Mécanisme d’action de la Propolis : Effet cardioprotecteur et éffet potentialisateur de l'activité antitumorale de la Doxorubicine sur modèle de cellules cancéreuses de pancréas (PANC-1) par blocage du cycle cellulaire et inhibition de la P-glycoprotéine

يحي نب قيدصلا دمحم ةعماج -

لجيج -

Faculté des Sciences ةايحلاو ةعيبطلا مولع ةيلك

de la Nature et de la Vie

Département de Biologie ةيولخلاو ةيئيزجلا ايجولويبلا مسق

Moléculaire et Cellulaire

Thèse Présentée par

Hassiba ROUIBAH

Pour l'obtention du diplôme

De Docteur en Sciences en Biologie

Option : Toxicologie

Thème

Mécanisme D’action de la Propolis : Effet

Cardioprotecteur et Effet Potentialisateur de l'Activité Antitumorale de la Doxorubicine sur Modèle de Cellules Cancéreuses de Pancréas (PANC-1) par Blocage du Cycle

Cellulaire et Inhibition de la P-glycoprotéine (P-gp)

Soutenue publiquement devant le jury composé de :

Président : Essaïd LEGHOUCHI (Professeur, Université MSB Jijel) Rapporteur : Mesbah LAHOUEL (Professeur, Université MSB Jijel) Examinatrice : Souad AMEDAH (Professeur, Université Constantine 1)

Examinateur : Abderahmane BENSEGUENI (Professeur, Université Constantine 1) Examinateur : Hocine RECHRECHE (Professeur, Université MSB Jijel)

Examinateur : Abdelouahab BOUZIDI (Professeur, Université Setif 1 )

« Le savant n’est pas l’homme qui fournit les vraies réponses, C’est celui qui pose les vraies questions. »

Cl. Lévi-Strauss, Le Cru et le cuit , 1964

A mes parents pour ces longues années de soutien inconditionnel, pour leur confiance permanente et l’acceptation de mes choix parfois ambitieux.

Ils m’ont offert la possibilité de réaliser mon rêve. Ils ont toujours fait preuve de la plus grande des patiences et de la plus grande des compréhensions.

Malgré toutes les difficultés qu’ont pu représenter ces longues années d’études, ils m’ont toujours facilité ce parcours, au prix de nombreux efforts.

Il me sera impossible de rendre tout ce qui m’a été offert. Rien n’aurait été possible sans eux, cette réussite est donc un peu la mienne, mais surtout beaucoup la leur.

Aucun remerciement ne serait être suffisant

A mon époux pour son soutien immense A mes anges

Soheib, Heitem Imrane

Ma petite chérie Alaa

Que Dieu vous protège

Premièrement, je remercie Allah, le bon Dieu, qui m’a donné l’ambitieux, le défi, la santé et le courage pour terminer cette thèse.

La première personne que je tiens à remercier est le Pr. Mesbah LAHOUEL, mon directeur

de thèse, qui a su me laisser la liberté nécessaire à l’accomplissement de mes travaux, tout en y gardant un œil critique et avisé. Je le remercie également pour sa gentillesse remarquable, pour tous les moments où il a su m’écouter, me réconforter et me conseiller, à toutes ces aides morales qu’il a pu m’accorder, à tous ces moments humains qui m’ont aidé. J’espère que cette thèse sera un remerciement suffisant au soutien et à la confiance sans cesse dont il a toujours fait preuve à mon égard. Après avoir fait une thèse avec vous, j’ai acquis une grande autonomie qui me permet d’affronter l’avenir sans aucune crainte.

J’exprime toute ma gratitude au Pr. Essaïd LEGHOUCHI, pour m’avoir fait l’honneur de présider le jury malgré tous ses engagements.

Je tiens à remercier également les membres du Jury les Professeurs Souad AMEDAH, Abderahmane BENSEGUENI, Hocine RECHRECHE et Abdelouahab BOUZIDI d’avoir eu l’amabilité, malgré leurs charges, de consacrer un temps précieux pour examiner cette thèse.

Je remercie du fond du cœur la personne sans laquelle la réalisation de ce travail aurais été impossible, le Pr. Malek Zihlif, directeur du laboratoire de pharmacologie de l'université Jordanienne, mon chef. Je le remercie d’avoir accepté de m’accueillir au sein de son laboratoire, d’avoir cru en moi et à mes idées. Il a montré toujours de l’intérêt pour mes travaux et répondu tous les jours à mes sollicitations.

Je remercie tous les membres du Laboratoire de Physiologie et biochimie de la faculté de médecine, université Jordanienne, tout spécialement le directeur du laboratoire Pr. Ahram Mamoun, pour son aide indispensable tout au long de mon travail dans son laboratoire, pour avoir toujours supporté mon impatience et pour ses conseils précieux.

Je remercie tous les membres du centre de recherche Hamdi Mango de la Jordanie, pour

leur gentillesse, leur accueil et pour m’avoir régulièrement dépanné lors de différentes

manips. Je pense particulièrement à Bachair Aburmeileh et aux différents Directeurs du

centre qui m’ont permis l’accès à certaines de leurs installations.

lui souhaitant bon courage et bonne continuation. Je n’oublierai jamais les moments les plus difficiles qu'elle a partagé avec moi surtout le travail au laboratoire durant la nuit, le soutien moral … C'est inoubliable !!!!! Elle a toujours été plus qu’une amie pour moi…

Je n’oublierai pas d’adresser mes vifs remerciements à mes amis de l'université de la Jordanie Ibtihel, Hemzeh, Mohammed Shehab, Abeer pour la contribution et l'aide concernant la réalisation des cultures cellulaires et l’approvisionnement de la lignée PANC- 1.

Mes remerciements sont aussi dirigés à tous mes enseignants, mes collègues de travail à l'université de Jijel et toute personne qui me partage les mêmes idées.

Un simple merci n'est pas suffisant à mes sœurs et mes frères, qui m'ont toujours soutenu, encouragé et conseillé dans toutes les situations que j'ai affronté. On partage beaucoup de moments ensemble qui sont gravés dans nos cœurs pour la vie. À mes sœurs et mes frères, je dois ma force, source de mon inspiration et de mon bonheur. Merci à tous les membres de ma famille.

Pour finir, j’exprime ma sincère gratitude envers tous ceux et celles qui m’ont accompagné de près ou de loin à la concrétisation de cette thèse particulièrement Ilhem HAMMOUDI.

Merci !

Travaux scientifiques Publications

- Rouibah H, Mesbah L, Kebsa W, Zihlif M, Ahram M, Aburmeleih B, Mostafa I, El Amir H. Algerian Propolis Potentiates Doxorubicin Mediated Anticancer Effect against Human Pancreatic PANC-1 Cancer Cell Line through Cell Cycle Arrest, Apoptosis Induction and P- Glycoprotein Inhibition. Anticancer Agents Med Chem. 2018. doi:

10.2174/1871520618666180110143239. [Epub ahead of print]

Impact factor: 2.598

- Rouibah H, Benguedouar L, Alyane M, Boussenane H.N, Kebsa W, Lahouel M. The Effect of Propolis Extract Supplement on the Prevention of Heart and Vascular Disease Risk. J.

Saudi Soc.For Food and Nutrition, 2008, 3(1) 1.

- Kebsa W, Lahouel M, Rouibah H, Malek Z, Mamoun A, Bachaer AI, Ebtihal M, Hamzeh JA, Mohammad AS. Reversing multidrug Resistance in chemo-resistant human lung adenocarcima (A549/DOX) cells by Algerian propolis through direct inhibiting the pgp efflux-pump, G0/G1 cell cycle arrest and apoptosis induction. Anticancer Agents Med Chem.

2018 doi: 10.2174/1871520618666180808100800. [Epub ahead of print]

- Alyane M, Kebsa LB, Boussenane H, Rouibah H, Lahouel M. Cardioprotective effects and mechanism of action of polyphenols extracted from propolis against doxorubicin toxicity. Pak J Pharm Sci. 2008 Jul; 21(3):201-9.

