A. Matériels et méthodes :

Nos travaux expérimentaux concernent principalement l'étude phytochimique des feuilles d’olivier (Olea europea L) .Ils consistent à identifier le maximum de composés de haute valeur ajoutée présents dans la plante, afin d'élargir et d'approfondir la connaissance phytochimique de cette plante.

L’objectif phytochimique correspond, en effet, à l'isolement et à la détermination structurale des molécules naturelles des feuilles d’olivier Pour ce faire, nous avons procédé à l’extraction, à la purification de différents phytoconstituants en utilisant diverses techniques de chromatographie (CCM, HPLC). Les métabolites secondaires isolés sont par la suite analysés et caractérisés à l’aide de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire RMN monodimensionnelle.

les quatre extraits obtenus à partir de l’extrait brute des feuilles d’olivier ont été sélectionné en vue de réaliser des tests biologiques concernant leur pouvoir antioxydant in vitro sur le radical libre DPPH, et de mettre en évidence in vitro leur activité antibactériennes vis à vis des différentes souches bactériennes de référence (aromatogramme, CMI,CMB…).

Ces différentes étapes de nos travaux seront développées et détaillées tout au long de cette partie. Mais dans un premier temps, nous aborderons quelques aspects d’ordre technique concernant l’extraction, l’isolement, la purification et l’analyse structurale des composés obtenus.

A. Matériels et méthodes : A- 1. Matériel

1- Matériel végétal :

Le matériel végétal est constitué des feuilles d’olivier (Olea europea L) variété Chemlal qui ont été collectées durant les mois d’ Avril et Mais 2011 de la région de Charef de la wilaya de Djelfa. Après séchage pendant plusieurs jours,à une température ambiante et à l’abri de la lumière solaire dans un endroit bien aéré, , pour préserver au maximum l’intégrité des molécules, les feuilles séchées ont été finement broyées dans un mixeur (Blender série 8011E, Model 38 BL 41).

2 -Microorganismes utilisés

4 souches bactériennes ont été testées :

- 3 souches de références : Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923.

- Proteus mirabilis (Pr 0536040).

3 - Milieux de culture :

Suivant les méthodes employées et selon les souches ; les milieux de culture principalement utilisés sont :

- Gélose Müeller Hinton;

- Gélose Nutritive;

- Bouillon Brain Heart Infusion Broth (BHIB) 4- solvants et réactifs chimiques :

Le méthanol, l’éthanol, ,l’hexane, le chloroforme, l’acétate d’éthyle ,le n-butanol, Na2SO4(bisulfate de sodium) ,l’acide ortho phosphorique H3PO4 et les différents polyphénols (acide gallique , la quercetine) et le réactif de Folin , l’acide ascorbique, carbonate de sodium Na2CO3 ,le chlorure d’aluminium ,le diméthyle sulfoxyde DMSO proviennent tous de (Sigma-Aldrich. Labor chemikalien.

Allemagne). DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl), est obtenus de Fluka.

4- Appareils

- Un spectrophotomètre BECKMAN DU 520 ; - Un rotavapor (Laboratora 4000-efficient Heidolph).

A-2- Méthodes de séparation et de purification ::

 Chromatographie sur couche mince :

La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une technique analytique rapide, simple et peu coûteuse, utilisée au cours de la séparation et de l’identification des métabolites. Elle repose principalement sur le phénomène d’adsorption. Elle s’applique aux molécules pures, aux extraits (mélange complexes de métabolites) et aux échantillons biologiques. Elle permet d’avoir une idée globale des métabolites présents dans un extrait ou une fraction, permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé lorsque les conditions opératoires sont bien déterminées. Elle permet également de suivre la progression d’une réaction étant donné qu’elle indique le nombre de composants dans un mélange réactionnel. La mise en œuvre d’une CCM nécessite plusieurs matériels tel que :

- Une cuve chromatographique : c’est un récipient en verre, de forme variable (selon les manipulations à effectuer) fermé par un couvercle maintenu étanche.

- Une phase stationnaire : c’est une couche d’absorbant étalé uniformément sur un support en aluminium ou en verre de dimensions variables L’adsorbant qui est souvent utilisé est le gel de silice qui permet la séparation de substances lipophiles et hydrophiles d’un mélange.

- La phase mobile : c’est l’éluant, il est composé d’un solvant unique ou d’un mélange de solvant qui migrent lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l’échantillon déposé.

