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Contribution à l’étude de la séparation des protéines par chromatographie d’échange d’ions en milieu complexe.
Effet du poids moléculaire sur l’équilibre et la cinétique de rétention
Manel Wakkel
To cite this version:
Manel Wakkel. Contribution à l’étude de la séparation des protéines par chromatographie d’échange d’ions en milieu complexe. Effet du poids moléculaire sur l’équilibre et la cinétique de rétention.
Biochimie, Biologie Moléculaire. INSA de Toulouse, 2015. Français. �NNT : 2015ISAT0023�. �tel- 01230948�
Remerciements
Je remercie le ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche qui m’a accordé une allocation de recherche pour réaliser cette thèse au Laboratoire d’Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés (LISBP) de l’INSA-Toulouse, au sein de l’équipe Séparation, Oxydation et Procédés Hybrides pour l’Environnement (SOPHYE).
Je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements à ma directrice de thèse, Maria Aurora FERNANDEZ, de m’avoir accompagné, encouragé et soutenu tout au long de ce travail doctoral. Ses compétences, ses réflexions, ses commentaires précieux et sa rigueur scientifique m’ont beaucoup appris. Je tiens également à remercier ma co- directrice de thèse Sandrine ALFENORE pour sa disponibilité, ses conseils et les nombreux échanges scientifiques qui m’ont constamment permis de progresser.
J’aimerai aussi remercier Stéphane MATHE pour son encadrement et son soutien ainsi que pour son accompagnement durant mon expérience pédagogique.
Je remercie vivement les membres du jury, qui ont accepté d’évaluer mon travail. Je remercie Monsieur Bruno GABRIEL, qui a bien voulu présider le jury. Je remercie Mesdames Laurence MUHR et Claire FARGUES pour l’honneur qu’elles m’ont fait pour leur participation à mon jury de thèse en qualité de rapportrices de mon travail. Je leur suis très reconnaissante pour l’intérêt qu’elles ont porté à mes travaux de recherche et pour les suggestions et les remarques judicieuses qu’elles m’ont indiquées. Je remercie également Monsieur Pierre Yves PONTALIER et Madame Charlotte CABANNE pour toute l’attention dont ils ont fait preuve en examinant ce manuscrit et pour l’honneur qu’ils m’ont fait en participant à ce jury.
Je voudrais remercier Jean Luc GAUFFIER du Laboratoire de Physique et Chimie des Nano-Objets (LPCNO, Toulouse) de m’y avoir accueilli et formé sur la MEB-EDX.
Je tiens à remercier également Isabelle FOURQUAUX du Centre de Microscopie Electronique Appliqué à la Biologie (CMEAB, faculté de médecine de Toulouse) pour l’acceuil et les nombreuses discussions qu’on a eu. Mes remerciements s’adressent aussi à Laurent AUGIER d’Agri Sud-Ouest Innovation pour l’occasion offerte pour participer au club ‘’agroraffineries et multidébouchés’’ ainsi que pour le support financier pour la participation au congrès international.
J’aimerais bien remercier mes professeurs Féthi ZAGROUBA et Khemaies ZAYANI pour leur soutien et leurs encouragements durant ces années de thèse.
Je remercie l’ensemble du laboratoire LISBP et particulièrement l’équipe SOPHYE de m’avoir soutenu et aidé au cours de ces années de thèse. Je voudrais remercier particulièrement Dominique BASTOUL pour sa bonté de cœur et son soutien.
Je tiens également à remercier tous mes amis et collègues du labo Ming, Nga, Syrine, Neila, Claire, Angélica, Mathias, Allan, Ana, Nour, Hector, Wael, Marie, Cheng- Cheng et Rania pour leur soutien et les bons moments partagés.
Un merci particulier à mes amies Nadia, Zayneb, Hana, Ines, Kaouther, Asma, Amel, samar, hind, Nejia et Salma pour leur soutien et leur belle compagnie durant mon séjour à Toulouse.
Une pensée très spéciale pour mes parents Mustapaha et Fathia. Je les remercie avec une grande émotion pour leur irremplaçable et inconditionnel soutien. Malgré mon éloignement, leur confiance, leure tendresse et leur amour me portent et me guident tous les jours. Leur présence et leurs encouragements sont pour moi les piliers fondateurs de ce que je fais et de ce que je suis.
Mes profonds sentiements de gratitude s’adressent à mes frères:
Un grand merci pour Nabil qui a su me soutenir, me supporter et m’encourager pendant toute la durée de ma thèse.
Un merci tout particulier à Chokri pour ses encouragements répétés, pour son soutien sans faille, sa bonté de cœur ainsi que pour les surprises venant de l’autre bout du monde.
Une mention spéciale à Dali qui m’a toujours supporté, encouragé et émerveillé par ses visites surprises sur Toulouse qui m’ont apporté que des ondes positives.
Un énorme merci pour mon petit Bassem qui était toujours là pour moi. Je le remercie pour son soutien depuis mon bac (Archaeopteryx, Ichthyostega) jusqu’
aujourd’hui.
Merci pour tous les bons moments passés ensemble…
Je remercie mes belles sœurs Ines et leila qui m’ont soutenu et encouragé durant ces années de thèse.
Au final, je voudrais remercier tous ceux qui m’aiment et qui ont cru en moi …
TABLES DES MATIERES
Liste des figures ……….. 14
Liste des tableaux……… 24
INTRODUCTION GENERALE………...30
CHAPITRE I. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE……….………..40
I. Procédés chromatographiques pour la séparation des protéines……….42
I.1. Les différents procédés chromatographiques……… 43
I.1.1. La chromatographie d’exclusion stérique……… 43
I.1.2. La chromatographie d’interactions hydrophobes……….44
I.1.3. La chromatographie d’affinité……….44
I.1.4. La chromatographie d’échange d’ions (CEI)………... 44
I.2. Les résines chromatographiques échangeuses d’ions……… 46
I.2.1. Classification selon les groupements fonctionnels………...46
I.2.2. Classification selon la matrice chromatographique………..47
a) Les polysaccharides réticulés homogènes……….48
b) Les polymères macroporeux à base de polymères synthétiques………... 49
c) Les matrices tentaculaires……… 49
d) Les matériaux composites basés sur le concept de « gel in shell »………..50
I.3. Propriétés intrinsèques des résines chromatographiques d’échange d’ions…...52
I.3.1. Capacité d’échange d’ions……… 52
I.3.2. Distance entre les groupements fonctionnels et leur densité……… 53
I.3.3. Taille des particules………..54
I.3.4. Structure interne des échangeurs : porosité, tortuosité et taille des pores……… 56
I.4. Conclusion………. 57
II. Les protéines : Structure et propriétés intrinsèques……… 58
II.1. Structure des protéines………...58
II.2. Les propriétés intrinsèques des protéines……….59
II.2.1. Charge……….59
II.2.2. Distribution des charges………..61
II.2.3. Hydrophobicité / hydrophilie des protéines……… 62
II.2.4. Activité de surface des protéines et modifications conformationnelles………..63
II.2.5. Poids moléculaire……… 64
II.2.6. Diffusivités effective et moléculaire des protéines………. 66
II.3. Conclusion……… 68
III. Interactions mises en jeu et facteurs influençant la rétention de protéines en
chromatographie d’échange d’ions……….69
III.1. Interactions électrostatiques……….70
III.2. Interactions hydrophobes………. 70
III.3. Comportement des protéines à l’état adsorbé……….71
III.3.1. Adsorption et changements conformationnels des protéines……….72
III.3.2. Adsorption et orientation des protéines………. 72
III.3.3. Interactions latérales……….. 74
