Détection électrochimique en puce microfluidique : importance des transducteurs nanocarbonés

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importance des transducteurs nanocarbonés

Bacem Zribi

To cite this version:

Bacem Zribi. Détection électrochimique en puce microfluidique : importance des transducteurs nanocarbonés. Biophysique [physics.bio-ph]. Université Paris Saclay (COmUE); Université de Sfax (Tunisie), 2016. Français. �NNT : 2016SACLS030�. �tel-01407362�

NNT : 2016SACLS030

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Electrical, Optical, Bio- Physics and Eingineering

Spécialité de doctorat :

Physique

Par

Mr. ZRIBI Bacem

Détection électrochimique en puce microfluidique: importance des transducteurs

nanocarbonés.

Thèse présentée et soutenue à LPN, le 26 Février 2016 :

Composition du Jury :

Mr. Pierre-Yves Joubert Professeur, Université Paris Sud Président Mme Stéphanie Descroix Chargée de Recherche, Institut Curie Rapporteur

Mme Rym Mlika Maître de conférence, Université de Monastir Rapporteur Mr. Olivier Francais Maître de conférence, ENS Cachan Examinateur Mr. Noureddine Raouafi Maître de conférence, Université el Manar Examinateur Mme Anne-Marie Haghirie-Gosnet Directrice de Recherche, LPN-CNRS Directrice de thèse Mr. Maohammed Koubaa Maître de conférence, Université de Sfax Directeur de thèse Mme. Hafsa Korri-Youssoufi Directrice de Recherche, Université Paris Sud Co-directrice de thèse

REMERCIEMENTS

J’exprime ma profonde gratitude à mes directeurs de thèse Anne-Marie Haghiri-Gosnet, Hafsa Korri-Youssouffi et Mohammed Koubaa qui ont dirigé ce travail. Je leur exprime ma gratitude pour l’encadrement qu’ils m’ont réservé, pour leurs conseils constructifs, leurs encouragements continuels et pour l’attention avec laquelle ils ont suivi la préparation de ce manuscrit. Je souhaite qu’ils reçoivent à travers ces lignes toutes les marques de ma reconnaissance.

Mes sincères remerciements particulièrement à mes proches collègues Antoine Pallander, Emmanuel Roy et Syrine Chebil pour leur aide, leur patience et les encouragements.

Je présente mes vifs remerciements et mon profond respect à tous les membres du jury : J’adresse mes sincères remerciements à Mme Stéphanie Descroix et Mme Rym Mlika, pour m’avoir fait l’honneur d’étudier méticuleusement cette thèse. Je les remercie pour l’intérêt qu'elles ont porté à mon travail et pour leur disponibilité.

J’adresse mes sincères remerciements à Mr Olivier Français, Mr Pierre-Yves Joubert et Mr Noureddine Raouafi d’avoir accepté d’examiner le présent travail et pour l’intérêt qu’ils

portent à mon travail.

Je remercie chaleureusement toute l’équipe du LPN (Nanoflu), LCBB et LPM de

m’avoir accueilli dans un cadre de travail dynamique et propice à l’apprentissage de la

recherche dans la bonne humeur. Et plus particulièrement tous ceux qui m’ont formé, aidé

ou conseillé à un moment ou à un autre.

En ce qui concerne mes amies, je leur dis merci pour leur soutien ainsi que leur

encouragement sans failles et sans relâche durant ces trois dernières années.

Avec un grand plaisir je réserve ces quelques lignes en signe de gratitude et

reconnaissance à tous ceux et celles qui ont contribué à la réalisation de cette étude.

DEDICACES

Au Dieu tout-puissant notre créateur.

Ce travail, je le dédie particulièrement à :

Ma mère qui m'a porté neufs mois, qui a veillé tous les nuits, et qui a été

pour moi une lumière qui me guide.

Je le dédie à l’âme de mon père.

Mon frère et mes sœurs qui n'ont pas hésité à m'aider et m'encourager au mieux de leurs

possibilités.

A tous mes amis et toutes mes amies.

A tous ceux qui me sont chers.

Veuillez trouver ici l’expression de mon estime et de ma profonde amitié

Et a toute la famille Zribi grande et petite.

Préambule ... 4

Chapitre 1 : Etat de l’art de la biodétection en puce microfluidique ... 11

I - Introduction à la bioanalyse en puce microfluidique : ... 12

I.1 - Historique des laboratoires-sur-puce : ... 13

I.2 – Architecture d’un laboratoire-sur-puce idéal : ... 16

I.3 - L’extraction de l’ADN : ... 17

I.4 - L’amplification par la méthode PCR : ... 19

I.5 - Modes de détection intégrés dans des LOC : ... 21

I.5.1 - La détection avec marquage des analytes : ... 21

I.5.2 - La détection sans marquage des analytes («label-free ») : ... 23

II – La biodétection électrochimique :... 25

II.1 - Définition d’un biocapteur : ... 25

II.2 - Méthodes d’immobilisation du biorécepteur : ... 27

II.2.1 - Voie physique : ... 27

II.2.2 - Voie chimique : le greffage covalent ... 28

II.2.3 - Voie électrochimique : ... 29

II.3 - Les différentes méthodes de mesure électrochimiques : ... 30

II.3.1 - La voltammétrie (voltampérométrie) cyclique : VC ... 32

II.3.2 - Voltammétrie à signaux carrés de potentiel : SWV ... 33

II.3.3 - La spectroscopie d’impédance électrochimique : SIE ... 34

III - Biocapteurs électrochimiques d’ADN : état de l’art ... 40

III.1 - Modes de détection électrochimique d’ADN : ... 40

III.1.1 – Etat de l’art sur la détection électrochimique d’ADN avec échantillons amplifiés par PCR: 42 III.1.2 – Etat de l’art sur la détection en puce microfluidique intégrant la PCR:... 48

III.2 - Objectifs de la thèse : ... 50

Chapitre 2 : Biodétection directe sur macroélectrodes carbonées ... 53

I - Les nanomatériaux carbonés : ... 54

I.1 - Structure : ... 56

I.2 – Propriétés électroniques et diagramme de bandes : ... 58

I.3 – Anisotropie et propriétés électrochimiques: ... 60

I.3.1 – Relation N(E) et constante de transfert de charge K0 : ... 60

I.3.2 – Propriétés électrochimiques des NTCs : ... 64

I.3.3 – Propriétés électrochimiques du graphène: ... 65

II - Elaboration de biocapteurs d’ADN à base de nanomatériaux carbonés : ... 69

II.1- Elaboration des transducteurs carbonés : ... 72

II.1.1 – Préparation des NTCs et caractérisation : ... 72

II.1.2 – Elaboration des films minces de graphène : ... 77

II.2- Etape(1) : optimisation du greffage électrochimique de l’éthylène diamine sur les NTCs physisorbés et sur le graphène épitaxial ... 82

II.3 - Etape (2) : greffage chimique du Ferrocène modifié par 2 esters activés Fc(NHP)2 sur l’amine .. 84

II.5- Caractérisation du biocapteur : ... 86

II.5.1 - par spectroscopie de photoélectrons X (XPS) : ... 86

II.5.2 – Caractérisation par spectroscopie RAMAN : ... 88

II.6 – Hybridation des brins d’ADN ... 89

III - Etude de la cinétique du transfert de charge : ... 91

III.1 – par voltamétrie cyclique: ... 91

III.2- par spectroscopie d’impédance (SIE) : ... 93

Conclusion ... 95

Chapitre 3 : Microfabrication des puces ... 96

I - Fabrication des puces microfluidiques : choix des matériaux ... 97

I.1 - La technologie « verre/verre » : ... 97

I.2 - La technologie « verre/PDMSphotosensible/verre » : ... 98

I.3 - La technologie mixte « verre/PDMS » : ... 98

I.4 - Les technologies émergentes – papier: ... 100

II - Fabrication d’un dispositif microfluidique : ... 101

II.1 - Intégration des microélectrodes métalliques : ... 102

II.1.1 - Nettoyage de la lame de verre et enduction de la résine UV par centrifugation : ... 102

