-PpoI et cette inhibition e n priacipiilexnent due à une diminution de l'affinité de l'enzyme pour sa séquence de reconnaissance, pouvant srexpliquer par I'aprégation des protéines en solution (Wittmayer et Raines, 1996). Toujours seIoa Wang et colI. (1993, Ie ~n", le

Mn'C

et le

ca2+

ont été évdués quant a Ieur capacité à jouer Le rôle de cofacteur pour I'activité de I-CreL SeuI le

m2+

mène a la formation de produits de coupure.

il est surprenant de noter que la température optimale pour i'acfivité de ICrel se

situe aux aientours de 50

T.

De pius, I-CreI possède une activité maximale dans un large éventail de pH, soit entre 7 et 9. Des épreuves de protection du substrat par Ia protéine a la digestion par la DNaseI, ont démontni que I-CreI se lie fortement ^à son substrat sur une distance de 12 nt soit des positions -7 a +5 sur chaque brin, protégeant autant le sillon mineur que le siIIon majeur (Figure 3).

1.6 Étude de variants de I-CreI

Seligman et coII. (1997) ont utiiisé un système génétique complexe chez E. coli dans le but d'étudier tant des mutations de la protéine que du substrat Cette étude a mené i I'isolement de piusiem variants de 1-CreI qui retiennent peu ou pas d'activité. Ceux-ci ont été évaiués selon trois paramètres: la toxicité, l'activité et la dominance (Tableau

III).

Tous les variants démontrent un niveau de toxicité qui se caractérise par la présence de petites colonies avec une fome irrégulière. L'activité, quant à elle, a été déterminée d'après la rétention de la résistance a la kanamycine puisque ce gène était intégré dans un plasmide ou Ia séquence de reconnaissance de 1-CreI était présente. Ainsi, le clivage de la

séquence de reconnaissance par 1-CreI, détruit la résinance et permet de discerner les variants actifs de cew ne possédant pas d'activité. Enfui, la domiriance de la mutation a été étudiée par la coexpression du variant et de I'enzyme sauvage, chacun formant supposément une sous-unité de I'homodimère. et de l'activité ^en résultant Notons la présence de variants à quatre positions intéressantes: D20, K98, R5 ₁ et 447. Selon les structures cristalIographiques de 1-CreI disponibIes, ces &idus seraient impliqués dans la

catdyse (Section 1.8). Ceux-ci ont été classés comme étant des variants ne possédant pas

d'activité tout en demeurant toxiques pour E. coli Iorsqu'ils sont surproduits. II est aussi intéressant de remarquer que tous Ies variants isoiés qui ne possèdent pas d'activité ont leur mutation située dans les deux premiers tiers _de la protéine. Ceci indiqye que cette portion de séquence contient les acides aminés nécessaires à Ia catalyse de I'ADN double brin de même que Ies résidus essentiels B Ia reconnaissance du substrat

Tableau i l L Variants de L'endonucléase 1-Crel (Tableau tiré de Seligman et coll., 1997)

Séquence Toxicité' ~ctivité~ Dominance'

S22A + ^-i-t NA

a ++, +,

-

^indique respectivement des colonies de tailles et d'une apparence normale, des colonies petites et de formes irréguiières et I'absence de cdonie sur milieu arabinose.

b. ++, +,

-

in- respectivement la présence d'activité sans arabinose, active après ajout darabinose et inactive après ajout drarabinose, le gène de 1-CreI étant sous Ie contrÔIe du promoteur mal.

c. NA, non-appIicabIe.

1-7 Études de variants au site de reconnaissance de 1-CreI

Pour ce qui ^est des études e f f m é e s sur le substrat, cinq paires de bases ont été trouvées importantes pour la reconnaissance par 1-CreL La substitution de chacune des paires de bases -7, -4, 1, 2 et 4 prévient la coupun par 1-CreI sauvage en condition de concentration équimoIaire (Figure 3). Par contre en excès d'enzyme par rapport au substrat, ces substitutions dans la séquence ne préviement pas le clivage par I'e~lzyme- On note aussi que la mutation de fa pb +I et fa doubfe mutation +2 et 4 mène a Ia libération des produits par I'enzynie, sans la nécessité d l ajouter du SDS (Selipan et coll., 1997).

