Etude des propriétés analytiques d’analogues non cycliques de dihydrobenzopyranes par CPG, HPLC et UV-visible

(1)

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE

SCIENTIFIQUE UNIVERSITE DE JIJEL

FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET INFORMATIQUES DEPARTEMENT DE CHIMIE

MEMOIRE

EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLÔME DE MAGISTER EN CHIMIE OPTION: CHIMIE PHYSIQUE

INTITULE : METHODES PHYSIQUE D'ANALYSE

THEME

Présenté par Louzri Somia

Devant le Jury:

Nom et prénom Grade Etablissement Statut

Dr. Belghobsi M. MCA Université de Jijel Président

Dr. Khelili S. Pr Université de Jijel Rapporteur

Dr. Merabet N. MCA Université de Jijel Examinateur

Dr. Ferkhi M. MCA Université de Jijel Examinateur

Etude des propriétés analytiques d’analogues non cycliques de

dihydrobenzopyranes par CPG, HPLC et UV-visible

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Table des matières

Table de matières Dédicaces

Remerciements Liste des tableaux Liste des figures Introduction générale

Partie I : Synthèse bibliographique

Chapitre I : Synthèse bibliographique sur les dihydrobenzopyranes cycliques et non cycliques

I. les dihydrobenzopyranes cycliques et non cycliques 2

I.1. Synthèse 2

I.2. Propriétés pharmacologiques 4

Chapitre II : Synthèses bibliographique sur les techniques d’analyses utilisées

II.1. Introduction 5

II.2. Chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse 5

II.2.1.Introduction 5

II.2.2. Historique 5

II.2.3. Principe de la chromatographie en phase gazeuse 6

II.2.4. L’appareillage 6

II.2.4.1. Injecteur 6

II.2.4.2. Colonne 8

II.2.4.3. Les phases stationnaires 10

II.2.4.4. Les détecteurs 11

II.2.4.4.1. Catharomètre 11

II.2.4.4.2. Détecteur à ionisation de flamme 11

II.2.5. Le spectromètre de masse 11

II.2.5.1.

La source

¹²

II.2.5.2. L’analyseur 13

II.2.5.3. Le détecteur 16

II.3.La chromatographie liquide à haut performance (HPLC) 17

II.3.2. Principe 17

II.3.3. Instrumentations 18

II.3.3.1. Réservoirs des solvants 18

II.3.3.2. Pompe 19

II.3.3.3. Injecteur ou vanne d’injection 19

II.3.3.4. Colonne 19

II.3.3.5. Détecteurs 21

(3)

II.3.3.6. Enregistreurs 21

II.3.4.Le choix des solvants de la phase mobile 22

II.3.4.1. La polarité 22

II.3.4.1.1.Les gradients d'élution 23

II.3.5. Analyses des chromatogrammes 23

II.3.5.1. Analyse qualitative 23

II.3.5.2. Analyse quantitative 24

II.3.6. Les avantages de la chromatographie liquide haute performance 24 II.4. Spectrophotométrie d’absorption moléculaire UV -visible 24

II.4.2. Définition 24

II.4.3.Appareillage 26

II.4.3.1. Source 27

II.4.3.2. Unité de dispersion 27

II.4.3.3. Cellule d’absorption 28

II.4.3.4. Détecteur 29

II.4.4. Aspect qualitatif 29

II.4.4.1. Spectre UV-visible d’une molécule 29

II.4.4.2. Intérêt analytique des spectres d’absorption UV-visible 30

II.4.5. Aspect quantitatif 30

II.4.5.1.Validité de la loi de Beer-Lambert 30

II.4.5.2. Méthodes de quantification 30

Partie II : Travaux réalisés

Chapitre III : Partie expérimentale

III. Matériel et méthode 33

III.1. Matériels utilisés 33

III.1.1. Chromatographie liquide a haut performance(HPLC) 33 III.1.2 Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG/MS)

33

III.1.3. Spectrophotométrie UV-visible 34

III.2. Produits et solvants utilisé 34

III.3. Echantillons 35

III.4. Protocole général d’analyse 36

(4)

III.4.1 Préparation des solutions 36 Chapitre IV : Résultats et discussion

IV. Résultats et discussion 38

IV.1. Chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse (CG/MS) 38

IV.1.1. Réglage de l’appareillage 38

IV.1 .2. Résultats de l’étude par la CPG-MS 38

IV.2. Chromatographie liquidehaute performance (HPLC) 53

IV.2.1. Les conditions opératoires 53

IV.2.2. Détermination expérimentale du temps mort 53

IV.2.3. Etude des paramètres de rétention des composés analysés (tr, tr’, k’, ) 53

IV.3. Spectrophotométrie UV visible

⁵⁸

Conclusion 61

Annexe

Références bibliographiques

(5)

Remerciements

Je remercie Dieu le clément de m'avoir aidé durant toute ma scolarité et de m’avoir permis d’arriver à ce niveau.

En premier lieu, j'exprime toute ma gratitude à mon encadreur le professeur Smail Khelili pour avoir accepté de diriger mon travail, pour son dévouement, ses précieux conseils, ses encouragements et sa patience. Je le remercie pour la confiance qu’il m’a témoignée en me confiant ce travail et pour m’avoir donné les moyens d’arriver au bout de ce projet. J’ai apprécié sa grande chaleur humaine et sa disponibilité quotidienne.

J’exprime toute ma gratitude aux membres du jury :

Dr Belghobsi M, pour avoir bien voulu présider mon jury.

Dr Merabet N, pour avoir bien voulu examiner ce travail.

Dr Ferhki M, pour avoir bien voulu examiner ce travail.

Je tiens particulièrement à remercier les ingénieurs de laboratoire de biologie surtout, Soumia et rachid.

J’exprime toute ma gratitude aux membres de laboratoire de chimie, naima , aicha , tawhida et Hadia.

Je tiens également à remercier tous les enseignants et à tous ceux qui m a rendu service de prés ou de loin.

(6)

Dédicaces

Je dédie ce modeste travail à ceux qui m’ont soutenu, m’ont encouragé durant toute ma période d’étude, et pour leurs sacrifices consentis .A ceux qui ont toujours voulu que je sois la meilleure : A ma mère et mon père.

Je dédie ce modeste travail à :

Mes enfants : Adem ,aridj et mon mari hakim . Mes frères : Riade,Abdelaziz,mouhamed,Abdelhak.

Mes sœurs :Nadjiba, lina ,djamila et son mari rabeh. aya et willa

A mes familles : filles et garçons ; surtout Messaouda ,widad, ilham , djahida, fahima et moaad.

A tous les étudiants de ma promotion surtout, nouria, moufida, siham, nadira , meriem .

