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modèles d’évaluation de la virulence
Céline Bahuon
To cite this version:
Céline Bahuon. Construction d’un clone infectieux d’une souche méditerranéenne du Virus West Nile, validation de ses propriétés biologiques et développement de nouveaux modèles d’évaluation de la virulence. Sciences agricoles. Université Paris Sud - Paris XI, 2012. Français. �NNT : 2012PA114828�.
�tel-00747842�
1
UNIVERSITE PARIS-SUD
ÉCOLE DOCTORALE : ED 425
Innovation Thérapeutique : Du Fondamental A l’Appliqué Laboratoire de l’UMR virologie (Anses, ENVA, INRA)
DISCIPLINE
Microbiologie et Thérapeutique Anti-Infectieuse
THÈSE DE DOCTORAT SUR TRAVAUX
soutenue le 14/09/2012
par Céline Bahuon
Construction d’un clone infectieux d’une souche méditerranéenne du Virus West Nile, validation de ses propriétés biologiques et développement de nouveaux modèles d’évaluation de la virulence
Directeur de thèse : Dr Stéphan ZIENTARA Directeur d’UMR (Anses) Co-directeur de thèse : Dr Sylvie LECOLLINET Chef d’équipe (Anses)
Composition du jury :
Président du jury : Dr Audrey ESCLATINE Maître de conférence (Paris 11) Rapporteurs : Dr Daniel GONZALEZ-DUNIA Directeur de Recherche (INSERM)
Pr Pierre-Emmanuel CECCALDI Directeur de Recherche (Institut Pasteur) Examinateurs : Dr Nadia HADDAD Maître de conférence (ENVA)
Dr Thierry LEFRANCOIS Directeur de Recherche (CIRAD)
2
Ce travail a été réalisé au sein de l’UMR 1161 de Virologie, ANSES- INRA-ENVA
Dans l’équipe Neurovirologie des Zoonoses
Sous la direction de Stéphan Zientara
3 Je souhaiterais exprimer ma reconnaissance aux membres du jury, M. Daniel GONZALEZ- DUNIA, M Pierre-Emmanuel CECCALDI pour avoir accepté de corriger le mauscrit en tant que rapporteur et, Mme Audrey ESCLATINE, Mme Nadia HADDAD, M Thierry LEFRANCOIS, Mme Sylvie LECOLLINET et M Stéphan ZIENTARA qui ont accepté de juger ce travail.
Aux professeurs Anne COLLIGNON et Marc PALLARDY pour leur accompagnement au sein de l’Ecole Doctorale 425, pendant ces 4 années.
Je remercie chaleureusement Stéphan Zientara, responsable de l’UMR 1161 et Sylvie Lecollinet, co-responsable de l’équipe Neurovirologie des zoonoses, de m’avoir encadrée et soutenue lors des diverses péripéties de la construction du clone infectieux ainsi que de la soumission de l’article.
Merci à tous ceux qui m’ont aidée dans la réalisation de ce travail :
Sylvie pour ta patience à toute épreuve, et il en faut avec mon fichu caractère ! Steeve pour son soutien technique et sa patience
Josiane pour son aide pour les ELISA Cécile pour sa bonne humeur
Et enfin à l’ensemble de l’équipe pour m’avoir déchargée du mieux possible des contraintes du laboratoire de référence pendant cette période. Je vous promets de vous soulager à mon tour maintenant que la thèse est terminée !
Je remercie l’équipe de l’Institut Pasteur, Philippe, Nathalie, Eva pour m’avoir conseillée pour la construction du clone infectieux et aussi pour m’avoir fourni du matériel biologique.
Un grand merci à Serge qui m’a bien aidé sur les prélèvements et les euthanasies de souris !!
Sans toi, je n’y serai jamais arrivée !
Manu et l’équipe FCO pour la couveuse et les œufs
4 Kamila pour ses soirées Twin Peaks/Pizza et son soutien moral!
Jennifer pour sa disponibilité pour la correction de mon anglais dans l’article et son aide pour les différentes soumissions, et contestations !!
Muriel et Emilie pour leurs connaissances sur le monde passionnant des neurones !
Enfin, merci à mes parents, à Juliette, pour m’avoir soutenue moralement quand les résultats n’étaient pas au rendez-vous.
Et surtout un grand merci à Jean-Philippe qui s’est intéressé à mon travail dès le début, à l’avancée de l’article puis du mémoire, qui a regardé mes exposés, un soutien indispensable !
5
Liste des abréviations 10
Liste des figures 14
Liste des tableaux 17
Liste des cartes 18
INTRODUCTION 19
PARTIE I : DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES SUR LE VIRUS WEST NILE ET LES
SYSTEMES DE GENETIQUE INVERSE 21
Chapitre 1 : Le virus West Nile 22
1- Le virus 23
1-1 Classification virale 23
1-2 La particule virale 23
1-3 Le génome viral 25
1-3-1 Les protéines structurales 26
1-3-1-1 La protéine de capside 26
1-3-1-2 La protéine de membrane 27
1-3-1-3 La protéine d’enveloppe 28
1-3-2 Les protéines non structurales 30
1-3-2-1 NS1 30
1-3-2-2 NS2A et NS2B 31
1-3-2-3 NS3 32
1-3-2-4 NS4A, 2K et NS4B 32
1-3-2-5 NS5 33
1-3-3 les régions non codantes 34
1-3-3-1 La région 5’ non codante 34
1-3-3-2 La région 3’ non codante 34
6
1-4-1 Entrée virale 34
1-4-2 Cycle cytoplasmique 35
1-4-2-1 Libération de l’ARN génomique et traduction de la polyprotéine 35
1-4-2-2 Réplication 37
1-4-2-3 L’assemblage des particules virales 39
1-4-2-4Figure récapitulative 40
2- Cycle de transmission du virus 41
3- Infection à VWN chez les oiseaux et les mammifères 46
3-1 Les voies d’entrée du virus 48
3-1-1 L’inoculation virale cutanée 48
3-1-2 L’infection des motoneurones 48
3-1-3 Une transmission verticale est-elle possible 50
3-2 La réponse antivirale 50
3-2-1 Rôle de l’immunité innée 50
3-2-1-1 La reconnaissance du virus 51
3-2-1-2 La voie de signalisation des IFNs : la voie JAK/STAT 53
3-2-1-3 Les gènes de résistances au VWN 55
3-2-1-4 Cytokines impliquées dans la réponse innée 58
3-2-1-5 Cellules immunitaires impliquées dans la réponse innée 59
3-2-2 La réponse adaptative 60
3-2-2-1 La réponse humorale 60
3-2-2-2 La réponse cellulaire, les lymphocytes T 62
3-2-3 Exemple chez l’oiseau du rôle du système immunitaire dans le contrôle de
l’infection à VWN et de l’effet de l’âge 63
3-2-4 Mécanismes d’évasion du VWN au système immunitaire de l’hôte 64
3-3 L’infection du système nerveux 67
3-3-1 Les différentes voies d’entrée dans le SNC 67
7
3-3-3-2 Destruction neuronale 72
3-3-3-2-1 Rôle du virus 72
3-3-3-2-2 Rôle des cellules du SNC 73
3-3-3-2-3 Persistance du virus dans le SNC ? 74
3-3-3-2-4 Les signes cliniques 74
4- Epidémiologie 76
5- Phylogénie 81
Chapitre 2 – Les outils de génétique inverse 89
1-Le réplicon 89
2-Le clone infectieux 92
CADRE ET OBJECTIFS 99
PARTIE II : CONSTRUCTION D’UN CLONE INFECTIEUX DE LA SOUCHE IS-98-ST1 DU VIRUS WEST NILE ET VALIDATION DE NOUVEAUX MODELES
D’EVALUATION DE LA VIRULENCE 103
Chapitre 3 : Construction d’un clone infectieux de la souche IS-98-ST1 du virus West Nile et validation des propriétés biologiques des virions
recombinants in vitro et in vivo 104
1- Introduction 104
2-Article soumis à Plos One 105