- Les échantillons : ils sont le plus souvent solubilisés dans un solvant volatil qui n’est pas forcément le même que l’éluant.

Le Rapport frontal :

Rf = Distance parcourue par le constituant Distance parcourue par le front de l'éluant

• Le Rf est caractéristique d’une substance donnée pour un éluant déterminé sur un

support «phase stationnaire» donné.

• Le Rf est le même, que le constituant soit pur ou dans un mélange.

• Le Rf ne dépend pas de la concentration du constituant dans le mélange.

74

 Chromatographie en phase liquide à haute performance CLHP

La chromatographie en phase liquide à haute performance (l’abréviation anglaise HPLC - High Performance Liquid Chromatography est plus fréquemment utilisé) est une technique de séparation analytique basée sur l'hydrophobicité des molécules d'un composé ou d’un mélange de composés. L’échantillon à analyser est poussé par un éluant liquide (appelée aussi phase mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire composée de grains solides très fins.

Le débit d'éluant est assuré par une pompe à haute pression. Dans la colonne, les divers composés de l’échantillon sont séparés l’un de l’autre en raison de leurs diverses affinités à l’égard des deux phases – stationnaire et mobile. A la sortie de la colonne les composés sont détectés à l’aide d’un détecteur (pouvant être UV, IR etc.). Dans nos études, des détecteurs UV basés sur la mesure de la longueur d’onde des composés ont été utilisés. Le schéma (fig.II.1.) présente le principe général de la méthode.^



1- Réservoirs des solvants, 2 - Dégazeur, 3 - Valve de gradient d'élution, 4 - Doseur de phase mobile (ou éluant), 5 - Pompe à haute pression, 6 - Vanne d'injection en position "inject", 6' - Vanne d'injection en position "load", 7 - Boucle d’injection de l'échantillon, 8 – Précolonne (éventuelle), 9 - Colonne analytique, 10 – Détecteur, 11 - Acquisition du signal, 12 - Décharge déchets.

A-3. Méthodes d’identification :

 La Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) :

La résonance magnétique nucléaire ou RMN est une technique utilisée pour l’analyse des structures de nombreuses molécules chimiques. Elle sert principalement à la détermination structurale des composés organiques. Les principaux noyaux étudiés sont le proton ¹H, le carbone ¹³C, le phosphore

31P, et l’azote ¹⁵N.

Cette méthode repose essentiellement sur le phénomène de magnétisme. En effet, les noyaux de certains atomes (¹H, ¹³C, etc…) possèdent un moment magnétique nucléaire, c'est-à-dire qu’ils se comportent comme des aimants microscopiques par une grandeur quantique appelée «le spin».^

La technique de RMN étudie le comportement des noyaux atomiques en présence d'un champ magnétique externe. Le champ magnétique appliqué aux produits entraîne un dédoublement des niveaux d'énergie du spin nucléaire, de sorte qu'on puisse induire des transitions entre eux, suite à l'absorption d'une radiation électromagnétique adéquate. Les échantillons

PenchevP.I. (2010) .Étude des procédés d’extraction et de purification de produits bioactifs à partir de plantes par couplage de techniques séparatives à basses et hautes pressions.Thèse de doctorat, Institut National Polytechnique de Toulouse

^ Boudonneu M., (1990). La détection inverse en RMN, Analysis n°1, Vol. 18.

Fig III.1. Schéma principal de la chromatographie en phase liquide à haute performance.

sont dissous dans un solvant deutéré qui peut être du méthanol, du chloroforme, de la pyridine etc… Ces solvants possèdent des déplacements chimiques spécifiques. Le tube contenant l’échantillon est soumis auchamps magnétique permettant l’obtention des spectres utiles à la l’élucidation structurale.^

Parmi les techniques de RMN utilisées au cours de nos travaux sont décrites ci-dessous.

A-3-1. RMN monodimensionnelle (RMN – 1D) - RMN proton (1H)

Le spectre RMN du proton est une méthode puissante utilisée dans la détermination structurale des composés organiques inconnus. Il fournit de nombreuses informations telles que, les différents types d’hydrogènes présents dans la molécule analysée, les différents types d’hydrogènes présents dans l'environnement électronique, le nombre d'hydrogènes

"voisins" d’un hydrogène donné et le déplacement chimique caractéristique de chaque proton.