III.3.4. Adsorption multicouches, réversibilité et désorption……… 75
III.4. Interactions mises en jeu dans les systèmes multi-solutés………..77
III.5. Facteurs physico-chimiques influençant les interactions dans le procédé d’échange d’ions……….. 79
III.5.1. pH……….. 79
III.5.2. Température………...79
III.5.3. Force ionique………. 80
III.5.4. Concentration initiale des protéines………...82
III.6. Conclusion……….. 83
IV. Equilibre d’échange d‘ions……… 84
IV.1. Les modèles d’équilibre d’échange d’ions………...86
IV.1.1. Modèle de Langmuir………. 87
a) Isothermes non compétitives………....87
b) Isothermes compétitives (Bellot, 1994)………..88
c) Conclusion………...90
IV.1.2. Loi d’action de masse……… 91
a) Isotherme non compétitive………91
b) Isothermes compétitives……… 95
c) Conclusion………...96
V. Transfert de matière dans les résines échangeuses d’ions………...96
V.1. Le transfert externe ou diffusion dans le film………...97
V.2. Le transfert interne ou diffusion intra-particulaire………...99
V.2.1. Modèle de diffusion dans les pores……….. 100
V.2.2. Modèle de diffusion superficielle………. 102
V.3. Identification des mécanismes cinétiques……… 104
V.3.1. Bilan de matière dans le réacteur fermé……… 105
V.3.2. Résolution des bilans de matière : cas limites……….. 106
V.4. Conclusion……….. 107
CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES……….110
I. Support chromatographique………. 112
I.1. Caractérisation de la résine……… 114
I.1.1. Caractérisation morphologique……….. 114
I.1.2. Taux d’humidité………. 114
I.1.3. Porosité et tortuosité de la résine……… 115
I.1.4. Distance entre les groupements fonctionnels de la résine……….. 115
I.1.5. Capacité d’échange d’ions……….. 115
II. Protéines………. 117
II.1. Protéines pures (BSA et ferritine)……… 117
II.1.1. Caractérisation des protéines pures………... 117
a) Taille des protéines………. 117
b) Potentiel Zêta………118
II.2. Rubisco………... 119
II.2.1. Préparation du jus de luzerne……… 119
II.2.2. Caractérisation du jus de luzerne……….. 120
a) Caractérisation conventionnelle……….. 120
b) Teneur globale en protéines……….. 121
c) Dosage des protéines hydrophobes et hydrophiles……… 121
II.3. Méthodes analytiques pour le dosage des protéines………... 122
II.3.1. Quantification des protéines par spectroscopie UV……….. 122
II.3.2. Absorption atomique………. 123
II.3.3. Quantification des protéines par HPLC-SEC……… 123
II.3.4. Validation des méthodes analytiques……… 129
III. Protocoles expérimentaux……….. 130
III.1. Etude de l’équilibre et de la cinétique d’échange d’ions dans un milieu modèle………. 130
III.1.1. Préparation de la résine……… 130
III.1.2. Protocole expérimental pour la détermination des isothermes……… 130
III.1.3. Protocole expérimental pour l’étude des cinétiques d’échange d’ions……… 132
III.2. Protocole expérimental des expériences de chromatographie en lit expansé pour le traitement des jus verts……… 133
III.2.1. Dispositif expérimental de la chromatographie préparative (Kerfai, 2011)… 133
III.2.2. Séparation de la Rubisco à partir de jus de luzerne en lit expansé………….. 134
CHAPITRE III. EQUILIBRE ET CINETIQUE DE LA RETENTION DES PROTEINES MODELES EN SYSTEME MONO- ET MULTI- CONSTITUANT………...136
PUBLICATION 1: Equilibrium and Kinetics of High Molecular Weight Protein Uptake in Ion Exchange Chromatography ... 140
Abstract………... 140
I. INTRODUCTION……….. 140
II. Theory……… 142
A. Uptake Equilibrium……….. 142
B. Kinetics of IEC System………. 143
III. Material and Methods………... 146
A. Chromatographic Media……….. 146
B. Proteins……….. 146
C. Uptake Equilibrium………. 146
D. Kinetic Study………. 147
IV. Results and Discussion……… 148
A. Uptake Equilibrium……….. 148
1) Low molecular weight protein: BSA case………... 150
2) High molecular weight: Ferritin case……….. 150
3) Comparison of BSA and ferritin………. 152
B. Kinetic Study………. 154
V. Conclusion………. 157
Acknowledgment……… 157
References………157
PUBLICATION 2: Competitive adsorption of low molecular weight (LMW) and high molecular weight (HMW) proteins in model mixtures by Q HyperZ chromatographic medium. Part I. Equilibrium uptake.. ... 162
Abstract………... 162
I. Introduction……… 162
II. Material and methods………... 167
II.1. Chromatographic matrix……….. 167
II.1.1. Q HyperZ structure……… 169
II.1.2. Ionic Capacity of Q Hyper Z………. 171
II.2. Proteins………... 172
II.2.1. Protein size……… 172
II.2.2. Radius of gyration………. 173
II.2.3. Molecular diffusivity………. 174
II.2.4. Zeta potential………. 174
II.3. Protein analysis by HPLC-SEC………175
II.4. Experimental protocols for equilibrium uptake determination in binary solution……… 177
II.4.1. Simultaneous uptake experiments………. 177
II.4.2. Sequential uptake experiments in binary system……….. 178
III. Theoretical models for multicomponent adsorption equilibrium……….. 178
IV. Experimental results and discussion……….. 180
IV.1. Simultaneous uptake experiments……….. 180
IV.2. Sequential uptake experiments in binary system……….. 185
V. Conclusions……… 188
ACKNOWLEDGEMENTS……….. 189
REFERENCES………... 189
PUBLICATION 3: Competitive adsorption of low molecular weight (LMW) and high molecular weight (HMW) proteins in model mixtures by Q HyperZ chromatographic medium. Part II: mass transfer mechanisms. ... 194
Abstract………... 194
I. Introduction……… 194
II. Theoretical basis……… 198
III. Experimental……… 200
III.1. Materials………...200
III.2. Kinetic experiments………. 201
III.2.1. Simultaneous uptake experiments………201
III.2.2. Sequential uptake experiments……… 201
IV. Results and discussion………. 202
IV.1. External mass transfer……… 202
IV.1.1. BSA uptake………. 202
IV.1.2. Ferritin uptake………. 203
IV.2. Internal mass transfer………. 205
IV.2.1. Single adsorption kinetics……… 205
IV.2.2. Multi-component adsorption kinetics……….. 206
V. Conclusions……… 213
ACKNOWLEDGMENT……… 214
REFERENCES………... 214
CHAPITRE IV. MISE AU POINT D’UNE METHODE D’ANALYSE PAR MEB-EDX POUR LA LOCALISATION DES PROTEINES AU SEIN DE LA RESINE Q HYPERZ………218
I. Introduction………... 220
II. Principe de l’analyse microscopique……… 222
II.1. Principe de fonctionnement……….. 222
II.2. La microanalyse X………. 223
III. Préparation des échantillons……….. 227
III.1. Déshydratation………. 227
III.2. Inclusion de l’échangeur Q HyperZ dans une matrice résineuse d’enrobage227 III.3. Découpage………. 229
III.4. Métallisation………. 230
III.5. Optimisation de la matrice résineuse d’inclusion………. 230
III.5.1. Cas de la matrice résineuse Methacrylate LR-white (tableau IV.1)………… 230
III.5.2. Cas de la matrice résineuse époxy Embed 812-Araldite 502 (tableau IV.2)... 230
III.5.3. Cas de la matrice résineuse époxy Embded 812 (tableau IV.3)……….. 231
III.5.4. Conclusion………... 232
IV. Les paramètres de l’analyse MEB – EDX………. 232
IV.1. Tension d’accélération………. 232
IV.2. L’intensité du faisceau électronique………... 233
IV.3. Choix du temps d’acquisition………. 233
IV.4. Distance de travail (WD)………. 233
V. Résultats………. 234
V.1. Echangeur sous forme dihydrogénophosphate………... 234
V.1.1. Carte spectrale………... 234
V.1.2. Profil de concentration……….. 236
V.1.3. Cartographie X……….. 236
V.2. Identification de la BSA adsorbée dans l’échangeur d’ions……….. 236
V.2.1. Carte spectrale et profil des concentrations……….. 237
V.2.2. Conclusion……… 237
V.3. Echangeur contenant de la Ferritine………... 240