- Kebsa Wided, Rouibah Hassiba and Lahouel Mesbah. Polyphenolic fraction of Algerian propolis reverses doxorubicin induced oxidative stress in liver cells and mitochondria. Pak. J.

Pharm. Sci., Vol.27, No.6, 2014, pp.1891-1897

- Kebsa Wided, Rouibah Hassiba & Lahouel Mesbah. Quercetin Protects Liver Cells and Mitochondria Against Doxorubicin Induced Oxidative Stress in Albinos' Rats. Journal of Biologically Active Products from Nature. Volume 5, Issue 5, 2015

- Benguedouar L, Boussenane HN, Wided K, Alyane M, Rouibah H, Lahouel M. Efficiency of propolis extract against mitochondrial stress induced by antineoplasic agents (doxorubicin and vinblastin) in rats. Indian J Exp Biol. 2008 Feb; 46(2):112-9.

- Boussenane H.Nadia, Kebsa Wided, Boutabet Kheira, Rouibah Hassiba, Lahouel,

Disruption of mitochondrial membrane potential by ferulenol and restoration by propolis

extract: Antiapoptotic role of propolis. Acta Biologica Hungarica 60(4):385-98 · December

2009.

Comunications

- Rouibah Hassiba and Lahouel Mesbah. Cardioprotective effect of Propolis Polyphenolic Compounds. The Second Euro-Med conference: plant Natural Products from Biodiversity to Bioindustry. December 2011 – Alexandria, Egypt.

- Rouibah Hassiba, Kebsa Wided et Lahouel Mesbah. L’extrait ethanolique et les hétérosides flavoniques de la propolis agissent sur la balance antioxydant-prooxydant et l’apoptose mitochondriale. Séminaire international “Cancer, Stress et Substances Bioactives” Jijel, septembre 2012.

- Hassiba Rouibah, Bochra Bouchelit, Amira Kemel, Faiza Sayoud and Mesbah Lahouel.

Protective effect of propolis on doxorubicin-taxoter induced hepatotoxicity in rat. 2

journées annuelles du laboratoire de toxicology moléculaire, Jijel, novembre 2017.

- Rouibah hassiba, Kebsa W, Lahouel M. Antioxidant and antiapoptotic effect of propolis flavonoids extract in cultured cells and prevention of vascular risk. 1

Congrès International de la Société Algérienne de Nutrition (SAN), Oran, Algérie, décembre 2012

- Kebsa Wided, Amiour Nawel, Aziz Amina, Zouaghi Amina, Rouibah Hassiba and Lahouel Mesbah. Algerian Green tea (Camellia sinensis) extract reduces Doxorubicin- induced hepatotoxicity in rats. 1

Congrès International de la Société Algérienne de Nutrition (SAN), Oran, Algérie, décembre 2012

- Kebsa W, Rouibah H, Lahouel M. Chemical composition and antioxidant activity of propolis from thee Algerian localities (Jijel, Mila and Tizi ouzou). Journées internationales de biotechnologie, Hammamet, Tunisie, décembre 2013.

- Kebsa W, Boubalouta H, Benguedouar L, Rouibah Hassiba & Lahouel Mesbah. Algerian green Tea (Camellia sinensis) extract attenuates doxorubicin hepathotoxicity in rats.

Séminaire National sur les Substances Bioactive. Novembre 2015. Bejaia

i Remerciements

Travaux scientifiques

Table des matières ... i

Liste des abréviations ... vi

Liste des figures et tableaux ... viii

Introduction et but de la recherche ...1

Analyse bibliographique I. Généralités sur le cancer du pancréas. ... 06

1. Introduction ...06

2. Incidence du cancer de pancréas ... ....07

3. Epidémiologie et facteurs de risque ...08

3.1. Le tabagisme ...08

3.2. L’alimentation ...08

3.3. Le diabète ...08

3.4. L'obésité ...09

3.5. Certaines maladies pancréatiques. ...09

II. Lien entre la division cellulaire, l'apoptose et le cancer ... 10

1. Généralités sur le cycle cellulaire ...10

1.1. Déroulement des différentes phases du cycle cellulaire ...10

1.1.1. Les phases de croissance G1 et G2 ...10

1.1.2. La réplication de l'ADN : la phase S du cycle cellulaire ...11

1.1.3. Le déroulement de la mitose : phase M du cycle cellulaire ...12

1.2. Régulation du cycle cellulaire ...12

2. L'apoptose et cancer ... 14

2.1. Concept de l'apoptose ...14

2.2. Les principaux effecteurs de l’apoptose ...14

2.2.1. Les Caspases...14

2.2.2. Les protéines de la famille Bcl2 (B cell lymphoma leukemia) ...15

2.3. Voies de l'apoptose ...16

2.3.1.Voie intrinsèque ...16

2.3.2.Voie extrinsèque ...18

III. La résistance pléïotropique aux agents anticancéreux ou phénomène de «Multidrug Resistance» (MDR) ... 19

1. Généralités ...19

ii

2.2. Altération du métabolisme de l'agent cytotoxique ...20

2.3. Résistance par modification de la cible ...20

2.4. Entrave à la mort cellulaire...21

2.5.Augmentation des mécanismes de réparation des anomalies de l’ADN induites par l'agent anticancéreux ...21

2.6. Augmentation de l’efflux des médicaments ...21

2.6.1. Le principal transporteur de résistance pléiotropique aux médicaments: glycoprotéine-P (P-gp) ...22

3. La réversion de la multi-drug resistance ...23

IV. La doxorubicine: Entre effet anticancéreux et effet cardiotoxique ... 25

1. Historique ...25

2. Pharmacocinétique de la doxorubicine ...25

3. Principaux mécanismes d’action ...26

3.1. Inhibition de l'enzyme topoisomérase II...26

3.2. Intercalation dans la molécule d’ADN ...26

3.3. Inhibition de la synthèse d’ADN ...27

3.4. Interaction avec les membranes plasmiques ...27

4. Mécanismes moléculaires de la toxicité cardiaque des anthracyclines ...27

4.1. Production des radicaux libres par les anthracyclines ...27

4.1.1. Effet toxique de la production des radicaux libres par les anthracyclines ...28

4.2. Perturbation de l’homéostasie calcique ...31

4.3. Hypothèse des métabolites toxiques issus du métabolisme des anthracyclines ...31

4.4. Hypothèse liée au niveau de l’apoptose cellulaire induite par les anthracyclines ...32

5. Stratégies de cardioprotection ...32

5.1. Antioxydants ...32

5.2.Chélateurs de fer ...33

5.3. Accélérateurs de la dégradation des peroxynitrites ... …………33

V. Importance thérapeutique de la propolis comme produit d'origine naturelle 34 1. Origine botanique de la propolis ...34

2. Composition chimique ...34

3. Activités biologique associées à la propolis ...35

3.1. Activité antioxydante ...35

3.2. Activité anticancéreuse ...36

3.3. Activité antibactérienne……… ...36

3.4. Activité anti-inflammatoire ...37

3.5. Activité immunomodulatrice ...37

3.6. Autres activités ...37

iii

I. Matériel et méthodes ...40

A. Etude phytochimique de la propolis ... 40

1. Récolte de la propolis ...40

2. Dosage des polyphénols totaux et des flavonoïdes ...40

3. Mesure de l’effet scavenger de l’extrait éthanolique de la propolis. ...41

B. Etude in vitro ...42

1. Conditions de la culture et les lignées cellulaires ...42

2.Mesure de la viabilité cellulaire par le test au 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)...44

3. Etude du cycle cellulaire par cytométrie en flux ...44

4. Test d’apoptose par marquage à l’annexine V/PI ...45

5. Mesure de l’activité des caspases : -3, -8 et -9 ...47

6. Mesure de l’accumulation intracellulaire de la doxorubicine...47

7. Test d’accumulation de la rhodamine-123 ...48

8. Etude de l'expression du gène MDR-1 par la technique de RétroTranscription - Réaction de Polymérisation en Chaîne (RT-PCR ...49

