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Submitted on 6 Jun 2020
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Construction et caractérisation d un clone infectieux du virus West Nile souche hautement virulente IS-98-ST1
Céline Bahuon, Sylvie Lecollinet, E. Mertens, Steeve Lowenski, Stephan Zientara
To cite this version:
Céline Bahuon, Sylvie Lecollinet, E. Mertens, Steeve Lowenski, Stephan Zientara. Construction et car-
actérisation d un clone infectieux du virus West Nile souche hautement virulente IS-98-ST1. XIIIème
Journées Francophones de Virologie, Apr 2011, Paris, France. pp.1, 2011. �hal-02811471�
Production et
validation du virus recombinant:
Construction du clone infectieux IS98 : CONTEXTE :
Céline BAHUON
1, Sylvie LECOLLINET
1, Muriel COULIER
1, Eva MERTENS
2, Stéphan ZIENTARA
1, Philippe DESPRES
2.
1
UMR1161 Virologie, AFSSA, INRA, ENVA, 23 avenue du Général de Gaulle, 94703 MAISONS-ALFORT, France
2
Unité Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôte, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS cedex 15, France
Le clone infectieux du Virus West Nile, souche IS-98-ST1, comme outil pour étudier les déterminants moléculaires de la
neurovirulence
pBR322+2+3+4
Figure 6 : Un marquage par immunofluorescence avec un anticorps anti-NS1 a permis de montrer l’expression de la protéine virale sur des cellules Vero transfectées avec le virus P1 WN IS98 recombinant .
PERSPECTIVES:
Cet outil nous permettra de faire des mutants ou des chimères impactant sur la virulence du virus issu de ce clone infectieux, et ainsi préciser les déterminants moléculaires de la neurovirulence du virus West Nile.
Figure 1: Stratégie de clonage du génome du VWN, IS-98-ST1.
En noir, sites de restriction utilisés pour le clonage, en rouge site de coupure dans le fragment 2 utilisé pour la reconstitution du clone infectieux.
Figure 2: Constructions obtenues. A gauche:
plasmide pCR2.1 avec les fragments 1 et 2. A droite: plasmide pBR322 avec les fragments 3 et 4, et la partie 3’ du fragment 2.
Cellules Vero transfectées pCMV PCR haute-fidélité
Clonage en pCR2.1 (4 fragments, séquençage et insertion d’un site de restriction dans NS3 pour discriminer virus sauvage/Clone Infectieux)
Digestions enzymatiques
Clonage en pBR322 comportant un gène synthétique (5’ et 3’NC)ou en
pCR2.1
Apa I Age I Xma1 BsiwI SpeI NsiI
Protéines Structurales
Protéines Non Structurales
Virus West Nile
Virus West Nile Virus West Nile
Réservoir Aviaire
Infection Accidentelle
Infection Accidentelle
Source: CDC
Moustique
Cycle de transmission du virus West Nile et Répartition géographique mondiale en
2010 Les études portant sur les déterminants moléculaires de la
neurovirulence utilisent des clones infectieux de souches hautement pathogène New York 1999 (NY99) (Beasley et al., 2005), et peu virulentes d’origine africaine (956) (Yu et al, 2005) ou australienne (Kunjin) (Liu et al, 2003).
Or le contexte européen a sa propre spécificité et est peu étudié. Nous avons comme objectif de travailler sur un clone infectieux Israël 1998 (IS98), souche hautement pathogène à l’origine d’une épidémie importante dans le bassin méditerranéen.
OBJECTIFS :
Figure 3: Construction finale comprenant les fragments 1 à 4.
Promoteur= Sp6/transcription in vitro, pas d’expression en système procaryote…Ribozyme HDV: fragments ARN arrêtés en 3’UTR
Cellules infectées avec le virus clone infectieux cellules infectées avec IS 98
Cellules électroporées sans ARN
Contrôle Anticorps secondaire
cellules infectées avec le virus recombinant
Figure 4: Linéarisation du plasmide par digestion enzymatique avec l’enzyme Bam HI.
Transcription in vitro avec le Kit Sp6 MEGAscript High yield transcription (Ambion).
ssRNA Marker (biolabs)
9000 nt 11000 nt
Figure 5: Transfection de cellules Vero avec le transcrit.
FCS= Serum de veau fœtal. ECP = effet cytopathogène.
P1, SNT -80°C 7x10e7 pfu/ml 700 ng ARN + 6x10e6 Vero
(400 µ l PBS) 25 µ F capacitance 0.29 kV
4 pulses à 4s interval 10 ml DMEM + 2% FCS
2 jours à 37°C, CO2 P0, SNT -80°C 1.4x10e7 pfu/ml Infection de nouvelles
cellules avec le surnageant P0
ECP 3 jours à 37°C
ECP
Figure 7 : Cinétique d’infection sur cellules Vero. Les ARN viraux ont été extraits des cellules et amplifiés par RT-PCRq (Linke et al., 2007). Il n’y a pas de différence significative entre les deux virus (p<0.05).
Log ((nombre copies ARN viral/ Nombre copies ARN B actine)*1e9)
Figure 8 : Courbes de survies des groupes de 5 souris balb/c de 6 semaines infectées en intra peritonéal à différentes doses de virus IS98 ou clone infectieux (CI). Il n’y a pas de différence significative entre les deux virus (p<0.05).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
0 20 40 60 80 100
IS98 1pfu IS98 10pfu IS98 100pfu IS98 1000pfu CI 1pfu CI 10pfu CI 100 pfu CI 1000pfu PBS
Days post-infection
% survie
Jours post infection
Beasley , Whiteman , Zhang , Huang , Schneider , Smith , Gromowski , Higgs , Kinney and Barrett (2005). Envelope Protein Glycosylation Status Influences Mouse Neuroinvasion Phenotype of Genetic Lineage 1 West Nile Virus Strains.
J.Virol. p. 8339–8347 Vol. 79, No. 13
Liu, Chen, and Khromykh (2003). Molecular and Functional Analyses of Kunjin Virus Infectious cDNA Clones Demonstrate the Essential Roles for NS2A in Virus Assembly and for a Nonconservative Residue in NS3 in RNA Replication. J.Virol. p. 7804–7813 Vol. 77, No. 14
.
Yu and Markoff (2005). The Topology of Bulges in the Long Stem of the Flavivirus 3 Stem-Loop Is a Major Determinant of RNA Replication Competence. J.Virol. p. 2309–2324 Vol. 79, No. 4