3-Discussion et conclusion 135
Chapitre 4 : Evaluation de nouveaux modèles d’étude de la virulence du VWN 139
1-Le modèle œuf embryonné de poulet 139
1-1 Matériel et méthodes 139
1-1-1 Cellules et virus 139
1-1-2 Les œufs 140
8
1-2 Résultats 141
1-2-1 Détermination de la dose létale 50 141
1-2-2 Evaluation de la mortalité suite à l’infection avec différentes souches 142 1-2-3 Quantification des charges virales dans les organes 143 1-2-4 Charges virales dans les cerveaux et cœurs des œufs infectés par les différentes
souches testées 145
1-2-5 Observation anatomo-pathologiques 146
1-3 Conclusion et discussion 147
2- Le modèle neuroblastome humain 149
2-1 Matériel et méthodes 149
2-1-1 Cellules et virus 149
2-1-2 Les infections 149
2-1-3 La RT-PCR quantitative 150
2-2 Résultats 150
2-3 Conclusion et discussion 152
Chapitre 5- Discussion et perspectives 154
1-Discussion 154
1-1 Obtention d’un clone infectieux de la souche IS-98-ST1 du virus West Nile 154
1-1-1 Mutation ponctuelle 155
1-1-2 Chimère 158
9 2-1 L’identification des déterminants moléculaires de la virulence du virus permettra d’établir des cibles de choix pour la mise au point d’inhibiteurs 164 2-2 Le clone infectieux permettra de participer au développement de vaccins atténués
165 2-3 Amélioration de la vigilance envers l’émergence de nouvelles souches 166
CONCLUSION 167
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 169
ANNEXE 209
10
µg microgramme
µl microlitre
Å Angström
A549 cellules épithéliales humaines AcN Anticorps Neutralisants
ADAR adénosines désaminases ARN-spécifiques ADNc Acide Désoxyribo Nucléique complémentaire AMCR AMerican Crow
AMP Anti Microbial Peptide (Peptide Anti Microbien) ANSES
Agence Nationale chargée de la Sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'Environnement et du travail
AP61 Cellule d'insecte (moustique Aedes pseudoscutellaris) APC Antigen Presenting Cell (Cellule Présentatrice d'Antigène) ARN Acide Ribo Nucléique
ARNase Ribonucléase ARNdb ARN double brin ARNsb ARN simple brin
ATCC American Type Culture Collection ATPase Adénosine Tri Phosphatase
AvBD défensines-β aviaires
BAGV Bagaza Virus (Virus Bagaza) BHE Barrière Hémato Encéphalique bp base pair (paire de base)
C capside
C6/36 cellules d’insecte (moustique Aedes albopictus) CAM Cell Adhesion Molecules
cDNA complementary Desoxyribo Nucleic Acid
CLR C-type lectin Receptor (récepteur à lectine de type C) cm centimètre
CMH Complexe Majeur d'Histoccompatibilité CMV Cyto Megalo Virus
CNS Central Nervous System (système nerveux central) CPE CytoPathic Effect (Effet Cyto Pathogène)
CTHL cathélicidines
DC Dentritic Cell (Cellule Dendritique) Dcr-2 Dicer-2
DC-
SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin
11 DL50 Dose Létale 50
D-MEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium Dnase Désoxyribonucléase
E enveloppe
E.coli Escherichia coli
ECDC European Centre for Disease Control EDTA EthylèneDiamnine Tetraacetic Acid
eIF eucaryotic Initation Factor (facteur eucaryotique d'initiation de la traduction) ENVA Ecole Nationale Vétérinaire d'Alfort
FBS Fetal Bovine Serum (Serum de Veau Fétal)
FMDV Foot and Mouth Disease Virus (Virus de la Fièvre Aphteuse) GTPase Guanosine Tri Phosphatase
h heure
HBMVE Human brain microvascular endothelial cells
HDVR Hepatitis delta Virus Ribozyme (Ribozyme du virus de l'Hépatite delta) i.p intra préritonéal
IC Infectious Clone
IFA ImmunoFluorescence Assay IFN Interféron
IgG Immunoglobuline G IgM Immunoglobuline M IL InterLeukine
INRA Institut National de la Recherche Agronomique IRES Internal Ribosome Entry Site
IRF Interferon Response Factor IS-98-
ST1 souche Israël 1998 du virus West Nile, isolée à partir d’une cigogne (stork) ISG IFN Stimulated Gene
ISRE IFN Stimulated Response Elements It08 souche Italie 2008 du virus West Nile
J Jour
JEV Japananese Encephalitis Virus (Virus de l'Encéphalite Japonaise) kb kilobase
kDa kilo Dalton
KUNV Kunjin Virus (Virus Kunjin) kV kilo Volt
LC Langerhans Cell (Cellule de Langerhans) LCR Liquide Céphalo Rachidien
M membrane
12 ml millilitre
mM millimolaire
MMP métallo-protéinase de matrice
MOI Multiplicity Of Infection (multiplicité d’infection) Mtase Méthyltransférase
MVEV Murray Valley Encephalitis Virus (Virus de l'Encéphalite de la Vallée de Murray)
NC Non Codant
ng nanogramme
NS protéines Non Structurales nt Nucléotide
NTPase Nucléotide Phosphatase
NY99 souche New York 1999 du virus West Nile OAS 2’-5’ oligoadénylate synthétase
OIE Office International des Epizooties p.i post infection
P0/P1 passage 0/ Passage 1 PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction (Réaction de Polymérisation en Chaine) PFU Plaque Forming Unit (Unité Formant Plage)
PGRP PeptidoGlycan Receptor Protein (récépteur aux peptidoglycanes) pH potentiel Hydrogène
PMO Phosphoro-diamidiate Morpholino Oligomers PNN PolyNucléaires Neutrophiles
PRR Pattern Recognition Receptor qRT-
PCR
quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Réaction de Polymérisation en Chaine en temps réel suite à une Transcription Inverse) RC Replication Complex (Complexe de Répication virale)
RE Réticulum Endoplasmique
RISC RNA-Induced Silencing Complex RNA Ribo Nucleic Acid
RNAi ARN interférent RTPase ARN triphosphatase
s seconde
SK-N-
SH Lignée de neuroblastomes humains
SLEV Saint-Louis Encephalitis Virus (Virus de l'Encepéhalite de Saint-Louis) SNC Système Nerveux Central
SP07 souche Espagne 2007 (Spain 2007) du virus West Nile TJP Tight Junction Proteins (protéines des jonctions serrées)
13 USUV Usutu Virus (Virus Usutu)
UTR UnTranslated Region
Vero Cellules de reins de singes verts, Cercopithecus aethiops VLP Virus Like Particle
VWN Virus West Nile VWNE
Virus West Nile Encephalomyelitis (Encéphalomyélite associée à une infection au VWN)
W956 souche W956 du virus West Nile WNV West Nile Virus
WNV-
IC West Nile Virus Infectious Clone
YFV Yellow Fever Virus (Virus de la Fièvre Jaune)
14 Figure 1: Cryo-microscopie éléctronique de particules du virus West Nile 24 Figure 2: Représentation schématique de la structure des particules virales 24 Figure 3: Représentation schématique de l’organisation du génome du VWN et de la traduction des protéines virales avec une indication de leur fonction 26
Figure 4: Maturation de la néo-particule virale 27
Figure 5: Représentation de la structure de la protéine d’enveloppe 29
Figure 6: Représentation de la forme trimérique de E 30
Figure 7: Mécanisme de fusion de la membrane virale à la membrane cellulaire par