- RMN carbone (¹³C): DEPT 135°

Dans cette expérience, chaque atome de carbone qui est dans un environnement unique provoque une crête distincte sur un spectre.

Généralement, cette technique permet de mettre en évidence tous les carbones de la molécule. L'analyse se base sur les déplacements chimiques observés en fonction de l'environnement de chacun des atomes de carbone.

Cette expérience permet la mise en évidence des carbones primaires (CH3), secondaires (CH²), tertiaire (CH) et dans une moindre mesure les carbones quaternaires.

La différence majeure entre le DEPT 135° et le Jmod, réside dans le fait que les carbones quaternaires sont détectés avec le Jmod alors qu’ils ne le sont avec le DEPT. ^70

B. Étude phytochimique:

B-1. Obtention des extraits :

^ Canet D., (1991). La RMN : concepts et méthodes. Inter éditions. Paris.

L’étude phytochimique des feuilles d’olivier (Olea europea L) de la variété Chemlal est réalisée à partir des parties aériennes (les feuilles) sèches préalablement broyées. La poudre (250 g) ainsi obtenue est soumise une macération dans un mélange hydroalcoolique à température ambiante (MeOH/eau70/30v/v) cette opération est répétée trois fois avec renouvellement de solvant. Les tros solutions sont réunies. Le filtrat obtenu après filtration sur un papier filtre a été concentré, sous pression réduite, à l'aide d'un rotavapor à la température de 45°C. La liqueur est épuisée, dans une ampoule à décantation, plusieurs fois,successivement, en utilisant des solvants de polarité croissante ; d’abord par l’hexane qui élimine la chlorophylle et les lipides, puis par le chloroforme qui extrait les produits peu polaires , ). La phase aqueuse ainsi obtenue est ensuite imprégnée trois fois avec un volume d'acétate d'éthyle (extraction des monoglycosides), et enfin par le n-butanol qui entraîne les composés polaires et la majorité des hétérosides (pour solubiliser les di et les triglycosides).

Les phases organiques sont séchées sur Na2SO4, filtrées et évaporées sous pression réduite, à l'aide d'un rotavapor (voir la figure IV.2) à la température de 45°C. Dans cet appareil on réalise une évaporation sous vide en utilisant une pompe à vide. Pendant l’évaporation , le ballon est mis en rotation et plongé dans un bain liquide chauffé. L’appareil est muni d'un réfrigérant avec un ballon-collecteur de condensat. La rotation du ballon crée une surface d’échange plus grande et renouvelée permettant donc d’effectuer une évaporation rapide.

L’abaissement de la pression permet d’évaporer le solvant à température réduite, évitant ainsi la dégradation thermique éventuelle des composés. C’est une méthode d’évaporation simple, utile, douce et rapide.

Figure III.2 :Evaporation des extraits par rota-vapeur (Laboratora 4000- efficient Heidolph).

Le schéma ci-dessous présente les différentes étapes de l’extraction jusqu’à l’obtention de la fraction butanolique.

250g de matière végétale sèche

-Macération (MeOH/H2O ; 70/30 ; v/v).

-Filtration.

Exrait Hydroalcoolique

-Evaporation sous vide.

-Hexane( 300ml x3).

-Décantation.

Phase aqueuse Extrait Hexanique:

-Chloroforme (300mlx3).

-Décantation.

Phase aqueuse Extrait Chloroformique:

-Acétate d'éthyle (300ml x3).

-Décantation.

Phase aqueuse Extrait d'acétate d'ethyle:

-n.butanol (300ml x3).

-Décantation.

Phase aqueuse Extrait butanolique:

Fig. III.3 : Les différentes étapes de l’extraction des feuilles

B-2. Quantification et séparation des différents extraits des feuilles d’olivier : B-2-1-Dosage des phénols totaux:

La teneur en composés phénoliques des différents extraits des feuilles d’olivier a été estimée avec le réactif de Folin-Ciocalteu selon la méthode décrite par Singleton et al (1965), ^qui est basée sur la réduction en milieux alcalin de la mixture d’acide phosphotungstique et l’ acide phosphomolybdique de Folin par les groupement oxydables des composés phénoliques en un mélange d’oxydes bleus de tungstène et de molybdène, conduisant à la formation de produits de réduction de couleur bleue. Ces derniers présentent un maximum d’absorption à 765 nm dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de polyphénols présents dans l’échantillon.^