8.1. Extraction et dosage des ARN totaux ...49

8.3.Transcription inversée ou Rétrotranscription (RT ...50

8.4. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR ...51

8.5. Analyse des résultats ...52

C. Evaluation de l'effet des polyphénols de la propolis et du vérapamil sur le stress induit par la doxorubicine ...53

1. Entretien des animaux ...53

2. Traitement des animaux ...53

3. Dosages cytosoliques ...54

3.1. Préparation de la fraction cytosolique ...54

3.2. Dosage du MDA cytosolique ...54

3.3. Dosage du glutathion (GSH...54

3.4.Mesure de l’activité enzymatique des enzymes antioxydantes ...55

3.4.1. Mesure de l’activité enzymatique de la catalase ...55

3.4.2. Mesure de l’activité enzymatique de la SOD ...55

3.4.3. Mesure de l'activité enzymatique de la Glutathion- S-transférase (GST ...56

4. Etude de la mitochondrie ... 56

4.1. Isolement des mitochondries cardiaques ...56

4.2. Mesure de la consommation d’oxygène par oxygraphie ...57

4.3. Dosage du MDA mitochondrial ...58

4.4. Mesure de la production de l’anion superoxyde par les mitochondries ...59

4.5. Mesure du gonflement mitochondrial ou swelling ...59

iv

II. Résultats et discussion ...62

Partie 1: Etude phytochimique de la propolis ...62

1. Teneur en polyphénols et en flavonoïdes ...62

2. Effet anti-radicalaire de la propolis ...62

Partie 2: Potentialisation par la propolis de l'effet anticancéreux de la doxorubicine sur les cellules cancéreuses pancréatiques PANC-1 ... 64

1. Effet sur la viabilité cellulaire ...65

2. Analyse du cycle cellulaire par cytométrie de flux ...70

3. Mise en évidence d’une population cellulaire apoptotique: présence d’un pic sub-G0/G1 ...73

4. Evaluation de l'apoptose ...76

4.1. Marquage à l’Annexine-V /IP : distinction nécrose-apoptose ...76

4.2. L'activité enzymatique des Caspases 3, 9 et 8 ...78

5. Effet de la propolis sur l'activité de la P- glycoprotéine (P-gp)...80

5.1.Effet sur l'accumulation intracellulaire de la doxorubicine ...80

5.2. Effet sur l'accumulation de la rhodamine-123 ...82

6. Effet sur l'expression du gène MDR-1 ...85

Partie 3. Effet de la propolis Algérienne et du vérapamil contre la cardiotoxicité induite par la doxorubicine ...88

A. Etude in vitro ...89

1.Effet sur la viabilité cellulaire ...89

2.Effet sur l'accumulation intracellulaire de la doxorubicine ...92

3.Etude de l'apoptose ...94

3.1. Marquage à l’Annexine-V /IP : distinction nécrose-apoptose ...95

3.2. L'activité enzymatique des Caspases 3 et 9 ...97

4. Effet in vitro sur la production de l'anion superoxyde par les mitochondries cardiaques ...99

B. Effet des polyphénols de la propolis et du vérapamil sur le stress oxydatif induit par la doxorubicine in vivo ...101

1. Effet sur les activités sériques de LDH, CPK et ASAT ...101

2. Evaluation de la peroxydation lipidique ...103

3. Variation des taux cardiaques en glutathion réduit GSH ...106

4. Effet sur l’activité des enzymes antioxydantes cardiaques ...108

4.1. Evaluation de l'activité enzymatique de la SOD ... 108

4.2. Evaluation de l'activité enzymatique de la CAT ...110

4.3. Evaluation de l’activité enzymatique du Glutathion- S-transférase (GST). ...110

v 7. Effet sur la respiration mitochondriale ...116

Conclusion et perspectives ... 120

Références bibliographiques ...124

vi

Liste des abréviations

ABC: ATP Binding Cassette

ALAT: Alanine Amino Transférase

ATCC: American Tissue and Cell Collection BAD: Bcl-2 Associated Death promoter BAX: Bcl-2 Associated X protein

Bcl-2: B-cell Lymphoma 2

CAPE: Caffeic Acid Phenethyl Ester

Caspases : Cystein Aspartate Specific Proteases CAT: Catalase

CDNB: 1-Chloro-2, 4-Dinitrobenzène CPK: Créatine Phosphokinase

DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO: Diméthylsulfoxyde

DOX: Doxorubicine

DPPH•: 2,2-Diphényl-1 –Picrylhydrazyl DTNB: Acide 5,5-Dithio2-Nitrobenzoïque EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EGTA: Ethylene Glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid FITC: Fluorescein Isothiocyanate

GPx: Gluthation Peroxydase GSH: Glutathion

GST: Glutathion S Transférase

IC50: Concentration inhibitrice de 50 % IP: Intra Péritonéale

LDH: Lactate Déshydrogénase

MDA: Malondialdéhyde

vii MDR: Multidrug Resistance

mPTP: Mitochondrial Permeability Transition Pore NBT: Nitroblue Tetrazolium

PANC-1: Pancreatic Carcinoma-1 PBS: Phosphate Buffered Saline PEE: Propolis Ethanolic Extract P-gp: P- Glycoprotéine

PI: Propidium Iodide

RCR: Respiratory Control Ratio Rh-123: Rhodamine-123

ROS: Reactive Oxygen Species

RT-PCR: RetroTranscription – Polymerase Chain Reaction SOD: Superoxyde Dismutase

TBA: Thiobarbituric Acid

TBARS: Thiobarbituric Acid Reactive Substances

TCA: Ttrichloroacetic Acid

viii

Liste des figures et tableaux

Figure 01: Taux d'incidence et de mortalité dans le monde (standardisés sur la population mondiale de

référence, pour 10 000 personnes / années)...07

Figure 02: Les quatre phases principales du cycle cellulaire... ...11

Figure 03: Abondance et succession des principaux complexes Cycline/Cdk au cours du cycle cellulaire……….……... . ...12

Figure 04: Les voies d’activation de l’apoptose, la voie extrinsèque et la voie intrinsèque...17

Figure 05: Principaux mécanismes cellulaires responsables de l’établissement de la résistance des cellules tumorales...20

Figure 06: Modèle de transport d'une molécule d'anthracycline par flip-flop... .. ...23

Figure 07 : Le stress oxydant induit par la doxorubicine ... .. ...29

Figure 08 : Mécanisme de toxicité cardiaque de la doxorubicine dans les cardiomyocyte ... ...31

Figure 09: Perméabilisation de la membrane cellulaire par le méthanol et marquage de l’ADN à l’iodure de propidium (IP ...45

Figure 10: Externalisation des phosphatidylsérines au cours de l’initiation de l’apoptose. ...46

Figure 11: Effet scavenger des différentes concentrations de la propolis et de la vitamine C vis-à vis du radical libre DPPH

... ...63

Figure 12: Viabilité cellulaire évaluée grâce à la technique MTT réalisée sur des cellules PANC-1 traitées avec différentes concentrations de doxorubicine (Dox)... ...66

Figure 13: Viabilité cellulaire évaluée grâce à la technique MTT réalisée sur des cellules PANC-1 traitées avec différentes concentrations de propolis (Pro). ... ...68

Figure 14: Courbe dose-réponse de l'effet de la doxorubicine sur la viabilité des cellules PANC-1 avec et sans propolis et vérapamil en utilisant le test MTT... ...69

Figure 15: Effet de la DOX seule ou en association avec la propolis ou le vérapamil sur le cycle cellulaire des cellules PANC-1 après 24 h de traitement... ...71

Figure 16: Effet de la DOX seule ou en association avec la propolis ou le vérapamil sur le cycle cellulaire des cellules PANC-1 après 48h, résultats de l’étude en cytométrie de flux... ...72