V.3.1. Carte spectrale, profil des concentrations et cartographie……… 240
V.3.2. Conclusion……… 242
V.4. Echangeur contenant de la Rubisco………. 242
V.4.1. Profil des concentrations et cartographie……….. 242
V.4.2. Conclusion……… 243
VI. Conclusions……….. 244
CONCLUSION GENERALE……… 246
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……… 256
ANNEXES……….. 278
Annexe I. Analyse des composantes principales (ACP) appliquée à la séparation de la Rubisco à partir du jus de luzerne en lit expansé ... 280
I. Principe de la méthode ACP………. 281
I.1. Table de données………. 281
I.2. Etude des corrélations……… 282
I.3. Composantes principales et cercle de corrélations……….. 282
II. Méthode ACP appliquée à l’étude du procédé chromatographique de séparation de la Rubisco en lit expansé……… 284
II.1. Définition des données……….. 284
II.2. Matrice des corrélations………287
II.3. Analyse des composantes principales……….. 289
II.3.1. Choix du nombre de composantes à retenir……….. 289
II.3.2. Cercle de corrélation………. 291
II.4. Conclusions……… 292
Annexe II. Matériel et méthodes………... ... 294
LISTE DES FIGURES
16 INTRODUCTION GENERALE
Figure 1. Chromatogramme obtenu par HPLC-SEC d’un échantillon de jus vert centrifugé et
filtré. ... 34
CHAPITRE I. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Figure I.1. Exemples de procédés chromatographiques pour la séparation des protéines : (A) Chromatographie d’échange d’ions, (B) Chromatographie d’exclusion stérique, (C) Chromatographie d’affinité (Alberts et al., 2002). ... 44
Figure I.2. Mécanisme d’échange d’ions d’une protéine (Bosma et Wesselingh, 1998) ... 45
Figure I.3. Les échangeurs anionique et cationique (Acikara, 2013) ... 46
Figure I.4. Comparaison de la structure des résines échangeuses d’ions: (A) médias conventionnels,(B) à base de matériau synthétique (C) à base de matériau composite (Pall Corporation, 2005). ... 48
Figure I.5. Structure ‘’gel in shell’’ (Pall corporation, 2015) ... 50
Figure I.6. Résine Céramique-HyperD (Pall corporation, 2015) ... 51
Figure I.7. Tortuosité de la résine échangeuse d’ions (O’Connell et al., 2010) ... 57
Figure I.8. Structure d'un acide aminé (A) et schéma de la liaison peptidique (B) (Balme, 2005) ... 58
Figure I.9. Structures primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire des protéines ... 59
Figure I.10. Notion de point isoélectrique et effet du pH sur la charge d’une protéine ... 60
Figure I.11. Structure et répartition en 3D du potentiel électrostatique (en rouge les charges négatives et en bleu les charges positives)(Balme, 2005) ... 61
Figure I.12. Influence de la symétrie de la distribution de la charge d’une protéine sur le nombre de liaisons protéine-support (Nicolas-Simonnot, 1991). ... 61
Figure I.13. Distribution des charges et des zones hydrophobes à la surface d'une protéine (Scopes 1987) ... 62
Figure I.14. Effet du déploiement de la protéine sur l'interaction avec une surface d’une résine échangeuse d’ions (Dee et al., 2003) ... 63
Figure I.15. Effet de la taille de la protéine sur l’interaction avec une surface d’une résine échangeuse d’ions (Dee et al., 2003). ... 65
Figure I.16. Représentation schématique d’une protéine interagissant avec une surface d’une résine échangeuse d’ions (Andrade, 1985) ... 69
17
Figure I.17. Evolution des interactions électrostatiques et hydrophobes en fonction de la conductivité (Pezzini, 2011) ... 71 Figure I.18. Fixation des protéines par leur coté ‘’side-on’’ et ‘’end-on’’ (Kim et Yoon, 2002)………. 73 Figure I.19. Différentes orientations des molécules de protéines adsorbées résultant de l’hétérogénéité de la protéine et de la surface d’adsorption (Dee et al., 2003) ... 73 Figure I.20. Les orientations possibles d’une protéine à la surface d’un support montrant l’existence de liaison multiples (Chenou, 1993) ... 74 Figure I.21. Adsorption de ß-lactoglobuline et mise en évidence des interactions latérales (Rabe et al., 2011). ... 75 Figure I.22. Effet du temps sur les protéines adsorbées sur une résine d’échange d’ions (Latour, 2005). ... 76 Figure I.23. Interactions mises en jeu en système multi-solutés et mise en évidence de l’effet de Vroman (Latour, 2005). ... ……78 Figure I.24. Profils schématiques SPR et illustration de l'effet Vroman quand (1) la protéine LMW adsorbe d'abord et ensuite la protéine HMW arrive plus tard à la surface. (2) Si la protéine HMW s’absorbe la première et la protéine LMW vient plus tard, aucun changement d'angle ne se produit (Choi et al., 2008). ... 78 Figure I.25. Effet de la concentration en sel sur la solubilité des protéines (« salting in » et
« salting out »). ... .. .80 Figure I.26. Site de liaison entravé suite à la réduction du rayon effectif de la protéine par l’effet du sel (500 mM NaCl) (Lim et al., 2005).. ... 81 Figure I.27. Représentation schématique de l’adsorption d'une protéine globulaire ayant deux régions chargées et hydrophobes en réponse à une force ionique croissante (Hamilton et al., 2000). ... 82 Figure I.28.A Tracé des isothermes pour différentes valeur de la constante d’équilibre. Même valeur numérique pour qR et CS ; n = 2 ;Isotherme linéaire (K =1), isotherme concave (échange favorable à l’ion Pn, K>1), isotherme convexe (échange défavorable à l’ion Pn, K<1). ... 85 Figure I.28.B Tracé des isothermes pour différentes valeurs de la salinité totale (en eq/L). K
= 50 ; qR = 0,01 eq/g ; n = 2. ... 85 Figure I.29. Exemple d’une isotherme de Langmuir ... 88 Figure I.30. Illustration d'une protéine ayant quatre groupes chargés négativement qui interagissent avec quatre groupes chargés positivement sur la surface d’un échangeur d’anions. Les contre-ions sous forme de chlorure situés en dessous de la protéine (région
18
grisée) sont cachés par la protéine, tandis que les contre-ions échangeables sont situés à l'extérieur de la zone grise (Shen et Frey, 2005). ... 93 Figure I.31. Les étapes de transfert de masse dans une particule poreuse (Knappe et Snoeyink, 1995). ... 97
CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES
Figure II.1. Représentation schématique du dispositif expérimental pour la détermination de la capacité d’échange d’ions de la résine Q Hyper Z en lit fixe. ... 116 Figure II.2. Distribution (% vol) de tailles de la BSA et de la ferritine en diamètre de sphère équivalente. Mesures réalisées avec des solutions d’une protéine dans l’eau à 1 g/L et 20°C……….... 118 Figure II.3. Etapes d’extraction du jus de luzerne ... 120 Figure II.4. Représentation schématique de l’appareil de chromatographie liquide à haute performance ... 124 Figure II.5. Allure gaussienne d’un pic chromatographique(ω : largeur du pic à la base et H’:
hauteur du pic)………126 Figure II.6. Différentes méthodes d’intégration des pics (a) intégration baseline/vallée (baseline projection), (b) intégration baseline/vallée (tangent skim), (c) intégration baseline/baseline, (d) intégration vallée/vallée. ... 126 Figure II.7. Chromatogramme montrant le rapport signal/ bruit (S/B) ... 128 Figure II.8. Représentation schématique du dispositif expérimental du procédé chromatographique d’échange d’ions en lit expansé. (1) solution à traiter (jus de luzerne), (2) pompe péristaltique, (3) colonne Streamline 25, (4) détecteur UV en ligne, (5) collecteur de fractions. ... 133