100μl d’extrait sont additionnés à 0.5ml de réactif de Folin -Ciocalteu (dilué dix fois dans l’eau distillée) ; 1,5ml de carbonate de sodium à 20% et 1 ml d’eau distillée sont ajoutés au mélange.les solutions ont été secouées immédiatement et bien mélangées puis elles maintenues à l’obscurité et à la température ambiante pendant 90minutes pour que la réaction accomplisse., l’absorbance de chaque solution a été mesurée à 760nm contre un blanc ( même solution précedante à l’exception de l’extrait phénolique) par un spectrophotomètre BECKMAN DU 520.

La concentration des polyphénols totaux est calculée à partir de l’équation de régression de la gamme d’étalonnage, établie avec le standard étalon l’acide gallique (0.056-0.250 mg/ml) et exprimée en mg d’équivalent d’acide gallique (E.A.G.)/100g d’extrait.

B-2-2-Dosage des flavonoïdes :

L’évaluation quantitative des flavonoïdes dans les différentes fractions est réalisée par dosage direct par le trichlorure d’aluminium d’après une méthode adaptée par Ayoola et al, (2008).^

1 ml de chaque extrait ou du standard (dissous dans le méthanol) avec les dilutions convenables a été ajouté à un volume égal d’une solution aqueuse 2% d’AlCl3 .Après 15 minutes

^ Singleton, V.L., Rossi J.A.( 1965)Colorimetry of total phenolics with phosphomolibdic - phosphotungstic acid reagents.

Amer. J. of Enology and Viticulture, 16, 144-158.

^ Georgé, S., Brat, P., Alter, P., Amiot, J.M. (2005) Rapid determination of polyphénols and vitamin C inplant-derived products. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53: 1370-1373.

^Ayoola G. A., Ipav S. S., Solidiya M. O., Adepoju-Bello A. A., Coker H. A. B. et Odugbemi T. O. 2008. Phytochemical screening and free radical scavenging activities of the fruits and leaves of Allanblackia floribunda oliv (Guttiferae).

International journal of health research., 1 (2) : 81-93.

d'incubation à l’obscurité et à la température ambiante, l'absorbance du mélange est lue à 430 nm.

La teneur en flavonoïdes est déterminée en se référant à la courbe d’étalonnage réalisé par un standard étalon qui est la quercétine à différentes concentrations (0.016 ,0.024, 0.032,0.048, 0.064,0.072m g/ml) dans les mêmes conditions que l’échantillon.

Les résultats sont exprimés en mg d’équivalent de quercétine /par 100 grammes d’extrait (EQ mg/100g d'extrait)

B-2-3-Méthodes de séparation (les méthodes chromatographiques) :

 Chromatographie sur couche mince (CCM)

Les analyses sur couche mince sont réalisées sur des plaques d’aluminium recouvertes d’un gel de silice Silicagel 60 F²⁵⁴ (Merck). Le développement des plaques s’effectue dans des cuves en verre saturées avec l’éluant approprié. Cette phase mobile est constituée d’un mélange binaire ou tertiaire de solvants selon le type de séparation souhaitée.

Nous avons procédé à des tests chromatographiques sur couche mince de gel de silice pour les quatre extraits hexanique, chloroformique, acétatique et butanolique par de multiple système de solvant polaire, apolaire et moyennement polaire qui nous ont mené au bon système de séparation.

Différentsréactifs ont été utilisés pour la révélation des CCM: (l’iode, la vanilline sulfurique et une solution diluée d’acide sulfurique (H2SO4), mélange sulfochromique, une solution d’anysaldehyde).

Les chromatogrammes sur couche mince permettent de vérifier la présence et l’état de pureté des extraits suivis, afin de sélectionner les extraits contenant moins du produits, qui vont subir ensuite des analyses spectrales (HPLC, RMN) pour les identifier.

Chromatographie en phase liquide à haute performance CLHP

Nous faisons appel à l’CLHP pour connaître le nombre de composés existants dans nos extraits (les extraits acétatique ou butanolique).

10 mg de notre échantillon (les extraits acétatique ou butanolique) est dissout dans 10 ml de méthanol pur la solution sera filtrée à travers un filtre propre à l’HPLC de 0,45µm. et 20µl de cette solution est analysé par HPLC ( volume d’injection 20 µl).