Figure 17: Pourcentages de cellules en sub-G1 suite aux différents traitements après 24 et 48h. ... ...74

Figure 18: Effet des différents traitements sur l'apoptose des cellules PANC-1…... .... . ...77

Figure 19 : Activité enzymatique de la Caspase-3, -8 et -9 des cellules PANC-1 après 24 heures de traitement avec la doxorubicine, la propolis et les différentes combinaisons... ...79

Figure 20: Accumulation intracellulaire de la doxorubicine dans des cellules PANC-1... ...82

ix Figure 21: Effet temps du vérapamil et de la propolis sur l'accumulation de la Rhodamine-123 dans la lignée cellulaire PANC-1... .. ...83 Figure 22: Effet de la propolis et du vérapamil sur l'accumulation de la rhodamine-123 dans des cellules PANC-1 après 2 heures de traitement………... .. ...84 Figure 23: Effet des différents traitements sur l'expression du gène mdr-1 dans les cellules PANC-1 après traitement de 24h... ... ...86 Figure 24: Viabilité cellulaire évaluée grâce à la technique MTT réalisée sur des cellules H9c2 traitées avec différentes concentrations de doxorubicine (Dox). ... . ...89 Figure 25: Viabilité cellulaire évaluée grâce à la technique MTT réalisée sur des cellules H9c2 traitées avec différentes cencentrations de propolis... ... ...90 Figure 26: Courbe dose-réponse de l'effet de la doxorubicine sur la viabilité des cellules H9c2 avec et sans propolis et vérapamil en utilisant le test MTT. ... ... ...91 Figure 27: Accumulation intracellulaire de la doxorubicine dans des cellules H9c2 ... ...93

Figure 28: Effet des différents traitements sur l'apoptose des cellules H9c2... ...96

Figure 29 : Activité enzymatique de la Caspase-3 et -9 des cellules H9c2 après 24 heures de traitement avec la doxorubicine, la propolis et les différentes combinaisons.. ... ...98 Figure 30: Effet de la doxorubicine et des différentes concentrations (10

à 10

g/l) de l'extrait de propolis (prop) sur la production mitochondriale d'anion superoxyde in vitro...100 Figure 3 1: Variation des taux de malondialdéhyde (MDA) comme indicateur de la peroxydation lipidique dans les cœurs des rats suite aux différents traitements ...105 Figure 3 2: Variation des taux de glutathion réduit (GSH) dans les cœurs des rats suite aux différents traitements. ... ...107 Figure 3 3: Variation de l'activité enzymatique de la SOD dans les cœurs des rats traités par la doxorubicine (DOX), la combinaison DOX-Vérapamil en présence ou en absence de la propolis... ...108 Figure 34: Variation de l'activité enzymatique de la catalase dans les cœurs des rats traités par la doxorubicine (DOX), la combinaison DOX-Vérapamil en présence ou en absence de la propolis.

... . ...109 Figure 35 :Variation de l'activité enzymatique de la GST dans les cœurs des rats traités par la doxorubicine (DOX), la combinaison DOX-Vérapamil en présence ou en absence de la propolis.

... . ...110

Figure 36: Effet des différents traitements sur la production de l'anion superoxyde par les

mitochondries isolées du cœur... . ...113

Figure 37: Effet de la doxorubicine et de l'extrait de propolis sur le gonflement

mitochondrial……….…..115

Figure 38: Effet de la doxorubicine (20 mg/kg) et de l'extrait de propolis sur la fonction respiratoire

mitochondriale... . ...117

x Tableau 01: Modifications morphologiques et biochimiques caractéristiques des cellules en apoptose...15

Tableau 02: Les teneurs en polyphénols et en flavonoïdes de la propolis...62

Tableau 03: Valeurs des IC

de la doxorubicine seule ou combinée à la propolis ou le vérapamil sur les cellules PANC-1. ...69 Tableau 04: Répartition des cellules PANC-1 dans les différentes phases du cycle cellulaire après 48 heures de traitement avec la doxorubine seule ou en association avec la propolis ou le vérapamil.

...73

Tableau 05: Changements des biomarqueurs cardiaques suite aux différents traitements...103

Introduction générale

1

E n oncologie digestive, le cancer du pancréas constitue aujourd'hui un challenge important avec une survie nette à 5 ans inférieure à 10 %. Même si son incidence reste relativement faible, les données issues des registres des cancers digestifs en France montrent une augmentation remarquable ces dernières décennies. Pour des raisons mal expliquées, cette incidence croissante est plus fréquente chez les femmes (variation annuelle de +3,6 %) que chez les hommes (+2,3 %). Son mauvais pronostic, malgré les progrès des techniques d'imagerie et le développement de l'arsenal thérapeutique, est dû en partie à l’absence de facteurs de risque très spécifiques interdisant une prévention efficace et à un diagnostic tardif en raison de signes cliniques de début absents ou non spécifiques [Drouillard et al., 2018]. En Algérie, selon le registre des tumeurs d’Alger, l’incidence est estimée à 3.2/10

personnes, pour l’homme et 1.7/10

personnes pour les femmes [Oukkal & Bouzid, 2012].

La prise en charge a beaucoup évolué par l’introduction de l’immunothérapie et des traitements ciblés dans la thérapeutique du cancer avec une place toujours prépondérante de la chimiothérapie. Elle repose essentiellement sur l’utilisation des anthracyclines en particulier la doxorubicine pour son efficacité incontestée dans les tumeurs solides et hématologiques malignes [Judson et al., 2014 ; Pecoraro et al., 2016]. Cependant, le développement de cardiomyopathies et d’insuffisance cardiaque congestive d’une part et l’apparition d’une résistance pléïotropique ou phénomène MDR (multidrug resistance) des cellules à la doxorubicine d’autre part, représentent un obstacle majeur d'échec de son application clinique [Li et al., 2018].

Les cellules cancéreuses pancréatiques sont capables de s’adapter aux conditions hostiles en détournant les mécanismes physiopathologiques de protection contre les agents cytotoxiques. Ces cellules développent et renforcent les systèmes de résistance, multidrug résistance MDR, et échappent aux différentes chimiothérapies [Gaianigo et al., 2017]. On assiste à la surexpression de certains transporteurs, dont la P-gp, qui sont capables d’exporter les molécules cytotoxiques hors des cellules diminuant ainsi la concentration intracellulaire des médicaments. Ainsi, le développement d’inhibiteurs de la P-gp semble être une voie intéressante à explorer pour améliorer la thérapeutique de nombreuses pathologies tumorales chez l’homme.

Le vérapamil, inhibiteur calcique, est l’une des molécules largement utilisées dans la

diminution de la chimiorésistance [Kathawala et al., 2015]. Toutefois, même si le vérapamil a

prouvé dans de multiples études son effet protecteur contre la cardiotoxicité de la

2 doxorubicine, son utilisation demeure controversée puisque plusieurs cas de cardiotoxicités reliées à l'augmentation des concentrations cardiaques de médicaments suite à son co- administration avec des médicaments anticancéreux ont été rapportés [Alkuraishy et al., 2017].

Concernant les mécanismes de la toxicité cardiaque de la doxorubicine, la plupart des études mettent en jeu le rôle du stress oxydatif dans ce processus induit par la formation des radicaux libres découlant de la structure chimique de la doxorubicine ayant tendance à générer des espèces réactives de l’oxygène durant la métabolisation du médicament [Mitry &

Edwards, 2016 ; Mobarki et al., 2017]. Toutefois, les cibles d’action précises, la relation avec le processus d’apoptose et bien d’autres mécanismes de toxicité aussi bien de la doxorubicine et des anthracyclines en générale demeurent obscures.

