La caractérisation de 1-CreI et de son substrat ont révélé pIusiem caractéristiques de Senryme. Wang et coll. (I997) ont pun*fié puis testé I'activité de 1 - C i d en fai'sant varier les conditions telles la concentration en ions, la température et le pK La taille de 1- CreI en soiution fut évaiuée a 36 kDa par chromatographie d'exclusion, confimiam la forme dimerique en solution L'enyme p t d k e fut aussi testée pour sa stabilité à 37T.
Ces essais démontrent que I'enzyme est relativement instable en soIution avec seulement 20% d'activité résÏdue1Ie après 40 minutes d'incubation Si on additionne Ie cofacteur
MC
durant la période d'incubation, cette valeur chute à 10%. Par contre* le simple ajout d'ADN cible ou non-cible dans la soIiibion de pré-incubation prévient de façon miportante I'inactivation, avec 90% de I'activité de départ préservée aprés 70 miautes d'incubation Chez I-SceI, L'ajout d'ADN plamidique contenant un site de recodssancemuté améliore la stabilité de i'enqme en soIution. Néanmoins, aucun effet notable n'est remarqué avec de I'ADN non-spécifique (Monteiihet et colL, 1990).
Dans les mesures d'activité, une caractéristique intéressante de 1-CreI a été mise en évidence: i'enryme ne relâche pas ses produits de coupure. Elle reste fortement attachée a c e m i , de sorte qu'il faut employer un agent dénaturant comme le SDS afin d'évaluer quantitativement son activité. Ce phénomène a déjii été observé chez plusieurs autres endonucIëases "homing". En effet, il a été démontré que 1-TwII, IScei, PISceI et I-Ceul partagent cette propriété (Loizos et coll., 1996; Pemn et coll., 1993; Wende et coll., 1996; Lemieux et COIL, résultats non-pubIiés). iI a été suggéré qu'il puisse s'agir d'un mécanisme prévenant la dégradation des extrémités par les exonucléases, pour ainsi promouvoir la réparation subséquente de l'ADN (Loizos et coII., 1996).
En ce qui concerne les conditions optimales pour l'activité de 1-CreI, Ie ''M~ fut trouvé essentiel au clivage du substrat. Toutefois, la liaison spécifique de l'enzyme à l'ADN se fait en I'absence du cofacteur. Cette propriété est aussi partagée par un bon nombre d'enzymes de restriction et d'endonucIéases "homing" (Pingoud et Jeltsh, 1997;
Vipond et coII., 1995). Les concentrations optimales de M~~~ se situent entre 5 et 10 rnM.
Lorsque Ia concentration dépasse la borne supérieure, on observe un certain degré d'inhibition de I'enyme. D'ailleurs, iI en va de même pour l'ajout d'ions monovalents.
Le NaCI en très faible quantité améliore subtilement Ie niveau d'activité de 1-CreI. Par contre, il devient un inhibiteur efficace à pIus haute concentration. Le même phénomène est observé chez 1-PpoI et cette inhibition e n priacipiilexnent due à une diminution de l'affinité de l'enzyme pour sa séquence de reconnaissance, pouvant srexpliquer par I'aprégation des protéines en solution (Wittmayer et Raines, 1996). Toujours seIoa Wang et colI. (1993, Ie ~n", le
Mn'C
et leca2+
ont été évdués quant a Ieur capacité à jouer Le rôle de cofacteur pour I'activité de I-CreL SeuI lem2+
mène a la formation de produits de coupure.il est surprenant de noter que la température optimale pour i'acfivité de ICrel se i I'isolement de piusiem variants de 1-CreI qui retiennent peu ou pas d'activité. Ceux-ci ont été évaiués selon trois paramètres: la toxicité, l'activité et la dominance (Tableau
III).
Tous les variants démontrent un niveau de toxicité qui se caractérise par la présence de petites colonies avec une fome irrégulière. L'activité, quant à elle, a été déterminée d'après la rétention de la résistance a la kanamycine puisque ce gène était intégré dans un plasmide ou Ia séquence de reconnaissance de 1-CreI était présente. Ainsi, le clivage de la
séquence de reconnaissance par 1-CreI, détruit la résinance et permet de discerner les variants actifs de cew ne possédant pas d'activité. Enfui, la domiriance de la mutation a été étudiée par la coexpression du variant et de I'enzyme sauvage, chacun formant supposément une sous-unité de I'homodimère. et de l'activité en résultant Notons la présence de variants à quatre positions intéressantes: D20, K98, R5 1 et 447. Selon les structures cristalIographiques de 1-CreI disponibIes, ces &idus seraient impliqués dans la
catdyse (Section 1.8). Ceux-ci ont été classés comme étant des variants ne possédant pas
d'activité tout en demeurant toxiques pour E. coli Iorsqu'ils sont surproduits. II est aussi intéressant de remarquer que tous Ies variants isoiés qui ne possèdent pas d'activité ont leur mutation située dans les deux premiers tiers de la protéine. Ceci indiqye que cette portion de séquence contient les acides aminés nécessaires à Ia catalyse de I'ADN double brin de même que Ies résidus essentiels B Ia reconnaissance du substrat
Tableau i l L Variants de L'endonucléase 1-Crel (Tableau tiré de Seligman et coll., 1997)
Séquence Toxicité' ~ctivité~ Dominance'
S22A + -i-t NA
a ++, +,
-
indique respectivement des colonies de tailles et d'une apparence normale, des colonies petites et de formes irréguiières et I'absence de cdonie sur milieu arabinose.b. ++, +,
-
in- respectivement la présence d'activité sans arabinose, active après ajout darabinose et inactive après ajout drarabinose, le gène de 1-CreI étant sous Ie contrÔIe du promoteur mal.c. NA, non-appIicabIe.