CHAPITRE III. EQUILIBRE ET CINETIQUE DE LA RETENTION DES PROTEINES MODELES EN SYSTEME MONO- ET MULTI-CONSTITUANT
PUBLICATION 1: Equilibrium and Kinetics of High Molecular Weight Protein Uptake in Ion Exchange Chromatography
Fig. 1. Schematic representation of the mass transfer of a protein molecule into porous adsorbent particle [24] ... 144 Fig. 2. Equilibrium uptake of BSA and ferritin by QHyperZ in a 50 mM Tris-HC1 buffer at pH 8.5.Symbols represent experimental data and solid lines represent theoretical results given by Langmuir isotherm. ... 148
19
Fig. 3. Equilibrium uptake of BSA by QHyperZ in a 50 mM Tris-HC1 buffer at pH8.5 for different salt concentrations. Symbols represent experimental data and solid lines represent theoretical results given by Langmuir isotherm. ... 150 Fig. 4. Equilibrium uptake of ferritin by Q-HyperZ media in a 50 mM Tris-HC1 buffer at pH 8.5 for different salt concentrations. Symbols represent experimental data and solid lines represent theoretical results given by Langmuir isotherm. ... 151 Fig. 5. Protein multipoint adsorption [35]... 152 Fig. 6. Effect of salt concentration on the maximum adsorption capacity, Q (A) and the affinity coefficient, KL (B) for BSA and ferritin on Q Hyper Z adsorbent at 25°C (Tris-HCl buffer 50 mM, pH 8.5). ... 153 Fig. 7. Kinetic uptake curves for BSA (A) and ferritin (B) (Tris-HCl buffer 50mM, pH 8.5).
Symbols represent experimental results. Solid lines represent theoretical results calculated by using the homogeneous diffusion model with parameters in Table IV. ... 155 Fig. 8. Ferritin kinetic uptake curves for different initial concentration (Tris-HCl buffer 50mM, pH 8.5). Solid lines represent theoretical results calculated by using the homogeneous diffusion model with parameters in Table IV. ... 156
PUBLICATION 2: Competitive adsorption of low molecular weight (LMW) and high molecular weight (HMW) proteins in model mixtures by Q HyperZ chromatographic medium. Part I. Equilibrium uptake
Figure 1: Q HyperD chromatography resin ‘’gel in shell’’ design (A) structure according to the manufacturer (Pall corporation, 2006) (B) Schematic representation of Hyper D material (black=gel) according to [38]. ... 168 Figure 2: Scanning electron microphotographs showing shape and structure of Q HyperZ adsorbents. (A) Shape of particles, magnified by 200×; (B) Surface structure, magnified by 5000×; (C) Inner structure, magnified by 35000× and (D) Embedded particles cross-sections analysis by EDX-Mapping. ... 170 Figure 3: Protein size distribution (% vol) for (A) BSA and (B) ferritin.. ... 173 Figure 4: (A) HPLC-SEC chromatograms obtained with UV/Vis detector at 280 nm for BSA and ferritin mixtures.. ... 176 Figure 5: Equilibrium uptake of (A) BSA and (B) ferritin by Q HyperZ in batch reactor.
Symbols represent experimental results: () single solution at S/L ratio 1; () single solution at S/L ratio2; () binary solution at S/L ratio 1; () binary solution at S/L ratio 2.
Lines correspond to Langmuir isotherm in single adsorption. Dotted lines correspond to: ( ( ) Langmuir competitive isotherm; ( ) Le Van-Vermeulen competitive isotherm; ( ) Gu et al. [17] competitive isotherm with 12 = QFerritin/QBSA; and finally ( ) Gu et al. [17]
competitive isotherm with 12 = 0.15 (fitted).Theoretical models have been calculated only for S/L ratio 1. ... 182
20
Figure 6: Possible orientations of BSA: orientation A “side-on”, orientation B “end on”
[64]……….. 183 Figure 7: Effect of protein unfolding on interaction with a surface [66] ... 184 Figure 8: Equilibrium uptake of BSA by Q HyperZ determined in batch reactor in simultaneous adsorption experiments (experimental conditions indicated in table 4) at S/L ratio 1 and for different ferritin initial concentrations. () BSA uptake at 1 g/L ferritin initial concentration; () BSA uptake at 2 g/L ferritin initial concentration. Equilibrium uptake for ferritin in these experiments have been also showed () 1 g/L ferritin initial concentration and () 2 g/L ferritin initial concentration. ... 185 Figure 9: Experimental results of single, sequential and simultaneous equilibrium uptake of ferritin by Q HyperZ in batch reactor at S/L ratio 1. () Single adsorption (data from [35]);
() Simultaneous BSA/ferritin adsorption () Sequential BSA/ferritin adsorption. ... 186 Figure 10: Ferritin HPLC-SEC chromatograms obtained from initial solutions (before adsorption) and from supernatant (after adsorption by BSA pre-saturated Q HyperZ in batch reactor at S/L ratio 1). (A) Ferritin initial concentration 0.5 g/L, (B) Ferritin initial concentration 1 g/L. ... 187
PUBLICATION 3: Competitive adsorption of low molecular weight (LMW) and high molecular weight (HMW) proteins in model mixtures by Q HyperZ chromatographic medium. Part II: mass transfer mechanisms
Figure 1: Experimental (symbols) and theoretical (solid lines) results of BSA transient uptake. (A) Evolution of solution concentration with time. () Single adsorption, () Simultaneous adsorption and () Sequential adsorption. Theoretical results have been calculated by considering kinetics controlled by external mass transfer. (B) kf determination from the C/C0 linearized curves. ... 203 Figure 2: Experimental (symbols) and theoretical (solid lines) results of ferritin transient uptake. (A) Evolution of solution concentration with time. () Single adsorption, () Simultaneous adsorption and () Sequential adsorption. Theoretical results have been calculated by considering kinetics controlled by external mass transfer. (B) kf determination from the C/C0 linearized curves. ... 204 Figure 3: Experimental and theoretical results for ferritin single adsorption: (A) Equilibrium uptake: experimental results at S/L ratio= 0.11 g dry resin/L () from this work and at S/L ratio= 0.03 g dry resin/L () from Wakkel et al. [28]. Theoretical results of Langmuir isotherm. (B) Transient uptake: experimental results at S/L ratio= 0.03 g dry resin/L and C0
=0.1g/L (), 1.7 g/L () and 3 g/L () from Wakkel et al. [28]; experimental results for S/L ratio= 0.11 g dry resin/L, C0= 3 g/L () from this work. Theoretical results of the homogeneous diffusion model for De = 2.5 10-14 m2/s... 206 Figure 4: BSA transient uptake in single, simultaneous and sequential adsorption experiments. Symbols represent experimental results: () single adsorption, () simultaneous BSA and ferritin adsorption and ()adsorption (set 2). Solid lines correspond to
21
theoretical results according to the homogenous diffusion model using DeBSA=7.50 10-13 m2/s for single adsorption [28]; DeBSA=9.8 10-14 m2/s for simultaneous adsorption (fitted);
DeBSA=1.15 10-13 m2/s for sequential adsorption (fitted).sequential ... 207 Figure 5: BSA and ferritin transient uptake in simultaneous adsorption experiments. Symbols represent experimental results: () BSA and () ferritin. Solid lines correspond to theoretical results according to the homogenous diffusion model using De=9.8 10-14 m2/s for both proteins (fitted). ... 208 Figure 6: Transient uptakes of BSA and ferritin in simultaneous adsorption experiments.