L’utilisation de substances adjuvantes aux chimiothérapies soit à visée préventive des cardiotoxicités soit pour inhiber la P-gp dans les résistances des cellules cancéreuses ou pour potentialiser les effets cytotoxiques des médicaments anticancéreux reste insuffisante. Au cours des dernières décennies, et malgré la découverte de nouveaux composés synthétiques, les sources naturelles restent le principal fournisseur de nouveaux médicaments et de nouvelles structures chimiques. Nous assistons donc à un regain de la phytothérapie. Le développement de traitements alternatifs plus efficaces avec une meilleure tolérance est toujours d’actualité et fait l’objet de nombreuses recherches.

Dans ce cadre, de nombreuses molécules antioxydantes ont été proposées comme protectrices de la cardiotoxicité [Vincent et al., 2013], mais des controverses existent encore dans le domaine clinique. Les scientifiques ne cessaient de rechercher et penchent vers les produits riches en multiples substances phytothérapiques tel que les flavonoïdes qui peuvent être l’arme permettant de faire face à la chimiorésistance de la doxorubicine et au stress oxydant induit par ce médicaments notamment au niveau du cœur.

La propolis, un sous-produit de la ruche d’abeille, est l’une de ces substances utilisée depuis longtemps en médecine traditionnelle pour ses activités biologiques et pharmacologiques antioxydantes [Valente et al., 2011] et cardioprotectrices [Hashemi, 2016]

ou encore antitumorales [Utispan et al., 2017]. Il a été rapporté que la propolis et ses

composés phénoliques exercent un effet protecteur contre plusieurs types de cancer,

3 notamment le cancer du côlon [Turan et al., 2015], de la langue [Czyżewska et al., 2016] et de la prostate [Zabaiou et al., 2017], entre autres.

Dans la continuité des travaux menés sur la propolis au sein de notre équipe de recherche et en particulier de son action sur les cellules du cancer de la prostate, des poumons et du mélanome, il nous a paru intéressant de savoir si cette substance pouvait être utilisée dans le développement de nouvelles voies thérapeutiques du cancer de pancréas.

Notre approche expérimentale a été axée donc dans un premier temps sur l’étude de la cytotoxicité et sur la réversion de la résistance à la doxorubicine (DOX), in vitro, sur des cellules cancéreuses pancréatiques, les cellules PANC-1.

En parallèle, et afin de mettre en évidence d’éventuelles propriétés antiprolifératives, potentialisatrices de notre produit sur le développement du cancer de pancréas, nous avons testé l’effet anticancéreux résultant de l’association de la propolis avec le médicament chimiothérapeutique. Cette étude a porté également sur la comparaison des effets modulateurs de la chimiorésistance de la propolis versus le vérapamil, modulateur de référence de la P-gp.

Plusieurs tests ont été réalisés, allant du test de viabilité, passant par la cytométrie en flux pour l’étude du cycle cellulaire et de l’apoptose grâce au double marquage avec l’annexine V/PI, la détection de quelques protéines impliquées dans la cascade apoptotique à savoir la Caspase-3, -9 et -8. Enfin, l’effet modulateur a été évalué par évaluation de l’activité de la P- gp et la quantification par RT-PCR de l’expression du gène MDR-1.

Partant des résultats déjà publiés par notre Laboratoire de Toxicologie Moléculaire sur les effets antioxydants et cytoprotecteurs de la propolis, notre deuxième partie de thèse vise à appréhender sur des modèles cellulaires et animaux :

 La cardiotoxicité induite par la doxorubicine et la potentialité de cardioprotection de la propolis.

 Les incidences des différents traitements associés appréciés au niveau du potentiel redox intracellulaire cardiaque, de l’apoptose et des fonctions mitochondriales.

 L’effet de l’association doxorubicine-vérapamil sur le tissu cardiaque en partant du

fait que les résultats déjà publiés sont controversés. Et puis, si l'association est toxique,

notre étude qui est la seule dans ce sens vise à mettre en évidence la place de la

propolis dans la cardioprotection.

4

Enfin et afin de faciliter sa lecture, notre manuscrit a été rédigé selon le schéma IMRED

comprenant donc une analyse des données bibliographiques concernant le sujet de notre thèse

(cancer du pancréas, chimiothérapie par la doxorubicine avec un résumé des mécanismes de

sa cardiotoxicité et stratégies de cardioprotection, lien entre la perturbation du cycle

cellulaire, l'apoptose et le développement du cancer, les résistances et les possibilités

thérapeutiques de la propolis comme produits de la ruche), ensuite l’exposé du travail

expérimental, les résultats avec leur discussion et enfin la conclusion générale avec

automatiquement des perspectives.

Analyse

Bibliographique

6

I. Généralités sur le cancer du pancréas

1. Introduction

Le cancer du pancréas représente actuellement un cancer de mauvais pronostic dont la survie à 5 ans est estimée à 5 %. Les estimations mondiales fournies par la base de données GLOBOCAN en 2012 montrent qu’avec 338000 nouveaux cas estimés (deux sexes confondus), le cancer du pancréas n’est qu’au douzième rang, mais est la septième cause de décès par cancer (330000 décès estimés). Dans l’Union Européenne, le cancer du pancréas est également la quatrième cause de décès par cancer tant chez les hommes que chez les femmes [Ferlay, 2014].

Puisqu’il est responsable de 40000 décès par an en Europe et près de 28000 aux Etats-Unis où il est la cinquième cause de mortalité par cancer, ce cancer est classé parmi les maladies les plus meurtrières. Le mauvais pronostic associé à ce cancer peut être principalement attribué à l'absence de détection précoce. Au premier diagnostic, la plupart des personnes atteintes présentent une maladie avancée et métastatique, et moins de 20 % des patients diagnostiqués avec des tumeurs résécables [Heestand et al., 2015]. Le cancer du pancréas métastatique est associé à une survie médiane de moins de 6 mois chez les patients à base de chimiothérapie par gemcitabine [Hidalgo, 2010]. Six mois après le diagnostic, 65 % des patients meurent et environ 90 % sont morts après un an. La chirurgie d’exérèse, quand elle peut être instituée à temps, est la seule forme de thérapie curative mais moins de 20 % des patients peuvent en bénéficier et parmi ceux-ci seuls 5 % sont encore en vie après 5 ans. Ce pronostic péjoratif s’explique par l’absence ou la non-spécificité des symptômes, par une agressivité tumorale marquée (invasion métastatique rapide) et enfin, par le manque de moyens thérapeutiques efficaces. De ce fait, au moment du diagnostic, 85 % des patients présentent déjà un envahissement locorégional avec souvent une extension métastatique rendant impossible la chirurgie à visée curative [Warshaw & Fernandez-del-Castillo, 1992;

Gopinathan et al., 2015].

Malgré les efforts qui visent à améliorer la survie des patients atteints de

l'adénocarcinome pancréatique, son pronostic reste très sombre. L'une des voies

d'amélioration de la survie serait donc de diagnostiquer le plus précocement possible ces

lésions pancréatiques. Une meilleure connaissance de la cancérogenèse et l'identification des

facteurs de risques apportés par l'épidémiologie descriptive tendent vers cet objectif

[Drouillard et al., 2018].

7 2. Incidence du cancer du pancréas

L'incidence du cancer du pancréas varie considérablement selon les régions et les populations (figure 01). Les taux enregistrés en 2012 étaient les plus élevés en Amérique du Nord (7,4 pour 100 000 personnes) et en Europe occidentale (7,3 pour 100 000), suivis des autres régions d'Europe, d'Australie et la Nouvelle-Zélande (environ 6,5 pour 100 000). Les taux les plus bas (environ 1,0 pour 100000 personnes) étaient observés en Afrique, en Moyen Orient et en Asie centrale. Plus de la moitié des nouveaux cas (55,5 %) ont été enregistrés dans les régions développées. Un peu moins de la moitié (41,0 %; 139363 des cas) de tous les nouveaux cas de cancer du pancréas en 2012 a été enregistré dans les pays d'Asie [Ferlay et al., 2015; Ilic, M & Ilic, I, 2016].