À tous ceux que j’aime

(7)

LISTE DES FIGURES

Figure

n°

Titre

Page

01 Analogue non cyclique de cromakalim 1

02 simplification moléculaire de dihydrobenzopyrane 3

03 Schéma d’un chromatographe en phase gazeuse 6

04 Injecteur pour colonnes remplies 7

05 L’injecteur split/splitless 8 06 Représentation et exemples de colonnes remplies 9 07 Représentation schématique d’une colonne capillaire 9 08 Eléments principaux d’un spectrométrie de masse 12

09 Représentation simplifiée d’un quadripôle 15

10 Représentation simplifiée d’une trappe ionique 16

11 instrumentation de l’HPLC 19

12 Injecteur à boucle à gauche, le remplissage de la boucle à droite, l’injection dans la colonne

20

13 Surface des silices 21

14 l’analyse qualitative d’un chromatogramme 23

15 Spectre électromagnétique de la lumière et domaine UV-visible 25 16 Principe de la spectrophotométrie d’absorption moléculaire 25

17 spectrophotomètre UV/vis à double faisceau 26

18 Montage à optique directe 27

19 Montage à optique inversée 28

20 Cuvette parallélépipédiques en quartz 28

21 Principe de la courbe d’étalonnage à partir d’une gamme d’étalonnage

31

22 Principe d’une gamme d’étalonnage 32

23 Appareille CG/MS 34

24 Programmation en température de l’appareil CG/MS utilisée dans l’analyse des produits.

38 25 Valeurs des facteurs de capacité k’ des différents composés

analysés (fraction volumique de l’acétonitrile = 0.30).

55 26 Effet du facteur de capacité sur la résolution 56 27 Valeurs des facteurs de capacité k’ des différents composés

56 28 Valeurs des facteurs de capacité k’ des différents composés

57

(8)

LISTE DES TABLEAUX

Tableuax n°

Titre page

1 Propriétés de quelques solvants utiles pour la chromatographie en phase liquide

22 2 Conditions chromatographiques expérimentales de l’appareil

CG/MS

34 3 Structures et nomenclature systématiques des composés

analysés.

35 4 La concentration de différentes solutions préparées 36 5 Les temps de rétention des différents composés analysés,

leurs pics moléculaires et pics de base.

38 6 Les conditions chromatographiques expérimentales utilisées. 52 7 Les valeurs de t_mdéterminées expérimentalement. 52 8 Temps de rétention, tr et tr’, et facteurs de capacité k’ des

différents composés, obtenus avec différentes compositions de la phase mobile.

53

9 Valeurs des sélectivités



ij des différents composés analysés (fraction volumique de l’acétonitrile = 0,30).

55



55



55

12 Transitions électronique caractéristiques des composés analysés en spectrophotométrie UV-visible

56

(9)

LISTE DES SCHEMAS

n° Titre Page

1 Voie de synthèse de dihydrobenzopyranes portant des groupes amide, urée et sulfonylurée

2 2 Voie de synthèse des composés cibles A, B et C, des

analogues non cycliques du cromakalim.

3

3 Mode de fragmentation du composé 1 41

(10)

Introduction générale

(11)

Introduction générale

Les dérivés de dihydrobenzopyrane sont suscité l’intérêt des chimistes et des biologistes depuis la découverte du cromakalim, une dihydrobenzopyrane portant un groupe cyano en position 7 et un groupe pyrolidinone en position 4. En effet, ce composé présente un effet relaxant très puissant sur les muscles lisses, en particulier le muscle lisse vasculaire, ce qui a fait de lui un candidat prometteur de futur médicament traitant l’hypertension artérielle, l’asthme et l’incontinence urinaire …etc. Depuis, de très nombreux travaux ont été entrepris pour synthétiser des analogues du cromakalim, cycliques on non cycliques, et d’en étudier les propriétés physicochimiques pharmacologiques. Un des aspects des propriétés est l’aspect analytique qui consiste à étudier les propriétés analytiques par l’usage des techniques d’analyses chromatographiques et spectroscopiques, permettant de faire l’analyse qualitative (identification) et quantitative d’un médicament quelque soit la matrice dans laquelle il se trouve, qu’elle soit minérale ou biologique. Nous avons choisi pour réaliser cet objectif des analogues non cycliques du cromakalim conçus et développés dans notre laboratoire, dont nous développons les détails plus loin dans ce mémoire.

Dans de travaux antérieurs, des analogues non cycliques de cromakalim ont été conçus et développés dans le laboratoire de pharmacologie et de phytochimie (figure1).

O N O H

R₂

R₁

Figure1. Analogue non cyclique du cromakalim.

Ces dérivés résultent de la simplification moléculaire du cromakalim, par ouverture du cycle pyranique, et remplacement du reste pyrolidinone par un amide. Ils ont montré des propriétés vasodilatatrices modérées sur aorte de rats [1]. Dans ce travail nous nous sommes intéressés à l’étude analytique de ces composés par chromatographie liquide à hante performance, par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse et par spectroscopie UV- visible.

(12)

Partie I

Synthèse bibliographique

(13)

Chapitre I

Synthèse bibliographique sur les

dihydrobenzopyranes cycliques et non

cycliques

(14)

I. les dihydrobenzopyranes cycliques et non cycliques I.1.Synthèse

Nous nous sommes intéressés antérieurement aux dihydrobenzopyranes portant de groupes urées, sulfonylurées et amides. Les schémas de synthèse permettant l’accès à ces molécules sont présentés dans le schéma 1[2].

OH X

(CH₂CO)₂O H₂SO₄

OCOCH₃ X

OCH₃ H₃N

AlCL₃

OH

X COCH₃

X = Br ,F ,NHCOCH₃ X = Br ,F

O X

O

Acétone pyrolidine

OCOCH₃ H₃COCHN

CH₃COCL /pyridine

AlCL₃ /CS₂

NaBH₄/MeOH

O X

OH

X= NHCOCH₃ NaOH 10%

O

H₂N

OH

CH₃CN H₂SO₄

O H₂N

NHCOCH₃

O X

NHCOCH₃

CH₃CN H₂SO₄

X = Br ,F HCL 37%

O X

NH₂

O X

NHCOCH₃ X = Br ,F,NO₂

HCL 37%

O X

N H

O R

R=alkyle ,aryle,NHalkyle, NHaryle,NHSO₂aryle

Schéma 1.Voie de synthèse de dihydrobenzopyranes portant des groupes amide, urée et sulfonylurée.

Le schéma débute par l’estérification d’un phénol para-substitué qui se réarrange en présence de chlorure d’aluminium, donnant un ortho-hydroxy-acétophénone substitué. Ce dernier est condensé avec l’acétone en présence de pyrrolidine aboutissant à 4-oxo-dihydrobenzopyrane

(15)

substitué. Ce dernier est réduit en 4-hydroxydihydrobenzopyrane, par le borohydrure de sodium, qui réagit avec l’acétonitrile, selon Ritter, pour donner un N-acétyldihydrobenzopyrane. L’hydrolyse de l’amide précédent avec HCl concentré donne le 4-aminodihydrobenzopyrane, qui réagit avec différents réactifs (chlorure d’acyle, isocyanate, isothiocyanate, sulfonylisocyanate), donnant différents analogues du cromakalim[2].

