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Chromatographie en Phase Liquide (HPLC)
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1. Présentation générale de l'HPLC
En chromatographie liquide classique on utilise des colonnes qui mettent en œuvre des phases stationnâmes de granulométrie assez élevée (le diamètre des grains de phase stationnaire est élevé).
Ceci à 2 conséquences :
- « une positive » ; la résistance à l'écoulement est assez faible : on peut éluer avec des pressions faibles ;
- « une fâcheuse » ; puisque la granulométrie est élevée, les durées de diffusion dans la phase mobile en absence de tout contact possible avec la phase stationnaire sont élevées. Ainsi les événements de rétentions différentielles qui sont le fondement des séparations chromatographiques sont rares : la colonne n'est pas très performante !
Une phase stationnaire est a priori d'autant plus performante que sa granulométrie est faible (ceci favorise les rétentions différentielles par la phase stationnaire). Mais la phase stationnaire devient alors très résistante à l'écoulement ! : il faudra une pression très élevée pour faire passer un liquide au travers
!
Commentaire technique plus précis :
Soit une colonne cylindrique rigide de longueur / (en m), de section s (en m2).
Soit cette colonne remplie d'une phase stationnaire poreuse avec des particules de diamètre ØP (en m).
Soit η la viscosité de la phase mobile percolant la colonne (en Pa.s) et u la vitesse linéaire de percolation (en m.s-1).
Soit ϕ le facteur de résistance caractéristique des particules de la colonne (c'est un nombre sans dimension qui dépend de la géométrie des particules poreuses de phase stationnaire).
On montre que la résistance à l'écoulement R de la colonne est :
R = ( ϕ η l ) / ( ØP ² s) (loi de Darcy) Or, pour assurer un débit D (en m3.s-1), il faut un gradient de pression ΔP tel que :
ΔP = R D D'où :
ΔP = ( ϕ η l u) / ( ØP ² ) puisque D = u s
On voit ainsi par la formule de Darcy que le gradient de pression nécessaire pour assurer un débit donné est (.../...)
Les progrès techniques ont permis la mise au point de :
- phases stationnaires de granulométries très fines donc très performantes et capables de résister aux pressions très élevées nécessaires à la percolation d'une phase liquide au travers (il ne faut pas que la phase stationnaire s'écrase sous la pression !) ;
- pompes capables de pomper sous faible débit très régulier et sous haute pression ; - d'injecteurs en ligne pouvant travailler sous haute pression.
A cet ensemble on a ajouté des systèmes de détection de sortie de colonne « en ligne, en continu », très performants, associés à des calculateurs.
On a ainsi amélioré globalement les performances séparatives et analytiques des chromatographies liquides. On parle aujourd'hui de techniques HPLC pour ces chromatographies.
En HPLC toutes les chromatographies liquides sont possibles : - adsorption sur phase stationnaire adsorbant non chargé, - échange d'ions ;
- exclusion-diffusion ;
Fanny Demay – BTS BioAnalyses & Contrôles 1/2
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- utilisation de phases greffées avec les motifs chimiques les plus variés : très polaires, apolaires - ....
(note : les phases greffées de motifs apolaires sont appelées phases inverses ou (reverse phase en anglais)).
La structure globale d'un ensemble d'HPLC est finalement la suivante : attention schéma à connaître par cœur !