Dans les deux cas, l’éluant utilisé est un mélange de 80% acetonitrile et 20% de solution aqueuse d’acide acétique (2 % pour maintenir une valeur de pH fixé à 2,5.).Le débit d’éluant est

égal 1 ml/min. A la sortie de la colonne les composés sont détectés à l’aide d’un détecteur UV basé sur la mesure de la longueur d’onde des composés a été utilisé.

La mesure est performée aux longueurs d’onde suivantes : 280nm, 320nm, 340nm, 360nm ,520nm .des bons spectres UV pour l’analyse des deux extraits ont été obtenu à 280 nm.

Toutes les analyses ont été effectuées à température 38C °.

B-3-Méthodes d’analyse structurale :

Après séparation, L’identification des structures moléculaires organiques de nos extraits se fait par utilisation combinée de la RMN ¹H, ¹³C

Pour la RMN ¹H : 5mg de chaque composé introduit dans un tube à RMN et dessous dans le méthanol deutéré comme solvant.

Pour la RMN ¹³C : la quantité nécessaire pour faire une analyse est 50 mg (une nuit d’accumulation). Les spectres de la RMN proton et du carbone13 ont été enregistrés sur un appareil Bruker AM 500.

Les déplacements chimiques sont exprimés en partie par million (ppm).

C. Activité biologique

1- Évaluation de l’Activité antioxydante (tests in vitro) :

La méthode DPPH^* est largement utilisée en raison de sa simplicité et de la stabilité des résultats.^ L’activité antioxydante des différents extraits des feuilles d’olivier vis-à-vis du radical DPPH a été évaluée spectrophotométriquement en suivant la réduction de ce radical qui s’accompagne par son passage de la couleur violette à la couleur jaune mesurable à 517 nm

 Principe :

En présence des piégeurs de radicaux libres, le DPPH. (2.2 diphenyl 1 picryl hydrazyl) de couleur violette se réduit en 2.2 diphényl 1 picryl hydrazine de couleur jaune (Fig. IV.4.), ce virage de couleur est due à une réaction entre l’électron d’azote (du DPPH^*) et l’atome d’hydrogène de l’hydroxyle (de la substance antioxydante). L’inconvénient de cette méthode est la sensibilité à la lumière. Pour cette raison, la réaction doit être conduite dans l’obscurité et dans un milieu non alcalin.^

^Brand-Williams W., Cuvelier M.E., Berset C.( 1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Food Science and Technology, 28, 25-30.

^Cui Y., Kim D.S, Park K.C. (2005). Antioxidant effect of Inonotus oblique. Journal of Ethnopharmacology, 96, 79-85.

( Forme réduite) (Forme libre)

NO2

O2N

NO₂ N N

NO₂ O₂N

NO2

N

HOR NH

2.2 diphényl 1 picryl hydrazine 2.2 diphenyl 1 picryl hydrazyl

La réduction du DPPH peut être représentée comme suit :

DPPH + R-H DPPH-H + R

 Mode opératoire

L’activité antiradicalaire des extraits est déterminée en utilisant la méthode décrite par Yen et Chien-Ya (2000). ^

Pour le test, les échantillons ont été préparés par dissolution dans le méthanol absolu. Pour tous les extraits ainsi que les contrôles positifs (l’acide ascorbique et l’acide gallique), nous avons préparé des solutions mères dans le méthanol absolu à raison de 1 mg/ml.

À partir de la solution mère une gamme de dilutions pour chaque extrait a été réalisée au cours de ces expériences comprises entre (0.0156- 0.5 mg/ml).

Le DPPH est solubilisé dans le méthanol pour avoir une solution de 0,3 mM. Dans des tubes on introduit 2,5 ml de chaque extrait et on ajoute 1ml de la solution méthanolique au DPPH. A près agitation par un vortex, les tubes sont placés à l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. La lecture est effectuée par la mesure de l’absorbance à 517 nm. L’essai est répété trois fois pour chaque concentration.

Pour chaque dilution on prépare un blanc, constitué de 2,5ml de la solution testée additionnée de 1 ml de méthanol.

^ Yen G. C. et Chen H. Y. (2000). Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. Journal Agricultural and Food Chemistry, 43: 27-32.