Les dihydrobenzopyranes non cycliques résultent de la simplification moléculaire de la partie pyranique du cromakalim (figure 2).

O

N O

H

R₁

R₂ O

N O

X

H

R₁

---

la simplification moléculaire

X = F, Cl, Br, NO2

R1 = alkyl or aryl (amide), NHR' (urea), NHSO2Ar (sulfonylurea)

R2 = Me, Et

Figure 2. Simplifications moléculaires de dihydrobenzopyranes cycliques.

La voie de synthèse adaptée est donnée par le schéma 2 ci-dessous. Elle débute par la réaction d’une ortho-alkoxybenzylamine avec un chlorure d’acyle, un isocyanate ou un sulfonylisocyanate, donnant ainsi trois séries d’analogues non cycliques, des dihydrobenzopyranes dérivés du cromakalim[1].

O N O H

R₁

R₁ O

N O H

R₁ N

R₁ H

O NH₂

R₁

O N O H

R₁ N H S

O O

R₂ 1a : R1 = CH₃ 1b : R1 = CH₂CH₃ R₂NCO

CH₂Cl₂

R₂COCl toluene

R₂SO₂NCO diethylether

A B

C

Schéma 2.Voie de synthèse des composés cibles A, B et C, des analogues non cycliques du cromakalim.

(16)

I.2. Propriétés pharmacologiques

Les dihydrobenzopyranes portant des groupes urée, sulfonylurée et amide n’ont pas présenté d’effet inhibiteur de la sécrétion de l’insuline [1,2].Par contre, la plus part des composés ont un effet myorelaxant significatif sur l’aorte de rat, en particulier ceux ayant des groupes urées. Il est intéressant de noter que les dérivés ayant des groupes sulfonylurées et méthylés sur l’azote, compris entre les groupes carbonyle et sulfonyle, présentent un effet inhibiteur de la sécrétion de l’insuline [1,2, 3], et myorelaxant sur l’aorte et sur l’utérus.

Les dihydrobenzopyranes non cycliques portant les restes urée, amide et sulfonylurée sont également été évalués sur la sécrétion de l’insuline et sur l’aorte de rat. Les dérivés portant le groupe urée ont montré un effet inhibiteur significatif sur la sécrétion de l’insuline alors que les autres étaient inactifs; les mêmes profiles ont été affichés sur le modèle d’aorte de rats [4].

(17)

Chapitre II

Synthèses bibliographique sur les

techniques d’analyses utilisées

(18)

II.1. Introduction

Les études ayant comme objectif le développement d’un médicament ou d’un outil pharmacologique, bref une substance bioactive, ne comporte pas uniquement l’étape de synthèse mais, nécessite également l’utilisation de méthodes d’analyses dans le but d’identifier la dite substance, parfois au sein de matrices très complexes comme le milieu biologique, et de ces éventuels métabolites, et de les quantifier avec une très grande précision. Ainsi, nous présentons ci- après les différentes méthodes d’analyses utilisés dans le cadre de ce mémoire de magister, dans l’étude des composés faisant l’objet de ce travail.

II.2. Chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse II.2.1.Introduction

Très nombreux sont les laboratoires de chimie analytique qui sont équipés d’un chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse. La technique est généralement désignée par ses utilisateurs sous le terme abrégé de "GC-MS" pour

"GasChromatography–Mass Spectrometry". La "GC-MS" est aujourd’hui à son apogée et trouve des applications dans des domaines aussi variés que l’industrie agroalimentaire, la médecine, la pharmacologie ou l’environnement [5].

La chromatographie en phase gazeuse est une méthode d’analyse de séparation qui s’applique aux composés gazeux ou susceptibles d’être vaporisés par chauffage sans décomposition (volatiles) [5].Le chromatographe en phase gazeuse est constitué de trois modules :un injecteur, un détecteur, et un four thermostaté, contenant la colonne. La phase mobile qui entraîne l’échantillon dans la colonne est un gaz, appelé gaz vecteur. Les débits, contrôlés avec précision, permettent une grande répétabilité des temps de rétention [6]. Il existe différents types de détecteurs mais, le spectromètre de masse tend aujourd’hui à supplanter tous les autres, car il peut fournir des informations structurales sur les composés séparés par chromatographie.

II.2.2.Historique

On attribue la découverte de la chromatographie en phase gazeuse (CPG) à Archer John Porter MARTIN et Richard Laurence Millington SYNGE, qui publient dès 1941 la théorie de la chromatographie de partage [5, 7]. Ils reçoivent en 1950 le prix Nobel de chimie pour cette découverte qui bouleversera le monde de l'analyse. Les progrès de l'instrumentation (colonne capillaire, détecteurs, ...) et sa relative facilité d'emploi font de la CPG une technique d'analyse de routine essentielle dans de nombreux laboratoires.

(19)

II.2.3. Principe de la chromatographie en phase gazeuse

Le mélange de composés est introduit dans l’injecteur à l’aide d’une seringue et chauffé, de façon à ce qu’il entre dans la colonne sous forme de vapeur. La phase mobile est un gaz chimiquement inerte, appelé gaz vecteur. Celui-ci entraîne avec lui le mélange de composés à travers la colonne qui contient une phase stationnaire. Les composés du mélange traversent la colonne à des vitesses différentes. Lorsqu’ils arrivent à la sortie de la colonne, ils sont détectés par un détecteur qui transmet un signal électrique à un enregistreur. Les résultats apparaissent sur le chromatogramme sous forme de pics de type Gaussien, appelés pics chromatographiques et l’ensemble constitue ce qu’on appelle le chromatogramme [8].

II.2.4. L’appareillage

Un chromatographe est constitué en première approximation de trois organes essentiels:

l’injecteur, la colonne, et le détecteur. L’appareillage est schématisé par la figure 3 ci-dessous.

Figure 3. Schéma d’un chromatographe en phase gazeuse.

II.2.4.1. Injecteur

Il permet d'introduire un liquide qui est vaporisé instantanément avant d'être transféré dans la colonne. Sa température doit être supérieure d'environ 20°C à la température d’ébullition du produit le moins volatil (ayant le point d’ébullition le plus élevé). La figure 4 représente un injecteur, dans lequel le gaz porteur, de préférence préchauffé, entre dans une chambre chauffée, obturée par une pastille d’élastomère, le septum, qui assure l’étanchéité. A l’aide d’une seringue hypodermique de petite capacité, on pique au travers du septum, afin que l’extrémité de l’aiguille arrive au-dessous du niveau de L’arrivée du gaz porteur, puis on pousse le piston pour réaliser l’injection [9].

(20)

Figure 4. Injecteur pour colonnes remplies.