Une dewieme étude traitant de la degénérescence du substrat a utilisé une stratégie différente pour générer des variants aux sites de reconnaissance de 1-PpoI et de 1-Crel (Argast et col1.. 1998). Par la construction d'une banque de plasmides contenant le site de reconnaissance de ISreI, de nombreux variants ont été produits pour être évalués quant à Ieur sensibilité a être clivés par 1-CreI. Ils ont ensuite été distribues en deux groupes &on Ieur dépendance au SDS pour le reIichement des produits de coupure.

Pour Ies vm-ants SDSdépendants, les paires de bases ne pouvant tolérer un grand niveau de dégénérescence sont:-I l 7 4, -3, -2, +2, +3, ^{+4, +S,} +8 et +9. Pour les variants SDS- indépendants Ies positions -10, +3, +4, +5, +7 et +9 ont été trouvées non-substituabIes pour obtenir une efficacité de cIivage cornparabte. On a pu ainsi déterminer que les positions ou aucune dégénérescence ^ne donne un clivage comparable à la ^séquence d'origine, et ce peu importe In conditions, sont aux positions +3, +4, +S et +9 (Figure 3).

La prem-ère structure dispomibIe d'uae endonucléase "homingn, fut ceIIe de 1- CreL La cristaiIogénèse a été &is& sur la protéine compIète en absence des ions

MC

et du nibstrat (Stephens et COU., ^1997). La structure cristallographÏque, déterminée à une résofimoo de 3

A,

montre que I'homodimere de 163 acides aminés par sous-imité

possède une topologie d B et une taille approximative de 25 A ^>t 25

A

x 70

A

(Heath et coll., 1997). Les résidus I l 3-123 et 139-1 63 de l'enzyme, ainsi que les résidus retiant les baneaux BI et 82 ne sont pas visibles, probablement parce qu'ils sont désordonnés dans le cristal (Heath et coll., 1997). Tout récemment la structure cristalIographique de 1-Cd a 3.0

A

de résolution, avec les ions caZ+ et son site de reconnaissance de 24 pb a été publiée (Jurica et coll., 1998). Notons que les ions

caZC

permettent la Iiaison spécifique de I'endonucléase a sa séquence de reconnaissance sans permettre la coupure de I'ADN db (Wang et coll., 1997). La liaison de l'enzyme à son substrat amène quelques modifications dans la structure obtenue au départ. Ainsi les résidus 29 à 37 reliant le

barreau B I a 02 de méme qu'une large portion en C-ter deviennent ordonnes suite aux contacts qu'ils effectuent avec la séquence de reconnaissance. Seul les 10 derniers résidus

( 153-163) demeurent désordonnés. Loaqu'on compare les deux structures, la portion en N-ter qui contient le site catalytrque, reste pratiquement inchangée. Toutefois, de nombreuses informations sont maintenant disponibles sur la reconnaissance du submat par l'enzyme, la coordination des ions

M&'

et le mécanisme catalytique.

Pour la liaison de l'enzyme a son substrat, on remarque un large feuillet B de 4 barreaux couvant le site de reconnaissance de 22 pb. De façon générale, 1-Cie1 contacte le substrat par le sillon majeur pour attaquer les deux brins par le sillon mineur (Jurica et coll., 1998). La première structure disponible laissait supposer qu'il n'y avait pas de déformation du substrat mite à la fixation de I'enzyrne (Heath et coll., 1997). Or celui-ci est légèrement recourbé avec moins de 10" par rapport à la surface de liaison de la protéine. Le diamètre du feuillet l3 est de 18