Bien qu'il ne soit pas possible d'expliquer entièrement l'effet de la zone géographique sur l'incidence du cancer du pancréas, la plupart des explications ont été basées sur les variations des facteurs de risque connus ou suspectées liés au mode de vie ou à l'environnement [Parkin, 2011].

Figure 01: Taux d'incidence et de mortalité dans le monde (standardisés sur la population

mondiale de référence, pour 10 000 personnes par années) [Forman et al., 2013]

8 3. Epidémiologie et facteurs de risque

Connaître l’épidémiologie d’un cancer et ses facteurs de risques est essentiel pour développer une approche thérapeutique rationnelle et efficace. Le cancer du pancréas se développe principalement dans les pays industrialisés et son incidence, par ailleurs en légère augmentation, approche celle de la mortalité (ratio mortalité/incidence = 0,99) selon les données de l’Organisation Mondiale de la Santé.

3.1. Le tabagisme

Le risque relatif d’adénocarcinome pancréatique est augmenté en cas de sur-consommation tabagique (en particulier au cours de formes héréditaires) avec un risque relatif de 2,2 [Silverman, 1994]

Une augmentation du risque de cancer du pancréas a été liée à la consommation de tabac: 2 % pour une cigarette fumée par jour et 62 % pour 20 cigarettes fumées par jour. La durée du tabagisme accroit aussi le risque, 1 % par année de tabagisme et 16 % après 10 ans de consommation [Vrieling et al., 2010]. Une étude récente montre que le taux plasmatique de cotinine, utilisé comme biomarqueur de l'exposition au tabac, est retrouvé en concentration élevée chez les patients atteints de cancer du pancréas [Leenders et al., 2012].

3.2. L’alimentation

Le risque de cancer pancréatique était associé à un apport élevé de régimes hypercaloriques, en particulier riches en graisses, avec un risque multiplié par 2 à 4 pour certains régimes (consommation excessive de sel, viande fumée, fritures, barbecue). A titre d'exemple, la consommation de 120 g de viande rouge par jour était associée à une augmentation de 29 % du risque de cancer du pancréas [Larsson & Wolk, 2012; Popescu- Valceanu et al., 2015].

Par contre, les régimes riches en fruits et légumes sont protecteurs avec une réduction du risque de l'ordre de 30 % chez les grands consommateurs [Bae et al., 2009].

3.3. Le diabète

Au moment du diagnostic de cancer du pancréas, un diabète est présent chez 40 à 60 % des

patients. Les chercheurs se demandent donc s’il existe un lien entre les deux maladies, et si le

diabète est une cause ou une conséquence de cancer du pancréas. Actuellement, les données

sont insuffisantes pour conclure, mais le diabète est un facteur de risque de cancer du

pancréas [Elena, 2012].

9 Le diabète sucré peut être associé à un facteur de 1,8 à l'augmentation du risque de cancer du pancréas, en particulier chez les hommes Asiatiques en comparaison avec les Blancs et les Noirs [Li et al., 2011 ; Liao et al., 2012].

3.4. L'obésité

L'obésité est impliquée dans le développement de différents types de cancer, y compris le cancer du pancréas [Davoodi et al., 2013]. Il a été constaté qu'un surpoids (indice de masse corporelle ≥ 25 kg / m

) ou une obésité (IMC ≥ 30 kg / m

) au début de l'âge adulte peut être associé à un risque accru de développer un adénocarcinome pancréatique de 10 et 20 % respectivement [Arslan et al., 2010]. Une étude publiée en 2011 a estimé qu'aux États-Unis, environ 12,8% des cancers du pancréas chez les hommes et 11,5 % chez les femmes étaient attribués au surpoids / l'obésité [Ilic, 2016].

Au contraire, une activité physique régulière semble avoir un effet protecteur en réduisant ce risque de 11 % [Behrens et al., 2015].

3.5. Certaines maladies pancréatiques rares peuvent favoriser l’apparition d’un cancer. La

pancréatite chronique est une fibrose diffuse de la glande, secondaire à une inflammation

prolongée ; le plus souvent, elle est due à une importante consommation de boissons

alcoolisées pendant plusieurs années. Le risque théorique de survenue d’un cancer du

pancréas est multiplié environ par un facteur de 20 mais le risque absolu d’en être atteint au

cours de la vie est probablement inférieur à 5 %. Certaines pancréatites chroniques très rares,

appelées « héréditaires » ou « familiales » - secondaires à une anomalie génétique transmise

par un parent - augmentent de façon beaucoup plus importante le risque de survenue d’un

cancer de la glande [Duell et al., 2012].

10

II. Lien entre la division cellulaire, l'apoptose et le cancer

1. Généralités sur le cycle cellulaire

En raison de son caractère fondamental, la division cellulaire a été décrite il y a 150 ans et fait l’objet de très nombreuses études. Un adulte humain à environ 100.000 milliards de cellules, toutes originaires d'une même cellule, la cellule œuf fertilisée. Tous les jours près d’un milliard de cellules doivent être renouvelées, ce qui représente 20 millions de divisions cellulaires par seconde. Ce processus extrêmement complexe en plusieurs phases est régulé par un grand nombre de protéines intervenant transitoirement et dans un ordre défini. Parfois des erreurs surviennent, pouvant favoriser la cancérogenèse.

Le cycle cellulaire, également appelé cycle de division cellulaire, décrit une série de modifications qui se produisent dans une cellule entre sa formation par division à partir d’une cellule mère et le moment où cette cellule a fini de se diviser en deux cellules filles. La durée du cycle cellulaire varie d’un type cellulaire à l’autre et d'une espèce à l’autre puisque dans l’organisme on trouve des cellules qui se divisent en continu, des cellules qui se divisent en fonction de stimuli externes et des cellules qui ne se divisent plus [Meijer et al., 2003].·

Le cycle est classiquement divisé en quatre phases : G1 (de « Gap », intervalle), S, G2 et M (Figure 02). On sépare communément le cycle cellulaire en deux périodes : l'interphase et la mitose. L'interphase correspond aux trois temps G1, S et G2, c’est-à-dire à l'intervalle de temps séparant deux mitoses successives [Burns & Tannock, 1970 ; De Souza et al., 2007 ; Tomura et al., 2013].

1.1. Déroulement des différentes phases du cycle cellulaire 1.1.1. Les phases de croissance G1 et G2

La phase G1 qui correspond à l'intervalle séparant la fin de la mitose et le début de la synthèse d'ADN, et la phase G2 correspondant à l'intervalle entre la fin de la synthèse de l'ADN et le début de la mitose, appartiennent à l'interphase du cycle cellulaire. Elles représentent un temps supplémentaire réservé à la croissance cellulaire, permettant à la cellule d'augmenter son volume cytoplasmique avant de se diviser.

Pendant la phase G1, la cellule contrôle son environnement et sa propre taille puis, elle

s’engage dans le cycle cellulaire en s’orientant vers la phase de réplication de son ADN.

11 C'est durant cette phase, en particulier par l'intermédiaire de l'action des facteurs de croissance, que la cellule se détermine définitivement vers la réalisation ou non de la division cellulaire. En effet après franchissement d'un point situé en fin de G1, la cellule parcourra forcément les phases suivantes du cycle ou, en cas de dommages irréparables de l'ADN, préexistant ou survenant lors de sa réplication, mourra et sera éliminée.

La phase G2 fournit un espace de sécurité, permettant à la cellule de s'assurer que la réplication de son ADN est bien complète avant de commencer la mitose. Durant cette phase, les systèmes de réparation de l'AND sont potentiellement mis en jeu pour détecter et corriger toute anomalie survenue durant la phase S de duplication du génome [Alberts et al., 1995].

Figure 02: Les quatre phases principales du cycle cellulaire [Segala, 2012].

1.1.2. La réplication de l'ADN : la phase S du cycle cellulaire

Pour que la division cellulaire puisse donner naissance à deux cellules filles contenant les mêmes informations génétiques, il est nécessaire qu'avant la division le contenu d'ADN de la cellule soit dupliqué. Ceci est réalisé durant la phase S du cycle par la réplication de l'ADN.

