2.2 - Etude de la cinétique du transfert de charge :

Une étude de la cinétique de transfert de charge a été faite pendant la mesure VC à différentes vitesses de balayage (Figure 4.10), pour tenter de comprendre pourquoi on a gagné 3 ordres de grandeurs en sensibilité dans la biopuce. Ces mesures permettent d’extraire plusieurs paramètres électrochimiques tels que le nombre des sites électroactives (Τ) et la constante de transfert des électrons au cours des réactions d’oxydo-réduction (Ks).

Figure 4.10 VC correspond à la biorécepteur avant (A) et après (B) l’hybridation à différentes vitesses de balayage ; L’insert supérieur dans chaque graphe représente la variation du potentiel en fonction du Log (V) et l’insert en bas représente la variation du courant en fonction de la variation de

la vitesse.

La différence entre les potentiels des pics anodiques aux basses et aux hautes vitesses de balayage (ΔEp) est inférieure à 0.2 V dans les systèmes (Figure 4.10). Le taux du transfert des électrons au cours des réactions d’oxydoréduction peut être déterminé à partir de la loi de Laviron¹⁵⁸ :

1

m⁼

nVF

RT

1

K

Nos mesures et fits conduisent à KS = 6 s^-1 dans les biopuces, et KS = 1 s^-1 en utilisant les macroélectrodes. Les différentes valeurs de Ks sont reportées dans le tableau ci-dessous. On remarque donc que la cinétique du transfert des électrons est favorisée dans le milieu confiné du microcanal.

Le nombre des sites électroactifs peut quant à lui être déterminé grâce à l’équation Ranles-Sevcik :

i_pc= ^nαnaF

2VC₀ 2.718 RT v

Ce nombre des sites Τ (10^-08 mol .cm^-2) qui est déduit à partir des fits est aussi reporté dans le tableau. Une diminution de T est enregistrée après chaque étape de greffage, mais sa valeur reste toujours de l’ordre de 10^-8 mol.cm^-2.

Γ (10^-08mol .cm^-2) K_s (s^-1) D₀ (10^-6 cm².s^-1) Macro- Microfluidic électrode chambre Macro- Microfluidic électrode chambre Macro- Microfluidic électrode chambre MWCNTs-Fc 3± 0.1 0.51± 0.06 1.4 ± 0.2 4.71 ± 1.51 25 ± 3 4.17 ± 0.5 MWCNTs-Fc-ssDNA 2.1± 0.1 0.45± 0.05 1.4 ± 0.2 2 ± 0.7 19 ± 1.5 3.3 ± 0.8 MWCNTs-Fc-dsDNA 1.3 ± 0.1 0.4 ± 0.04 1.2 ± 0.1 5.8 ± 1.2 5 ± 1 3 ± 0.9

La spectroscopie d’impédance électrochimique (SIE) reste l’un des outils le plus performants et fiable pour étudier les propriétés électriques des systèmes électrochimiques, l’état de surface des électrodes et la cinétique des électrodes. Nous avons donc effectué des mesures de spectroscopie d’impédance pour étudier les propriétés électriques du transducteur (Au/NTCs) sur l’électrode du travail (Et) avant greffage du biofilm. L’approche conventionnelle consiste à perturber le système Et/solution [Fe(CN)6]^3-/4 (10 mM) par un potentiel V (ɷ, t) de l’ordre de -0.05V (cette valeur du potentiel a été préalablement déterminée à partir du voltammogramme de la même solution électrolytique). Le potentiel varie de manière sinusoïdale avec une amplitude de 10 mV, liés à une fréquence qui varie entre 0.5 et 100 KHz. On mesure simultanément le courant I (ɷ, t) qui résulte de l’excitation électrique. Nos spectres SIE sont présentés dans la figure 4.11 B pour la biopuce. La figure 4.11A rappelle nos mesures effectuées sur macroélectrodes dans les mêmes conditions expérimentales.

Figure 4.11 Diagrammes de Nyquist obtenues sur les électrodes sans la fonctionnalisation chimique (en noir) et après le greffage du Fc (en rouge), dans une solution électrolytique de [Fe(CN)6]^3-/4-(10

mM) dans la gamme de fréquence à partir de 0.5 Hz à 100 kHz,(A) à 0.25 V vs. Ag/AgCl dans les macroélectrodes et (B) à -0.05 V vs. Au dans les biopuces, par application d'un potentiel (AC) de 10

mV.

Le circuit équivalent pour la biopuce, obtenu à partir de la modélisation des spectres expérimentaux selon le modèle de Randels, montre l’apparition d’un CPE à l’interface « électrode/électrolyte » comme cela avait été observé avec les macroélectrodes. Cette CPE traduit l’hétérogénéité de la surface d’électrode en NTCs, qui favorise une distribution de charge non homogène. A basse fréquence, on remarque l’apparition d’un CPE2, au lieu d’un W en série avec Rct

observé pour les macroélectrodes. L’observation de CPE2 signifie que la cinétique de transfert de charge n’est pas la même dans les deux systèmes. A basse fréquence, comme indiqué dans les tableaux des résultats des fits, la valeur n= 0.68 du CPE1 diffère de celle des macroélectrodes (n= 0.55) traduisant une diffusion différente. Nous pensons que le haut flux utilisé peut avoir un effet sur le tapis de NTCs de faible densité et modifier indirectement ce transfert de charge. Nos paramètres expérimentaux de la biopuce ont une incidence notable sur la cinétique de la réaction d'oxydo-réduction.