Il existe deux grandes familles d’injecteurs : a- Injecteurs à fuite (split/splitless) (Figure 5)

 le mode d’injection le plus répandu est l’injection en ‘split’ ou injection avec division de flux.

Une électrovanne permet de régler le débit de fuite.

 le gaz vecteur se divise en 2 flux (1% pénètre la colonne)

Si on injecte 1 microlitre, pour un split de 100, il n’y a que 0,01 microlitre qui rentre dans la colonne, le reste est évacué dans l’atmosphère.

 le mode d’injection en ‘splitless’ est utilisé pour des produits très minoritaires ou très dilués dans un solvant. Le mode splitless est recommandé, et dans ce cas tout le produit injecté se retrouve dans la colonne. Les composants de l’échantillon sont volatilisés dans l’injecteur, puis recondensés au début de la colonne refroidie.

(21)

Figure 5. L’injecteur split/splitless[10].

b- Injecteurs sans fuite

 Plus performants que le ‘splitless’ en terme de répétabilité et de sensibilité, l’injection ‘on column’ consiste à introduire directement l’analyte en solution dans la colonne ou précolonne.

 Injection d’un volume bien plus important (10 mL)

 Injection le plus souvent à froid : introduction à l’état liquide en tête de colonne pour éviter la décomposition des substances fragiles. Dans ce système d’injection, une brusque montée de température de l’injecteur est opérée.

II.2.4.2. Colonne

Elles contiennent la phase stationnaire. Elles se présentent sous forme de tubes fins enroulés.

Il existe deux types de colonnes : a- Les colonnes remplies

On distingue les colonnes à remplissage proprement dit, constituées d’une tubulure en verre, acier ou autre métal (les plus fréquentes sont en acier inoxydables), dont les dimensions varient de 2 à 6 mm pour le diamètre intérieur et de 1 à 10 m pour la longueur. Le support remplissant la colonne est constitué de grains dont les dimensions varient de 60 à 70 μm; ils sont à base soit de matériau réfractaire soit de silice. La phase stationnaire est un liquide peu volatil, formant environ 10% de la masse du support non imprégné (figure 6) [9].

(22)

Figure 6 : Représentation et exemples de colonnes remplies [11].

b-Colonne capillaire

Le four contient l’élément clé de la séparation chromatographique : la colonne analytique.

De nos jours, les colonnes utilisées en GC-MS sont des colonnes dites "capillaires". La figure 7 représente une coupe transversale de colonne capillaire. Elle est constituée d’un tube de silice fondue dont la paroi interne est couverte d’un film chimique nommé phase stationnaire. La paroi externe est gainée d’un revêtement en polyimide qui confère souplesse et robustesse à la colonne.

La phase stationnaire est caractérisée par des fonctions chimiques greffées sur la silice. Si ces dernières sont peu polaires (chaînes alcanes ou groupements phényles, par exemple), la colonne est dite peu polaire. Si, au contraire, la phase stationnaire est constituée de composés polaires tels que, par exemple, des polyéthylènes glycols, la colonne est dite polaire. Les constituants d’un mélange sont séparés en fonction de leur polarité si la phase stationnaire est polaire, de leur volatilité si cette dernière est apolaire ; leurs différences de propriétés physicochimiques leur confèrent des vitesses d’élution différentes et ils sont donc séparés en fonction du temps. Confronté à un mélange mixte, on privilégie souvent le choix d'une colonne peu polaire, les phases stationnaires peu polaires étant généralement plus robustes et thermiquement beaucoup plus stables que leurs homologues polaires [12].

Figure 7. Représentation schématique d’une colonne capillaire.

(23)

En plus de la nature de la phase stationnaire, la colonne capillaire est caractérisée par trois paramètres géométriques : sa longueur (de 10 à 100 m), son diamètre interne (de 0,1 à 0,5 mm), l’épaisseur de sa phase stationnaire (de 0,1 à 5 μm) ; chacun exerce une influence déterminante sur la qualité de la séparation. L’objectif de la chromatographie est triple : obtenir des pics chromatographiques les plus fins possibles (grande efficacité), les mieux séparés possible (bonne résolution), en un temps d’analyse minimum.

La résolution augmente avec la longueur de la colonne, au détriment du temps d’analyse et de l'efficacité. Une colonne de 15 mètres suffit à séparer des mélanges simples alorsque l’analyse d’échantillons complexes nécessite une colonne de longueur supérieure à 30 m. La plupart des applications de la GC-MS utilisent des colonnes de 25 à 30 m. Augmenter l'épaisseur de la phase stationnaire augmente les interactions entre celle-ci et les solutés, ce qui améliore la séparation chromatographique mais augmente la durée de l'élution, donc de l'analyse. On choisit généralement une épaisseur de film importante lorsque l'on souhaite séparer des composés très volatils.

L'augmentation du diamètre interne permet de raccourcir les temps d'analyse mais se traduit par une diminution de l'efficacité. Lorsque l'on travaille en "fast GC", c'est-à-dire lorsque l'on souhaite des temps d'analyse très courts (quelques secondes à quelques minutes), on choisit une colonne courte avec un film de faible épaisseur (0,1 μm, par exemple); il convient alors d'utiliser une colonne de faible diamètre interne pour ne pas trop perdre en efficacité [6].

La température de la colonne est un paramètre important qui doit être contrôlé a quelques dixièmes de degré, c’est pourquoi la température optimale de la colonne dépend du point d’ébullition de l’échantillon et du degré de séparation requis. En général, une température égale ou légèrement supérieure au point d’ébullition conduit a un temps d’élution raisonnable (de2 à 30 min) [13].

II.2.4.3. Les phases stationnaires a- Phases stationnaires solides

Ces phases sont constituées par des matériaux adsorbants divers: silice ou alumine désactivées par des sels minéraux, tamis moléculaires 5 Å, verres ou polymères poreux, carbone graphité (ex. Chromosorb® 100, Porapak®). Dans le cas des colonnes capillaires à couche poreuse (PLOT), ces matériaux sont déposés en une couche uniforme, sous forme de particules très fines, sur la paroi interne de la colonne. On les utilise pour séparer les composés gazeux ou très volatils [14].

b- Phases stationnaires liquides

Pour les colonnes remplies, la technique d’imprégnation, de mise en œuvre très simple, permet de choisir de nombreux composés organiques peu volatils à usage de phases stationnaires.

Mais, pour les colonnes capillaires, les contraintes de fabrication imposent un choix beaucoup plus

(24)

limité. Les phases actuelles correspondent à deux principaux types de composés,lespolysiloxanes et les polyéthylèneglycols, chaque catégorie pouvant faire l’objet de modifications structurales mineures. On peut y ajouter les phases particulières à base de cyclodextrines pour l’étude des composés optiquement actifs (chiraux) [14].