II.1.2 - Lithographie optique des électrodes dans la résine photosensible AZ5214 : ... 103

II.1.3 - Métallisation et lift-off des électrodes : ... 104

II.2 - Microstructuration des nanomatériaux carbonés sur les microélectrodes de travail : ... 105

II.2.1 - Microstructuration des NTCs : Dépôt ... 105

II.2.2 - Microstructuration du graphène : ... 105

II.3 - Fabrication du capot PDMS : ... 106

II.4 – Le dispositif final : ... 109

Chapitre 4 – Biodétection en puce microfluidique ... 110

I - Choix des conditions fluidiques pour la capture des biomolécules cibles :

introduction aux phénomènes de diffusion, migration et réaction ... 112

I.1 - Le régime de diffusion pure (flux nul) : ... 114

I.2 - le régime fluidique avec transport convectif : ... 115

I.2.1– Cas de PeH << 1 : régime piloté par la diffusion (faible flux) ... 116

I.2.2 – Cas de PeH >> 1 : haut flux ... 116

II - Biodétection dans la puce à NTCs : ... 119

II.1 - La préparation du biorécepteur : Etapes 1 à 3 ... 119

II.2 - Hybridation avec des solutions modèles d’ADN de l’Hépatite C: ... 121

II.2.1 - Suivi par voltammétrie cyclique : ... 121

II.2.2 - Etude de la cinétique du transfert de charge : ... 123

II.2.3 – Estimation des paramètres fluidiques et discussion sur la LOD: ... 128

II.3 - Hybridation avec des isolats cliniques de Tuberculose : première démonstration ... 130

III - Biodétection dans la puce à microélectrode en graphène : ... 132

III.2 - La détection avec des solutions modèles d’ADN de l’hépatite C ; ... 134

Conclusion ... 136

Chapitre 5 : Nanostructuration du graphène par nanoimpression douce assistée

aux UV pour la biodétection ... 137

I - Création des défauts artificiels et réguliers par nanoimpression douce assistée

par UV (Soft UV NIL) : ... 139

I.1 - Fabrication du timbre en PDMS : ... 139

I.2 - Nanostructuration de l’échantillon de graphène : ... 140

I.3 - Caractérisation morphologique du graphène nanostructuré : ... 141

II - Etude électrochimique du comportement du graphène nanostructuré : ... 143

II.1 - La voltammétrie cyclique : ... 143

II.2 – La spectroscopie d’impédance électrochimique : SIE ... 144

III - Evaluation des performances analytiques du biocapteur d’ADN à base

graphène nanostructuré : ... 144

Conclusion générale ... 150

ANNEXE A : Synthèse du graphène ... 174

ANNEXE B : Propriétés structurales des nanomatériaux carbonés utilisant la

Spectroscopie RAMAN :... 178

CORRELATION DES PROPRIETES STRUCTURALES AVEC LES DONNEES EN RAMAN POUR LE GRAPHENE: ... 178

ANNEXE C : Optimisation de l’élaboration d’un biorécepteur d’ADN sur le graphène

CVD ... 181

ANNEXE D : Technique optique de surface ... 185

Pré ambulé

Ce travail de thèse s’est déroulé au Laboratoire de Photonique et Nanostructures (LPN) unité propre du CNRS (UPR 20) dans le groupe NANOFLU « Nanotechnologies et dispositifs microfluidiques » animé par Anne-Marie Haghiri-Gosnet et ceci en collaboration très étroite avec l’équipe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique (LCBB) de l’ICMMO (UMR 8182, Université Paris-Sud, Orsay), avec Hafsa Korri-Youssoufi. Ce doctorat a été co-financé par une cotutelle avec l’Université de Sfax (Tunisie) et plus précisément avec le Laboratoire de Physique des Matériaux en collaborant avec Mohamed Koubaa.

Les recherches technologiques et fondamentales propres à la miniaturisation sont pour partie les bases nécessaires à la conception de biopuces ultra-sensibles visant la détection d’agents pathogènes. Cette thématique pluridisciplinaire est à l’origine de ma motivation pour aborder ce travail de recherche et se finalisant par la défense de cette thèse de doctorat scientifique. Dès mon stage de master, il y a de ça quatre ans, j’ai pris conscience de la nécessité d’acquérir une meilleure compréhension des phénomènes physico-chimiques mis en jeu lors de la biodétection. Les mécanismes de transfert des charges de la zone biosensible vers le transducteur sont complexes et mettent en jeu des phénomènes électrochimiques à l’origine des limites de détection ultra-basses que nous avons observées. Les résultats et l’étude fondamentale présentés dans ce manuscrit devraient déboucher à court terme sur des applications telles que le diagnostic précoce de maladies graves ou bien permettre de générer des dispositifs miniaturisés pour la détection de toxines à des concentrations extrêmement faibles dans les fluides. On comprend alors que la relation structure propriété tant étudié et pourtant si difficile à maîtriser a été ici combinée avec la mécanique des fluides pour la formation de biocomplexes particulièrement fragiles.

Mon sujet de thèse avait donc pour but initial la détection rapide de brins d’ADN fortement dilués dans une approche « directe » c’est-à-dire sans amplification préalable. Ce challenge scientifique est à contre-courant de la plupart des études publiées jusqu’à aujourd’hui. Notre système de détection se repose sur l’électrochimie par le biais d’une architecture complexe de couches nanométriques carbonées (feuillets de graphène et nanotubes de carbone). Les matériaux carbonés que nous avons nanoassemblés possèdent des caractéristiques très avantageuses vis-à-vis de la conductivité électrique. D’autre part, la principale difficulté technologique s’est située pour nous, au niveau de l’intégration de ces couches. C’est grâce à des procédés de micro/nanofabrication pour l’introduction des électrodes de travail dans des chambres réactionnelles microfluidiques que nous avons obtenu les résultats les plus impressionnants.

L’analyse des interactions moléculaires au niveau du biofilm du biocapteur est complémentaire de la caractérisation des cinétiques d’interactions biologiques entre la cible et l’analyte. Cette connaissance des processus d’association à l’échelle moléculaire est une étape essentielle à la compréhension et à l’optimisation des biocapteurs modernes. Plus largement, la formation des biocomplexes et les mécanismes d’association interviennent dans le vivant, ou lors du traitement des patients par un principe actif, ou lors de l’introduction de certains dispositifs médicaux dans l’organisme. Mettre au point des dispositifs analytiques pour l’étude approfondie de ces interactions sans marquage préalable, comme la fluorescence ou le titrage radioactif, est devenu un enjeu majeur de ces dix dernières années. En effet le marquage est souvent imparfait, car il génère des populations de biomécules possédant un nombre différent de tags ou pire, il dégrade la structure des biomolécules d’intérêt. On retrouve dans la littérature quelques modes de détection directe 1, 2, pourtant certains de ces outils analytiques restent perfectibles; notamment en ce qui concerne l’évaluation et la caractérisation des cinétiques d’interactions moléculaires. Ma thèse se positionne dans cette problématique. L’objectif qui m’a été confié consistait à développer des puces microfluidiques multicanaux intégrant une détection directe par électrochimie. Obtenir une concentration en temps réel avec une migration hydrodynamique, tout en ciblant spécifiquement un biomarqueur génétique semblait initialement particulièrement ardue.

L’utilisation de microsystèmes fluidiques permet de manipuler de faibles volumes de liquide au sein duquel sont dilués des espèces biologiques 2,3. Ces microsystèmes sont compatibles avec des analyses multiplexées.4 Parmi les modes de détection compatibles avec ces dispositifs, l’un d’eux est particulièrement mis en avant dans la littérature spécialisée, car il est capable en temps réel d’étudier la cinétique d’interaction moléculaire: c’est la résonance plasmonique de surface (SPR).5 Si cette méthode optique permet une mesure d’interaction en mode dynamique, elle nécessite toutefois une instrumentation dédiée relativement complexe autour de la puce.