Theoretical results were calculated according to homogeneous diffusion model for: DeAB= 9.8 10-14 m2/s ( ); DeAB= 1.25 10-13 m2/s ( ); DeAB= 1.55 10-13 m2/s ( ). ... 211 Figure 7: BSA and ferritin transient uptake in sequential adsorption experiments. Symbols represent experimental results: () BSA and () ferritin. Solid lines correspond to theoretical results from the homogenous diffusion model: De=8.0 10-14 m2/s for set 1 and De=1.57 10-13 m2/s for set 2 (fitted). ... 212
CHAPITRE IV. MISE AU POINT D’UNE METHODE D’ANALYSE PAR MEB-EDX POUR LA LOCALISATION DES PROTEINES AU SEIN DE LA RESINE Q HYPERZ Figure IV.1 Microscope électronique à balayage couplé au détecteur EDX (Menguy, 2015)………... 222 Figure IV.2 Interaction faisceau d’électrons incident – matière (A) poire d’interactions, (B) électrons et rayonnement émis (Menguy, 2015)……… ... …223 Figure IV.3 Les trois modes de la microanalyse X (Faerber, 2008) ... 224 Figure IV.4 Carte spectrale EDX (Zagora, 2013) ... 225 Figure IV.5 Profils de concentration (exemple de l’échangeur Q HyperZ sous forme dihydrogénophosphate) ... 226 Figure IV.6 (A) Instrumentation de découpe des échantillons. (B) Représentation schématique de l’étape de la découpe des particules incluses dans une matrice résineuse par un couteau diamant (Lipomi et al., 2010). ... 229 Figure IV.7 Micro-coupes déposées sur une grille en cuivre fixée sur un film carbone adhésif………. 230 Figure IV.8 Micrographies électroniques à balayage des coupes (300 nm) de particules d'échangeur incluses dans la matrice résineuse méthacrylate (A : 150x, B : 500x) ... 231 Figure IV.9 Micrographies électroniques à balayage des coupes (300 nm) de particules d'échangeur incluses dans la matrice résineuse Embded 812-Araldite 502 (C: 500 x, D:
1000x). ... 231
22
Figure IV.10 Micrographies électroniques à balayage des coupes de particules d'échangeur incluses dans la matrice résineuse Embded 812 (E: 300 nm, F: 500 nm) ... 232 Figure IV.11 Effet de la tension d’accélération sur la poire d’interactions entre l’échantillon analysé et les électrons (Ruste, 2012) ... 233 Figure IV.12 Analyse spot des microcoupes de l’échangeur Q hyperZ sous forme dihydrogénophosphate aux grossissements 350x (A) et 7500 x (B), carte spectrale réalisée au point 5 (C). ... 235 Figure IV.13 Cartographies spectrales des micro-coupes des particules d’échangeur Q HyperZ : (A) définition de la zone d’analyse ; (B) analyse du phosphore ; (C) analyse du Zirconium.. ... 236 Figure IV.14 Analyse spot des microcoupes de l’échangeur Q hyperZ saturé en BSA aux grossissements 350x (A) et 7500 x (B), carte spectrale réalisée au point 4 (C). ... 238 Figure IV.15 Profils de concentration des éléments zirconium, phosphore, soufre, Chlore et Sodium dans l’échangeur Q HyperZ saturé en BSA. ... 238 Figure IV.16 Analyse semi-quantitative (A) et Carte spectrale (B) réalisées au point 20 des micro-coupes de l’échangeur Q Hyper Z saturé en ferritine. ... 240 Figure IV.17 Profils de concentration des éléments zirconium, phosphore, soufre, chlore et sodium dans l’échangeur Q HyperZ saturé en ferritine. ... 241 Figure IV.18 Cartographie spectrale du fer sur les micro-coupes de l’échangeur Q HyperZ saturé en ferritine ... 241 Figure IV.19 Profils de concentration des éléments zirconium, phosphore, soufre, chlore et sodium dans l’échangeur Q HyperZ chargé en Rubisco. ... 242 Figure IV.20 Cartographies spectrales des micro-coupes des particules d’échangeur Q HyperZ chargé en Rubisco : (A) Définition de la zone d’analyse, (B) analyse du zirconium, (C) analyse du phosphore et (D) analyse du soufre.. ... ….243
ANNEXES
Annexe I. Analyse des composantes principales (ACP) appliquée à la séparation de la Rubisco à partir du jus de luzerne en lit expansé
Figure A.I.1 Analyse de la variabilité et cercle de corrélation ... 283 Figure A.I.2 Chromatogrammes HPLC-SEC des jus de luzerne d’alimentation ... 284 Figure A.I.3 Courbes de percée de la Rubisco obtenues lors des expériences : () 1, () 2, () 3 et () 4. ... 285
23
Figure A.I.4 Courbes d’élution de la Rubisco obtenues lors des expériences : () 1, () 2, () 3 et () 4. ... 286 Figure A.I.5 Représentation de l’analyse de la variabilité ... 290 Figure A.I.6 Cercle de corrélation des paramètres selon les deux composantes principales retenues. ... 292 Annexe II. Matériel et méthodes
Figure A.II.1 Courbes d’étalonnage utilisées pour la mesure des concentrations de protéines pures en solution par spectroscopie UV-Vis : (A) BSA ; (B) ferritine. Représentation de l’absorbance à 280 nm en fonction de la concentration. ... 294 Figure A.II.2 Courbe d’étalonnage utilisée pour la mesure de la concentration en fer par absorption atomique. Représentation de l’absorbance en fonction de la concentration en fer………294 Figure A.II.3 Détermination de la concentration en ferritine à partir de celle de fer. Cette relation est considérée inhérente à la composition de la protéine, et donc valable quelle que soit la gamme de concentration en fer mesurée. ... 295 Figure A.II.4 Courbe d’étalonnage de la colonne chromatographique d’exclusion de taille Shodex KW-804 : représentation du poids moléculaire en fonction du volume d’exclusion en échelle semi-log. ... 295 Figure A.II.5 Courbe d’étalonnage utilisée pour la mesure de la concentration de Rubisco par HPLC-SEC (DO à 280 nm) : concentration de Rubisco en fonction de l’aire du pic chromatographique. ... 296 Figure A.II.6 Courbe d’étalonnage utilisée pour la mesure de la concentration de ferritine par HPLC-SEC (DO à 280 nm) dans les solutions en mélange avec la ferritine : aire du pic chromatographique en fonction de la concentration de ferritine dans la solution étalon. ... 296 Figure A.II.7 Courbe d’étalonnage utilisée pour la mesure de la concentration de BSA par HPLC-SEC (DO à 280 nm) dans les solutions en mélange avec la ferritine : aire du pic chromatographique en fonction de la concentration de BSA dans la solution étalon. ... 297 Figure A.II.8 Validation des méthodes analytiques : comparaison des mesures de concentration en ferritine déterminées par HPLC-SEC (DO à 280 nm) et par spectroscopie UV-Visible (280 nm). ... 297 Figure A.II.9 Validation des méthodes analytiques (expériences série 1) : comparaison des mesures de concentration en ferritine déterminées par absorption atomique (mesure du fer) et par HPLC-SEC (DO à 280 nm). ... 298 Figure A.II.10 Validation des méthodes analytiques (expériences série 2) : comparaison des mesures des concentrations en BSA en mélange avec la ferritine à la même concentration (CBSA1), avec les mesures de concentration de BSA dans une solution contenant 1 g/L de ferritine. Mesures réalisées par HPLC-SEC (DO à 280 nm). ... 298