II.2.4.4. Les détecteurs II.2.4.4.1. Catharomètre

C’est un détecteur différentiel de conductibilité thermique utilisant la variation de la résistivité avec la température de deux résistances d’un pont de Wheatstone. La résistance dite de référence est immergée dans un flux de gaz vecteur ne traversant pas la colonne, alors que la résistance de mesure baigne dans l’effluent de colonne. En l’absence de soluté, le pont de Wheartstone est en équilibre .Au passage d’un soluté, la conductibilité thermique de l’effluent change, faisant varier la quantité de chaleur apportée à la résistance de mesure, donc sa température et sa résistance. Ainsi le pont est déséquilibré, un courant apparaît, qui est détecté et amplifié. Les performances du détecteur seront bonnes, s’il est bien thermostaté, si l’alimentation en gaz vecteur est bien stabilisé et si la différence de conductibilité thermique entre le soluté et le solvant est grande [15].

II.2.4.4.2. Détecteur à ionisation de flamme

Le détecteur à ionisation de flamme est le plus populaire des détecteurs chromatographiques après le détecteur à conductivité thermique. Son principe de fonctionnement est le suivant :

Lorsque le soluté est brûlé dans une flamme d’hydrogène, il se forme des ions qui sont collectés par une électrode, souvent en forme de grille cylindrique centrée autour de l’axe de la flamme et portée à un potentiel variant entre 100 et 300 V. Le courant ionique est ensuite amplifié et enregistré [15].

C’est un détecteur sélectif qui ne répond qu’aux composés carbonés. Il ne répond pas aux gaz permanents ainsi qu’à un certain nombre de gaz minéraux et composés organiques : CO, CO2, COS, CS2, H2O, SO2, H2O, NH3, NO, N2O, HCOOH, HCHO, SiCl4 [16]. Ce détecteur est très sensible mais nécessite des débits gazeux très stables.

II.2.5. Le spectromètre de masse

Le spectromètre de masse permet l’identification et la quantification des analytes. Il existe de nombreux types de spectromètres de masse ; tous ont en commun trois éléments : une source, un analyseur et un détecteur (figure8) [17]. Le principe de fonctionnement de chacun de ces éléments est détaillé dans ce qui suit. Ne sont présentés ici que les spectromètres de masse équipés d’analyseurs dit "quadripolaires" qui représentent la très grande majorité des analyseurs utilisés en couplage GC-MS pour trois raisons principales : leur "vitesse de balayage" très élevée, leur coût raisonnable, leur facilité de maintenance. Ces spectromètres sont équipés de systèmes de pompage

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assurant un vide de l’ordre de 10^-⁴à 10^-⁵mbar. La qualité du vide est un facteur déterminant pour l’analyse. Il s’agit d’évacuer les molécules résiduelles telles que l’azote, l’oxygène et l’eau atmosphériques ainsi que les molécules éluées du chromatographe qui, pour la plupart, n’auront pas été ionisées (les rendements d’ionisation sont très faibles) et qui pourraient polluer le spectromètre de masse. Il s’agit également de garantir le bon fonctionnement du filament et du multiplicateur d’électrons qui sont extrêmement fragilisés par une pression trop élevée.

Figure 8. Eléments principaux d’un spectromètre de masse [18].

II.2.5.1.

La source

La source est la partie du spectromètre de masse où sont produits des ions gazeux à partir des molécules introduites. La nature de la source utilisée dépend de l’état physique de la substance à analyser. On peut ainsi utiliser une source d’ionisation-désorption lorsque l’analyte est un solide, une source d’ionisation-désolvatation lorsqu’il s’agit d’un liquide. En couplage avec un chromatographe en phase gazeuse, où les composés élués arrivent au spectromètre à l’état gazeux, les sources utilisées sont dites à ionisation électronique (EI pour Electron Ionization ou Chemical Impact) ou à ionisation chimique (CI pour Chemical Ionization). Leur usage est réservé à l’analyse des composés gazeux ou volatils (point d’ébullition n’excédant pas 400°C). La source est maintenue à une température élevée (généralement comprise entre 100 et 250°C) pour éviter la condensation des analytes.

L’ionisation électronique consiste à bombarder les molécules par un faisceau d’électrons de haute énergie. L’énergie des électrons incidents est telle que l’ion M^+.initialement formé, appelé ion moléculaire, acquiert une grande quantité d’énergie interne qui l’amène généralement à se fragmenter spontanément en ions plus petits baptisés ions-fils ou ions-fragments. Les électrons sont produits par le chauffage d’un filament métallique (tungstène ou rhénium, le plus souvent) et accélérés par une différence de potentiel de 70 V, ce qui leur confère une énergie cinétique de 70 eV. Le fait de disposer d’un standard mondial pour l’énergie des électrons ionisants permet de comparer des spectres de masse réalisés sur différents appareils et d’avoir recours à des bases de données (comprenant plusieurs dizaines de milliers de spectres) dispensant d’interpréter les spectres

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obtenus pour identifier les analytes. Les algorithmes de recherche extraient des bases de données les composés dont les spectres de masse ressemblent le plus au spectre étudié et il est parfois difficile de trancher entre les solutions proposées. Les bases de données ne sont évidemment efficaces que si les spectres des composés étudiés y sont répertoriés. Lorsque ce n'est pas le cas, l'analyste doit tenter d'interpréter le spectre de masse, ce qui est souvent difficile. L’universalité de l’ionisation électronique (la quasi-totalité des molécules sont ionisables), justifie l’immense succès de cette technique [19].

L’EI n’est pas le seul mode d’ionisation utilisé en couplage GC-MS; l’ionisation chimique est également largement employée en complément de l’ionisation électronique. La CI est plus sélective et toutes les molécules éluées ne sont pas ionisées, ce qui peut constituer un avantage avec des échantillons particulièrement complexes. Comparée à l'EI, la CI est un mode d’ionisation doux:

les ions MH+ obtenus en CI ont beaucoup moins d’énergie interne que les ions M^+.produits par EI et se fragmentent donc beaucoup moins que ces derniers [20]. Le spectre d'IC informe presque toujours sur le poids moléculaire de l’analyte alors que celui d’EI fournit plus d’informations structurales mais pas de certitude sur le poids moléculaire.

En CI, l’analyte n’est pas directement ionisé par les électrons. C’est un gaz R, dit gaz réactant qui, introduit dans la source, subit l’ionisation électronique. Ce gaz est à une pression telle que les ions R^+.formés réagissent immédiatement avec les molécules R non ionisées pour former des ions RH⁺ à nombre pair d’électrons. Ce sont ces derniers qui, dans un deuxième temps, vont réagir avec l’analyte M, en lui transférant un proton pour former des ions MH^+.Le transfert n’est évidemment possible que si l’affinité protonique de l’analyte (affinité de la molécule pour le proton, analogue de la basicité mais en phase gazeuse) se trouve supérieure à celle du gaz réactant. Les gaz utilisés est classiquement sont le méthane, l’isobutane ou l’ammoniac. Certains appareils permettent d’utiliser des liquides tels que le méthanol ou l’acétonitrile (on introduit dans la source la vapeur pompée en surface du liquide). Le choix du gaz réactant obéit à des critères chimiques précis [21].Plus l’affinité protonique du gaz est élevée, plus le transfert de proton vers les analytes est difficile et, par conséquent, moins l’énergie interne des ions MH⁺ est élevée et moins ces derniers se fragmentent. En d’autres termes, on choisit un réactant à forte affinité protonique (NH3) si l’on ne souhaite pas fragmenter l’ion MH⁺; on a recours, au contraire, à un réactant de faible affinité protonique (CH₄) si l’on veut dissocier cet ion pour obtenir un spectre de masse plus riche en informations structurales.