endocytose 35
Figure 8 : Structure du génome viral et expression de la polyprotéine 36
Figure 9: Le complexe de réplication 37
Figure 10: Couplage de la traduction, de la réplication et de l’assemblage des particules
virales 38-39
Figure 11: Représentation schématique du cycle de multiplication virale du VWN 40
Figure 12: Cycle de transmission du virus West Nile 45
Figure 13: Mécanismes de la neuro-invasion par le VWN 47
Figure 14: Schéma d’une coupe transversale au niveau d’une vertèbre cervicale 49 Figure 15: Mécanismes de la réponse innée induits par les PRR 53 Figure 16: Les différentes voies d’activation par les IFNs 54 Figure 17: Activation de la voie des 2’5’oligoadénylate synthétases 56 Figure 18: Fonctions biochimiques de protéines induites par la voie IFN 58 Figure 19: Cinétique du virus et des anticorps IgM et IgG au cours d'une infection par le
virus West Nile 61
Figure 20: Voie de signalisation IFN et mécanismes d’évasion du VWN 65-66
Figure 21: Schéma de la barrière hémato-encéphalique 68
15
Figure 24: Arbre phylogénétique du lignage 1 83
Figure 25: Arbre phylogénétique des lignages 1 à 5 86-87
Chapitre 3
Figure legend 1: Schematic representation of the cloning strategy. 125 Figure legend 2: in vitro validation of the biological properties of the IC virus. 126 Figure legend 3: in vivo validation of the biological properties of the IC virus in
susceptible mice, survival curves. 127
Figure legend 4: in vivo validation of the biological properties of the IC virus in
susceptible mice, viremia. 128
Figure legend 5: in vivo validation of the biological properties of the IC virus in
susceptible mice, viral load. 129
Figure legend 6: in vivo validation of the biological properties of the IC virus in
susceptible mice, histology. 130
Figure legend 7: in vivo validation of the biological properties of the IC virus in resistant
mice. 131
Figure legend 8: Viral load in different organs of chicken embryo infected with IS-98-
ST1 WNV. 132
Figure legend 9: in vivo validation of the biological properties of the IC virus in chicken
embryo. 133
Supplementary data: Survival curves of chicken embryos infected with parental IS-98-
ST1 virus. 134
16 Figure 27: Charges virales dans le cerveau ou le cœur d’œufs embryonnés infectés par
différentes souches de VWN à J4 p.i. 145
Figure 28: Lésions macroscopiques observées sur des embryons de poulet à J4 post
infection. 146
Figure 29: Cinétiques de réplication virale sur des cellules SK-N-SH. 151
Chapitre 5
Figure 30: Courbe de mortalité de perdrix rouges infectées par le VWN. 157 Figure 31: Comparaison des courbes de mortalité de souris infectées avec la souche IS-
98-ST1 ou Italie 08. 159
17
West Nile. 95-97
Chapitre 4
Tableau 2: suivi sur 7 jours de la mortalité d’œufs embryonnés de 10 jours. 141 Tableau 3: Suivi de la mortalité de groupes de 6 œufs de 10 jours inoculés avec 1 PFU de
virus. 143
Chapitre 5
Tableau 4: Comparaison des séquences de différentes souches en position 249 dans NS3
et évaluation de la DL50. 156
Tableau 5: Comparaisons des séquences en acides aminés des souches NY99, Ken98,
SP07, MO03, It08 avec IS-98-ST1. 160-161
Tableau 6: Moyenne des niveaux d’expression de gènes durant le développement
embryonnaire du poulet 163
18 Carte 2: Flambée de cas cliniques d’infection par le virus West Nile en Europe en 2010 et
2011. 79
19 Le virus West Nile (VWN) est un arbovirus (pour « Arthropod-Borne Virus ») transmis par piqûre de moustiques, appartenant au genre des Flavivirus et l’agent de la fièvre West Nile ou fièvre du Nil occidental. Le réservoir naturel du VWN est constitué de la faune aviaire sauvage. Les hôtes mammifères représentent un cul de sac épidémiologique. Parmi les mammifères, l’Homme et les équidés sont les plus sensibles, développant des symptômes neurologiques sévères dans 1 à 10 % des cas. Le VWN circule en Europe et dans le bassin méditerranéen depuis une longue période et a été à l’origine de nombreuses épidémies humaines et épizooties équines depuis la fin des années 1990 en Europe et plus largement dans le monde.
Une des spécificités de la situation épidémiologique européenne est la présence d’une grande diversité de souches, appartenant à au moins 5 lignages (principalement au lignage 1). Cette situation évolue avec l’apparition et l’expansion d’une infection à lignage 2 pathogène (Hongrie 2008, Grèce 2010) ainsi qu’avec la conquête de nouveaux territoires par le lignage 1a (Italie 2008/2009, Albanie, Macédoine…). La souche IS-98-ST1 a été isolée suite à l’une des plus importantes épidémies ayant touché le bassin méditerranéen, en Israël en 1998 (Lucas et al., 2004). A ce jour, il reste beaucoup à explorer sur les propriétés neuroinvasives et les déterminants moléculaires de la virulence concernant les souches circulant en Europe.
Notre projet vise à mieux connaître les déterminants moléculaires de la virulence du VWN, en étudiant l’impact de mutations ou de gènes in vivo mais aussi in vitro, par le développement de modèles permettant d’étudier l’effet direct du virus en l’absence d’intervention du système immunitaire. Pour atteindre cet objectif, nous avons construit un clone infectieux de la souche européenne IS-98-ST1.
Le présent mémoire est organisé en deux parties, la première partie correspondant à l’état des connaissances bibliographiques sur le VWN (chapitre 1), et sur l’état de l’art concernant les outils de génétique inverse chez les Flavivirus, en particulier du VWN (chapitre 2).
20 Les résultats des travaux sont présentés dans la seconde partie du manuscrit intitulé
«Construction d’un clone infectieux de la souche IS-98-ST1 du virus West Nile et validation de nouveaux modèles d’évaluation de la virulence ». Le chapitre 3 est consacré aux étapes de construction du clone infectieux de la souche IS-98-ST1 du VWN et de la validation de ses propriétés biologiques à la fois in vitro et in vivo. Le chapitre 4 se consacrera au développement de deux nouveaux modèles d’étude portant sur des hôtes d’intérêt du VWN:
un modèle in vivo aviaire, le modèle œuf embryonné de poulet et un modèle neuronal humain in vitro, le modèle neuroblastome. Ce chapitre exposera la pertinence de ces modèles en termes d’évaluation de la virulence suite aux premiers résultats obtenus lors d’infection avec différentes souches. Enfin, le 5ème et dernier chapitre du manuscrit présente une discussion générale des travaux réalisés et les perspectives envisagées.