1-7 Études de variants au site de reconnaissance de 1-CreI
Pour ce qui est des études e f f m é e s sur le substrat, cinq paires de bases ont été trouvées importantes pour la reconnaissance par 1-CreL La substitution de chacune des paires de bases -7, -4, 1, 2 et 4 prévient la coupun par 1-CreI sauvage en condition de concentration équimoIaire (Figure 3). Par contre en excès d'enzyme par rapport au substrat, ces substitutions dans la séquence ne préviement pas le clivage par I'e~lzyme- On note aussi que la mutation de fa pb +I et fa doubfe mutation +2 et 4 mène a Ia libération des produits par I'enzynie, sans la nécessité d l ajouter du SDS (Selipan et coll., 1997).
Une dewieme étude traitant de la degénérescence du substrat a utilisé une stratégie différente pour générer des variants aux sites de reconnaissance de 1-PpoI et de 1-Crel (Argast et col1.. 1998). Par la construction d'une banque de plasmides contenant le site de reconnaissance de ISreI, de nombreux variants ont été produits pour être évalués quant à Ieur sensibilité a être clivés par 1-CreI. Ils ont ensuite été distribues en deux groupes &on Ieur dépendance au SDS pour le reIichement des produits de coupure.
Pour Ies vm-ants SDSdépendants, les paires de bases ne pouvant tolérer un grand niveau de dégénérescence sont:-I l 7 4, -3, -2, +2, +3, +4, +S, +8 et +9. Pour les variants SDS- indépendants Ies positions -10, +3, +4, +5, +7 et +9 ont été trouvées non-substituabIes pour obtenir une efficacité de cIivage cornparabte. On a pu ainsi déterminer que les positions ou aucune dégénérescence ne donne un clivage comparable à la séquence d'origine, et ce peu importe In conditions, sont aux positions +3, +4, +S et +9 (Figure 3).
La prem-ère structure dispomibIe d'uae endonucléase "homingn, fut ceIIe de 1- CreL La cristaiIogénèse a été &is& sur la protéine compIète en absence des ions
MC
et du nibstrat (Stephens et COU., 1997). La structure cristallographÏque, déterminée à une résofimoo de 3
A,
montre que I'homodimere de 163 acides aminés par sous-imitépossède une topologie d B et une taille approximative de 25 A >t 25
A
x 70A
(Heath et coll., 1997). Les résidus I l 3-123 et 139-1 63 de l'enzyme, ainsi que les résidus retiant les baneaux BI et 82 ne sont pas visibles, probablement parce qu'ils sont désordonnés dans le cristal (Heath et coll., 1997). Tout récemment la structure cristalIographique de 1-Cd a 3.0A
de résolution, avec les ions caZ+ et son site de reconnaissance de 24 pb a été publiée (Jurica et coll., 1998). Notons que les ionscaZC
permettent la Iiaison spécifique de I'endonucléase a sa séquence de reconnaissance sans permettre la coupure de I'ADN db (Wang et coll., 1997). La liaison de l'enzyme à son substrat amène quelques modifications dans la structure obtenue au départ. Ainsi les résidus 29 à 37 reliant lebarreau B I a 02 de méme qu'une large portion en C-ter deviennent ordonnes suite aux contacts qu'ils effectuent avec la séquence de reconnaissance. Seul les 10 derniers résidus
( 153-163) demeurent désordonnés. Loaqu'on compare les deux structures, la portion en N-ter qui contient le site catalytrque, reste pratiquement inchangée. Toutefois, de nombreuses informations sont maintenant disponibles sur la reconnaissance du submat par l'enzyme, la coordination des ions
M&'
et le mécanisme catalytique.Pour la liaison de l'enzyme a son substrat, on remarque un large feuillet B de 4 barreaux couvant le site de reconnaissance de 22 pb. De façon générale, 1-Cie1 contacte le substrat par le sillon majeur pour attaquer les deux brins par le sillon mineur (Jurica et coll., 1998). La première structure disponible laissait supposer qu'il n'y avait pas de déformation du substrat mite à la fixation de I'enzyrne (Heath et coll., 1997). Or celui-ci est légèrement recourbé avec moins de 10" par rapport à la surface de liaison de la
Iien hydrogène ou d'un sed Iien electrostatr'que entre I'enzyme et chaque base de l'ADN.
ce qui donne a la protéine sa fl exr-bfiité et sa tderance envers 1e changement d'me paire