Le génome d% colt contient plusieurs sites de reconnaissance propres a I-CieI, ce qui en fait un gene toxique pour la ceIIde h6te (Wang et coll., 1997). Les vecteurs de type pET sont sous le contr6Ie du promoteur T7, lui-même régde par I'opérateur lac.
Ainsi, grâce au contrôle strict exercé sur I'expression du gène clone, on obtient un niveau d'expression relativement devé des variants de 1-CreI, suite a Ifinduction par I'IPTG. On observe un niveau d'expression moindre chez I'enzyme sawage, sans doute dû a la toxicité pius éIevée. D'aiIIeurs, pour obtenir des cultures viables de ISreI sawage et des mutants plus actifs te1 D20E et K98K il s'est révéIé parfiois nécessaire d'abaisser la température d'incubation a 30°C plutôt que 37°C. Malgré uu niveau d'expression un peu pIus faible chez les variants K98R et D20E, soit environ 75% de ceux des variants K98A
a
D20A, I'ensernbIe des étapes de pdcation a montré un patron similaire sur SDS- PAGE. Puisque I'ensembie des étapes de purification de tous Ies variants se présente comme L'enzyme sawage, ceci suggère que Ies doubles mutationsT c-à-d les mutations dans chacune des sous-mitésT n'ont pas affecté la conformation native de la protéine-Figure 9: AnaIyse SDS-PAGE (12%) des étapes de purification du variant D20A Des échantiilons Wvalant à 100 pl de la culture ceoulaire de départ ont été prélevés en cours de purification. Les puits 1 à 10 contiennent respectivement, 1) la culture cellulaire avant induction et 2) aprés induchi 3) les protéines solubies du Iysat et 4) Ie culot (protéines insolubles) après passage à Ia Presse de French, 5) I'éluat de Ia &ine Ni-NTA, 6) les lavages à 20 et 7) 40 mM d'iinidazole, 8) la fkcîion p d é e de 100 pi et 9 ) 1 ml après protéoiyse par 17enteroLinase et enfin 10) 17éIuat de la Rsine Ni-NTA avec 250 m M
imidazole. Les puits MI, M2 et M3 sont ceux des marqueurs de poids moléculaire. Le gel a été révélé au Bleu de Coomassie,
La figure 9 présente une expérience typique de purification réalisée avec le variant D20A Suite à la lyse des cellules a la presse de French et a la centn'fugation du lysac on note une excellente solubilité de I-CreI, telle qu'indiqué par la forte bande présente dans la fiaction soluble du lysat et en contrepartie de très faibie quantité dans le culot Par contre* on rencontre des pextes importantes dans 17éIuat, après passage sur résine de N?'.
Afin d'éliminer les protéines fixées de façon non-spécifique à la résine* on procède à des lavages avec de Cimidazole B ZDmMet 40 mM L'étape suivante consiste a cliver la queue de pdyhistidine par l'entérokinase recombinante, directement sur la résine. On observe qu'une large proportion de I-CreI débanassé de la queue de polyhimdine reste sur la résine malgré les nombreux lavages effectués. De pius, le clivage avec SU d'entérokinase recombinante ne permet pas de cliver la totalité de protéines recombinantes, comme le démontre la fraction d'elution avec de I'irnidazole à 250 mM. A la lumière de ces résultats, un essai fut effectué pour le clivage de la queue de polyhistidine en solution, par I'entérokinase. Avec le même nombre d'unité enzymatique, il y avait présence de bandes a des poids moléculaires inférieurs a celui de 1-CkeI sauvage sur SDS-PAGE, traduisant la présence de variants tronques dans fa solution de protéine purifiée.