La miniaturisation d’une détection électrochimique est généralement plus aisée que celle des systèmes optiques, car elle bénéficie des développements de la microélectronique. La détection électrochimique qui est basée sur l’intégration de jeux d’électrodes dans les microcanaux est à privilégier pour des détections ultra-sensibles en mode dynamique au sein de puces compactes et portatives 6, 7. Il existe cependant aujourd’hui peu d’outils analytiques basés sur une mesure électrochimique d’interaction biologique sous flux dynamique, car elle nécessite un calibrage préalable difficilement automatisable.

L’électro-greffage de polymère conjugué a permis l’immobilisation de biomarqueurs pour finalement aboutir à la détection électrochimique directe de bioanalytes dans les fluides biologiques, tels que le plasma.8 Ces biocapteurs électrochimiques amplifient le signal d’interaction cible-analyte

lorsqu’ils sont immobilisés dans un milieu confiné au sein d’une chambre microfluidique. 9 Ces systèmes permettront à terme d’analyser différentes réactions: les interactions antigènes/anticorps, les interactions inhibiteurs/enzymes et les réactions d’hybridations d’ADN. La diversité des marqueurs redox présentant des potentiels redox suffisamment différents nous permet d’envisager à moyen terme des systèmes multiplexés pour la réalisation de check-up complet de santé.

Ce manuscrit s’articule autour de cinq chapitres.

Le premier chapitre a pour but d’introduire le contexte général de mon travail de thèse autour de la biodétection de brins d’ADN, biomarqueurs du virus de l’Hépatite C et de la Tuberculose, dans une puce microfluidique.

Le deuxième chapitre s’intéresse aux performances électrochimiques des nanomatériaux carbonés utilisées dans le domaine des biocapteurs. Il intègre une partie descriptive de l’élaboration de ces nanomatériaux, suivie par des caractérisations morphologiques, structurales, optiques et électrochimiques. Enfin, nous présentons l’ensemble des réactions chimiques mises en jeu pour la préparation de nos biocapteurs d’ADN, pour dans un deuxième temps aborder une étude cinétique. Le but de cette étude est de mieux appréhender les performances des transducteurs.

Le troisième chapitre s’attache à décrire les différentes méthodes de fabrication des biopuces microfluidiques. Ce chapitre inclut la description des deux procédés utilisées pour la fabrication de nos biopuces : le premier aboutissant à l’intégration d’électrodes en Au sur verre pour obtenir des biocapteurs à base de nanotubes de carbone (NTCs) et deuxièmement d’électrodes microstructurées en graphène sur des surfaces monocristallines en SiC. Ensuite nous détaillerons le procédé de fabrication optimisé que nous avons conçu pour l’intégration des biocapteurs microfluidiques.

Le quatrième chapitre est consacré à l’introduction des paramètres fluidiques qui régissent l’efficacité et la robustesse de nos biocapteurs (convection, diffusion et réaction d’hybridation). Les aspects théoriques introduits dans cette partie serviront ensuite pour l’interprétation de nos résultats expérimentaux. Dans la deuxième partie du chapitre, nous présenterons les biodétections d’ADN avec nos dispositifs microfluidiques avec des microélectrodes en NTCs ou avec du graphène. Enfin, le dernier chapitre montre comment créer un réseau des défauts artificiels sur la surface du graphène épitaxiale. Par nano-impression douce assistée par UV pour augmenter le nombre de biomolécules greffées. Nous étudierons le comportement électrochimique de ces différents jeux d’électrodes en fonction de la structure surfacique du matériau avant et après la création des défauts artificiels. Enfin, nous montrons tout l’intérêt de la création de ces matrices de défauts artificiels sur la surface du graphène d’un point de vue analytique.

Pour conclure, nous dresserons un certain nombre de constats associées à ces résultats tout en proposant des perspectives concernant l’intégration de ce type biocapteurs dans les biopuces microfluidiques en général.

Chapitré 1 :

Etat dé l’art dé la biodé téction én pucé

microfluidiqué

Ce premier chapitre a pour but d’introduire le contexte général de mon travail de thèse autour de la biodétection de brins d’ADN, dans une puce microfluidique.

La première partie de ce chapitre introduit les dispositifs analytiques en microfluidique appelés « laboratoires-sur puce », présente l’architecture idéale de ces microsystèmes, et résume les différents modes de transduction usuellement intégrés sur puce.

Ce chapitre se poursuit avec une description des biocapteurs dévelppés pour la détection de brins d’ADN cible, et une introduction à la détection électrochimique.

Enfin, ce chapitre s’acheve par un état de l’art sur la détection des biomarqueurs ADN de l’Hépatite C et de la Tuberculose et enfin un état de l’art des biocapteurs électrochimiques intégrés dans des dispositifs fluidiques.

I - Introduction à la bioanalyse en puce microfluidique :

Aujourd’hui, la microfluidique permet de réaliser des dispositifs parfaitement adaptés à des applications analytiques qu’il s’agisse de diagnostiquer, de manière précoce, des maladies ou bien de faire avancer la recherche pharmaceutique. Aujourd’hui, ces dispositifs microfluidiques deviennent performants, car les matériaux, le contrôle des flux et les propriétés des interfaces sont suffisamment bien maitrisés. Cette micropuce qui est le plus souvent appelée « laboratoire-sur-puce» (de « Lab-on-a-Chip » en anglais) intègre, sur quelques centimètres carrés, l’ensemble des fonctions d’analyses chimiques effectuées aujourd’hui en laboratoire de biologie médicale. On peut ainsi manipuler de toutes petites quantités de liquide biologique (de quelques microlitres à quelques nanolitres) en travaillant de manière parallèle. De même, séparer et détecter des biomolécules au sein de microcanaux fluidiques est devenu une vraie réalité qui permet de mener des analyses sensibles, pour le diagnostic médical précoce et le suivi médical personnalisé de patient.

Si réaliser des fonctions de circulation des fluides dans un microdispositif, sans fuites, sans bulles, avec des vannes et des pompes ne pose pas de problème, l’intégration de toutes les fonctions nécessaires à une analyse biologique complète reste toutefois un enjeu majeur. Il n’existe en effet que peu de démonstrateurs analytiques tout intégrés qui sont développés souvent dans le laboratoire académique. L’intégration de toutes ces fonctionnalités justifie donc encore un effort de recherche, dont l’importance est bien reconnue au niveau international. Nous verrons que la simplification du protocole analytique peut être une voie intéressante, car cela permettrait de simplifier la puce microfluidique et son intégration. Cette simplification était l’un des objectifs mon travail de thèse.

I.1 - Historique des laboratoires-sur-puce :

Le concept de systèmes miniaturisés pour l’analyse chimique totale (en anglais « μ TAS » pour « Micro Total Analysis System » ou LOC pour « Lab_on-a-Chip ») a été proposé par Manz et coll. en 199011 et appliqué d’abord à des systèmes microfluidiques de chromatographie liquide sous haute pression, ainsi qu’à l'électrophorèse capillaire microfluidique en 199212,13. Un effort important de recherche a ensuite été effectué pour le développement de véritables laboratoires sur puce qui devaient intégrer, au sein d’une puce microfluidique, la quasi-totalité des opérations analytiques de diagnostic telle qu’elles sont réalisées aujourd’hui dans le laboratoire d’analyse d’un hôpital. Comme l’indique la Figure 1 montrant l’évolution de ces laboratoires-sur-puce (LOC), jusqu’en 1990, la majorité des dispositifs étaient encore fabriqués en silicium ou en verre suivant des procédés issus de la microélectronique, et nécessitaient donc des infrastructures lourdes. Dès les années 1995 des technologies alternatives basés sur des polymères (comme la polydiméthylsiloxane PDMS) sont apparus et ont permis de réduire le coût des microsystèmes. La commercialisation de certains systèmes n’a vraiment démarré que dans les années 2000 (Figure 1.1).