LISTE DES TABLEAUX
26 CHAPITRE I. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau I.1 Groupements fonctionnels des échangeurs anioniques et cationiques ... 47 Tableau I.2 Propriétés moléculaires influençant l’activité de surface et l’adsorption des protéines (Gonnet et Gonnot, 1990) ... 63 Tableau I.3 Propriétés des protéines (poids moléculaires, coefficient de diffusion moléculaire et rayon de giration) (a) : Hunter et Carta (2002) ; (b et c):Tyn et Gusek (1990) ... 68
CHAPITRE II. MATERIEL ET METHODES
Tableau II.1 Caractéristiques de la résine échangeuse d’anions Q HyperZ® (Pall Corporation)………113 Tableau II.2 Propriétés physico-chimiques de la résine Q Hyper Z déterminées ou estimées…. ... 116 Tableau II.3 Propriétés physico-chimiques de la BSA et la ferritine ... 119 Tableau II.4 Caractéristiques physico-chimiques de différents jus de luzerne ... 122 Tableau II.5 Paramètres HPLC –SEC pour le dosage des protéines ... 124 Tableau II.6 Marqueurs pour la calibration qualitative de la colonne HPLC-SEC ... 125 Tableau II.7 Facteurs de correction des aires des pics de la BSA en mélange ... 127 Tableau II.8 Conditions expérimentales utilisées pour la détermination des isothermes. .... 132 Tableau II.9 Conditions expérimentales utilisées pour l’étude de la cinétique d’échange. .. 133
CHAPITRE III. EQUILIBRE ET CINETIQUE DE LA RETENTION DES PROTEINES MODELES EN SYSTEME MONO- ET MULTI-CONSTITUANT
PUBLICATION 1: Equilibrium and Kinetics of High Molecular Weight Protein Uptake in Ion Exchange Chromatography
Table I: Langmuir Parameters for BSA and Ferritin Uptake by Q HyperZ media in a 50mM Tris-HCI Buffer at PH 8.5 ... 149 Table II: Langmuir Parameters for BSA uptake by q HyperZ media in a 50 mM Tris-HCI Buffer at PH 8.5 ... 151 Table III: Langmuir Parameters for Ferritin Uptake by Q HyperZ Media in a 50 mM Tris- HCI Buffer at pH 8.5 for Different Salt Concentrations ... 152
27
Table IV: Kinetic Parameters Obtained from the Homogeneous Diffusion Model for Bsa and Ferritin Uptake by Q HyperZin 50 mM Tris–HCl Buffer a: [6] ... 155 PUBLICATION 2: Competitive adsorption of low molecular weight (LMW) and high molecular weight (HMW) proteins in model mixtures by Q HyperZ chromatographic medium. Part I. Equilibrium uptake
Table 1: Q HyperZ and Q HyperD properties ... 169 Table 2: BSA and ferritin properties ... 175 Table 3: Experimental conditions for the first set of simultaneous uptake equilibrium in binary system ... 177 Table 4: experimental protocol for simultaneous protein adsorption in binary-system ... 178 Table 5: Experimental conditions for sequential protein adsorption ... 178 PUBLICATION 3: Competitive adsorption of low molecular weight (LMW) and high molecular weight (HMW) proteins in model mixtures by Q HyperZ chromatographic medium. Part II: mass transfer mechanisms ... 194 Table 6: Experimental conditions used in both simultaneous and sequential adsorption experiments. ... 201 Table 7: External mass transfer coefficients for BSA in single and multicomponent adsorption experiments (Rp=3.7510-5 m). ... 203 Table 8: External mass transfer coefficients for ferritin in single and binary adsorption experiments. ... 204 Table 9: Interdiffusion coefficient of ferritin and BSA estimated from simultaneous adsorption experiments.Values of qFerritin and qBSA are from experiments. DeA(ferririn)=2.5 10-
14m2/s (this work), DeB(BSA)=7.5 10-13 m2/s [28]. ... 210 Table 10: Interdiffusion coefficient of ferritin and BSA estimated from sequential adsorption experiments. Values of qFerritin and qBSA are from experiments. DeA(ferririn)=2.5 10-14 m2/s (this work), DeB(BSA)=7.5 10-13 m2/s [28]. ... 213 CHAPITRE IV. MISE AU POINT D’UNE METHODE D’ANALYSE PAR MEB-EDX POUR LA LOCALISATION DES PROTEINES AU SEIN DE LA RESINE Q HYPERZ………218 Tableau IV.1. Les différentes matrices résineuses d’inclusion et leurs propriétés ... 228 Tableau IV.2. Composition de la matrice résineuse Embed 812-Araldite 502 (commercialisée par Electron Microscopy Science) ... 228 Tableau IV.3. Composition du kit Embed 812-hard (commercialisé par Electron Microscopy Science) ... 228
28
Tableau IV.4. Concentrations massiques normalisées à 100 % des éléments correspondant aux différents points sélectionnés sur la figure IV.12 ... 235 Tableau IV.5. Concentrations massiques normalisées à 100 % des éléments correspondant aux différents points sélectionnés sur la figure IV.14 ... 237
ANNEXES
Annexe I. Analyse des composantes principales (ACP) appliquée à la séparation de la Rubisco à partir du jus de luzerne en lit expansé ... 280 Tableau A.I.1. Exemple d’une matrice de corrélation, r i,j est le coefficient de corrélation . 282 Tableau A.I.2. Conditions expérimentales utilisées lors du procédé chromatographique de séparation de la Rubisco en lit expansé. ... 285 Tableau A.I.3. Paramètres étudiés en ACP ... 286 Tableau A.I.4. Variables et réponses analysées dans le cadre de l’étude préliminaire par ACP………..287 Tableau A.I.5. Matrice des coefficients de corrélations déterminée à partir des expériences réalisées en lit expansé pour les paramètres définis dans le tableau 3 Abs(valeur) = 1 : forte corrélation ; Abs(valeur) = 0 : variables dé-corrélées ... 287 Tableau A.I.6. Matrice des p-values déterminée à partir des expériences réalisées en lit expansé pour les paramètres définis dans le tableau 3. P-value > 0.95 : forte corrélation ; P- value< 0.05 : variables dé-corrélées ... 288 Tableau A.I.7. Résultats sur la composition des composantes principales en fonction des paramètres étudiés ... 289 Tableau A.I.8. Analyse de la variabilité ... 290 Tableau A.I.9. Composantes principales sélectionnées ... 291
INTRODUCTION GENERALE
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La purification des biomolécules comme les protéines représentent 80 à 90% des coûts totaux de production dans l'industrie des biotechnologies (Costa et al., 2014). Parmi les procédés disponibles, les techniques chromatographiques sont particulièrement bien adaptées pour la séparation des biomolécules. Le succès de la chromatographie liquide à l’échelle préparative réside dans sa capacité à atteindre des facteurs élevés de purification, tout en préservant l'intégrité des biomolécules labiles. Ainsi elle permet d’obtenir des produits purs, concentrés et non dénaturés.