A

et les baneaux le constituant se tordent pour pemietûe 12 contacts directs, c . 4 4 sans l'intermédiaire d'une molécule d'eau, ntr

9 pb avec chacun des monoméres. Ce& sont sur les bases +3 à +11 avec pIusÏeurs Iiem remarqués sur les bases +3, +5 et +9. Draprés les eîudes génétiques effectuées sur la séquence de reconnaissance de I-CreI. ces paires de bases seraient parmi les mieux consen&s (Argast et wII., 1998) (Figure 3). Ailleurs, on constate la présence d'un seul

Iien hydrogène ou d'un sed Iien electrostatr'que entre I'enzyme et chaque base de l'ADN.

ce qui donne a la protéine sa fl exr-bfiité et sa tderance envers 1e changement d'me paire

Fipre 4: Structure cristalIographique de 1-CreI Iié à son substrat en présence de ~ a ? A)

Vue perpendiculaire à l'axe de symétrie entre Ies monomères. Les structures secondaires tek les barreaux

D

sont représentés en vert et contactent la séquence de reconnaissance sur une Iongueur minhaie de 20 pb, les hélices formant un noyau hydrophobe sont montrées en rouge. On peut discerner les 2 ions caiciums à I'échelIe. a l'extrémité des heiices a formant i'interface de dimérisation, coI1Sfituiées des acides amin& du motif conservé LAGLIDADG et le double brin d'ADN coIoré en bleu B) Le site catdytique

d'un monomère de I-CieL Les résidus potentiellement impliqués dans la catalyse, de même que I'ion caL+ (rose) sont montres. D20,Q47, R51 et Kg8 figurent respectivement en vioIet, orange, rouge et jaune. Seul le résidu K98 provient du monomère opposé. La double hélice d'ADN est représentée sous forme simplifiée (brins gris), excepté sur une courte distance ou elle est sous forme de bâtonnets changeant du bleu marin au bleu cyan à l'endroit de clivage. Deux molécules d'eau sont présentées ainsi que les liens effectués entre les résidus et I'ADN (vert). C) Les résidus K98 et D20 de chacun des monomères de 1-CreI. Les structures secondaires comportant les résidus K98 (jaune) et D20 (bleu cyan) de chacun des monomères sont montrées, Ies hélices a étant en rouge et les barreaux D en

vert Les ions ~ a ' " sont représentes par de petites sphéres roses et sont pointés par des flèches pour permettre plus de visibilité. Les figures ont été créées au moyen du IogÎciel Swiss PDB Viewer à partir des domées structuraies extraites de la Protein Data Bank (Jtnica et coll., 1998).

de base dans sa séquence de reconnaissance. Encore une fois, compatibles avec Ies études d'interférence par méthylation du

ces données sont subsûat et ceiles concemant le niveau de dégénérescence (Wang et coII., 1997; Argast et coii., 199%). On observe aussi 6 interactions non-spécifiques dont l'me est effectuée avec le résidu K98.

Ces interactions non-spécifiques se caractérisent par la formation d'un lien électrostatique entre un acide aminé qui porte une charge positive et un groupement phosphate de l'ADN. Enfin, aux extrémités et entre Ies phosphates scissibles, il ne sembIerait pas y avoir de liens directs avec la protéine. Notons que les résidus R70, R68 et 438 font plus d'un contact avec la séquence de reconnaissance. De part et d'autre de ce feuillet on remarque cinq hélices a Celles-ci sont compactées contre un côté du feuillet et forme un noyau hydrophobe. Le motif LAGLIDADG, ou plus exactement L1AGFVDGD20G pour 1-CreI, se retrouve dans la portion C-ter de I'héIice a l et le début du premier barreau B. Les hélices al et al' produisent I'intediace du dimère. Les interactions maintenant les deux sous-unités sembleraient ètre de type van der Waals, car le motif contient de petits acides aminés hydrophobes.