Le premier avantage du dispositif LOC miniaturisé est de pouvoir analyser un très faible volume de sang ou de salive prélevé par le patient lui-même. Sachant qu’une goutte récupérée par une piqûre au doigt est de l’ordre de 25 µl, le volume estimé à analyser est de l’ordre du microlitre, voire quelque centaines de nanolitres.

Un deuxième objectif est d’effectuer une analyse en quelques minutes et à faible coût. Rappelons que les diagnostics effectués dans les hôpitaux ont, comme principaux critères de sélection, la fiabilité et le coût par test sachant que les échantillons sont envoyés au laboratoire central et souvent placés dans une file d'attente avec différentes priorités en fonction de l’analyse à effectuer. C’est la raison pour laquelle le résultat de cette analyse classique en laboratoire est communiqué au patient après plusieurs heures ou plusieurs jours. L’un des inconvénients vient aussi de ce que les opérateurs d'analyseurs cliniques sont des techniciens très spécialisés, ce qui augmente le coût et complique la tâche. Le coût par test est donc en général plus faible pour des analyses simples et fréquentes, mais plus élevé pour des analyses nécessitant un matériel coûteux.

Un dispositif capable de remplacer le laboratoire d’analyse classique devrait être capable de détecter un ligand cible dans un petit échantillon de fluide dans une zone de la puce où le flux et la séparation des analytes sont contrôlés.14 Le dispositif contient en général des chambres d’introduction des différents analytes ou réactifs, des vannes hydrophobes pour contrôler le passage et l’incubation des analytes au travers de canaux et, enfin, en aval de la puce, des chambres d’analyse intégrant des capteurs de haute sensibilité et spécificité. Ces capteurs peuvent être électrochimiques, optiques, mécaniques ou en fin magnétiques.

Enfin, pour que l’analyse soit pertinente avec peu de faux positifs, elle sera réalisée dans le dispositif LOC, dans un grand nombre de réservoirs et canaux indépendants de manière parallèle : on parle d’analyse multiplexe sur un ou plusieurs biomarqueurs d’intérêt. Ces mesures multiplexées réalisés sur puce, sous flux, pourront identifier et, quantifier en un temps très court, plusieurs biomarqueurs (ADN ou protéine). On peut citer, par exemple, le cas du diagnostic précoce de l’AVC (Accident Vasculaire Cérébral) qui suppose d’examiner 17 biomarqueurs sanguins simultanément et de suivre leur évolution au cours du temps après l’attaque ischémique15. La société Samsung16,17,18 vient de commercialiser les premiers laboratoires-sur-CD portatifs permettant de suivre 3 biomarqueurs cardiaques en 20 minutes, au cours par exemple du trajet en ambulance vers l’hôpital.

Figure 1.2 (A) Photo d’un appareil de diagnostic médicale. (B) Représentation schématique de cette appareil. (C) Vue éclaté du Laboratoire sur CD avant le collage (D) Conception du Laboratoire sur CD montrant les différentes designs microfluidiques en détail. (E) Une photo du Laboratoire sur CD après

le collage montrant la formation des valves. (F) Une vue de shématique montrant la chambre où s’effectue l’opération de la lyse des cellules grâce à des billets de polystyrène. 17

Si les technologies microfluidiques ont été initialement développées pour les sciences de la vie, elles peuvent toutefois être utilisées dans un grand nombre d’applications parmi lesquelles :

- Le diagnostic précoce de maladies et le suivi thérapeutique. Ici en médecine, le but est d’identifier avec précision l'agent étiologique ou pathogène causant une maladie soudaine, comme par exemple les infections aiguës des voies respiratoires inférieures, les maladies diarrhéiques, les fièvres d'apparition soudaine et les infections sexuellement transmissibles. Le suivi thérapeutique de maladies chroniques devient important aujourd’hui, car il permettrait au médecin de vérifier si le médicament pris par le patient est au bon dosage.19,

- La manipulation et l’étude de cellules confinées (ou non) dans des microcanaux pour la recherche fondamentale en biologie cellulaire. Ici, la microfluidique a pour but d’approvisionner les canaux (ou chambres) de culture avec des nutriments adaptés à la culture des cellules. Ces puces sont, en général, couplées à des microscopes confocaux pour de l’imagerie de haute résolution.23,24

- La cristallisation et synthèse de protéines où la microfluidique permet de faire varier en parallèle un très grand nombre de conditions de cristallisation (température, pH, humidité, etc…).25

En conclusion de cette introduction, si le concept de « laboratoires-sur-puce » (LOC pour «Lab-on-a-Chip » ou POC pour « Point-of-care ») avait été avancé dans les années 1990, quinze années plus tard, il n’existe encore que peu de démonstrateurs multi-analyses, et ceux-ci se limitent souvent à des dispositifs de laboratoire qui sont peu adaptés aux besoins des cliniciens. Effectuer un diagnostic immunologique, qui a pour but d’identifier les protéines clés permettant de classer la maladie (cardiovasculaire, pulmonaire, métabolique ou cancer), au sein d’un dispositif miniaturisé impose un grand nombre de caractéristiques que nous avons citées précédemment. En résumé, le dispositif LOC doit permettre : 1/ une analyse rapide en quelques minutes, 2/ multiplexe sur plusieurs biomarqueurs, 3/ sensible et fiable c’est-à-dire sans faux positif, 4/ adapté au clinicien ou suffisamment simple pour être manipulé par le patient lui-même. Enfin, ce système doit être peu coûteux et portatif (Figure 1.3 b) pour permettre un diagnostic au plus proche du malade. La montée en puissance de la télémédecine imposant maintenant une transmission par antenne rf des données, la miniaturisation de ces petits laboratoires autonomes devient plus complexe. Certains industriels rêvent de dispositifs biocompatibles qui pourraient être implantés pour un suivi en temps réel de la pathologie (Figure 1.1). On entre progressivement dans l’ère des LOC in-vivo.

Figure 1.3 (a) Une plate-forme microfluidique dédiée pour la recherche. Elle exige la présence d’un microscope, écran, puce microfluidique. (b) Le dispositif POC portable qui nécessite un lecteur

périphérique. (c) La plate-forme de laboratoire central. Dans ces trois exemples, le volume de l'échantillon est ≤100 μL. 10

I.2 – Architecture d’un laboratoire-sur-puce idéal :

Après avoir exposé la nécessité d’utiliser des dispositifs LOC pour le diagnostic et le suivi thérapeutique, nous pouvons nous poser la question de ce que serait le prototype idéal d’un tel microsystème LOC fluidique.

La figure 1.4 présente une vue schématique idéalisée d’un tel microsystème, qui se décompose en deux parties : une « tête » microfluidique jetable, où se déroulent les analyses, et un lecteur électronique, qui devra être capable d’enregistrer les données et de les transmettre cryptées. La partie jetable du dispositif devra à terme coûter moins d'un dollar à fabriquer. Elle doit être robuste, imperméable à l'eau, et fabriqué avec des matériaux transparents pour pouvoir analyser les écoulements de liquide et visualiser les marqueurs fluorescents (impératif dans le cas d’une détection optique).

Figure 1.4 Le dispositif POC idéal. 10

Le diagnostic d’un échantillon infecté nécessite essentiellement 3 étapes, la préparation, l’amplification et la détection, comme cela est illustré dans la figure 1.5.26 Puisque mon travail de thèse concerne la détection d’ADN qui d’effectue dans le dernier troisième bloc de la figure 1.5, nous allons décrire de manière plus détaillée tous les étapes de l’analyse d’ADN sur puce, depuis l’extraction et la lyse de la cellule (ou bactérie) jusqu’à la purification de la solution lysée pour obtenir le biomarqueur ADN de la maladie que l’on cherche à diagnostiquer, qui sera en général amplifié avant la détection finale. La première étape consiste à extraire et séparer les analytes cibles à partir des échantillons infectés (sang, salive, ...), tandis que la deuxième étape servira à multiplier le nombre des analytes surtout dans le cas des maladies primordiales. Enfin la troisième étape de détection permet à partir de la quantification précise du biomarqueur ADN de fournir un rapport sur le taux d’infection du patient.