La réplication fait intervenir de nombreux systèmes enzymatiques, agissant de façon

séquentielle et coordonnée. La principale famille d'enzymes intervenant dans cet événement

correspond à celle des ADN polymérases qui assurent la duplication de la double hélice. Au

cours de la réplication de l'ADN, chacune des chaînes de la double hélice d'ADN sert de

matrice pour la fabrication d'une chaîne entièrement nouvelle. De ce fait, chaque gène est

présent non plus en deux mais quatre copies, et chacune des deux cellules filles d'une cellule

12 qui se divise hérite d'une nouvelle double hélice d'ADN contenant une ancienne et une nouvelle chaîne [Alberts et al., 1995 ; Zhang et al., 2013].

1.1.3. Le déroulement de la mitose : phase M du cycle cellulaire

A la fin de la phase G1 et de la phase G2, il existe ce qu’on appelle des points de restriction, ou "checkpoint", où la cellule contrôle que tout est parfaitement mis en place pour que respectivement la réplication de l’ADN et la mitose se déroulent normalement. Si les conditions sont favorables, la cellule rentre en mitose.

La mitose est constituée de quatre grandes phases : prophase, métaphase, anaphase et télophase, qui sont hautement régulées. Il existe de plus un point de restriction à la transition métaphase/anaphase qui permet de contrôler le déroulement correct de la mitose. La mitose s’achève ensuite et laisse généralement place à la division du cytoplasme, la cytocinèse, afin de constituer deux cellules filles [Castro et al., 2003].

1.2. Régulation du cycle cellulaire

Tout au long de son déroulement, le cycle cellulaire passe par plusieurs points de contrôle qui permettent ou non sa poursuite. De nombreuses molécules (en particulier des protéines) interviennent dans ces processus. Parmi ces molécules, on trouve des protéines effectrices comme les cyclines et les Cdk (kinase Cycline dépendent). L’activité kinase de toutes les Cdk nécessite la fixation d’une sous-unité activatrice nommée cycline. Les cyclines sont des protéines formées et dégradées au cours du cycle cellulaire [Evans et al., 1983 ; Obaya &

Sedivy, 2002].

Figure 03: Abondance et succession des principaux complexes Cycline/Cdk au cours du cycle cellulaire

Les Cdk peuvent donc être sous forme activée ou désactivée, selon qu’elles sont associées

ou non à leur cycline. Les cyclines et les Cdk forment des complexes enzymatiques capables

13 de phosphoryler d’autres protéines afin qu’elles deviennent biologiquement actives. Les Cdk sont des sérine/thréonine kinases, leurs activités catalytiques sont modulées par des interactions avec les cyclines et les inhibiteurs de Cdk (CKIs). Une coopération étroite entre ce trio est nécessaire pour assurer la progression ordonnée du cycle cellulaire. Les protéines régulatrices de la famille P21 influent sur des protéines empêchant ainsi la formation du complexe cdk/cycline [Lecona et al., 2013; Lim & Kaldis, 2013].

Le point de départ du cycle cellulaire est le point de restriction G1-S. C’est lui qui conditionne le devenir de la cellule. Une cellule qui ne passe pas le point de restriction entrera en phase G0. Cependant, le passage du point de restriction ne garantit pas que le cycle arrivera à son terme car il existe de nombreux autres points de contrôle qui peuvent conduire à l’arrêt du cycle et à la mort de la cellule. Le point de restriction est en fait un ensemble de processus impliquant des protéines qui permettent la progression dans le cycle et d’autres qui l’inhibent. Parmi les protéines à action positive on trouve les facteurs de croissance qui induisent la synthèse de la cycline D et du cdk2 qui sont impliqués avec cdk4 et la cycline E dans le passage de la phase G1 vers la phase S. Lorsque le signal induit par les facteurs de croissance ne dure pas assez longtemps, les taux de cycline D et cdk chutent condamnant les cellules à retourner en G0 [Hatakeyama et al., 1994].

Les complexes cdk4/cycline D et cdk2/cylcine E forment le SPF (S phase promoting factor) qui phosphorylent la protéine Rb (de la famille des protéines des rétinoblastome).

Dans les conditions normales, la protéine Rb forme un complexe avec E2F (fonction inhibitrice). La phosphorylation de Rb entraîne la libération de E2F qui est un facteur de transcription de nombreux enzymes de la phase S [Pagano et al., 1992 ; Geng et al., 1996].

A ce stade, la cellule effectue un contrôle de son ADN au moyen d’un mécanisme complexe non encore bien élucidé impliquant la P53. Le taux des protéines de la famille P53 augmente lors des lésions sur l’ADN. Ces protéines augmentent l’expression des P21 qui inhibent la formation du complexe cdk4/cycline D et donc la poursuite du cycle cellulaire. Si l’ADN n’est pas réparé, l’augmentation des P53 peut conduire à la mort cellulaire par apoptose [Foster, 2008].

Grâce à la précision de la régulation du cycle, le taux d'accidents est très faible. Cependant

des proliférations incontrôlées aboutissant à des cancers s'observent. Parmi les

caractéristiques des cellules cancéreuses est qu'elles échappent à la régulation du cycle

cellulaire.

14

2. L'apoptose et cancer

Plusieurs maladies comme des maladies auto-immunes, des maladies neuro-dégénératives comme la maladie d’Alzheimer et de cancer sont la conséquence d'une perturbation des mécanismes régulateurs ou effecteurs de l’apoptose [Dubois et al., 1998]. En effet, la diminution de l’apoptose est un facteur important qui conduit à la cancérogenèse. Les cellules cancéreuses sont caractérisées par une insensibilité à une multitude de signaux apoptotiques physiologiques comme par exemple le TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) [Wiezorek et al., 2010]. Un déséquilibre entre la prolifération cellulaire et l’apoptose se crée alors et favorise ainsi la promotion tumorale.

L'objectif du traitement par les médicaments anticancéreux est d’induire la mort des cellules tumorales en évitant de cibler les cellules normales. La mort cellulaire se déroule suivant nombreux mécanismes distincts. Par exemple, en réponse à une agression très violente, les cellules meurent par un processus de lyse appelé nécrose. Dans d’autres situations, la mort cellulaire peut ȇtre génétiquement programmée et met en jeu des voies de signalisation complexes telle que l’apoptose.

Les agents anticancéreux peuvent aussi aboutir à un arrêt de la prolifération des cellules tumorales, notamment en induisant un phénomène appelé sénescence ou de restaurer leur capacité de différenciation [Jaattela, 2002]. Les agents anticancéreux, quelles que soient leurs cibles cellulaires, peuvent induire la mort par apoptose de nombreuses lignées cellulaires tumorales in vitro [Solary, 2006].

2.1. Concept de l'apoptose

La mort cellulaire «programmée», c’est-à-dire génétiquement contrôlée, est un processus physiologique indispensable au développement des organismes pluricellulaires [Conradt, 2009]. Par l’élimination des cellules surnuméraires, l’homéostasie des tissus est garantie et la taille des organes est maîtrisée. Au cours de la vie adulte, la mort cellulaire programmée est indispensable à l’élimination de cellules potentiellement dangereuses (lymphocytes T auto- réactifs, cellules endommagées ou infectées) [Rathmell & Thompson, 2002].

La notion d’apoptose a été introduite pour la première fois par Kerr et al. pour désigner une forme de mort cellulaire morphologiquement et biochimiquement différente de la nécrose [Kerr et al., 1972]. La cellule en apoptose subit plusieurs modifications morphologiques et biochimiques au niveau membranaire, cytoplasmique, et au niveau des organites et du noyau.

Ces modifications sont résumées dans le tableau 01.

15 Tableau 01 : Modifications morphologiques et biochimiques caractéristiques des cellules en apoptose [Kerr et al., 1972 ; Lazebnik et al., 1993 ; Los et al., 1999 ; Gardai et al., 2006].