Avant Ia disponibilité de la structure de 1-Cm1 avec son site "homing", la présence des résidus D20 de chaque monomère, tout près des phosphates scissibles, laissait supposer qu'il pouvait s'agir des éléments coordonnant le seul ion M~'' _du site actif.

N h o i n s , selon les nouvelles données, iI y aurait non seulement deux ions au(x) site@) actiqs), mais chacun de ceuxci seraient cwrdinés par au moins 5 éléments de stnictwe.

Ainsi, le résidu D20 dm monomère, un oxygène provenant du groupement phosphate scissiile, un autre oxygène s h é dans le sillon mineur7 Ie groupement carbonyle du résidu G19 provenant du monomère oppose et au moins une moIécuIe d'eau maintenue dans le site actif par le résidu

447,

cotlstitueraient l'ensemble des éIements impIiquCs dans la coordination d b ion (Figure 4B). Évidemment, les mêmes élhents -ent fournis par les monomères opposés pour Ia coordination du second ion, Pour cornphiter le site catdytique~ ie&) résidu(s) K98 euou RZ1 de chaque monomère pourraï(en)t agir comme

acide de Levis en stabdisant Mat de transition pentavaknt, te1 qttobsenie chez Ies

enymes de restrîctÏon. Bref, il y aurait pcobabIement deux sites acbifs, dus ^{à la} présence

des deux ions

ca2+

et donc deux mécanismes catdytiques distincts pour la coupure de chacun des brhs a l'endroit de clivage.

La dimérisation est un déterminant Emportant de la capacité de ICreI a Lier sa longue séquence de reconnaissance. Si on regarde attentivement cette séquence, on s'aperçoit que sans être @aitement paIindromïque, elle contient de nombreux éIéments de symetrie (Figure 3). De plus, la ^symétrie du dimère suggère qu'il est sans _doute possible p u r I-CreI de reconnatatre un substrat entièrement pdindromique. Or, d'après des résultats préliminaires, l'enzyme posséderait une activité et une affinité plus grande sinon semblable avec ce type de substrat (Heath et cou., 1997).

1.9 Stmcture de PIISceI: et caractérîsatioo de mutants au site actif

La structure aistaiIographique d'me autre endonucléase "homing" LAGLDDADG a été déterminée a une résolution de 2,4

A

(Duan et coll., 1997). L'intéine ^PISceI contient deux domaines dont I'activité est très différente. Le monomère contient un domaine (domaine 1) servant à I'épissage de la protéine de son précurseur protéique. On a assigné I'activité endonucléasique au second (domaine

II),

qui tout comme ECTeI, possède une topologie ^dB. Ces deux endonucléases partagent de nombreuses caractéristiques structwales dans ce domaine avec une déviation mis de 2.0

A

sur 120 des 200 Ca partageant une topologie similaire, et ce, maigre une homoIogie de séqwnce de 27% (Gimble et coll., 1998). Chez PISceI, chacun des motifs conservés se retrouve en C-ter d'une hélice a et ceIIes-ci sont juxtaposées paraIIèIement de la même manière que chez I-CreL Ainsi, il est possible de tracer un axe de symétrie divisant le domaine II en deux sous-stnictures, notées N et C sousdomaine, comspondant à chacun des monomères retrouvés chez 1 - C d Ceci suggère que ces domaines de I-Crel et PI-SceI ont CvoIue à partir d'un ancêtre commun par duplication en tandem d'im monomère de 1-CreI et d'un sousdomaine de PISceI (Gimble et COIL, 1998). De plus, PI-SceI utiIiseraÎt une stratégie de fiaison a l'ADN semblable a I-CreI pour Ie domahe endonucIéasique avec son large feuiIIet

D

a 7 bat~eaux (He et coll., 1998; Duan et COIL, 1997). Toutefois, la

liaison de PI-SceI se fat en deux temps, puisque le domaine 1 se Iie a une région de la séquence et le domaine II se lie a la portion immediaternent adjacente. Ainsi, il est possibIe de mes- deux constantes de dissociation différentes pour PIScel.