Fig. III.4. Réduction du radical DPPH^par un antioxydant

I % = [1 – (AbsÉchantillon / AbsControl négatif)] X 100

Le contrôle négatif est composé de 1 ml de la solution méthanolique au DPPH et de 2,5 ml de méthanol.

Le pouvoir antioxydant des extraits testés s a été estimé par comparaison avec les contrôles positifs (l’acide ascorbique et l’acide gallique). Tous les tests ont été réalisés avec 3 répétitions pour chaque concentration.

 Détermination du pourcentage d’inhibition :

Le pouvoir antiradicalaire des extraits est exprimé en pourcentage d’inhibition du radical DPPH :

Où

I % : Pourcentage d’inhibition;

Abs Échantillon : Absorbance de l'échantillon à 517 nm;

Abs Control négatif : Absorbance du contrôle négatif à 517 nm.

Des pourcentages du DPPH inhibés en fonction des concentrations des différents extraits et en acide gallique et en Ac ascorbique, ont été tracés à la fin de la réaction, afin d'obtenir l’indice IC 50 qui correspond à la concentration d'antioxydant nécessaire pour obtenir environ 50% d’inhibition, pour comparer les extraits entre eux.

2 - Étude de l’activité antibactérienne des E.B (Tests in Vitro) :

Pour ce but, deux types de méthodes ont été abordés en vue de mettre en évidence les effets antimicrobiens des quatre extraits:

- Étude qualitative de l’effet antibactérien des quatre extraits (test de criblage);

- Études quantitative de l’effet antibactérien des extraits chloroformique, acétatique, et butanolique, en déterminant la CMI et la CMB et l’IC50.

Les différents extraits sont utilisés pour tester l’activité antibactérienne vis-à-vis les quatre (04) souches choisies.

2-1- Préparation de l'inoculum :

 Repiquage des souches bactériennes

Les différentes souches bactériennes ont été repiquées par la méthode des stries, puis incubées à l’étuve à 37°C pendant 18 à 24 heures afin d’obtenir une culture jeune et des colonies isolées (des cellules bactériennes à leur phase exponentielle de croissance). Les colonies isolées ont servi à préparer l’inoculum.

 Préparation de la suspension bactérienne :

Afin d'obtenir une suspension bactérienne, des tubes stériles à bouchon à vis contenant de l'eau physiologique stérile ont été inoculés à partir des cultures bactériennes pures et jeunes (sur GN) ultérieurement préparées; ces tubes ont été vortexés pour bien disperser les amas de bactéries, quelque gouttes de cette culture a été dilué dans de l’eau physiologique stérile pour obtenir une suspension légèrement opale dont leur densités optiques (DO) égal à 0,1.

On admet que cette densité mesurée à 625 nm contre un blanc qui est l'eau physiologique stérile grâce à un spectrophotomètre d'absorption moléculaire de type BECKMAN DU 520 est équivalente à 10⁸ufc /ml. La suspension d’inoculum a été en suite diluée 1/10 dans de l’eau physiologique stérile à une concentration finale de 10⁷cfu/ml.

2. 2- Étude qualitative de l’effet antibactérien des extraits des feuilles d’olivier :

bio test de criblage simples et reproductibles est nécessaires pour les étapes de criblage préliminaire et pour guider le processus d’isolement vers les molécule actives.

 Méthode de diffusion des disques sur gélose (antibiogramme):

Principe de la méthode :

La méthode de diffusion sur gélose est l'équivalent de l'antibiogramme où les antibiotiques sont remplacés par nos extraits étudiés.

Cette méthode est effectuée par dépôt de disques stériles (6mm de diamètre, papier Wattman n°1) imprégnés des extraits étudiés sur un milieu gélosé Mueller Hinton (M.H) préalablement coulé dans les boites de pétri et ensemencé par 1ml de micro-organismes testés (10⁷ufc/ml).

Après incubation, la lecture des résultats se fait par la mesure du diamètre (en mm) de la zone d’inhibition (zone claire indemne de colonies autour du disque) à l’aide d’un pied à coulisse.

 Mode opératoire de la méthode :

- Liquéfier le milieu de culture Müeller-Hinton dans un bain marie à 95°C ;

- Verser aseptiquement le milieu dans les boites de pétri à raison de 15ml par boite ; - Laisser le milieux refroidir et solidifier sur paillasse ;

- À partir d’une culture jeune de 18h à 24h en suspension ensemencer le milieu gélosé (M.H) par 1ml et étaler sur toute la surface à l’aide d’un râteau ;

- Après ¼ d’heure, des disques stériles imprégnés d’une quantité d’E.B (5ul) sont déposés à la surface du milieu ensemencé de telle manière que les zones d'inhibitions ne se chevauchent pas.

