Stéphane EGEE - Maître de conférence Enseignant chercheur UPMC PRESENTATION DU PATCH MONOCANAL SUR GLOBULE ROUGE HUMAIN Station Biologique de Roscoff

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Stéphane EGEE - Maître de conférence – Enseignant chercheur UPMC PRESENTATION DU PATCH MONOCANAL SUR GLOBULE ROUGE HUMAIN

Station Biologique de Roscoff - 21 mars 2018

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STRUCTURE MOLECULAIRE DE LA MEMBRANE

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DIFFERENTS CANAUX DU GLOBULE ROUGE

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PRINCIPE DU PATCH-CLAMP: ISOLER UN SEUL CANAL

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PRINCIPE DU PATCH-CLAMP : IMPOSER U MESURER I

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IMPOSER TENSION MESURER COURANT

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LE CANAL POTASSIQUE DU GLOBULE ROUGE

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NEHER –SAKMANN PRIX NOBEL POUR LE PATCH-CLAMP

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NEHER –SAKMANN PRIX NOBEL 1991 POUR PATCH-CLAMP

Enregistrement des 1^ers courants ioniques sur patch de fibre musculaire de grenouille

Neher et Sakmann en 1976

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ETIREMENT DU CAPILLAIRE EN DEUX MICROPIPETTE DE PATCH

Tube en verre creux (capillaire) Etirement par chauffage

Injection électrolyte K⁺ 150 mM Micropipette prête à l’emploi Absence de bulle d’air

Etireuse de tube capillaire

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APPAREIL A ETIRER A CHAUD LES MICROPIPETTES

Micropipette de diamètre 0,5 à 5 µm selon micro ou macropatch Micropipette étirée et coupée

à chaud (Etireuse programmable)

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MICROPIPETTE DE PATCH FINE CREUSE ET CHARGEE -

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MICROPIPETTE DE PATCH FINE CREUSE ET CHARGEE -

Micropipette avec bleu de méthylène vue de profil x 5,9

Micropipette de macropatch vue de face au MEB x 10 000

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GLOBULES ROUGES HUMAINS

Globules rouges humains, cellule anucléée en forme de disque biconcave

Globules rouges humains MO x 800

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PREPARATION DES GLOBULES ROUGES HUMAINS

Eppendorf avec globules rouges humains à 37°C

Milieu de culture des globules rouges : K⁺, glucose

Réducteur avec 10 µL de GR dans 400 µL de milieu

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POSTE DE PATCH-CLAMP

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AmplificateurRK-400

Vimposé Imesuré

Tête de mesure

DAT enregistreur Oscilloscope GOULD

I mesuré

Filtre Bessel CED

Microordinateur de type PC

Stockage et traitement des données obtenues

POSTE DE PATCH-CLAMP

Ecran suivi vidéo

MO inversé

Table sur coussin d’air

Cage de Faraday

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OPTIQUE ET TETE DE MESURE DU POSTE DE PATCH-CLAMP

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UNITE MICROPIPETTE– ELECTRODE - CELLULES

Microscope inversé x800 Micromanipulateur avec micropipette de patch

Boîte de Pétri avec globules rouges Electrode de référence

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REGLAGES DE LA TETE DE MESURE ET DU MICROSCOPE

Présentation de la micropipette à proximité des globules rouges

Descente de la micropipette avec le micromanipulateur

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OPTIQUE ET TETE DE MESURE DU POSTE DE PATCH-CLAMP

Présentation de la tête de mesure Mise en place de la tête de mesure Réglage optique

Tête et optique réglées Micropipette et électrode dans suspension Micropipette sur un GR

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UNITE OPTIQUE ET TETE DE MESURE

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MATHILDE AUX MANETTES POUR DESCENTE ET COLLAGE

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TRISTAN AUX MANETTES POUR DESCENTE ET COLLAGE

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L’OSCILLOSCOPE IMPOSE VOLTAGE MESURE TENSION

Oscilloscope Voltage imposé Voltage imposé

Courant mesuré Courant K+ à travers un canal

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APPROCHER LA MICROPIPETTE D’UN GLOBULE ROUGE

Micropipette ouverture

1 µm Globule rouge 8 µm

Echinocyte GR disque

anucléé biconcave

Suspension de GR au MO inversé x 800

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ATTACHER ET COLLER LA MICROPIPETTE A LA MEMBRANE

Micropipette collée au

patch de membrane

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CHRONOLOGIE DE L’ATTACHEMENT ET DU COLLAGE

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MICROPIPETTE SCELLEE AU GLOBULE ROUGE

Attachement électrostatique

Scellement micropipette - membrane

R=114 Méga Ohm

R=1 Giga Ohm

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COLLAGE ELECTROSTATIQUE MICROPIPETTE-FIBRE

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-3,00E+00 -2,50E+00 -2,00E+00 -1,50E+00 -1,00E+00 -5,00E-01 0,00E+00 5,00E-01

-0,07 0,03 0,13 0,23 0,33 0,43 0,53

ENREGISTREMENT D’UN CANAL POTASSIQUE

Courant d’ions K⁺ à travers un canal potassique Gardos de la membrane du globule rouge, canal activé par les ions Ca²⁺ intracellulaires.

Enregistrement immédiatement après le scellement . La déformation de la membrane liée à la formation du scellement induit une entrée de Ca ²⁺ qui active le canal K⁺ activé par les ions calcium (canal Gárdos). Attention courant K+ inversé car micropipette avec 150 mM K⁺

t (ms)

I (pA)

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Im

1 pA 0.5 s

État ferméÉtat ouvert

Seuil de transition de

changement d’état

ENREGISTREMENT D’UN CANAL POTASSIQUE

Les canaux ioniques fonctionnent selon 2 états (binaires) ouvert ou fermé

Le temps d’ouverture moyen du canal est de 13 millisecondes Le temps de fermeture moyen est de 20 millisecondes

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0 5 10 15 20 25 30

Courant unitaire (pA)

-3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5

Temps (s)

Canaux fermés

1 Canal ouvert 2 Canaux ouverts

Enregistrement immédiatement après le

scellement (« seal »)

Décrochage vraisemblablement lié à l’ouverture d’un troisième canal (cationique non sélectif).

Enregistrement activité du canal Gárdos en configuration cellule attachée

Temps (s)

0 1 2 3 4 5

-3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5

Zoom entre 0 et 5 secondes 30 secondes

correspondent à 20000 points d’enregistrement

ENREGISTREMENT D’UN CANAL POTASSIQUE

Le canal Gárdos est activé par Ca ²⁺ intracellulaire

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0 5 10 15 20 25 30

-3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5

Temps (s)

Canaux fermés

1 Canal ouvert

2 Canaux ouverts

0 5 10 15 20 25 30

-3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5

Temps (s)

0 5 10 15 20 25 30

-3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5

Temps (s)

Canaux fermés

1 Canal ouvert 2 Canaux ouverts

Canaux fermés 1 Canal ouvert

3 minutes

après scellement

7 minutes

après scellement 0 minutes

après scellement

ENREGISTREMENT D’UN CANAL POTASSIQUE

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TRANSMISSION HORIZONTALE – ECHANGES PROF-ELEVES

Jean-Pierre Pennec – UFR Médecine - Brest

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EN ATTENTE DU SCELLEMENT

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MERCI STEPHANE …et A BIENTOT

Diaporama S. Egée - H.Kempf

21-Mars-2018