II.2.5.2. L’analyseur

L’analyseur sépare les ions produits par la source en fonction de leur rapport de masse sur la charge (m/z). Dans un contexte de couplage GC-MS, on parle souvent abusivement de mesure de masse car z=1 (ou –1, beaucoup plus rarement, lorsque l’on utilise l’ionisation chimique négative),

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les ions étant trop petits pour être chargés plusieurs fois (on considère qu’en phase gazeuse un ion peut porter 1 charge pour environ 1000 unités de masse).

Les analyseurs sont caractérisés par quatre paramètres : la résolution, la vitesse de balayage, la gamme de rapports masse/charge balayée et la transmission [22]. La résolution traduit la précision sur la mesure des rapports m/z des ions. Celle d'un analyseur dit quadripolaire est liée à sa vitesse de balayage en m/z : plus le balayage est rapide et moins bonne est la résolution. Avec un tel analyseur, on travaille le plus souvent avec une vitesse de balayage très élevée (jusqu'à 6000 Thomson par seconde) et une résolution unitaire; cela signifie que les rapports m/z des ions sont donnés sans chiffre après la virgule. En balayant beaucoup moins vite, on ne pourrait accéder qu’à deux chiffres significatifs sur la mesure des m/z, ce qui ne présente pas un grand intérêt en GC-MS dans la mesure où un rapport m/z avec deux chiffres significatifs ne permet pas de déterminer une formule brute. Balayer très vite permet en revanche l’enregistrement de plusieurs spectres par seconde et permet un tracé très précis des pics chromatographiques ; cela améliore la sensibilité et la résolution de l’appareil de GC-MS ainsi que la précision sur les dosages. Si la gamme de rapports masse/charge balayée par un analyseur quadripolaire peut atteindre 8000 m/z, elle est généralement limitée à 1000 m/z en couplage GC-MS où l’on analyse des composés volatils, donc de poids moléculaires faibles à moyens. La transmission caractérise la capacité de l’analyseur à conserver les ions entre leur formation et leur détection. Elle est difficile à évaluer car on ne connaît pas précisément la quantité d’ions formés en source.

Il existe deux catégories d’analyseurs quadripolaires : la première regroupe les quadripôles, la seconde est constituée de trappes ioniques (encore appelées pièges à ions).

a- Quadripôles

Comme le montre la figure 9, un quadripôle est systématiquement associé à un système d’extraction et de focalisation des ions produits en source. Il s’agit le plus souvent d’un hexa pôle ou d’une lentille électrostatique (analogue électrique d’une lentille optique). Le quadripôle est constitué de quatre électrodes métalliques parallèles raccordées électriquement deux à deux, de section idéalement hyperbolique. Ces électrodes sont cylindriques et longues de douze à vingt centimètres selon les modèles. L'application d’un potentiel de type ‘U+Vcosωt’ crée un champ quadripolaire entre les électrodes.

Deux électrodes symétriques par rapport à l’axe central du quadripôle sont portées à un potentiel de type U+Vcosωt, les deux autres au même potentiel mais de signe opposé (-U-Vcosωt).

U et Vcosωt sont, respectivement, les composantes de tension continue et de tension alternative du potentiel de radiofréquence. V et ω sont, respectivement, l'amplitude et la pulsation de la tension alternative.

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Figure 9. Représentation simplifiée d’un quadripôle [23].

La valeur de ω est fixée par le constructeur. Les polarités des électrodes sont rapidement inversées, ce qui confère aux ions un mouvement "en tire-bouchon" dont l'amplitude radiale dépend des paramètres U et V. Pour qu’un ion de rapport m/z donné ait une trajectoire stable dans le quadripôle et qu’il puisse ainsi atteindre le détecteur, il faut que les paramètres U et V soient tels que l'amplitude radiale de la trajectoire de l’ion soit inférieure à la distance séparant les électrodes.

Dans la pratique, le quadripôle fonctionne comme un filtre à ions : on fait varier simultanément les valeurs de U et de V de manière à ce que les ions produits par la source soient stables à tour de rôle.

A un instant t donné, ne sont détectés que les ions d’un m/z donné. Les autres ions vont heurter les électrodes ou les parois internes du spectromètre ; ils se déchargent et sont entraînés par le système de pompage [24].

b- Trappes ioniques

Il existe deux types de trappes ioniques en couplage GC-MS. Lorsque les ions sont produits dans une source analogue à celle d’un quadripôle avant d’être introduits dans la trappe, on parle de trappe ionique à source externe. Lorsque les ions sont directement produits au cœur de la trappe (la colonne chromatographique arrive dans la trappe), cette dernière joue tour à tour le rôle de source et d’analyseur ; on parle alors de trappe ionique à ionisation interne. Une trappe ionique est constituée de trois électrodes métalliques (figure 10): une électrode annulaire et deux électrodes dites chapeaux. Des séparateurs (spacers en anglais) en forme d’anneau jouent le rôle d’isolants électriques entre ces électrodes.

Les deux électrodes chapeaux sont percées en leur centre, l'une pour permettre l'introduction séquentielle d’électrons ou d’ions (selon que l’ionisation est interne ou non), l'autre pour permettre l'éjection des ions vers le détecteur. Précisons que, quel que soit le lieu de l’ionisation les trappes ioniques permettent, comme les quadripôles, de travailler en ionisation électronique ou chimique.

Contrairement au quadripôle, la trappe ionique possède la capacité de stocker les ions: l’application d’une radiofréquence de type Vcosωt sur l'électrode annulaire produit un champ quadripolaire au

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sein duquel chaque ion acquiert un mouvement oscillant dont l'amplitude et la fréquence dépendent du rapport m/z de l’ion et de la valeur de V.

Figure 10. Représentation simplifiée d’une trappe ionique [25].