21
PARTIE I : DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES SUR LE VIRUS WEST NILE ET LES SYSTEMES DE
GENETIQUE INVERSE
22 L’existence du virus West Nile est connue depuis 1937, lorsqu’il a été isolé en Ouganda, dans la province du Nil Occidental (West Nile), à partir du sang d’une femme présentant un accès fébrile (Kramer et al., 2007). Initialement, la fièvre WN était considérée comme une arbovirose mineure, essentiellement responsable chez l’homme d’infections asymptomatiques ou d’un syndrome pseudo-grippal et plus rarement d’encéphalites pouvant être mortelles. La situation a changé dans les années 1990 avec des épidémies incluant de nombreux cas humains, comme en Algérie (1994), en Roumanie (1996), en Tunisie (1997), en Israël (2000), et des cas équins au Maroc (1996), Italie (1998), Israël et France (2000) (Zeller et Schuffenecker, 2004). Un tournant majeur est atteint en 1999, lorsqu’une épidémie éclate à New York, sur un territoire vierge de VWN. 10 ans plus tard le virus est considéré comme endémique sur tout le territoire nord -américain. Près de 12000 cas humains de méningites ou d’encéphalites dont plus de 1000 infections fatales y ont été répertoriés. Une mortalité massive de la faune aviaire locale y a aussi été observée (Murray et al., 2010). La souche isolée à New York est très proche de celle isolée en 1998 sur une cigogne en Israël avec 28 changements nucléotidiques impliquant 10 changements d’acides aminés (Malkinson et al., 2002). De nombreuses études se sont attachées à la compréhension de la pathogénicité du VWN et de ses mécanismes/déterminants en utilisant des clones infectieux de souches africaines, B956 (Yamshchikov et al., 2001a), australiennes, Kunjin (Liu et al., 2003;
Khromykh and Westaway, 1994) et surtout de la souche new-yorkaise, NY99 (Kinney et al., 2006; Beasley et al., 2005; Audsley et al., 2011; Schlick et al., 2009; Borisevich et al., 2006;
Shi et al., 2002a), mais jamais sur une souche méditerraneo-européenne, comme la souche israélienne, IS-98-ST1. Or, le contexte européen est différent du contexte américain, à la fois au niveau de l’écologie (vecteurs, faune sauvage aviaire) et de l’épidémiologie (variété des souches plus importante en Europe (Zeller et Schuffenecker, 2004), absence d’immunité préexistante en Amérique contre une présence récurrente plus ancienne en Europe (Dauphin et Zientara, 2005). Nous verrons dans la suite du manuscrit ces différents aspects.
23 1- Le virus
1-1 Classification virale
Le VWN appartient à la famille des Flaviviridae, genre Flavivirus. Il fait partie d’un complexe de virus comprenant le virus de la fièvre jaune (YFV), à l’origine du nom du genre (flavius signifie « blond » en latin), le virus de la Dengue (DENV), ainsi que de virus à l’origine d’encéphalites comme l’encéphalite japonaise (JEV) qui circule en Asie, le virus de l’encéphalite de Saint-Louis (SLEV) rencontré en Amérique, ou le virus de Murray Valley (MVEV) rencontré en Australie. JEV, SLEV, MVEV et VWN appartiennent au séro- complexe de l’encéphalite japonaise. Récemment, des virus proches ont été identifiés en Europe : le virus Usutu (USUV), rencontré jusque là en Afrique, a été isolé en Autriche, en Hongrie, en Allemagne, en Suisse, en Italie et en Espagne (Weissenböck et al., 2003 ; Bakonyi et al., 2007 ; Steinmetz et al., 2011 ; Becker et al., 2012 ; Savini et al., 2011 ; Busquets et al., 2008) ; un nouveau virus émergent, le virus Bagaza (BAGV), a été identifié en Espagne en 2010 (Agüero et al., 2011).
1-2 La particule virale
Les images de cryo-microscopie électronique révèlent des particules virales de symétrie icosaédrique de 50 nm de diamètre, sans spicules à leur surface (figure 1) (Kramer et al., 2007). Il s’agit de virus enveloppés avec une capside formée d’une seule protéine, la protéine C, contenant une molécule d’ARN(+) d’environ 11kb. L’enveloppe est formée de deux protéines, une protéine d’enveloppe (E) et une protéine de membrane (M) dont l’agencement confère une apparence lisse (figures 1 et 2).
24
Figure 1: Cryo-microscopie éléctronique de particules du virus West Nile (d’après Kramer et al., 2007). A gauche, la structure du virion est reconstituée d’après les données de cryo- microscopie électronique. Le triangle à la surface de la structure indique une unité asymétrique d’icosaèdre. A droite, la reconstruction de la section centrale montre des couches concentriques de densité de masse correspondant à l’enveloppe. Lipid bilayer : bicouche lipidique, Core : noyau, E and M : E et M.
Figure 2: Représentation schématique de la structure des particules virales (d’après http://viralzone.expasy.org). A gauche, représentation des protéines d’enveloppe et de membrane à la surface de la particule virale. Les protéines de capside forment une structure protégeant l’ARN viral. A droite, représentation de l’organisation des dimères d’enveloppe à la surface du virion.
Dimère de E Protéine M
Capside
ARN génomique
T=3 organisation des dimères de surface
25 1-3 Le génome viral
Le génome viral est constitué d’un ARN simple brin de 11 kb coiffé à son extrémité 5’ (7- méthylguanosine), non polyadénylé en 3’ (figure 3). Les régions non codantes (NC) en 5’ et 3’ sont conservées et forment des structures secondaires en épingle à cheveux, nécessaires pour la transcription, la traduction et l’empaquetage de l’ARN viral (Brault, 2009). Le génome complet est traduit en une polyprotéine qui est clivée pendant et après la traduction par des protéases cellulaires et virales. La partie 5’ de la polyprotéine code pour les protéines structurales (C, prM, E) et la partie 3’ pour les protéines non structurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5) (figure 3). Les protéines structurales sont nécessaires pour l’encapsidation (par la protéine C) de l’ARN viral, et les protéines de surfaces (M et E) sont requises pour l’interaction et la fusion avec la cellule cible (Kimura et al., 1988). M et E sont aussi à l’origine de la stimulation de la réponse lymphocytaire B et T (Campbell et al., 2002 ; Sanchez et al., 2005). La protéine d’enveloppe est la plus immunogène et induit la majorité des anticorps neutralisants (Sanchez et al., 2005). Elle est constituée de trois domaines structuraux, parmi lesquels le domaine III est le plus immunogène. Les protéines non structurales jouent un rôle dans la réplication virale, l’assemblage des virions et l’évasion à la réponse antivirale de l’hôte (Kummerer et Rice, 2002; Liu et al., 2005; Liu et al., 2003;
Munoz-Jordan et al., 2003; Pugachev et al., 2004).
26 Figure 3: Représentation schématique de l’organisation du génome du VWN et de la traduction des protéines virales avec une indication de leur fonction (d’après Murray et al., 2010). L’ARN génomique est cappé en 5’ et non polyadénylé en 3’. L’ARN code pour une polyprotéine de 3300 acides aminées ensuite clivée en 10 protéines virales : 3 protéines structurales (C, prM et E) et 7 protéines non structurales (NS1/NS1’, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5). Les protéines structurales jouent un rôle dans l’assemblage des particules virales, le spectre d’hôte, le tropisme et la fusion à la membrane de la cellule cible.
Les protéines non structurales sont impliquées dans la réplication de l’ARN, et la morphogénèse virale.
1-3-1 Les protéines structurales
1-3-1-1 La protéine de capside
La protéine de capside (C) est une protéine hautement basique de 11 kDa (Lindenbach et al., 2007). Les résidus chargés sont situés dans les régions N- et C-terminales, séparées par une région interne hydrophobe impliquée dans la structuration de la capside (Ma et al., 2004). Le domaine C-terminal hydrophobe sert de peptide signal pour la translocation au réticulum endoplasmique (RE) de la protéine de membrane (M). Ce domaine est clivé de la protéine de capside mature par la serine protéase virale (NS3) (Lobigs et al., 1993). Il n’est pas encore bien établi comment les dimères de C sont organisés au sein de la nucléocapside.