Figure 1.5 Schéma illustratif des différentes étapes nécessaires pour le diagnostic.

L’objectif de mon travail de thèse était de mettre au point une méthode de détection suffisamment sensible et spécifique pour pouvoir s’affranchir des étapes d’amplification et séparation. Je terminerai donc cette introduction par une description synthétique de ces différentes étapes et aussi des différentes méthodes de détection utilisées et intégrées sur puce.

I.3 - L’extraction de l’ADN :

L’acide nucléique est une molécule que l’on trouve dans tous les organismes vivants spécialisés pour le stockage et la transmission des informations et des codes génétiques et donc ce sont les constituants principaux du noyau de la cellule humaine. Ainsi, il existe deux types d'acides nucléiques: ADN (acide désoxyribonucléique) et l'ARN (acide ribonucléique).

L’ADN est constitué de deux longues chaînes ou brins sous forme d’une hélice (découverte en 1953 par James Dewey Watson, Francis Crick et coll.)27 qui sont nécessaires à la production de protéines. Chaque brin d’ADN est composé des bases azotées entourées par deux groupements de phosphates chargés négativement. Ces bases sont au nombre quatre : l’Adénine (A), la Guanine (G), la Thymine (T) et la Cytosine (C) ils sont complémentaires et peuvent s’associer deux à deux : A s’associe avec la T et la G s’associe avec C. Ensuite, chaque brin d’ADN s’écrit toujours à partir de l’extrémité 5’, associée à un groupement phosphate vers l’extrémité 3’, associée à une fonction alcool (voir figure 1.6). Cette succession de nucléotides correspond à une structure primaire simple brin, les deux brins complémentaires étant antiparallèles, ce qui signifie que pour un brin observé dans le sens 3’ vers 5’, le complémentaire est orienté de 5’ vers 3’. La structure ainsi reformée est alors dite double brin hélicoïdal. Cette orientation antiparallèle est nécessaire pour que les brins s’emboîtent dans l'espace à trois dimensions.

La reconnaissance de deux brins d’ADN est connue sous le nom d’hybridation, où il y a une formation des liaisons d’hydrogène entre les bases A-T et G-C qui constitue l’ADN et c’est ce qui relie

les deux brins d’ADN. L’ordre de succession de ces nucléotides est à l’origine même du codage génétique, il détermine les caractéristiques de chaque organisme.

Finalement, l’ADN peut être extrait facilement en éclatant les cellules pour pouvoir extraire l’ADN, il est possible d’effectuer l’amplification de la séquence d’ADN souhaitée en s’appuyant sur la réaction de polymérisation en chaine (PCR).

Figure 1.6 Structure de l’ADN. (a) double hélice d’ADN, (b) les bases azotées (Guanine et Adénine ; Cytosine et Thymine)

Plusieurs protocoles ont été développés afin d’amplifier des séquences spécifiques d’ADN. La première étape consiste à détruire les membranes cellulaires et nucléaires des cellules pour libérer l’ADN. Il existe deux voies, la première consiste à lyser les cellules en utilisant des billes magnétiques de tailles similaires à ceux des cellules. Une simple centrifugation de ce mélange bille/cellule permet d’exploser les membranes de ces cellules et de libérer l’ADN génomique. L’ADN est récupéré par la suite grâce aux propriétés magnétiques de ces billes qui se fixent sur l’ADN et qui peuvent être dirigées par un aimant pour récupérer le mélange bille/cellule avec une micropipette. La deuxième voie repose sur l’utilisation d’une enzyme de digestion comme la protéinase K qui est capable de digérer des cellules et d'extraire les acides nucléiques (ADN ou ARN). La protéinase K est une endopeptidase qui coupe les liaisons peptidiques, de préférence au niveau du carboxyle d'un acide aminé à chaîne latérale hydrophobe ou aromatique. Son activité est stimulée par des agents dénaturants comme le sodium dodécylsulfate (SDS). L'étape critique qui suit la lyse cellulaire est la purification afin d’éliminer les protéines et les contaminants récupérés avec l'ADN en solution. Cette étape est nécessaire, puisque les différents composés de la solution de lyse et surtout les enzymes

cellulaires peuvent exercer une dégradation de l’ADN génomique voire même perturber les analyses ultérieures en entrainant l'inhibition de l'amplification. 28,29

Enfin, ces techniques reposent sur l’extraction d’une séquence d'ADN spécifique qui peut être isolée de son contexte génomique avant d’être amplifiée pratiquement sans limite. L'ADN ou l'ARN récupéré subit différentes étapes de lavage à l'isopropanol ou à l'éthanol, puis des étapes de centrifugation. Toutes ces méthodes nécessitent de nombreuses et longues étapes pour recueillir les ADN ou les ARN à partir des échantillons biologiques. Elles exigent toujours la manipulation des concentrations importantes d’ADN (1 g/ml) pour faciliter les étapes de centrifugation et de lavage. Pour simplifier l’étape de purification des échantillons, l'extraction sur colonne en phase solide (SPE) a été développée. 30

Une fois que l’extraction des séquences d’ADN spécifiques et l’isolation de son contexte génomique sont réalisées, une étape de PCR est réalisée sur l’ADN afin d’amplifier sans limite ses séquences spécifiques.

I.4 - L’amplification par la méthode PCR :

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est sans doute l’un des outils le plus puissant et le plus fiable dans le domaine du diagnostic. Elle a été découverte et mise en œuvre par Kary Mullis et ses collègues de Cetus Corporation au début des années 1980.31,32 Grâce à son invention Kary Mullis a obtenu le Prix Nobel en chimie en 1993. Cette méthode a été officiellement présentée à « l'American Society of Human Genetics Conference » en octobre 1985 et sa première application clinique a été testée la même année pour l’anémie falciforme. 33

L'amplification d'ADN par PCR consiste à produire in vitro des copies de séquences d'ADN spécifiques. Le processus d'amplification par PCR de l’ADN extrait de la lyse de cellules humaines consiste à mélanger l’ADN génomique dans une solution tampon, qui contient deux amorces oligonucléotidiques, dont les extrémités 3-prime pointent l'une vers l'autre, chacune étant complémentaire des brins d’ADN génomique, et en présence, d’une part d’une forte concentration de quatre désoxynucléosides triphosphates et, d’autre part, de l’ADN polymérase thermostable qui est une enzyme de synthèse de l'extrémité 5-prime vers l'extrémité 3-prime de l’ADN32,31, 34. L’ADN polymérase thermostable est isolé, soit à partir d’une bactérie qui s’appelle Thermus aquaticus (T. aq.)34 ou d’une bactérie qui s’appelle Escherichia-Coli 32. La polymérase de ces bactéries possède la propriété de résister à plusieurs expositions successives à de hautes températures (jusqu'à 100°C). La PCR consiste en 3 phases effectuées à différentes températures : 1) la dénaturation, 2) l’hybridation et 3) l’élongation. Elle consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrices

pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer afin de ne réutiliser que la matrice originale. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est donc exponentielle.

La réaction est basée donc sur une répétition de cycles de température réalisée successivement, où chaque cycle contient les trois étapes suivantes (figure 1.7) :

- La dénaturation du double brin d’ADN génomique, réalisée à 95°C pendant typiquement 15 minutes pour dés-hybrider l’ADN et obtenir les deux simples brins (Figure 1.7 _ étape 1). - L’hybridation des oligonucléotides amorces avec les séquences cibles de l’ADN génomique à

une température comprise entre 40 et 70 °C pendant moins d’une minute. La température est choisie selon la longueur et la composition en nucléotides des amorces (Figure 1.7 _ étape 2).