Actuellement, la chromatographie sur résine échangeuse d'ions est une des méthodes de purification et de concentration des protéines la plus utilisée industriellement car elle assure des rétentions quantitatives et des résolutions élevées. Cette technique exploite la propriété des protéines à présenter une charge variable selon le pH du milieu et elle est appliquée généralement sur des milieux pré-purifiés, plus compatibles avec un fonctionnement en lit fixe. Cependant, les milieux naturels ou biologiques contenant des protéines sont généralement complexes, et contiennent des matières en suspension et dissoutes de tailles et masses moléculaires différentes. Dans la pratique, compte tenu de la nature du milieu initial, le besoin d'obtenir une fraction pure de protéines contraint à l’utilisation d’une combinaison de différentes opérations unitaires (clarification, concentration et purification primaire), désignés fréquemment par « downstream processes ».
La complexité et le coût associés aux procédés de séparation ainsi que la perte potentielle de rendement ont conduit depuis quelques années à déployer des efforts importants pour séparer et concentrer la molécule cible directement à partir des milieux bruts. L’objectif est d’obtenir une réduction significative du temps et du coût du procédé en plus d’un gain de rendement par rapport aux procédés traditionnels. Avec la mise en ouvre de la technologie dite du lit expansé (Expanded Bed Adsorption ou EBA), les étapes de clarification, de concentration et de purification initiale peuvent être combinées en une seule opération unitaire, fournissant ainsi une économie accrue du procédé et une réduction du temps de traitement (Jun et al., 2009).
Parmi les innovations apportées par les procédés chromatographiques en lit expansé, le développement de nouveaux supports chromatographiques, ou l’adaptation des ceux existant pour les applications classiques en lit fixe, peuvent être mis en avant (Birger Anspach et al., 1999) : la fluidisation des particules, qui permet de réduire drastiquement les pertes de charge dans les colonnes, nécessite des vitesses de traitement plus importantes, et donc les temps de
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contact entre les solutions et le support sont réduits. Cela contraint à utiliser des particules adaptées à l’hydrodynamique du lit expansé (denses et de distribution granulométrique bien établie), par ailleurs capables d’assurer des vitesses de diffusion des molécules élevées pour réduire au maximum les limitations par le transfert de matière. Les résines composites denses s’avèrent donc a priori compatibles avec les traitements à haut débit tout en permettant une rétention optimale des protéines (Cabanne et al., 2004).
Une étude antérieure réalisée dans l’équipe à l’échelle du laboratoire (Kerfai, 2011) a permis d’étudier un procédé chromatographique pour la séparation d’une protéine végétale, la Rubisco (Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygénase), à partir de jus de luzerne. En dépit de la complexité du milieu, l’étude a mis en évidence une étonnante performance dans la purification et la concentration de cette protéine avec une seule étape de traitement en utilisant la résine composite Q HyperZ (Biosepra, Pall Corporation). En outre, la force ionique importante de la solution ne provoque qu’une faible diminution de la capacité d’adsorption dynamique de cette protéine de haut poids moléculaire (560 kDa). Or les protéines de grande taille (High Molecular Weight ou HMW) ont un intérêt industriel croissant dans des applications cosmétiques, pharmaceutiques, ou agroalimentaires (Van de Velde et al., 2011), notamment lorsqu’elles sont d’origine végétale.
Afin de progresser dans l’analyse et la compréhension des procédés chromatographiques appliqués à la séparation des protéines du type HMW à partir de milieux complexes (comme c’est le cas du procédé de séparation de la Rubisco mentionné précédemment), nous avons appliqué une approche globale d’Analyse en Composantes Principales (ACP). En effet, la variabilité des paramètres physico-chimiques inhérente à la matière première naturelle utilisée (jus de luzerne issus de coupes différentes et préparés différemment) rend le contrôle et l’analyse du procédé chromatographique difficile et justifie l’utilisation de cette approche.
L’objectif d’une ACP (dont les bases sont décrites dans l’annexe 1) est de permettre, sur la base d’une analyse statistique, de dégager l’influence des paramètres (variables imposées et réponses obtenues) sur le procédé, et leurs couplages éventuels. On cherche essentiellement à identifier les paramètres qui expliqueraient la variabilité des réponses et qui pourraient être regroupés sous la forme d’un ou plusieurs ensembles appelés composantes principales.
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Dans ce travail, seule une analyse préliminaire a pu être réalisée, car le nombre total d’expériences utilisées (4) est inférieur au nombre normalement admis comme minimum pour une analyse statistiquement correcte. En effet, la réalisation expérimentale étant lourde et très contrainte dans le temps par les récoltes de la plante, cette première analyse cherchait à vérifier rapidement si des tendances se dégageaient et, donc, si l’effort consenti pour la mise en œuvre de la méthode était pertinent. La démarche mise en œuvre et les résultats obtenus sont synthétisés dans l’annexe 1.
L’ACP a mis en évidence une composante principale constituée des paramètres caractéristiques de la performance du procédé (i.e. facteur de concentration, rendement d’élution, quantité de Rubisco récupérée), du pH et de la pureté de l’alimentation. Cette dernière a été définit comme le ratio entre la quantité de protéines d’intérêt initialement présentes dans le milieu (protéine HMW) et les autres molécules « contaminantes » de plus petites tailles. La figure 1 montre un exemple de chromatogramme obtenu par HPLC-SEC du jus de luzerne (Kerfai, 2011) et permet de mieux appréhender la notion de pureté comme définit ici. En effet, la pureté initiale du jus en protéine d’intérêt est apparue comme un paramètre clé impactant la performance du procédé.
Figure 1. Chromatogramme obtenu par HPLC-SEC d’un échantillon de jus vert centrifugé et filtré.
Par la suite, des approches plus classiques ont été développées pour étudier les aspects fondamentaux de l’équilibre et de la cinétique d’échange d’ions dans le cas de la séparation
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d’un mélange contenant au moins deux protéines, et en particulier dans le cas où au moins une des protéines a un poids moléculaire très élevé.
Malgré l'utilisation étendue de la chromatographie d'échange d'ions dans le domaine des bio- séparations, les mécanismes de séparation des protéines de HMW n'ont pas été complètement élucidés et les fondements théoriques restent mal connus (Acikara, 2013). Or, suite aux résultats obtenus dans le cadre de la séparation de la Rubisco (Kerfai, 2011), des hypothèses avaient été énoncées, auxquelles ce travail se proposait de répondre : (i) quel(s) mécanisme(s) peuvent expliquer ce résultat ? (ii) Existe-t-il une localisation spécifique pour la fixation de la molécule sur l’échangeur d’ions qui rend plus simple et efficace sa récupération lors de l’étape d’élution ?
En effet, des phénomènes d’exclusion stérique (rendant difficile l’accès aux sites de l’échangeur pour les protéines de plus grande taille (Gu et al., 1991 ; Johnston and Hearn, 1991)), l’effet Vroman (Rabe et al., 2011) ou des modifications conformationnelles ou de ré- orientation (Yu et al., 2015) peuvent affecter tout particulièrement les biomolécules de HMW.
Dans la littérature, de nombreux travaux se sont intéressés aux études thermodynamique et cinétique des séparations chromatographiques, mais ils concernent quasi-systématiquement des protéines de poids moléculaire inférieur à 300 kDa (Martin et al., 2005, Hunter et Carta, 2002).
Le comportement des protéines dans les procédés chromatographiques est généralement caractérisé par les isothermes d’adsorption, établies pour différentes conditions de pH et de force ionique, et par les étapes de transfert qui limitent cinétiquement le procédé. La modélisation des équilibres d’adsorption et de leur cinétique est donc indispensable à la compréhension et à la prédiction des performances d’un procédé chromatographique.