Cadre ouvert de lecture de 3300 acides aminés
Traduction
Protéines structurales Protéines non structurales
Clivage de la polyprotéine
Réplication de l’ARN viral, morphogénèse des virions Assemblage, spectre d’hôte,
tropisme, fusion Pathogénèse
27 1-3-1-2 La protéine de membrane
Le précurseur glycoprotéique de 26 kDa (prM) de la protéine de membrane (M) est adressé au RE via le domaine C-terminal hydrophobe de C. La région N-terminale contient 1 à 3 sites de glycosylation, et 6 résidus cystéine conservés qui forment tous des ponts disulfure (Lindenbach et al., 2007). prM se replie et participe au repliement correct de E (Konishi et Mason, 1993 ; Lorenz et al., 2002). Une des fonctions essentielles de prM est de prévenir le réarrangement pH-dépendant de E lors de son transport dans la voie sécrétoire lors de la libération des nouvelles particules virales. La conversion des particules immatures en particules matures coïncide avec le clivage de prM en deux fragments, pr et M par la furine présente dans le Golgi (Stadler et al., 1997). Suite au clivage, les hétérodimères prM-E se dissocient, le fragment pr est relargué et les homodimères de E se forment (figure 4).
Figure 4: Maturation de la néo-particule virale (d’après Lindenbach et al., 2007). La maturation du virion est accomplie lorsque la partie pr de la protéine prM est clivée et que le peptide de fusion de E est exposé. E dimer : dimère de E.
Des mutations affectant le nombre de résidus cystéine dans le fragment pr a pour conséquence la formation de virions sensibles à la température contenant des protéines prM intactes (Elshuber et Mandl, 2005)
Virion immature
Virion mature
Virion immature Virion mature
nucléocapside
dimère de E
28 1-3-1-3 La protéine d’enveloppe
La protéine d’enveloppe (E), 53 kDa, est la principale protéine à la surface du virion. Elle est impliquée dans la reconnaissance du récepteur et la fusion à la membrane plasmique. Les protéines sont glycosylées et organisées en domaines renfermant une boucle hydrophobe, le peptide de fusion permettant l’entrée virale. L’intégrine αvβ3 (Jang-hann Chu et Ng, 2004), le TLR3 (Wang et al., 2004), DC-SIGN et DC-SIGNR (Davis et al., 2006b) et la protéine de liaison à la laminine (Bogachek et al., 2008) ont été identifiés comme des récepteurs potentiels du VWN. Des récepteurs différents sont impliqués dans l’infection des cellules de moustiques et des cellules de mammifères (Robinson et al., 2006 ; Cheng et al., 2010). E contient 12 résidus cystéine conservés qui forment des ponts disulfure. Il a été montré que E est une protéine hautement glycosylée et que sa glycosylation est un facteur déterminant dans la neuroinvasion du VWN (Beasley et al., 2005). E se replie sous sa forme native en une structure allongée riche en feuillets β, et forme des homodimères disposés tête bèche (Lidenbach et al., 2007). Chaque sous-unité de E est constituée de 3 domaines : le domaine I, le domaine II qui se projette le long de la surface du virion, et le domaine III qui maintient la conformation de l’ensemble (figure 5).
29 Figure 5: Représentation de la structure de la protéine d’enveloppe (forme homodimérique présente à la surface des particules virales matures) (d’après Lidenbach et al., 2007). La figure montre une vue par-dessus et de côté de la protéine. La protéine d’enveloppe possède trois domaines dont le peptide de fusion. Domain : domaine, fusion peptide : peptide de fusion, TOP VIEW : vue du dessus, SIDE VIEW : vue de côté.
Le domaine III est impliqué dans la liaison au récepteur et représente la cible principale des anticorps neutralisants (Dauphin et Zientara, 2007). Lorsque le pH est acide (vésicule d’endocytose par exemple), les dimères se dissocient en monomères qui ensuite forment des trimères avec leurs peptides de fusion entièrement exposés vers la membrane avec laquelle la particule virale doit fusionner (figure 6). La trimérisation s’opère par une rotation du domaine III et un repliement d’un angle de 30 Å par rapport au domaine I et par une rotation du domaine II par rapport au domaine I (Lidenbach et al., 2007).
30 Figure 6: Représentation de la forme trimérique de E (d’après Lidenbach et al., 2007). La protéine d’enveloppe est représentée lors de l’étape de fusion, lorsque les dimères se dissocient en monomères suite à l’exposition au pH acide de l’endosome et exposent leurs peptides de fusion vers la membrane plasmique de la cellule cible. fusion peptides : peptides de fusion.
1-3-2 Les protéines non structurales
1-3-2-1 NS1
NS1 est une glycoprotéine de 46 kDa transloquée vers le RE pendant sa synthèse, clivée de E par une signal-peptidase cellulaire. C’est dans le RE qu’une peptidase cellulaire non identifiée clive la jonction NS1/NS2A (Falgout et al., 1989 ; Falgout et al., 1995). Ce processus requiert les 8 derniers acides aminés en C-terminal de NS1 et les 140 acides aminés en N-terminal de NS2A (Falgout et al., 1995 ; Hori et Lai, 1990).
NS1 est très largement séquestrée dans les cellules infectées mais elle peut aussi être localisée à la surface cellulaire ou être sécrétée des cellules de mammifère (Lidenbach et Rice, 2003).
31 NS1 a été localisée dans les sites de réplication de l’ARN viral (Westaway, 1987 ; Mackenzie et al., 1996 ; Westaway et al., 1997).
Même si son rôle dans la réplication de l’ARN n’est pas encore clairement défini, des mutations sur son site de glycosylation peuvent entrainer des défauts dans la réplication de l’ARN viral (Muylaert et al., 1996), étape pendant laquelle son interaction avec NS4A est requise (Lidenbach et Rice, 1999).
La fonction de la forme extracellulaire de NS1 n’est pas connue. En revanche, cette forme extracellulaire est hautement immunogène (Dauphin et Zientara, 2007). De plus, NS1 est impliquée dans l’inhibition de la réponse innée antivirale et plus particulièrement dans l’inhibition de la transduction du signal induit par le TLR3 (Wilson et al., 2008). En effet, la capacité à contrer la transduction du signal médiée par TLR3 a été mesurée individuellement pour chacune des protéines non structurales du VWN. Wilson et al. (2008) ont montré que NS1 inhibe l’activation par la voie TLR3 du promoteur de la transcription de l’IFN (interféron) et d’un promoteur dépendant de NF-κB. Cette inhibition est due à l’incapacité du ligand poly (I :C) de TLR3 à induire la translocation nucléaire d’IRF3 et de NF-κB.
L’expression de NS1 inhibe aussi la production TLR3-dépendante de l’interleukine 6, et donc la mise en place d’un état antiviral.
Une forme plus longue de NS1, NS1’, est souvent détectée lors d’infections par les membres du sero-complexe de l’encéphalite japonaise (Murray et al., 2010). NS1’ est le résultat d’un décalage ribosomique qui se produit en 5’ de NS2A, en aval d’une structure secondaire de l’ARN et cette protéine joue un rôle dans la neuroinvasion du VWN (Melian et al., 2010).
1-3-2-2 NS2A et NS2B
NS2A est une protéine hydrophobe de 22 kDa. Le clivage cytosolique NS2A/NS2B est effectué par NS3 associée à NS2B. NS2A est impliquée dans l’assemblage des particules virales (Liu et al., 2003). Elle est localisée dans les sites de réplication et interagit avec NS3 et NS5, ainsi qu’avec la région 3’ non codante (Mackenzie et al., 1998).
32 NS2A est donc un bon candidat pour la coordination entre l’empaquetage de l’ARN et sa réplication (Khromykh et al., 2001b). NS2A est aussi impliquée dans l’inhibition de la réponse interféron α/β (Liu et al., 2004, 2006).
NS2B est une petite protéine de 14 kDa associée à la membrane plasmique (Clum et al., 1997). NS2B forme un complexe stable avec la partie sérine protéase de NS3 (Falgout et al., 1991) et agit comme co-facteur de NS3.