- L’élongation qui s’effectue à 72°C consiste en la polymérisation qui se fait par ajout successif des déxoxyribonucléotides. Chaque base ajoutée est complémentaire de la base correspondante du brin matrice. Durant cette étape, la polymérase se fixe aux amorces, servant de point de départ, et ajoute des désoxyribonucléotides (dNTP’s) afin de synthétiser le brin complémentaire de l’ADN (Figure 1.7 _ étape 3).

Figure 1.7 Schéma illustratif des différentes étapes de la réaction de polymérisation en chaine. Le cycle est répété plusieurs fois (en général environ 30 cycles) afin d’obtenir plusieurs copies de la séquence d’ADN cible. Les tests d'amplification PCR d'acide nucléique ont été mis au point afin de détecter de très petits nombres de copies de séquences d'acide nucléique spécifiques.

I.5 - Modes de détection intégrés dans des LOC :

Passons en revue brièvement l’état de l’art des biocapteurs qui ont été intégrés dans un laboratoire-sur-puce. Il existe quelques revues récentes qui présentent cet état de l’art ; je rapporte ici une synthèse de l’article de Gervais et al. 10 avec certaines figures extraites. Les biocapteurs peuvent être classifiés selon le mode de reconnaissance des analytes biochimiques. L’étape de reconnaissance biomoléculaire peut donc être révélée :

- soit de manière indirecte, ce qui signifie que les espèces impliquées dans l’interaction étudiée sont couplées à des molécules détectables par leurs propriétés de transduction connues (fluorescence, marqueurs radioactifs, sonde rédox…) comme illustré sur la figure 1.8. On parle ici de détection avec marquage préalable de l’analyte.

- soit de manière directe, c’est-à-dire sans marqueurs où les phénomènes liées à la présence de l’analyte sont directement mesurées après l’introduction de celui-ci sans aucune étape d’amplification ou de marquage préalable. On parle de détection sans marquage - « label-free » en anglais. Dans ces biocapteurs la présence d’un transducteur dont les propriétés physiques sont modifiées est employée comme représenté sur la figure 1.9.

Décrivons brièvement ces différents modes de reconnaissance. I.5.1 - La détection avec marquage des analytes :

A - Détection optique :

La Figure 1.7 présente les différentes méthodes de détection avec marquages qui sont les plus utilisées pour suivre la présence d’une cible biologique ou chimique. La détection optique est la méthode la plus utilisée. C’est la détection colorimétrique (Figure 1.8 a), qui permet de mettre en évidence de manière la plus simple la reconnaissance moléculaire entre l’analyte d’intérêt et le biorécepteur. La figure 1.8 a illustre cette lecture, où une ligne colorée en rouge apparaît lorsque l’analyte (thrombine) est capturée par les aptamères. 35 Ces tests sont souvent qualitatifs et la ligne n’est visible qu’en présence de l'analyte à des concentrations élevées. Parmi les dispositifs POCs les plus simples et les plus connus, on trouve le test de grossesse qui utilise la détection colorimétrique intégrée sur puce. De même, la méthode ELISA (« Enzyme-linked immunosorbent assay » en anglais) est la méthode la plus utilisée employant un dosage de type colorimétrique. Cette méthode est principalement utilisée en immunologie pour détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon. Ce test entre dans le cadre plus général des « enzyme immunoassays » (EIA), dans lequel le dosage est couplé à une réaction catalysée par une enzyme qui libère un composant

coloré. Ce composé coloré peut être suivi, soit par spectroscopie couplée à une détection optique36, soit par un changement de couleur visuel ou mesurable dans l’UV-visible (figure 1.8 d).

Figure 1.8 Les différents modes de transductions en utilisant un pré-marquage de l’analyte avec (a) la colorimétrie, (b et c) la fluorescence, (d) le marquage opto-magnétique et (e) l’électrochimie

extrait de l’article de revue de Gervais et al (ref).10

La deuxième méthode optique de mesure de la présence d'un analyte est la fluorescence, qui est la voie couramment utilisée. L’analyte peut être couplé avec un ou plusieurs centres fluorescents. Ces fluorochromes ou fluorophores sont soit des composés constitués de plusieurs noyaux aromatiques conjugués, soit ils se présentent sous forme de molécules planes et cycliques possédant des liaisons π dont un signal fluorescent est produit suite à une excitation optique. Ce signal est facilement lisible avec des microscopes optiques munie d’une caméra (une caméra CCD : dispositif à couplage de charge) ou avec des spectromètres (Figure 1.8 b).37, 38 Pour atteindre, un signal facilement lisible, différentes façons ont été utilisées pour amplifier ce signal comme l’augmentation du nombre de fluorophores fixés aux molécules sonde ou bien utiliser un appareil avec un jeu de miroirs (Figure 1.8 c) afin de modifier les chemins optiques qui peuvent augmenter la quantité d'excitation c’est-à-dire augmenter la lumière d'émission. 39_{Les inconvénients majeurs de ces}

techniques sont bien évidemment liés à la nécessité de marquer les molécules en amont de la détection. La fonctionnalisation des molécules requiert des étapes supplémentaires de préparation dans les protocoles à mettre en œuvre. Les marqueurs fluorescents présentent un certain nombre de limitations parmi lesquelles on citera le phénomène de « désactivation » (« quenching» en anglais), qui résulte de l’absorption d’une partie de l’énergie par les autres molécules situées dans le milieu. Le phénomène de photo-blanchiment, qui se caractérise par la perte des propriétés fluorescentes

des molécules sous l’effet d’une excitation par une forte intensité lumineuse, est aussi limitant. Le fluorophore va ensuite s’engager dans une réaction photochimique qui va empêcher son retour vers un état excitable ce qui altère de façon irréversible les propriétés de fluorescence. Aussi, la durée de vie d’émission de fluorescence des fluorophores est relativement courte (de l’ordre de la nanoseconde) qui nécessite l’utilisation d’un grand équipement pour son acquisition.

B - Détection par marquage magnétique:

Les marquages magnétiques offrent des avantages considérables dans la biodétection. Ils sont considérés non invasifs, biocompatibles, relativement peu coûteux, et produisant un bruit de fond négligeable. À ce jour, de nombreuses méthodes ont été développées pour détecter des biomolécules en se servant du marquages magnétique40. Ces méthodes s’adaptent à la miniaturisation et peuvent être intégrées facilement dans des dispositifs microfluidiques41. Cette approche consiste à fonctionnaliser l’anticorps désiré avec des nanoparticules magnétiques qui sont manipulées avec un champ magnétique dont la détection se fait de manière optique (Figure 1.9 d)42 I.5.2 - La détection sans marquage des analytes («label-free ») :

Pour les biocapteurs basés sur l’identification des analytes sans marquage préalable, la détection est suivie par les propriétés physiques ou chimiques du transducteur suite à la réaction entre l’analyte et le biorécepteur.

Figure 1.9 Les différents modes de transductions sans marquage. Détection en utilisant. (a) des cristaux piézoélectrique, (b) résonance plasmonique de surface, (c) des guides d'ondes optiques

résonnants, (d) transistor à effet de champ et (e) les cantilevers.10

La figure 1.9 présente les différentes biocapteurs de détection sans marquage tels que : la détection optique intégrée soit (b) par la résonance des plasmons de surface (SPR) ou (c) par guide d’onde (suivie de la propagation des ondes évanescentes), la détection électrique (d) par effet du

champ (biocapteurs potentiométriques « transistors à effet de champ »), et enfin la détection mécanique (a) par effet piezoélectrique et (e) par micro-leviers. Par souci de concision, je ne présenterai ci-dessous que les méthodes optiques et mécaniques, qui sont des voies alternatives à la détection électrochimique étudiée pendant ma thèse.