Les concentrations en protéines purifiées finent mesurées au moyen de la trousse MicroBCA Protein assay Ragent (Pierce). Les plus hauts rendements obtenus en protéines clivées à partir de 400 ml de milieu de culture pour chacun des variant étaient de 0,640 mg pour le variant D20k 0,530 mg pour K 9 8 A 0,445 et 0,250 mg pour D70E
et K98R respectivement (Tableau IV). On note une grande fluctuation des rendements
obtenus dans des expériences indépendantes de puritkation d'un même variant
3 3 Détermination de ia constante d'équilibre Ko
L'ajout d'ions
caL'
favorise la formation d'un complexe entre 1-Cie1 et sa séquence de reconnatnnatssance sans toutefois permettre le clivage du substrat par I'enyme.Cette caractétistique est observée chez p h s i e u enzymes de restriction et d'endonucIéase
"homing" (Pingoud et Jeltsch, 1997; Belfort et Robert, 1997) et permet de déterminer la constante d'affinité des vm-anp de 1-CreL D'autre pan, chez les mutants ne comportant
Tableau N. Purification des variants de 1-CreI
Variant de 1-Crel Concentration (mg/ml) Volume (mi) Quantité (mg)
D20A 0,6 70 0,955 0,640
0,240 i ,O 50 0,250
DZOE 0,380 1,170 0,445
K98A 0,320 1,170 0,370
0,290 0,825 0,240
0,540 0,980 0,530
0,290 1,090 0,3 l O
K98R 0,240 1,040 0,250
pas d'activité, la mesure d'affinité peut être réalisée avec des ions
MC,
comme ce fiit le cas chez D20A-Des concentrations variables du variant D20E ont été incubées avec me concentration foce de substrat (Figure 10). Les essais sont menés a température ambiante sur une période de 20 min, pour que la réaction atteigne L'équilibre. Après migration des échantillons à 4OC dans un gel de polyacrylamide, I'image obtenue par
"Phosphorirnagin~ permet de quantifier la radioactivité du substrat marqué au
p3
dans le complexe ADN-protéine et du substrat non-lie. Par la suite. le programme Kaieidagaphe est utilisé pour tracer les -mphiques, dont un exemple typique e n montré.L'erreur moyenne sur les mesures indépendantes du KD des variants est de 14%. Cette
mesures, cette différence serait non-significative. Par conne, notons que la vaIeur de ki, obtenue avec l'ion
MC
est plus faible que celle obtenue avec l'ion ~ a ' - dans les dem expériences utilisant les ions parallèlement Donc il y aurait une réelle prèference de l'ion divalent M$ par rapport à l'ion ca'' pour la formation du complexe ADN-protéine.Cependant puisque la différence entre les valeurs de KD est faible, on peut conclure que les ions ~ a " peuvent être substitués aux ion M~'+ pour induire la formation du complexe
avec une efficacité diminuée mais semblable.
Le changement d'un résidu chargé vers un résidu neutre, chez D2OA et K98A entraîne des valeurs de KD d'environ 90 fois et 40 fois respectivement la valeur du KD de l'enzyme sauvage. Lorsque cette charge est conservée, chez les D20E
a
K98R on observe une plus grande affinité, coffespondant 4 une valeur de 15 fois et 6 fois plusélevée que la valeur de KD de I'e-e sauvage.
F i r e IO: Mesure de I'affinite du variant D20E. A) Ge1 de polyacrylamide 5% d'un essai
sur gel de retardement effectué avec le variam D2OE. Des concentrations vm-ables de protéines indiquées au haut de chacun des puits ont été incubées dans du tampon de retardement
1X
(Tris-HCI 50 mM, pH 8,5. C a 2 1 mM, DTT 1 mM)a
du giycérol IO%, 0.05 pglpi de polydIdC, 0,I pdpI de BSA, en présence de 7,s pM de substrat marqué par intégration de adCTp3]. Les bandes conespondent au substrat (S)a
au complexe protéine-substrat (PtS). B) Mesure de i'affinité de D20E en presence de 7,s pM de substrat et 1 mM de ~ g ? La courbe de la concentration de protéine liée en fonction de la concentration de protéine libre a été tracée par corrélation avec I'équation (3) (Section 2.6) au moyen du logiciel Kaiéidagraphe.Tableau V. Caractérisation des variants de I-Crel
Enzyme "f=o(nM) ~ m ' k m KM' k,, Activité
(PM) ( p ~ * ' m i l ' ) (min*') relativeh
Type 0-05 I 0,0 13 03 1 -L 0.001 s 1 2 5 0-03 I 0.001 1 sauvagec
a Constante de dissociation mesrnée en présence de 1 mM de
caL-
en triplicata.b. k i rfi' de I'erüryme muté ! kmcrr ~m'de I'enqme sauvage.
c. Lemieux et coll., résultats non-publiés.
CL Des essais menés a 800 n M de protéine pendant 360 min ne démontrent aucune trace d'activité.
e. Mesure du KD effectue en présence 1 rnM de ~ ~ ~ + e r t duplicata
E Mesure de i'activité approximative; évduation de Ia constante de premier ordre par Ia concentration & substrat résiduelle aux temps IO min d o n I'equation ~ = ~ o e h
3.4 Comportement des variants de Ia position 98 en absence de poly-dIdC
Pour la mesure des Ka iI est nécessaire d'ajouter de 1'ADN dont les séquences ne sont pas recomues par 1-Crel, pour éviter la formation de cornpIexes non-spécifiques. Le poIy-cUdC agit comme competiteur, dirigeant ainsi la formation du complexe a la Sequeme spécifique. Chez I-CreI sauvage, I'omissioa d'ADN non-spécifique mène au résultat montré a la figure 11. Ainsi, on observe plusieurs bandes sur gel de retardement,
Unportante de L'endonucléase "homing" I-CreI. En effet, contrairement a la majorité des enymes, 1-Crel a une nés grande &nité pour ses produits de coupure, de sorte que ceux-ci w sont pas libérés par I'eayme, qui n'est donc pas regénérée pour un clivage successif de l'ADN. Afin d'effectuer des mesures adéquates des paramétres cinétiques, le
modèle mathématique développé par M o r d et colI. (1979 et 1980) fut employé. Ce