1-3-2-3 NS3
NS3, protéine multifonctionnelle de 70 kDa, est impliquée dans la réplication et le clivage de la polyprotéine virale. NS3 possède une activité serine protéase dans son domaine N-terminal et des activités ATPase et hélicase en C-terminal (Gorbalenya et al., 1989 ; Murray et al., 2010). L’activité protéase clive les jonctions NS2A/NS2B, NS2B/NS3, NS3/NS4A et NS4B/NS5 (Lidenbach et al., 2007). Cette activité est aussi impliquée dans la maturation des régions C-terminales de la protéine de capside (Amberg et al., 1994 ; Yamshchikov et al., 1994) et de NS4A (Lin et al., 1993). NS3 possède également une activité ARN triphosphatase (RTPase) qui lui permet de déphosphoryler la partie 5’ de l’ARN avant l’ajout de la coiffe (Wengler, 1993). NS3 se lie aux structures en épingle à cheveux en 3’ du génome en association avec NS5 (Chen et al., 1997) et la présence de NS5 augmente l’activité NTPase de NS3 (Cui et al., 1998). De plus, NS3 semble jouer un rôle dans l’effet cytopathique après infection par le VWN, par induction d’une mort cellulaire par apoptose. Ramanathan et al.
(2006) ont montré le rôle de NS3 dans l’activation de la caspase 8.
1-3-2-4 NS4A, 2K et NS4B
NS4A et NS4B sont des petites protéines hydrophobes de 16 et 27 kDa, séparées par le peptide 2K. NS4A a été localisée au sein des complexes de réplication (Mackenzie et al., 1998), ce qui suppose un rôle dans la réplication de l’ARN.
33 2K est un fragment d’acides aminés hydrophobes localisé entre NS4A et NS4B. Ce fragment sert de séquence signal pour la translocation de NS4B dans la lumière du réticulum endoplasmique (Lin et al., 1993).
Des études ont montré que le clivage NS4A/2K/NS4B était nécessaire pour l’induction des réarrangements des membranes cytoplasmiques (/formation de vésicules) par NS4A (Roosendaal et al., 2006). Le clivage à la jonction 2K/NS4B est assuré par la fonction sérine protéase de NS3 associée à NS2B en amont d’un peptide signal du domaine transmembranaire 2K (Lin et al., 1993). Le fragment 2K est impliqué dans la synthèse de l’ARN viral (Zou et al., 2008), ainsi une mutation (en position 9) est responsable de la résistance à un anti-viral (la lycorine) par l’augmentation de la vitesse de réplication.
NS4B fait partie du complexe de réplication viral (Miller et al., 2006). NS4B colocalise avec NS3 et l’ARN double brin dans des structures membranaires dérivées du RE, lieu de la réplication virale (Westaway et al., 2002). Une mutation dans la partie C-terminale de NS4B réduit la vitesse de réplication et la quantité d’ARN synthétisé, ce qui suggère que cette région de NS4B est critique pour la réplication virale (Puig-Basagoiti et al., 2007). NS4B est également impliquée dans l’échappement à la réponse immunitaire innée de l’hôte en inhibant la voie interféron α/β (Munoz-Jordan et al., 2005 ; Wicker et al., 2006).
1-3-2-5 NS5
NS5, grosse protéine de 103 kDa, est hautement conservée et multifonctionnelle. Elle possède une activité méthyltransférase (MTase) (Lidenbach et al., 2007). NS5 est l’ARN- polymérase-ARN-dépendante, nécessaire pour la réplication de l’ARN viral au sein de complexes faisant intervenir des protéines d’origine à la fois virale et cellulaire (Murray et al., 2010). NS5 en relation avec NS3 a été identifiée comme étant un composant majeur des complexes de réplication de l’ARN viral.
NS5 participe à la suppression de la réponse innée de l’hôte en empêchant l’accumulation de la forme phosphorylée de STAT1 (pY-STAT1) (voir paragraphe 3-2-1-2) et à la suppression de l’expression des gènes sous contrôle des interférons de type I (Laurent-Rolle et al., 2010).
34 1-3-3 les régions non codantes
1-3-3-1 La région 5’ non codante
La région 5’ non codante (NC) possède une coiffe m7GpppA qui est reconnue par la protéine cytoplasmique eIF4B (facteur eucaryotique d’initiation de la traduction) ainsi que par le facteur eIF4F du complexe d’initiation (Chiu et al., 2005 ; Clyde et Harris, 2006). Ce complexe recrute la petite sous-unité ribosomale pour la traduction de la polyprotéine virale.
1-3-3-2 La région 3’ non codante
La région 3’ non codante possède une structure en épingle à cheveux hautement conservée qui sert de promoteur à la synthèse du brin ARN(+) (Shi et al., 1996), ainsi qu’une séquence de cyclisation. Cette séquence induit l’interaction entre les parties 5’ et 3’ du génome viral, ce qui est nécessaire pour la réplication (Khromykh et al., 2001a; Polacek et al., 2009a; Thurner et al., 2004; You et Padmanabhan, 1999).
La réussite de la cyclisation est liée à l’action de la protéine PABP (poly(A) binding protein) qui interagit avec la région 3’NC et eIF4F (Polacek et al., 2009b). La structure en épingle à cheveux se lie à un certain nombre de protéines cellulaires, permettant d’initier la synthèse du brin d’ARN(-) (Blackwell et Brinton, 1997; De Nova-Ocampo et al., 2002; Li et al., 2002;
Polacek et al., 2009a; Shi et al., 1996).
1-4 Le cycle viral 1-4-1 Entrée virale
L’entrée virale suppose l’internalisation du virus par endocytose suite à l’interaction de l’enveloppe virale avec les récepteurs (qui ne sont pas tous identifiés). L’abaissement du pH dans l’endosome entraîne le processus de fusion entre l’enveloppe et la membrane endosomale libérant ainsi la capside (figure 7).
35 protéine E notamment sa trimérisation et un réarrangement de sa surface exposant le peptide de fusion vers la membrane cible (Chu et Ng, 2004 ; Gollins et al., 1986a). Ce peptide s’insère alors et se replie en épingle à cheveux permettant de rapprocher les deux membranes, ce qui entraîne la formation d’un pore permettant le passage de la capside.
Figure 7: Mécanisme de fusion de la membrane virale à la membrane cellulaire par endocytose (d’après Cosset, 2010). La protéine d’enveloppe reconnaît son récepteur à la surface de la cellule cible, elle est ensuite endocytée au contact du pH acide de l’endosome.
La protéine E change de conformation, libérant ainsi le peptide de fusion. La capside est alors libérée dans le cytoplasme.
1-4-2 Cycle cytoplasmique
1-4-2-1 Libération de l’ARN génomique et traduction de la polyprotéine
L’ARN(+) est coiffé en 5’ mais ne possède pas de queue polyA en 3’. Par contre, la région 3’ NC possède une structure en épingle à cheveux hautement conservée.
Les clivages protéiques sont co-traductionnels et se font grâce à des protéases virales et cellulaires (voir figure 8).
36 Les protéines d’enveloppe doivent être glycosylées. Pour cela, elles doivent transiter dans le RE et le Golgi, ce qui nécessite une séquence signal. En cours de synthèse, des séquences signal adressent les régions prM, E et NS1 de la polyprotéine dans le RE grâce à des régions transmembranaires (figure 8). Les séquences signal sont ensuite clivées par des signalases cellulaires. Les protéines prM et E restent ancrées dans la membrane alors que la protéine NS1 est libérée dans la lumière du réticulum et sera excrétée. La protéine prM sera clivée plus tardivement dans le trans-Golgi par des protéases de types furines résidantes du Golgi.