Micro-électrodes

Au

5.87 ± 0.11 0.34 ± 0.04

n=0.68 ± 0.01

101 ± 4.135

n=0.54 ± 0.02

0.03

4.81 ± 0.17 1.7 ± 0.19

n=0.57 ± 0.01

166 ± 4.86

n=0.4 ± 0.02

0.01

1.44 ± 0.09 0.12 ± 0.03

n=0.8 ± 0.03

119 ± 2.17

n=0.33 ± 0.01

0.03

0.541 ± 0.12 0.06 ± 0.04

n=0.88 ± 0.06

114 ± 1.6

n=0.27 ± 0.01

0.03

2.42 ± 0.16 0.571 ± 0.12

n=0.7 ± 0.02

138 ± 7.16

n=0.32 ± 0.01

0.02

Macro-électrodes

5.68 ± 0.12 1.75 ± 0.22

n = 0.56 ± 0.01

1.17 ± 0.02 0.04

4.6 ± 0.34 6.14 ± 1.29

n = 0.4 ± 0.02

1.07 ± 0.03 0.08

3.6 ± 0.14 3.66 ± 0.74

n = 0.49 ± 0.02

1.29 ± 0.03 0.06

4.8 ± 0.21 4.23 ± 0.87

n = 0.46 ± 0.02

1.18 ± 0.03 0.07

La SIE est l’un des outils les plus utilisés pour suivre l’élaboration des biocapteurs. Elle a donc été utilisée pour suivre l’immobilisation des biomolécules du biofilm récepteur à chacune des étapes. Tout d’abord, on remarque une forte diminution de la Rct juste après le greffage de Fc dans le dispositif microfluique comparativement aux macroélectrodes (Figure 4.11 - rouge), ce qui explique l’augmentation du taux de transfert de charge Ks au cours des réactions d’oxydoréduction.

Figure 4.12 Diagrammes de Nyquist obtenues au cours des différentes étapes d’immobilisation du biocapteur, dans une solution électrolytique de [Fe(CN)6]^3-/4-(10 mM) dans la gamme de fréquence à

partir de 0.5 Hz à 100 kHz à -0.05 V vs. Au dans les biopuces, sous 10 mV (AC).

Les fits de chacun des diagrammes de Nyquist obtenus au cours des différentes étapes d’immobilisation du biorécepteur sont rapportés dans la figure 4.12 avec le circuit électrique équivalent illustrée dans l’insert.

On remarque une diminution notable de la Rct de 5.87 ± 0.019 KΩ à 4.81 ± 0.035 KΩ après le dépôt des NTCs. Cette diminution de résistance n’est pas surprenante d’après les propriétés électroniques remarquables de ce nanomatériau. Une fois le ferrocene fixé sur l’amine, la valeur du Rct diminue traduisant l’amélioration du transfert de charge entre cette sonde rédox et la solution électrolytique du [Fe (CN) 6] ^{4 -/3-}. Ensuite, l’immobilisation de l’oligonucléoite sonde (ODN) montre un

comportement métallique du biorécepteur qui doit provenir de la charge négative acquise à partir des groupes phosphates de l’ODN. Ceci est confirmé par le décalage vers les potentiels négatifs observé précdemment en voltamétrie cyclique (figure 4.8). Enfin, après l’hybridation, la Rct

augmente, ce qui pourrait être lié à l'effet de la diminution du nuage électronique autour des groupements azotes, au cours de la formation des liaisons hydrogènes entre les 2 brins d’ADN. L’observation d’une diminution de l’électronégativité des brins duplex d’ADN est renforcée par notre étude cinétique en VC qui a montré une diminution de Ks de 1.4 ± 0.2 (pour ODN sonde) jusqu’à 1.2 ± 0.1 (pour l’ADN complémentaire). Enfin, notre circuit électrique présente une CPE1 à l’interface électrolyte/électrode, qui reflète la distribution de charges entre l’interface électrolyte/électrode et l’hétérogénéité de la surface de l’électrode.

Figure 4.13 Analyse par VC du biorécepteur Au-NTCs-Fc dans une solution tampon

Fe

(

, v = 50 mV/s.

L’analyse par VC (figure 4.13) en utilisant une sonde redox externe permet aussi d’avoir une idée sur le transfert de charge à l’interface électrolyte/électrode. Une fois le dépôt des NTCs mise en place sur l’électrode en or, le signal rédox de Fe^2+/3+ devient plus intense grâce aux propriétés électroniques de ce nanomatériau permettant d’obtenir ainsi un transfert balistique des électrons. Lors du greffage du ferrocène, l’intensité du signal rédox est très légèrement augmentée ce qui traduit un meilleur transfert d’électrons.

En conclusion, les expériences en milieu confiné associé à des flux élevés favorisent la cinétique de transfert de charge, mais n’expliquent pas facilement l’origine du gain en sensibilité. Pour comprendre ce gain de 3 ordres de grandeur en LOD , nous allons maintenant revenir sur les paramètres microfluidiques, qui peuvent être facilement calculés d’après la théorie de Squires, Messinger et Manalis²⁰⁹.