A - Biocapteurs optiques:

La résonance plasmonique de surface dite SPR (Surface Plasmon Resonance) est une méthode de détection permettant une analyse quantitative en temps réel. 43 La surface d’un substrat de verre couvert d’une mince couche métallique est irradiée par un faisceau lumineux polarisé (monochromatique) dont une partie du faisceau incident sera réfléchie par l'interface. Cette fine couche de métal est riche en électrons libres qui entrent en résonance avec les photons du faisceau incident, ce phénomène est appelé résonance de plasmons de surface. Cette résonance est visible dans le faisceau réfléchi qui, analysé avec une barrette de diodes, présente une chute d'intensité à un angle défini. Cet angle d'intensité minimale correspond à l'angle de résonance. Il varie en fonction de l'indice de réfraction du milieu présent dans le champ évanescent. La deuxième partie du faisceau incident réfracté va induire la pénétration d’une onde évanescente dans le matériau conducteur permettant la propagation d’une onde électromagnétique sur la face parallèle à la surface du métal sur une distance équivalente à sa longueur d'onde. 44 C’est l’intensité de l’onde réfléchie caractérisée par un indice de réfraction et la variation de l’angle de résonance qui va permettre de donner des indications sur les espèces immobilisées sur la surface et permettent de les quantifier. Par exemple, la fixation d’un antigène sur l’anticorps spécifique préalablement immobilisé sur la surface métallique provoque un changement de l’indice de réfraction. La mesure du décalage induit dans la longueur d’onde par ce changement d’indice de réfraction45 conduit à une variation de l’angle de résonance et de la réflectivité.

B - Biocapteurs mécaniques :

Les biocapteurs piézoélectriques peuvent être classés comme des systèmes de transduction sans marquage puisque la détection est liée directement au changement physique du signal et aucun marquage n’est nécessaire pour détecter l'interaction entre le biomarqueur et le récepteur sur la surface du biocapteur. 46 La variation de la fréquence oscillante du cristal piézoélectrique est liée directement à d’interaction entre l’analyte et les biorecepteurs qui sont immobilisées à la surface du cristal (figure 1.9 a). Elle permet une détection en temps réel des événements de bio-reconnaissance qui ont lieu sur la surface du cristal. En effet, la variation de la masse (Δm) des molécules déposées sur la surface du cristal est proportionnelle à la variation de la fréquence de résonnance (Δf) du

piézoélectrique. 47 Ces variations de fréquence Δf peuvent être déterminées selon l’équation de Sauerbrey:

∆f = −2𝐹2 ∆𝑚

𝐴√𝜌𝑄𝜇𝑄

où Δf est l'écart de fréquence à la résonance (en Hz), F est la fréquence fondamentale du cristal (en Hz), Δm correspond à la variation de masse (en g) et A à la surface de l'électrode (en cm2) 𝜌𝑄 est la

masse volumique du cristal de quartz (2,643 g/cm3) et μQ la célérité d’une onde acoustique dans la

coupe du quartz (le module de cisaillement = 2, 947 1011 g cm-1 s-2).

À l'heure actuelle, un certain nombre de capteurs se servant de la lecture piézoélectrique sont disponibles sur le marché et sont utilisés pour diverses applications médicales comme pour les immunocapteurs pour la détection de certaines marqueur du cancer (PSA - antigène spécifique de la prostate et AFP α- fétoprotéine). 48 Une revue scientifique parue en 2010 fait un état de l’art sur les applications de cette méthode en détection. 49 Ces biocapteurs piézoélectriques ne sont pas facilement adaptables pour des applications de mesure sur le terrain car leurs performances et leurs sensibilités sont fortement influencées par fluctuations externes. 50

D’autres méthodes de mesure se sont développées par la suite en utilisant l’effet piézoélectrique. On peut citer la détection avec des micro-leviers. Dans ce cas, le transducteur (micro-levier) dispose d'un matériau piézo-électrique intégré à proximité de la surface supérieure du cantilever (figure 1.8 e). Une modification de la masse sur la surface du biocapteur provoque un changement observable de la raideur de la poutre, où chaque modification des contraintes mécaniques induites après le phénomène de reconnaissance biomoléculaire entraîne une déflexion de la poutre, ce qui amène à un changement de la fréquence de résonance de la poutre. Ce système de détection est adapté à des mesures multiplexées et il peut être intégré dans une puce. En revanche, les microleviers sont limités dans leurs applications par leur processus de fabrication complexe. 51,52

II – La biodétection électrochimique :

II.1 - Définition d’un biocapteur :

Un biocapteur est défini comme un outil analytique qui convertit une réponse biologique en un signal mesurable, traitable et quantifiable (selon l'Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée : IUPAC)53. Il combine un composant biologique appelé "biorécepteur" et un "transducteur" représentant le mode de détection54. Une fois la reconnaissance d'analytes est effectuée, le transducteur convertit cette réponse biologique en un signal mesurable et qui reflète la

présence ou non de l’analyte. La concentration de l’analyte dans la solution est ainsi directement proportionnelle à la modification du signal et peut être donné après traitement du signal mesuré. Ce signal peut être électrique (capteur électrochimique - cf figure 1.10) ou optique (capteur photonique).

Figure 1.10 Schéma général d’un biocapteur électrochimique

Les principales caractéristiques des biocapteurs à prendre en considération dans la biodétection et à respecter sont :

- La sélectivité : cette caractéristique renseigne sur la fiabilité du biocapteur à ne répondre qu’à une cible spécifique permettant de la distinguer parmi d’autres molécules ayant une structure similaire.

- La sensibilité du biocapteur qui consiste à fournir la valeur de la concentration minimale d’analyte cible détectable avec le biocapteur. Celle-ci peut être obtenue en mesurant la réponse du signal lors d’ajouts croissants en concentration de molécules cibles ce qui permet d’établir une courbe de calibration. A partir de cette courbe on peut déterminer les caractéristiques du biocapteur : la sensibilité qui représente la pente de cette courbe et la limite de détection qui est calculée selon l’équation suivante :

𝐿𝐷 =3 × 𝑆𝐶𝑓 S

où LD est la limite de détection, Scf est l’écart type de la plus faible concentration et S est la

de LD est obtenue d’après au moins 3 mesures expérimentales et s’exprime en mA.L.mol-1.cm

-2

.

- Le domaine de linéarité qui représente la gamme en concentrations d’analyte où une variation du signal est observée. Ce domaine est généralement compris entre les valeurs de la limite de détection et la valeur de la concentration pour laquelle le biocapteur présente une saturation.

- Le temps de réponse correspond au temps nécessaire pour obtenir une réponse du biocapteur après l’ajout de l’analyte. Il doit être court pour permettre une détection en temps réel.

II.2 - Méthodes d’immobilisation du biorécepteur :

Différentes stratégies peuvent être utilisées afin de créer des attaches sur le transducteur permettant l’ancrage de molécules pour former le biorécepteur appelé « sonde spécifique ».

Trois grandes approches peuvent être employées pour immobiliser les biomolécules sur la surface d’une électrode, ils sont classifiés comme décrit ci-dessous.

II.2.1 - Voie physique :

Il existe différentes approches d’immobilisation de biomolécules par voie physique. Citons brièvement les fonctionnalisations les plus pertinentes dans le domaine de biocapteurs :

A - L’adsorption : C’est l’immobilisation des biomolécules sur la surface du transducteur par physisorption qui est basée sur l’établissement des interactions de faible énergie du type ionique (polaire ou hydrophobe). Ces interactions sont dues aux forces attractives à grande distance de Van-der-Waals et aux forces répulsives électroniques à courte distance. 55,56 L’interaction polaire est une interaction électrostatique par définition, qui peut être soit attractive soit répulsive selon la charge des ions et cations. L’interaction hydrophobe est quant à elle souvent connue comme une interaction apolaire (de faible polarité), ce qui signifie qu'il n’y a pas d'interactions électrostatiques avec l'eau, de type dipôle-dipôle permanent. Cette interaction n’est donc pas spécifique, puisqu’elle n'a pas la capacité à créer des liaisons hydrogènes. Un autre procédé de physisorption dû à des interactions π-empilement (πi-stacking) existe et se manifeste dans l’exemple des molécules de métalloporphyrines pyrène adsorbées sur des surfaces carbonées57. Cette technique d’immobilisation par adsorption présente plusieurs avantages. C’est une méthode économique et très simple à mettre en œuvre. Par contre, les liaisons mises en jeu entre le support et les biomolécules sont réversibles, et donc très fragiles. Ce greffage ne permet pas de contrôler la densité d’entités biologiques greffées à la surface. De plus, l’immobilisation des protéines n’est pas uniforme. Enfin, cette stratégie de greffage peut

conduire à une perte partielle ou totale de l’activité biologique due à la dénaturation des protéines du fait des interactions avec le substrat ou par réduction de la mobilité des protéines. De manière générale, le greffage par les techniques de physisorption ne semble pas le plus performant.