Après diffusion de nos extraits dans la gélose pendant 20 mn, les boites sont incubées à 37°C, la lecture s'effectue après 24 heures d'incubation

Après incubation, l’absence de croissance bactérienne se traduit par un halo translucide autour du disque dont le diamètre est mesuré à l’aide d’un pied à coulisse (exprimé en mm où le diamètre du disque inclue).

La sensibilité des différentes souches vis-à-vis des extraits est classée, selon le diamètre d’inhibition, selon les critères suivant :

Fig. III.5. Illustration de méthode de diffusion sur gélose (antibiogramme)

 Non sensible (-) : Ø < 8 mm ;

 Sensible (+) : Ø compris entre 9- 14 mm ;

 Très sensibles (++) : Ø 15-19 mm ;

 Extrêmement sensible (+++) : Ø > 20 mm .^

 Test préliminaire :

La méthode de test a été choisie après un essai préliminaire étant donné que les flavonoïdes à la fin d’extraction seront récupérés par un solvant.

On a testé la toxicité de trois solvants (Méthanol, Ethanol, DMSO) Des témoins sans extrait ont été réalisés:

 Contrôle MH +EtOH sans extrait butanolique.

 Contrôle MH +DMSO sans extrait butanolique .

 Contrôle MH +MeOH sans extrait butanolique Chaque essai expérimental est réalisé en duplicata.

Chaque essai expérimental est réalisé en duplicata.

 Nature de l’activité antibactérienne (bactériostatique ou bactéricide) :

La nature de l’activité de chacun des extraits testés a été déterminée par la méthode de Pibiri (2005).^

À partir des aromatogrammes de 48h où il y’a effet antibactérien, repiquer à partir des zones translucides correspondantes à l’aide d’une anse stérile dans le bouillon BHIB, puis incuber à 37°C/24h.

Faire un repiquage à partir du BHIB sur la gélose nutritive en stries et incuber à 37°C/24h.

Observer à l’œil nu la présence ou non de développement bactérien :

 Développement bactérien : l’E.B exerce un effet bactériostatique.

 Absence de développement bactérien : l’E.B exerce un effet bactéricide.

Dans les deux cas, il faut déterminer la concentration minimale à laquelle l’effet est exercé

^ Ponce A.G., Fritz R., Del valle C. et Rouras I. (2003). Antimicrobial activity of essential oils on the native microflora of organic swiss chard. Society of Food Science and Technology (Elsevier).36: 679-684.

^Pibiri M.C. (2005).Assainissement microbiologique de l’air et des systèmes de ventilation au moyen d’huiles essentielles.

Thèse de doctorat. École Polytechnique Fédérale, EPEL. Lausanne (Suisse).

2.3- Étude quantitative de l’effet antibactérien des extraits des feuilles d’olivier:

En se basant sur les essais préalables d’antibiogramme, une étude quantitative de l’activité antimicrobienne a consisté à déterminer des paramètres antibactériens (CMI et CMB) de nos des extraits chloroformique, acétatique, et butanolique des feuilles d’olivier, Pour sa réalisation, nous avons utilisé la méthode de la macrodilution en milieu liquide.

Le suivi de la croissance microbienne sous l’effet des différentes concentrations des extraits est surveillé par la mesure de la densité optique a pour objectif de déterminer la concentration CMI, CMB et IC50, ^qui réduit le taux de la population microbienne de 50% par rapport à celle du contrôle.

a- Préparation de la gamme de concentration de la substance végétale :

^ Atwal R. (2003) Invitro Antimicrobial Activity Assessment of Zymox Otic Solution Against a Broad Range of Microbial Organisms. Int.J.Res.Veterinary Medicine. Raucho Domininguez.California.