Le champ quadripolaire n’est homogène qu’au centre de la trappe ionique. Il faut éviter que les ions ne s’approchent des électrodes sinon leurs trajectoires deviennent instables et ils ne sont plus piégés. Pour cela, on introduit dans l’analyseur de l’Hélium à une pression partielle de 10^-3torrs Les ions subissent de multiples collisions avec les atomes d’Hélium, ce qui a pour effet de diminuer les amplitudes de leurs trajectoires et de les confiner au centre de l’analyseur. Lors de la phase d’éjection et donc de détection des ions, la valeur de V est progressivement augmentée alors qu’une radiofréquence de type V2cosω2t est appliquée entre les électrodes chapeaux. Le balayage de V amène tous les ions, tour à tour et par m/z croissant, en résonance avec V2cosω2t. Il y a alors augmentation brutale de l’amplitude de la trajectoire de l’ion et éjection de ce dernier vers le détecteur [26]. L'écart entre les électrodes n'étant que de quelques millimètres, le volume disponible pour le piégeage des ions est faible. Les premières trappes ioniques n'ont pas rencontré le succès commercial escompté en raison de phénomènes d'espace de charge importants: la répulsion électrostatique exercée par chaque ion vis-à-vis des autres ions provoque des distorsions spectrales en fonction de la quantité d'analyte introduite. Les trappes ioniques sont aujourd'hui équipées de régulateurs automatiques de gain qui ajustent le nombre d'ions présents dans l'analyseur, en jouant sur la durée d'ionisation. Le spectre de masse est toujours enregistré à partir du même nombre d'ions, quelle que soit la quantité d'analyte injectée en chromatographie; le tracé du chromatographe prend en compte le temps d'ionisation optimisé, de manière à conserver l'aspect quantitatif de la méthode. Grâce aux régulateurs électroniques de gain, les trappes ioniques fournissent aujourd'hui une reproductibilité spectrale satisfaisante, néanmoins inférieure à celle des quadripôles.

II.2.5.3. Le détecteur

Le rôle du détecteur est double: détecter les ions proportionnellement à leur nombre et amplifier le courant correspondant (de l’ordre de 10-12 Ampères) pour le rendre détectable par

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l’électronique du système. La plupart des appareils de GC-MS sont équipés de détecteurs de type chaneltron tels ceux représentés sur les figures 9 à 10. Un chaneltron présente la forme d’un entonnoir courbe ou d’une corne d’abondance. L’intérieur est enduit d’un alliage plomb/oxyde de plomb qui a la propriété d’émettre des électrons sous l’effet d’un choc. Une différence de potentiel de 1000 à 3000 V est appliquée entre l’entrée et la sortie de l’entonnoir. Lorsqu’un ion vient heurter la paroi interne, il y a émission d’électrons qui, accélérés par la différence de potentiel, rebondissent de part et d’autre de la paroi. Chaque choc décroche de nouveaux électrons qui sont eux-même accélérés ; on parle de cascade électronique. Un chaneltron fournit un gain de l’ordre de 10⁵ ; c’est à dire que l’arrivée d’un ion est traduite par un courant de 10⁵ électrons.

II.3.La chromatographie liquide à haut performance (HPLC)

Une analyse par HPLC permet la séparation de composés en solution, élués à travers une colonne chromatographique à l’aide d’une phase mobile liquide, elle-même percolée grâce à une pression élevée. Il existe une réelle interaction triple entre l’analyte, la phase stationnaire et la phase mobile basée sur l’affinité physicochimique entre les trois [27].

II.3.1. Historique

Après les travaux de MikhailSemenovichTswett du début du XXème siècle, c'est dans un premier temps la chromatographie sur colonne qui prend un essor considérable.Ainsi, Reichstein, en 1938, montre le principe de l'élution des composés dans une colonne après leur séparation. En 1952, l'utilité des gradients d'élution est montrée puis, vers les années 1960, la chromatographie par perméation sur gel se développa.

On peut situer en 1967, grâce aux travaux de Huber et Huzsman, le début de la chromatographie liquide à haute vitesse, plus tard appelée à juste titrechromatographie liquide haute performance (CLHP) [28].La phase stationnaire, constituée de billes de granulométrie de 3 et 50 μm est compactée sous pression dans une colonne en métal inoxydable. La phase mobile se déplace dans la colonne sous pression à l'aide d'une pompe.

La chromatographie liquide haute performance, utilisée en routine depuis 1995 a réduit au moyenne de 10 fois le temps nécessaire à l'analyse de nombreux composés biochimiques. On est passé à des durées de quelques minutes alors qu’auparavant une chromatographie requérait quelques dizaines de minutes. Le Gain de temps et le haut pouvoir de résolution sont les maîtres mots de cette technologie [29].

II.3.2.Principe

La phase mobile parcourt un tube appelé colonne, cette colonne peut contenir des granulés poreux (colonne remplie) ou être recouverte à l'intérieur d'un film mince (colonne capillaire). Dans les deux cas, la colonne est appelée phase stationnaire [30].Le mélange à séparer est injecté à

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l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne [30,31].

Ce mélange doit être poussé à haute pression afin d'assurer un débit constant dans la colonne et y éviter toute perte de charge [31]. Si la phase stationnaire est bien choisie, les constituants du mélange appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne [30]. De ce phénomène, appelé rétention, il résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses relatives de déplacement soient différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés [30].

Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile) [32,33].

Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. En effet, il dirige sur un enregistreur un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque soluté séparé, il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic [30]. Dans des conditions chromatographiques données, le temps de rétention (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté [30].

Le principe est donc d’exploiter les interactions entre les solutés et les deux phases (mobile et stationnaire) pour séparer ces solutés en fonction de leurs affinités et ainsi de les identifier et ou de les doser [33]. La chromatographie liquide haute performance classique fait intervenir des mécanismes d'échange soluté, phase mobile et phase stationnaire, basés sur les coefficients de partage ou d'adsorption selon la nature des phases en présence [27,31].

II.3.3.Instrumentations

Dans tous les appareils de chromatographie liquide haute performance, on retrouve un ensemble de modules reliés entre eux par des tubes de faible diamètre (figure 11) [27, 34,35]:

- un ou plusieurs réservoirs de phase mobile;

- une ou plusieurs pompes;

- un système d'injection;

- des colonnes;

- un ou plusieurs détecteurs;

- et un ordinateur (enregistreur);

II.3.3.1. Réservoirs des solvants

Ils contiennent la phase mobile en quantité suffisante : plusieurs flacons à éluant (solvants de polarités différentes) sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs solvants à des concentrations variables) à l'aide des pompes [30].

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Figure 11: instrumentation en HPLC [27].

II.3.3.2.Pompe

Les pompes utilisées en HPLC permettent de délivrer les solvants à débit constant sous de fortes pressions pouvant atteindre quelques centaines de bar (70 bars 1000 psi) [35]. Elles sont munies d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature et de la quantité du solvant. Elles permettent donc de travailler en mode isocratique (avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse) ou en mode gradient (une variation de la concentration des constituants du mélange d'éluants) [30]. Les pompes actuelles ont un débit variable de quelques μl à plusieurs ml/min [30].Par définition le débit correspond au volume de la phase mobile circulant au travers de la colonne chromatographique par unité de temps (x ml.min-1) [32].