B - Le piégeage : Le principe de cette technique consiste à fixer ou à incorporer la molécule biologiquement active dans une matrice organique (polymère) par la méthode sol-gels ou inorganique (argiles). La biomolécule se trouve piégée de manière physique et non chimique contrairement au greffage covalent. La maille de la matrice assure de manière physique la maintenance des biomolécules tout en permettant la diffusion des électrons de la solution électrolytique vers le transducteur grâce à une porosité suffisante du gel56. Cette technique est cependant limitée par la taille des pores du gel qui peut entrainer le décrochage des molécules de faible taille. Par ailleurs, les groupements actifs d’une enzyme, par exemple, peuvent réagir avec la matrice et donc entraîner une diminution de l’activité catalytique de celle-ci.

C - Le traitement par plasma : Cette technique permet de créer des liaisons telles que les liaisons carboxyliques sur la surface du transducteur dans le but de faciliter la fixation des biomolécules en utilisant du plasma (oxygène ou corona).

II.2.2 - Voie chimique : le greffage covalent

Une liaison covalente sera formée par l’intermédiaire des groupements :

A - Carboxyliques (-COOH) et hydroxyliques (-OH) : Dans ce cadre, l’électrode du travail subit des traitements par différents acides afin d’obtenir des groupes carboxyliques sur sa surface qui facilitent ensuite la fixation du biorécepteur, comme dans le cas des nanotubes de carbones (NTCs) modifiés par des liaisons –COOH et –OH, où il peut être facilement utilisé pour plus de fonctionnalisation des NTCs par diverses biomolécules. 58

B - Esters activés : Le NHS et le sulfo-NHS sont utilisés pour préparer des esters amines réactifs avec des groupes carboxylates pour l'immobilisation sur une surface. La production d’un ester activé se fait par une simple réaction entre les carboxylates (-COOH) et le NHS (ou Sulfo-NHS) en présence d'un carbodiimide tel que l'EDC, qui peut ensuite être mis à réagir avec une amine primaire (NH2) pour former une liaison amide. 55

Figure 1.11 Liaison amide stable

De plus, ces esters améliorent bien l'efficacité de couplage entre le biorécepteur et la surface du transducteur.

C - Silanisation (-SiH) : Pour permettre l’immobilisation des biomolécules de silane sur une surface d’électrode, de nombreux protocoles de greffage des molécules de ce type sont disponibles tel que l’autoassemblage. Il existe deux voies : (1) la première, appelée silanisation, consiste à exposer l’électrode aux vapeurs d’une solution de silane (comme par exemple le 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)) et (2) la deuxième consiste à plonger l’électrode dans cette même solution, pour avoir une monocouche de silane auto-ordonnée sur l’électrode. Dans ce cas (2), le schéma réactionnel de cette réaction repose sur l’établissement des liaisons chimiques fortes entre un groupe fonctionnel des molécules de type silane et un site sur l'électrode.

Figure 1.12 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)

La création de liaisons siloxanes est basée sur la condensation des groupements éthoxy des silanes sur les groupements silanols avec élimination d’un alcool. 55

D - Thiols (-SH) : Les molécules d’alcanethiol sont constituées d’une chaîne alkyle se terminant par un groupement -SH présentant une grande réactivité avec les surfaces d’or favorisant le phénomène d’autoassemblage. Dans ce cas, il aura un établissement des liaisons chimiques entre les thiols et le transducteur qui caractérise le phénomène de chimisorption et pas la physisorption.

L’avantage du greffage chimique est d’éviter tout d'abord le décrochage des molécules au cours d’une expérience, qui est le principal inconvénient de la méthode par adsorption. Il permet aussi de réduire le bruit de fond provenant d'adsorption non spécifique parce que la chimie de surface optimisée peut-être mise en œuvre à cet effet. Enfin, le dispositif peut-être réutilisable si un processus de régénération correct est conçu.

II.2.3 - Voie électrochimique :

A - Le greffage électrochimique consiste à polariser sous champ électrique l’électrode de travail (transducteur) en présence des molécules que l’on souhaite greffer (éthylène diamine ou sels du diazonium), ce qui génère l’oxydation ou la réduction de la molécule à base de solution ou un groupe fonctionnel à base de surface59. Cette technique fournit une voie particulièrement commode

pour la modification de la surface d'électrode et surtout les électrodes de carbone. L’éthylène diamine60 ou le sel de diazonium61 possède un groupement amine (NH2) susceptible de créer une

liaison covalente sur la surface de l’électrode après avoir subi une oxydation ou une réduction électrochimique générant des molécules avec des radicaux cations qui vont se réagir après pour former des liaisons covalentes (amide) entre l’électrode et ces molécules. C’est ce que l’on appelle le greffage électrochimique.

De manière générale, cette technique offre l’opportunité de la sélectivité du greffage et aussi la possibilité de greffer une ou multi couche des molécules. De plus, l'efficacité du biocapteur dépend aussi du nombre des molécules greffées, ce qui est un des avantages de cette technique qui permet de bloquer la surface de l’électrode avec les molécules souhaitées. La commodité et la diversité offerte par le greffage électrochimique facilitent les procédures de travail dans différents domaines allant de l'étude des cinétiques de transfert d'électrons,62 l'électronique moléculaire, la conception de biocapteur, et même dans la modification chimique de carbone phase stationnaire en chromatographie en phase liquide. Nous verrons plus loin dans le mémoire que c’est cette méthode qui a été mise en œuvre au cours de ma thèse.

B - L’électropolymérisation : Cette technique consiste à éléctro-polymériser des monomères

afin d’obtenir un film de polymère conducteur sur la surface de l’électrode. Les monomères sont considérés comme des semi-conducteurs avec une faible conductivité électronique de l’ordre de 10-9 S cm-1 parce que ces derniers sont électro-neutres (non dopés) à l’état stable. Un simple dopage permet également d'obtenir des matériaux avec une très large gamme de conductivités électroniques de l’ordre de 105 S.cm-1 qui sont typiques de métaux ou de semi-conducteurs59.Dans ce cas, ce type de dopage est produit par oxydation électrochimique du monomère (dopage p), dans lequel les chaînes de polymère acquièrent des charges positives provenant de la naissance des radicaux cations. L'électroneutralité du matériau résultante est conservée par l'incorporation de petits contres-ions (l’anion dopant) de la solution d'électrolyte.63 Le radical cation du monomère est formé à l’issue de l’oxydation initiale. Il réagit ensuite avec les autres monomères présents en solution afin de former respectivement des oligomères et le polymère. La synthèse et le dopage du polymère sont donc généralement effectués simultanément. Grâce à cette technique, on arrive facilement à contrôler l’épaisseur du film polymérique ce qui facilite le piégeage des molécules biologiques, tout en conservant leur activité.

II.3 - Les différentes méthodes de mesure électrochimiques :

Depuis le premier biocapteur électrochimique développé par Clark et Lyon en 1962 pour la détection du glucose sanguin64, la communauté scientifique a connu ces dernières années un effort