Sur la face cytoplasmique, la protéine NS3 nécessite NS2B comme cofacteur pour réaliser les clivages protéiques.
GENES STRUCTURAUX
LUMIERE DU RETICULUM ENDOPLASMIQUE
CYTOPLASME
GENES NON STRUCTURAUX
NS3 clivée CADRE OUVERT DE LECTURE
Figure 8 : Structure du génome viral et expression de la polyprotéine (d’après Lidenbach et al. (2007)). A : structure du génome (protéines structurales et non structurales) et des éléments ARN (coiffe, régions 5’ et 3’ NC). B : Traitement de la polyprotéine par les protéases cellulaires ♦, virale (↓), furines (▼) ou inconnues ( ?).
C : topologie des produits de clivage de la polyprotéine. NCR (Non Coding Region) : région non codant, 3’SL (Stem Loop) : stucture secondaire en épingle à cherveux.
37 1-4-2-2 Réplication
La réplication a lieu au sein des complexes de réplication viral (RC) constitués de NS1, NS2A, NS3, NS4A et NS5 (figure 9).
Figure 9: Le complexe de réplication (synthèse personnelle). Le complexe de réplication viral (RC) constitués de NS1, NS2A, NS3, NS4A et NS5.
La réplication débute par la synthèse d’un brin d’ARN de polarité négative qui sert ensuite de base pour la synthèse d’un ARN génomique positif sous un mode semi-conservatif et asymétrique. La réplication est couplée à la traduction (figure 10) et à l’assemblage (figure 10). Le complexe de réplication s’assemble avec les protéines qui viennent d’être traduites. La réplication est également couplée à l’encapsidation.
38
de l’assemble du RC (complexe de réplication)
Circularisation du brin d’ARN (+) et fin de l’assemblage du complexe de réplication
Le complexe de réplication transcrit l’ARN(+) en ARN(-) aboutissant à la forme réplicative (FR)
Le FR se réattache au complexe de réplication pour l’initiation de la synthèse de l’intermédiaire
de réplication (IR)
Réplication semi-conservative asymmétrique de l’ARN (+)
Libération de l’ARN(+) néo-synthétisé et du FR pour un nouveau cycle
Fin du cycle de réplication
39 néoformé va alors être traduit et de nouvelles particules virales vont pouvoir alors se former.
(1) Stem loop : structure secondaire en épingle à cheveux, RNA (+) strand : brin d’ARN (+), Lumen : lumière, Anchor on ER : ancrage sur le RE, (2) Lumen of ER : lumière du RE, CIRCULARIZATION OF RNA(+) COMPLEX : circularisation du complexe ARN (+) (6) displaced RNA(+) : ARN (+) déplacé, nascent RNA (+) : ARN (+) naissant, (7) Single progeny RNA(+) with 5’type 1 cap : copie unique d’ARN (+) cappé, Completion of nascent RNA (+) : maturation de l’ARN (+), free RF : FR libre, (8) Translation Initiated as ribosomes attach : initiation de la traduction lorsque les ribosomes s’attachent, Progeny RNA (+) : ARN(+) néo-synthétisé, Assembly with structural proteins : Assemblage avec les protéines structurales.
1-4-2-3 L’assemblage des particules virales
L’assemblage des particules virales se fait par association de l’ARN avec les protéines de capside. L’acquisition de l’enveloppe se fait par bourgeonnement au niveau du RE.
prM sert de chaperon pour maintenir la conformation de la protéine E afin d’éviter l’exposition du peptide de fusion. Une fois le bourgeonnement réalisé, il y a formation de particules virales immatures avec un aspect hérissé correspondant à l’insertion d’hétérodimères prM-E dans l’enveloppe virale.
Le clivage de prM en M se déroule dans l’appareil de Golgi permettant la maturation de la particule virale (Mackenzie et Westaway, 2001).
40 1-4-2-4 Figure récapitulative
Figure 11: Représentation schématique du cycle de multiplication virale du VWN (d’après Heinz et Stiasny, 2012). Le VWN reconnaît sa cellule cible grâce à la protéine d’énveloppe qui possède le domaine de liaison au récepteur. La particule virale est alors endocytée. Le pH acide de l’endosome provoque un changement de conformation de la protéine d’enveloppe, ce qui aboutit à l’exposition du peptide de fusion. La capside est alors libérée dans le cytoplasme suivit de la libération de l’ARN viral. L’ARN de polarité positive est immédiatement traduit. Les protéines virales issues de la traduction s’assemblent pour former un complexe de réplicatio. Les ARN néosynthétisés sont encapsidés et transportés via des vésicules de fusion. De nouveaux virions sont libérés.
Attachement
CYTOPLASME
Endocytose induite par le récepteur
Désencapsidation
Traduction
Assemblage Bourgeonnement Virion immature
RE (Clivage prM)
Virion mature
EXOCYTOSE
NOYAU
41 2- Cycle de transmission du virus
Dans les années 1950, des études menées en Egypte ont permis d’identifier le cycle de transmission du VWN (Brault, 2009). Le rôle des oiseaux, comme hôtes amplificateurs, a été précisé, ainsi que celui de certains moustiques vecteurs, principalement du genre Culex (figure 12). Ces études ont permis de définir des zones de circulation endémique du virus et des zones de transition où le virus ne s’installe pas.
Les moustiques s’infectent lors d’un repas sanguin en ingérant le virus (figure 12). Après passage à travers la barrière intestinale, le virus se réplique localement puis atteint les glandes salivaires pour ensuite être transmis lors d’un repas sanguin ultérieur. Cette dernière étape est directement liée aux conditions climatiques (température, hygrométrie…), qui sont déterminantes en termes d’activité des vecteurs et de durée de transmission. De nombreuses espèces de moustiques, de genres différents (Culex, Aedes, Anopheles, Mansonia…) ont été trouvées porteuses du VWN (Hayes et al., 2005).
Des études expérimentales permettent de préciser les espèces compétentes, c’est-à-dire impliquées dans le cycle de transmission du virus (Granwehr et al., 2004). Les espèces Culex pipiens, moustique « urbain », et Culex modestus, présents dans les zones humides, rizières et roselières en Camargue par exemple, semblent être plus particulièrement impliquées dans la transmission du virus en Europe.
Le niveau de virémie varie selon les espèces d’oiseaux et sa durée est assez courte (de l’ordre de quelques jours) : ainsi, les passériformes (passereaux), les chradriiformes (oiseaux aquatiques), les strigiformes (rapaces nocturnes) et les falconiformes (rapaces diurnes) présentent des niveaux de virémie généralement suffisants pour infecter la plupart des moustiques. Par contre, les columbiformes, les piciformes (piverts) et ansériformes (canards etc…), généralement résistants à l’infection, développent une virémie faible (Komar et al., 2003). Les oiseaux sont considérés comme de bons agents disséminateurs du VWN dans la mesure où ils peuvent parcourir de grandes distances lors des migrations (Sotelo et al., 2009).
42 Ce sont sans doute les oiseaux qui sont à l’origine de l’introduction du VWN à partir de l’Afrique sub-saharienne vers l’Europe et la région méditerranéenne (Berthet et al., 1997;
Charrel et al., 2003; Jourdain et al., 2007).
Depuis la découverte du virus en 1937, aucune mortalité aviaire naturelle n’avait été rapportée (Hayes et al., 1988), jusqu’aux foyers de la fin des années 1990 en Israël et aux Etats-Unis (Bernard et al., 2001 ; Bin et al., 2001 ; Swayne et al., 2001). En 1998, le VWN est isolé à partir d’une cigogne moribonde trouvée en Israël (Malkinson et al., 2001b). Des mortalités élevées chez les jeunes oiseaux de 3 à 8 semaines étaient observées dans des populations de cigognes et d’oies (Malkinson et al., 2001a).