II.3.3.3. Injecteur ou vanne d’injection

C'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes (10, 20, 50 μl) dont le choix se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, sans variation importante de la pression, dans le circuit allant des pompes vers l'entrée de la colonne, ce qui est important pour l'analyse quantitative [30.35].La figure 12 montre le mode de fonctionnement des boucles d’injection, et un exemple de vanne et de boucles.

II.3.3.4. Colonne

C’est un tube en inox ou en verre (inerte aux produits chimiques). Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm [30]. La colonne renferme la phase stationnaire qui peut être polaire (phase normale) ou non polaire (phase inverse).

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Figure 12.Injecteur à boucle: a) le remplissage de la boucle ;b) l’injection dans la colonne [23]; c) vanne d’injection pour CLHP; d) .boucles assorties [28].

a- La phase normale : elle est généralement constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire, il faut donc utiliser un éluant apolaire (figure 13). Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires qui sortent en tête.

L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des séparations [30].

b- La phase inverse : elle est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18) (figure 13). Cette phase est apolaire et nécessite donc un éluant polaire (Acétonitrile, méthanol, eau). Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier.

Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps et la qualité de la séparation est donc maintenue constante [30].

La chromatographie de partage est la plus usuelle et permet la mise en œuvre de deux types de phase stationnaire :

 soit une phase stationnaire normale (polaire) qui nécessite l'utilisation d'une phase mobile peu polaire (hydrocarbures).

 soit une phase stationnaire inverse ou greffée (non polaire) qui nécessite l'utilisation d'une phase mobile polaire (mélanges : eau-méthanol ; eau-acétonitrile ; eau- tétrahydrofuranne).

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Figure13. Surface des silices: a) non greffées (polaire) et b) greffée (apolaire).

II.3.3.5. Détecteurs

Placé en sortie de colonne, le détecteur enregistre un signal (électrique ou optique) en fonction du temps caractéristique du passage progressif des solutés [32]. Deux types de détecteurs sont classiquement utilisés :

a- Le détecteur UV-visible: il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne et opère à longueur d'onde constante, celle-ci étant fixée par l'opérateur. La lampe au deutérium est utilisée pour des longueurs d'ondes variant de 190 à 350 nm et la lampe à vapeur de mercure est utilisée à la longueur d'onde non variable de 254 nm [30,32]. Il faut que :

- le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à l'appareil et que son coefficient d'absorption soit suffisamment grand.

- la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur.

b- Le réfractomètre: il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la colonne. Cette mesure, extrêmement précise, dépend néanmoins de la température du liquide. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure; il y a donc une référence d'où le terme de variation de l'indice.

Ce détecteur exclut les variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique avec ce détecteur. Les données sont collectées par l'intermédiaire soit d'un intégrateur soit d'une station d'acquisition [30,39, 40].

II.3.3.6.Enregistreurs

Les enregistreurs sont les mêmes que ceux utilisés en chromatographie en phase gazeuse.

Les logiciels d’application, comme le Millenium, sont également utilisés en HPLC [41].

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II.3.4.Le choix des solvants de la phase mobile

Le choix du solvant organique dépend grandement de l'hydrophobicité des molécules à séparer. Pour des molécules très hydrophobes, on peut choisir d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne ou une faible concentration d'un solvant organique de polarité faible.

La phase mobile ne doit pas comporter d'impuretés ni avoir une forte absorbance aux faibles longueurs d'onde (ultra-violet), pour ne pas interférer avec les propriétés optiques des molécules à séparer. De plus, selon sa qualité, on peut ou non utiliser un solvant organique pour un type d'analyse donné. En conséquence, il faut prendre des solvants certifiés ultra-purs (qualité HPLC) [37].

L'équilibre d’adsorption est un phénomène de compétition : les molécules de la phase mobile entrent en compétition avec les molécules de solutés pour les sites polaires d'adsorption (séparation liquide-solide). Plus l'interaction entre la phase mobile et la phase stationnaire est forte moins l'adsorption du produit en solution sera importante et vice-versa. Les solvants sont donc classés selon leur force qui va dans le même sens que leur polarité (Dubreuil, 2007), cette classification est présentée dans le tableau1.

Tableau 1.Propriétés de quelques solvants utiles pour la chromatographie en phase liquide [23].

Solvant UV (nm) Polarité (P)

Isooctane 215 0,1

Hexane 195 0,1

Toluène 284 2,4

Méthyl-t-butyléther 210 2,5

Dichlorométhane 233 3,1

Propanol-1 210 4,0

Tétrahydrofurane 212 4,0

Chloroforme 245 4,1

Éthanol 210 4,3

Acétate d'éthyle 256 4,4

1,4-Dioxane 215 4,8

Acétone 330 5,1

Méthanol 205 5,1

Acétonitrile 190 5,8

Acide acétique - 6,0

Eau 190 10,20

II.3.4.1.La polarité

Les polarités des phases mobiles et stationnaires sont déterminantes pour obtenir une bonne séparation des solutés [30, 34, 39]. Il existe deux possibilités :

- la chromatographie en phase normale: la phase stationnaire est polaire et la phase mobile est non polaire. Les solutés sont séparés dans l’ordre de leur polarité croissante.

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- la chromatographie en phase inverse: la phase stationnaire est non polaire et la phase mobile est polaire. Les solutés polaires seront entraînés rapidement par la phase mobile polaire tandis que les solutés peu polaires seront retenus par la phase stationnaire non polaire.

II.3.4.1.1.Les gradients d'élution

Les interactions moléculaires ont lieu entre le soluté et les phases mobiles et stationnaires simultanément. Si la composition de la phase mobile est maintenue constante durant toute l’analyse, la séparation sera dite en mode isocratique. Si la composition est modifiée progressivement, la séparation sera dite en mode de gradient d’élution [39], qui en phase normale est utile pour la séparation de solutés de polarités très différentes. En phase inverse il sert à la séparation des substances de masses molaires différentes d'une série homologue [23].

II.3.5.Analyses des chromatogrammes

Une bonne séparation se traduira par une séparation distincte des pics correspondant à chacun des produits, la figure 14 montre la différence entre un bon et un mauvais chromatogramme.

Figure 14.L’analyse qualitative d’un chromatogramme [30].

Un chromatogramme doit être parfaitement reproductible, pour cela, il faut préciser pour chaque analyse [30] :

- le type de colonne : marque, nature, diamètre, longueur, support…etc.

- la nature de l'éluant : solvant, si c'est un mélange préciser sa composition, son débit et le mode de détection λ en nm.

- la quantité injectée, le début de l'injection sur le chromatogramme, la sensibilité du détecteur, etc II.3.5.1. Analyse qualitative

- Temps de rétention

Le temps de rétention (tR en min) est une caractéristique de chaque soluté dans les conditions opératoires fixées. Ainsi l'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire (normale ou à polarité inversée) se répercute sur les temps de rétention des solutés [30].

Le temps de rétention (

t

R) est le temps écoulé entre l’injection et le point maximal du pic. Le temps