La superposition des structures de I-CreI et PI-SceI a permis à Gimble et coll.

(1998) de prédire les résidus potentiellement impliqués dans la catalyse. Les résidus D218

a

D326 ont été identifiés comme étant homologues aux résidus D20 de chaque monomère de KreL Selon les données de la première structure de 1-CreI, I'espacement de ces deux aspartates du motif L A G L D m Ies plaçait dans une position idéde pour la coordination de l'ion

MC

( ~ e a t h et coll., 1997). L'hypothèse de Duan et coll. ⁽ 1997) fut Ia mème pour I'enyme PI-SceI, d'autant plus que des études par mutagénèse dingèe confirmaient deja I'importance de ces résidus (Gimble, F.S. et Stephens, B. W., 1995). En effet, chacun de ces aspanates avait été substitué par une alanine, une asparagine et un résidu glutamate. De ces van-ants, seul D326E générait des produits de coupure. Cela laisse sous-entendre l'importance du groupement carboxylique de ce résidu pour I'activité de PI-SceI. Dans un deuxième temps, tous conservaient leur capacité a se lier à Ieur séquence "homing". Au moyen d'expériences de protection du substrat par I'enzyme a la dégradation par la DNasd, iI a été trouvé que les variants D218E et D326A protégeaient leur séquence 2 à 3 fois moins que l'enzyme de type sauvage. Par contre, la mesure _de l'affinité par gel de retardement ne traduisait pas cette diminution dans les contacts ADN- protéine. Cela peut s'avérer compréhensible, puisque a I'origine de cene étude, la Iiaison séquentielle de I'endonucléase, c.-à-d. aux domaines 1 et II, n'était pas connue. Deux autres résidus chez PlSceI qui trouvent Ieurs homologues chez 1-CreI, poumient être impliqués daris Ia cataiyse. ïi s'agit de K30 1 et de K403 correspondant aux résidus K98 de chacun des monomères de I-CreL Ceux-ci ont aussi fait l'objet d'étude par mutagénkse dirigée chez PISceI (He et colI. 1998; Gimble et cou. 1998). Le résidu K301 a été substituée par une alanine, une arginine

a

un résidu glutamate. En utilisant le

MC

comme cofacteur, Ie variant K30IR £Ùt Ie x u I à démontrer une activité endoaucléasique, mais près de 2OX pIus faible que chez i'eazyme sauvage. Par contre, Ion du remplacement du cofacteur par k

Md+,

l'activité fut détectabk cher Ies trois variants

Figure 5: Homologie des structures de PISceI et I-CleI A) Structure crktailographique de PI-SceL Les barreaux

B

figurent en vert et les hélices a sont colorées en bleu. Les deux domaines de PI-SceI sont présentés sur cette figure, le domaine 1 étant constitué EPUW grande majorité de baneaux B est nsporisabIe de l'excision de PI-SceI du Iong précuneur protéique

a

le domaine II posséde une topologie dB nécessaire à l'activité endonucIéasiqpe. Figure créée au moyen du logiciel Swiss PDB Viewer à partir de la

sûucture dispontile (Duan et COIL, 1997).

B)

Superposition des stnictures de PISceI (bleu) et _I-Crel (jaune et or) sous l'axe de symétrie des monomères. Le N-sousdomaine (haut) et le C-sous-domaine (bas) de I'endonucléase PISceI et chacun des moaomèm de 1-CreI sont montrés. Les résidus D2I8 et K30 1 du N-sousdomaine et les résidus D326 et K403 du C-sousdomaine sont homologues au résidu D20 et au résidu Kg8 de 1-CreI de chaque monomère. C) Même superposition des deux structures qu'en B) avec une rotation de 90" par rapport à un axe horizontal pour une vue sous Ie feuillet B des résidus conservés. (Figures B et C tirées de Gimble et coll., 1998)