Néanmoins, la prise en compte de l’ensemble de ces phénomènes devient très difficile lorsque la séparation est réalisée directement à partir d’un milieu brut, quel que soit son origine, végétale ou biologique. Ainsi, la description des isothermes d’équilibre dans les milieux multi-constituants est possible et a été réalisée dans des conditions bien définies, bien que leur caractère prédictif reste très limité. Lorsque l’échangeur a des capacités maximales différentes pour les protéines considérées (notamment lorsque leur poids moléculaire est très différent) la
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modélisation est bien plus complexe, et des modèles physiquement simplifiés (Gu et al., 1991) ne permettent pas de représenter les observations que dans certains cas simplifiés.
En ce qui concerne la cinétique, la vitesse des phénomènes d'échange d'ions est généralement toujours limitée par des étapes de transferts, représentées par des bilans « globaux » qui ne fournissent pas d'information directe sur les événements se produisant à l’intérieur des échangeurs. Fernandez et al. (1995) ont montré dans certains systèmes la difficulté, voire l’impossibilité, de discrimination des mécanismes cinétiques à l’intérieur des échangeurs par la seule évolution de la concentration des espèces concernées en solution. De même, Carta et al. (2005) concluent sur l’intérêt des mesures microscopiques locales pour caractériser des profils de concentration dans les phases stationnaires afin d’améliorer la compréhension des phénomènes mis en jeu au cours de la séparation des protéines par échange d'ions. La microscopie confocale à balayage de laser (Ljunglöf et al., 2007) a été ainsi parfois utilisée pour localiser des protéines à l’intérieur des échangeurs mais ces travaux n’ont jamais concerné des protéines de HMW.
Ce travail s’est attaché à caractériser et à analyser l’équilibre et la cinétique d’adsorption des protéines dans un système modèle choisi pour mettre particulièrement en évidence l’effet du poids moléculaire et donc de la taille des protéines sélectionnées. Bien évidemment, dans la réalité, il est impossible de distinguer l’effet de la taille proprement dite de celui d’autres aspects physico-chimiques qui lui sont indissociables, comme la charge de surface, la conformation spatiale, etc... Pour cela, des protéines représentatives des propriétés physico- chimiques à étudier ont été sélectionnées et des expériences ont été réalisées dans des conditions de travail bien définies.
Des études aux échelles macroscopique et microscopique ont été réalisées, et pour ces dernières, des questions restent encore en suspens. Dans cette approche, il a fallu s’appuyer sur les compétences internes au laboratoire, mais il a aussi été nécessaire d’établir des collaborations avec des laboratoires extérieurs.
Dans ce travail, la démarche a été :
- utiliser la ferritine (450 kDa, pI = 4,4) en tant que protéine globulaire de HMW, à la place de la Rubisco de luzerne (PM = 560 kDa ; pI =4,6 non commercialisée). En plus
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d’avoir un poids moléculaire très supérieur aux protéines habituellement étudiées dans les procédés chromatographiques d’échange d’ions, elles ont aussi des points isoélectriques (pI) proches.
- d’utiliser l’albumine de sérum bovin ou BSA (66,5 kDa, pI = 4,9) comme protéine de référence, représentative notamment des protéines de faible poids moléculaire (LMW), et qui a fait l’objet de nombreux travaux.
- de déterminer les isothermes d’échange d’ions de ces protéines dans des conditions contrôlées voire maîtrisées et de les modéliser.
- d’étudier l’effet de la force ionique sur les isothermes d’échange d’ions de la ferritine, afin d’approcher d’éventuels phénomènes plus ou moins spécifiques à la rétention des protéines de HMW.
- de déterminer le comportement dynamique (cinétique d’échange d’ions) de la rétention de la ferritine, et de le modéliser, afin d’établir son comportement au sein de l’échangeur.
- d’analyser ces mêmes comportements en situation de compétition entre la Ferritine et la BSA.
Afin de présenter l’ensemble des résultats obtenus, et les discussions qui peuvent en découler, ce mémoire est organisé de la manière suivante :
Le premier chapitre expose le cadre théorique de l’étude. En effet, dans cette partie bibliographique, une description des propriétés physico-chimiques des protéines et des supports chromatographiques est réalisée, en mettant l’accent sur les différentes interactions protéines/support ainsi que sur les facteurs physicochimiques régissant le procédé chromatographique. Des rappels génériques sur l’équilibre et la cinétique d’échange d’ions sont également fournis tout en développant les différents modèles reportés dans la littérature pour les systèmes mono- et multi-solutés.
Le deuxième chapitre est consacré à une description détaillée des matériaux utilisés dans ce travail, des dispositifs expérimentaux et des techniques analytiques utilisés. La méthode d’analyse microscopique par MEB-EDX mise au point est présentée, tout comme l’optimisation qui a été effectuée pour les différentes étapes de préparation des échantillons.
Les protocoles expérimentaux suivis dans les essais de séparation de la Rubisco à partir de jus de luzerne brut utilisés pour l’analyse par ACP en lit expansé ont été également détaillés. La
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résine d’échange d’ions Q HyperZ utilisée dans ce travail est décrite et caractérisée de manière approfondie.
Les troisième chapitre est dédié à l’étude de la rétention de la Ferritine sur la résine d’échange d’ions en réacteur discontinu « batch » avec l’objectif d’analyser les aspects liés à l’équilibre et la cinétique d’échange. Ce chapitre se présente sous forme de publications, publiées ou soumises, enrichies d’une introduction et d’une conclusion spécifiquement développées.
Dans le premier article, les expériences portent sur la détermination de l’équilibre et de la cinétique des protéines se trouvant dans des solutions modèles contenant une seule protéine.
Les effets de la force ionique sont alors étudiés et des efforts de modélisation des isothermes obtenues sont réalisés. Dans les deuxième et troisième article, les expériences réalisées avec des solutions contenant les deux protéines modèles ont permis de caractériser l’échange lorsqu’elles sont chargées simultanément ou séquentiellement dans la résine. Les phénomènes observés sont décrits et des interprétations sont proposées, aidés de la modélisation, pour autant que cela a pu être possible.
Enfin, dans le quatrième et dernier chapitre, les expériences et les résultats obtenus dans l’étude réalisée à l’échelle microscopique par MEB-EDX sont décrits et discutés. Plusieurs approches ont été essayés afin de déterminer les profils de concentration des protéines dans les particules d’échangeur, afin de déterminer notamment si la taille de particule y jouait un rôle important. Cette méthode qui se trouve à un stade très avancé de développement, n’a pas encore permis de conclure faute de sensibilité suffisante des sondes actuellement à disposition. Récemment, la commercialisation des sondes plus sensibles (WDX) permet d’envisager une issue plus satisfaisante à ce travail.
Enfin, les principaux résultats de ce travail et les conclusions auxquelles il nous a emmenés seront synthétisés, en essayant de dégager les conclusions plus intéressantes. Les principales perspectives qui se dégagent de cette thèse de doctorat seront finalement exposées.
Pour conclure cette introduction, il est important de mentionner une difficulté à laquelle nous avons été confrontés tout le long de ce travail: l’utilisation généralisée, parfois abusive, du terme adsorption dans la littérature. En effet, d’un point de vue des phénomènes physiques
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mis en jeu, l’échange d’ions et l’adsorption ne sont pas équivalents, le premier étant soumis à des contraintes spécifiques (notamment l’électro-neutralité). Malgré l’effort consenti pour éviter ce type de confusion, l’utilisation du terme adsorption est demeurée parfois nécessaire en particulier dans la partie bibliographique, car ce terme est très largement utilisé sans distinction des phénomènes physiques sous-jacents, ce que nous avons tenu à respecter.