Modifications morphologiques Modifications biochimiques

Digitations cellulaires Fragmentation caractéristique de l'ADN mise en évidence par électrophorèse

Corps apoptotiques Augmentation de l'expression des ARNm de la glycoprotéine 2 sulfate

Accumulation de grains de zymogène Activité de la desoxynucleotidyl transferase terminale

Condensations cytoplasmiques Expression des gènesTRPM2 & TGFb1 Chromatine condensée

Désorganisation du reticulum endoplasmique granuleux

2.2. Les principaux effecteurs de l’apoptose 2.2.1. Les Caspases

Les Caspases sont une famille de protéines effectrices de l’apoptose dont l’activation représente un marqueur de l’apoptose. Ces protéases présentent une spécificité stricte de clivage de leurs substrats après un résidu aspartique.

Toutes les Caspases ont une structure conservée et sont synthétisées sous forme de précurseurs inactifs ou zymogènes. Les Caspases sont constituées d’un pro-domaine N- terminal de longueur variable allant de 23 à 219 acides aminés, suivi d’un domaine de 17 à 21 kDa (P20) qui deviendra après clivage la grande sous-unité et enfin d’un domaine C-terminal de 10 à 14 kDa (P10) qui constituera la petite sous-unité. Le rôle des Caspases est d’inactiver les voies protectrices et d’activer les molécules qui vont participer à la destruction cellulaire [Taylor et al., 2008].

Chez les mammifères, il existe 14 Caspases (dont 12 chez l’Homme) que l’on classe en trois sous-types : les Caspases initiatrices (Caspases -2, -8, -9, et -10) et les Caspases exécutrices ou effectrices (Caspases -3, -6 et-7) apoptotiques ainsi que les Caspases inflammatoires. Les Caspases initiatrices sont en amont dans la cascade et, quand elles sont activées, elles activent à leur tour les Caspases exécutrices. Ces Caspases initiatrices sont capables de s’auto-activer en réponse aux stimuli pro-apoptotiques au sein de complexes multiprotéiques [Orth et al., 1996 ; Hofmann et al., 1997].

2.2.2. Les protéines de la famille Bcl2 (B cell lymphoma leukemia)

Les membres de la famille Bcl-2 ont une importance cruciale dans la régulation des

voies de signalisation de la mort cellulaire. Cette famille comprend aussi bien des protéines

16 pro-apoptotiques (Bax, Bak, Bad, Bid, Bim, etc.) qu’anti-apoptotiques (Bcl-2 et Bcl-xL). Le niveau relatif de chaque protéine dans la cellule détermine sa sensibilité à un signal de mort [Adams & Cory, 1998].

Les molécules anti-apoptotiques siégeraient au niveau de la mitochondrie [Kim et al., 2008] tandis que les protéines pro-apoptotiques posséderaient une localisation différente (cytosol ou microtubules). À la suite d’un signal apoptotique, ces dernières s’inséreraient dans la membrane mitochondriale et induiraient sa perméabilisation [Crompton, 2000].

Les protéines anti-apoptotiques telle que Bcl-2 sont capables de bloquer la production des ROS, de stabiliser le potentiel transmembranaire en régulant le flux de protons, ou encore de moduler l’homéostasie du calcium mitochondrial [Vander Heiden et al., 1997]. Bcl-2 préviendrait la fuite du cytochrome c en compensant le déséquilibre ionique, probablement à l’origine de la baisse de ΔΨm, de l’ouverture des mégapores et de la rupture de la membrane externe mitochondriale [Krishna et al., 2011].

2.3. Voies de l'apoptose

L’apoptose peut classiquement être divisée en trois phases : une phase d’induction ou d’initiation, une phase d’exécution et une phase de dégradation. Il existe deux voies principales d’induction de l’apoptose : la voie des récepteurs de mort (ou voie extrinsèque) et la voie mitochondriale (ou voie intrinsèque) (figure 04).

2.3.1. Voie intrinsèque

Cette voie est également appelée voie mitochondriale. Elle est induite par des signaux de stress cellulaire tels que l'exposition à des radiations, des altérations de l'ADN ou encore suite à l'action de protéines suppresseurs de tumeurs ou de protéines virales. Enfin, elle est également activée par la plupart des agents chimiothérapeutiques [Kroemer, 2003].

La voie intrinsèque est associée à des changements de perméabilité des membranes mitochondriales internes et externes. Ainsi, l’activation des Caspases se produit comme conséquence de la perméabilisation mitochondriale [Green, 2000 ; Martinou & Green, 2001].

Cette perméabilisation est contrôlée par des protéines de la famille Bcl-2 qui peuvent être pro- apoptotiques comme Bax (Bcl-2 associated X protein) ou Bak (Bcl-2 homologous antagonist/killer) ou anti-apoptotiques comme Bcl-2 ou Bcl-xl (longer alternatively spliced form of Bcl-x) [Adams & Cory, 1998].

En effet, sous l’influence de différents stimuli intracellulaires, les protéines pro-

apoptotiques Bax et Bak s’oligomérisent, s’insèrent à la membrane de la mitochondrie pour

17 former le pore de perméabilité transitoire (PTP). L’ouverture du PTP conduit à la libération dans le cytoplasme de protéines mitochondriales comme le cytochrome c, SMAC/diablo (Second Mitochondria Derived Activator of Caspase/Direct Inhibitor of Apoptosis Binding protein with Low pI), AIF (Apoptosis Inducing Factor), et l’endonucléase G, qui vont activer des voies apoptotiques dépendantes ou indépendantes des caspases [Kroemer & Reed, 2000].

Le cytochrome c libéré va s’associer avec la protéine Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1) et la procaspase-9 pour former un grand complexe protéique appelé apoptosome au sein duquel la procaspase-9 va être activée par clivage protéolytique. La caspase-9 va ensuite à son tour activer par clivage les Caspases effectrices 3 et 7 qui sont à l’origine des dommages cellulaires conduisant à la mort cellulaire (figure 04) [Rodriguez & Lazebnik, 1999 ; Riedl &

Shi, 2004].

Figure 04: Les voies d’activation de l’apoptose, la voie extrinsèque et la voie intrinsèque

[Boumela et al., 2009].

18 2.3.2. Voie extrinsèque

Une deuxième voie apoptotique induite par les récepteurs membranaires DR (death

receptors) appartenant à la superfamille des TNF-R (tumor necrosis factor receptor). Les voies

de signalisation apoptotique des récepteurs de mort conduisent à l’activation des Caspases et

en sont directement dépendantes. Les récepteurs de mort sont activés par fixation de leur

ligand et vont recruter les Caspases initiatrices (Caspases 8 et 10) et induire leur activation par

auto-clivage. La transmission du signal apoptotique de Fas passe par la formation d’un

complexe multiprotéique formé par l’agrégation des récepteurs Fas, la protéine FADD (Fas-

associated death domain) et la pro-Caspase-8, le complexe DISC (Death Inducing Signaling

Complex) [Medema et al., 1997 ; Peter & Krammer, 2003]. Suite à son auto-activation, la

Caspase-8 va alors activer la Caspase-3 par clivage, déclenchant une cascade de Caspases

effectrices qui vont conduire à la mort apoptotique de la cellule (figure 04). .

La protéine Bid, membre de la famille Bcl-2, constitue un des liens entre la voie du

récepteur Fas et la voie mitochondriale. Un fragment de la protéine Bid, issu du clivage par la

Caspase-8, est transféré du cytoplasme à la mitochondrie. Bid tronsloqué (tBid) se lie à Bax

(protéine pro-apoptotique de la famille Bcl-2) et induit son oligomérisation et son intégration

dans la membrane externe mitochondriale entrainant l’ouverture de mégapores

mitochondriaux à l’origine de la chute du potentiel transmembranaire mitochondriale et la

libération du cytochrme c [Indran et al., 2011 ; Pereira & Amarante-Mendes, 2011].