Fig. III.6.: Détermination de la nature de l’activité antibactérienne des extraits à tester

Inhibition = (A contrôle –A test) / A contrôle. 100%

La gamme de concentrations des différents extraits a été préparée dans des tubes à essais par la méthode d’une dilution selon une progression géométrique de raison 2 avec des concentrations allant de 2 mg/ml à 0.03mg/ml (les extraits sont dissous dans l’éthanol).

b- Inoculation

Dans une série de 8 tubes stériles à bouchon à vis contenant 5 ml de milieu de culture liquide (BHIB) numérotés de T1 à T8, préalablement contaminé par le germe à tester (1ml de la suspension bactérienne à partir des colonies jeunes préparées plus tôt). Ensuite nous avons ajouté dans ces mêmes tubes 1ml d’extrait à tester de concentration bien connue selon la gamme de concentrations préparées. Cette répartition d’extrait végétal s’est faite de sorte que 1ml d’extrait végétal de 2 mg/ml soit transféré dans le tube T1, celui de 1 mg/ml dans le tube T2 ainsi de suite jusqu’au tube S/32 qui recevra 1ml d’extrait végétal de 0.06 mg/ml. Le tube T8 a servi du témoin de croissance. Les sept premiers tubes (de T1 à T7) sont appelés« tubes expérimentaux » et le dernier tube (T8) est noté « tube témoin de croissance ou TC ». Ces tubes chargés sont incubés à 37°C pendant 24 heures.

Chaque essai expérimental est réalisé en duplicata.

c- Lecture et dénombrement des germes :

La croissance est déterminée après 24h d’incubation par lecture de la densité optique au spectrophotomètre UV/VIS à 625nm. Le pourcentage de l’inhibition de la croissance cellulaire a été calculé par l’équation :

A contrôle : est la densité optique à 625nm de témoin sans extrait (le tube qui représente 100%

de survie).

A test : est la densité optique à 625nm du test.

L’analyse des résultats a permis de tracer les courbes de sensibilité des germes (pourcentage de survie des germes en fonction de la concentration du milieu en extrait).

d - Détermination de la Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) :

La Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) de façon générale est la plus faible concentration d’antimicrobien capable d’inhiber toute croissance visible après un temps d’incubation de 18 à 24 heures. Ici sa détermination s’est effectuée à partir de la mesure de la turbidité induite par la croissance des germes étudiés. La CMI correspondra donc à la plus petite concentration pour laquelle il y a absence de turbidité. Par conséquent c’est le tube où ses densités optiques finale et initiale sont égales.

e - Détermination de la Concentration Minimale Bactéricide (CMB) :

La concentration minimale bactéricide (CMB), est définie comme étant la plus faible concentration pour laquelle les bactéries sont détruites.

Pour sa détermination, Faire un repiquage à partir des tubes expérimentaux déterminés ayant présentés une inhibition totale sur la gélose nutritive en stries puis incubée à 37°C pendant 24 heures. Observer à l’œil nu la présence ou non de développement bactérien.

Selon Marmonier (1990), lorsque le rapport d’activité CMB/CMI d’une substance antimicrobienne est inférieur ou égal à quatre (≤ 4) cette dernière est qualifiée de substance bactéricide et si le rapport CMB/CMI est supérieur à quatre (> 4), alors elle est dite bactériostatique.^

D- Analyse statistique

Une étude statistique des données est réalisée à l’aide du logiciel STATISTICA 5,5 Fr.

Afin de mettre en évidence les différences significatives entre les extraits pour chaque paramètre.

Le dosage des polyphénols, le dosage flavonoïdes et la détermination du pouvoir anti-radicalaire ont été effectués en triplicatas. Alors que les tests d’activité antibactérienne ont été réalisé en duplicata.les résultats sont exprimés en moyenne SEM (écart-type à la moyenne).

Les valeurs d’IC50 (concentration inhibitrice à 50%) sont calculées par la méthode de régression linéaire à partir de la courbe des matrices de corrélations [% inhibition = f(concentration)].La différence entre le contrôle et les différents tests, est déterminée par le test de Student . Une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur suivie du test LSD (la plus petite différence significative) a été appliquée pour les comparaisons simples et la détermination des taux de signification.

^ Marmonier A. A. (1990) Introduction aux techniques d’étude des antibiotiques. Bactériologie Médicale, technique usuelles, 227-236.

D’un autre coté, pour étudier la relation entre le contenu en flavonoïdes et la teneur en polyphénols et entre l’activité antiradicalaire et le contenu en polyphénols totaux et en flavonoïdes des matrices corrélation ont été réalisées. Les valeurs de p≤0.05 sont considérées statistiquement significatives.