Aux Etats-Unis, beaucoup d’oiseaux et en particulier le Quiscale bronzé (Quiscalus quiscula), le Corbeau Américain (Corvus brachyrhynchos), le geai bleu (Cyanocitta cristata), la pie (Pica pica), le roselin (Carpodacus mexicanus) et le moineau (Passer domesticus) ont été sévèrement touchés par l’épidémie/épizootie et ont permis une amplification efficace du virus (Hayes et al., 2005). Les passériformes et en particulier les corvidés sont hautement sensibles à l’infection (Komar et al., 2003).
Les espèces de ces familles, et tout particulièrement le Grand Corbeau (Corvus corax (Potter, 2004)) et le Corbeau Américain (Corvus brachyrhynchos (Caffrey et al., 2005; Ward et al., 2006; Yaremych et al., 2004), présentent de forts taux de mortalité. Différents types de rapaces, dont l’Autour de Palombe (Accipiter gentilis, Erdélyi et al., 2007) ont été identifiés comme sensibles à l’infection à VWN (Nemeth et al., 2006; Bakonyi et al., 2006; Höfle et al., 2008).
Parmi les espèces européennes, la perdrix rouge (Alectoris rufa) de l’ordre des galliformes s’est montrée sensible lors d’infections expérimentales avec les souches Maroc 2003 (Ma03) et Espagne 2007 (SP07) (Sotelo et al., 2011). Tous les oiseaux inoculés étaient virémiques et ont présenté des signes cliniques avec des taux de mortalité de 70% (Ma03) et 30% (SP07).
Le niveau de virémie varie selon les espèces d’oiseaux et sa durée est assez courte (de l’ordre de quelques jours) : ainsi, les passériformes (passereaux), les charadriiformes (oiseaux aquatiques), les strigiformes (rapaces nocturnes) et les falconiformes (rapaces diurnes)
43 présentent des niveaux de virémie généralement suffisants pour infecter la plupart des moustiques, par contre les columbiformes, les piciformes (piverts) et les ansériformes (canards…), généralement résistants à l’infection, développent une virémie très faible (Komar et al., 2003).
Des infections expérimentales réalisées sur de jeunes oies avec un isolat nord-américain ont permis d’observer des taux de mortalité similaires à ce qui est observé dans la nature avec des virémies suffisantes pour infecter les moustiques (Swayne et al., 2001). La virulence d’un isolat nord-américain a été évaluée sur 25 espèces aviaires américaines. Parmi ces espèces, les corvidés dont le corbeau américain (AMCR, pour AMerican CRow) et le geai bleu (Cyanocitta cristata), présentent une virémie comprise entre 8 et 10 log10 PFU/ml (Komar et al., 2003).
Les espèces sensibles présentent de fortes virémies et des taux de mortalité élevés (Ladeau et al., 2007). De façon paradoxale, la baisse d’une population aviaire, due à une forte mortalité, au lieu de diminuer la transmission du VWN, peut, au contraire, l’augmenter.
D’une part, parce que la survie d’animaux infectés et donc immunisés pourrait diluer l’effet/empêcher de futures transmissions (Foppa et Spielman, 2007), ensuite parce que la mortalité aviaire est associée à une forte virémie entrainant une infection efficace des moustiques moyennement sensibles/compétents (Brault et al., 2004 ; Kinney et al., 2006 ; Komar et al., 2003).
Enfin une augmentation des signes pathologiques pourraient avantager l’infection des moustiques suite à une baisse des comportements de défense des oiseaux contre les moustiques (Day et Edman, 1983). De plus, les moustiques pourraient être davantage attirés par des oiseaux en hyperthermie (Kinney et al., 2006).
44 Plus la population locale de moustiques a une faible compétence vectorielle à l’infection par le VWN, plus il est primordial pour le virus d’atteindre une virémie forte chez son hôte, ce qui est le cas pour certaines espèces américaines de Culex spp. Inversement, les vecteurs sensibles au VWN peuvent transmettre efficacement le virus même lorsque la virémie aviaire est plus faible, ce qui est le cas dans les régions endémiques (Afrique, Europe…) (Brault et al., 2009).
Des cas de transmission directe par voie alimentaire ou par contacts directs entre oiseaux ont été décrits (McLean et al., 2001). Ces modes de transmission, en particulier la prédation de petits oiseaux infectés par le VWN, pourraient jouer un rôle épidémiologique non négligeable dans le contexte nord américain (infection de corbeaux) ou en Hongrie (infection de rapaces) (Zientara et al, 2010).
L’apparition de cas chez l’homme et le cheval est liée à une circulation importante du virus dans l’avifaune, via des vecteurs ornithophiles, et à la présence de moustiques vecteurs, à la fois ornithophiles et mammophiles, capables de s’infecter à partir d’oiseaux virémiques et de piquer ultérieurement un hôte sensible (figure 12) (Murray et al., 2010). De très nombreuses espèces animales peuvent être infectées dont des reptiles, des amphibiens, des carnivores…
Cependant le VWN provoque des signes cliniques essentiellement chez l’homme et le cheval.
Les signes cliniques rencontrés consistent en des atteintes pseudo- grippales avec fièvre, céphalées, myalgies, arthralgies, nausées, vomissements et parfois un exanthème de type maculo-papuleux. Plus rarement, des atteintes neuroméningées, pouvant être mortelles, de type méningite ou méningo-encéphalites sont rencontrées. Des cas de paralysies flasques aiguës semblables à celles rencontrées dans la poliomyélite ou des cas évoquant un syndrome de Guillain-Barré, ont été rapportés aux Etats-Unis chez l’homme (Ahmed et al., 2000). A la différence de ce qui est observé chez les oiseaux, ces espèces ne développent généralement pas une virémie suffisante pour permettre la transmission du virus à des vecteurs compétents, lors d’un repas sanguin.
45 Chez le cheval, le niveau de virémie est au maximum de 103 particules virales/ml (Bunning et al., 2002). L’homme et le cheval sont ainsi considérés comme des culs-de-sac épidémiologiques (Zientara, 2002).
Les reptiles peuvent potentiellement contribuer à la persistance du virus dans un environnement donné par la virémie soutenue qu’ils développent (Desenclos et al., 2009).
Figure 12: Cycle de transmission du virus West Nile (d’après Huhn et al. (2003)). Les oiseaux sont les hôtes amplificateurs du virus. Les moustiques s’infectent lors d’un repas sanguin. La présence de moustiques vecteurs, à la fois ornithophiles et mammophiles est responsable de la transmission du virus à des mammifères sensibles dont l’homme et le cheval. Ces hôtes ne développent pas une virémie suffisante pour permettre la transmission du virus à des vecteurs compétents, lors d’un repas sanguins et sont des culs de sac épidémiologiques. En revanche, des cas de transmission directs suite à une transfusion sanguine, des greffes d’organes, par voie transplacentaire ou par le lait maternel ont été rapportés.
Les mécanismes de la persistance du virus en dehors de la période d’activité des vecteurs restent mal connus. La transmission transovarienne du virus à la descendance est décrite pour certains flavivirus, comme ceux de la dengue ou de la fièvre jaune, avec des vecteurs du genre Aedes. Elle a été rapportée pour certaines espèces de Culex avec des taux bien moindres, les Culex étant considérés comme des vecteurs peu efficaces en terme de transmission verticale pour le VWN (Goddard et al., 2003).
Oiseaux
Cycle enzootique Maintenance
Vecteur moustique
Hôtes accidentels
Individu à individu (transfusion de sang, transplantation d’organe, transmission via le placenta, ou le lait maternel).
