Evaluation de la résistance de la souche Streptococcus salivarius ssp thermophillus aux conditions de stress liées à la composition des aliments

علا مـــيلعتلا ةرازو ــ

لا ــ بلا و ي ــ لعلا ثــــح ــ

م ــ ي

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique ةعماج

يحي نب قيدصلا دمحم –

لجيج

Université Mohammed Seddik Benyahia - de Jijel

Mémoire de fin de cycle

En vue de l’obtention du diplôme : Master Académique en Biologie Option : Microbiologie Appliquée

ةيلك ع ـــ طلا مول ـــ ةعيب حلاو ــــ

ةاي

ـــسق م : ةيقيبطتلا ايجولويبوركيملا

عو ــ ةيذغتلا مول

Thème

Présenté par :

BOULMELH Meriem BOUKHELLOUT Safia

Année Universitaire 2016 - 2017 Membres de Jury

Président : Mme. MOUSSAOUI Sagia Examinateur : Mr. KHENNOUF Tarek Encadreur : Prof. SIFOUR Mohamed

Numéro d’ordre (bibliothèque):………….

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département : Microbiologie Appliquée et Sciences Alimentaires

Evaluation de la résistance de la souche Streptococcus salivarius ssp thermophillus aux conditions de stress liées à la composition des aliments

Avant tout, je remercie ALLAH le tout puissant de nous avoir donné le courage, la volonté et la patience pour terminer ce travail.

Mes remercient et me profond gratitude s’adresse à :

PROFESSEUR MOHAMED SIFOUR pour avoir encadré ce travail, pour son aide, ses conseils et sa patience.

Je voudrais également exprimer mes vifs remerciements à

Mr. TAREK KHANNOUF et Dr. SAJIA ROULA d’avoir accepté d’examiner et de juger ce travail.

Je tiens à remercier vivement madame KARIMA RIANE pour son soutient et son aide, pour clarifier les premières étapes de la recherche, et aussi de nous

fournir divers document.

J’adresse aussi mes vifs remerciements à touts nos professeurs qui ont contribué à notre formation tout au long de ces Cinque ans.

Je remercie ma famille et mes amis pour leurs aides durant mes études et leurs soutiens.

MERIEM et SAFIA

Dédicace

Je dédie ce modeste mémoire en signe se respect et de reconnaissance aux être plus chers à mon cœur :

A mes très chers parents pour leur affection,

prières je les remercie d’avoir réussi à faire de moi l’être que je suis, d’avoir conforté mon âme et mon esprit, veillé sur mon confort nuits et jours je pris dieu de les garder et les protéger pour qu’ils soient témoin de mes futures réussites.

Mon Père et Ma Mère

A mes chers frères : Khaled, Imen, Mohamed et le petit Ibrahime.

A mes tantes oncles

Et je n’oublie pas mes chers amies et collègues surtout de cette

année universitaire.

*Safia*

^Dédicace

A mes chers parents :

Aucune dédicace ne saurait exprimer mon respect, mon amour éternel et ma considération pour les sacrifices que vous avez consenti pour mon

instruction et mon bien être.

Je vous remercie pour tout le soutien et l‘amour que vous me portez depuis mon enfance et j‘espère que votre bénédiction m‘accompagne

toujours.

A mes chers et Adorable frères et sœurs :

Radoine, Sana, Sara et housseme

En témoignage de mon affection fraternelle, de ma profonde tendresse et reconnaissance, je vous souhaite une vie pleine de bonheur et de succés et

que dieu, le tout puisssant, vous protège et vous garde.

A tous les membres de ma famille, petits et grands

Je vous dédie ce travail avec tous mes vœux de bonheur, de santé et de réussite.

A mes amis de toujours et a mes camarades d‘auditoires et tous ceux de la faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l‘université de Jijel .Veuillez trouver dans ce travail l‘expression de mon respect le plus

profond et mon affection la plus sincère

*MERIEM*

Contenant Page

Liste des abréviations i

Liste des figures ii

Liste des tableaux iii

Introduction 2

Partie Ι : Analyse bibliographique I. Les bactéries lactiques 4

Ι. 1. Caractéristiques générales des bactéries lactiques 4

Ι. 2. Classification et taxonomie des bactéries lactiques 4

Ι. 3. Les principaux genres de bactéries lactiques 6

Ι. 3.1. Le genre Lactobacillus 6

Ι. 3. 2. Le Streptocoques 6

Ι. 3. 2. Le genre Enterococcus 6

Ι. 3. 4. Le genre Lactococcus 7

Ι. 3. 5. Le genre Bifidobacterium 7

Ι. 4. Utilisation des bactéries lactiques dans l’industrie alimentaire 8

Π. le stress et la réponse des bactéries lactiques 9

II. 1. Définition du stress Π. 2. Le stress thermique 9

Π. 3. Le stress du au froid 10

Π. 4. Le stress acide 10

a) Effet d’acide lactique sur les bactéries 11

b) Mécanisme de résistance des bactéries lactiques au stress acide 11

Π. 5. Stress oxydatif 12

a) Les espèces réactives d’oxygène 12

b) Mécanismes de défense des BL contre le stress oxydatif 12

Π. 6. Stress osmotique 13

a) Effet du stress osmotique sur les bactéries 13

b) La réponse au stress osmotique 14

Partie Π : Matériel et Méthodes I. Matériels Ι. 1. La souche bactérienne 17

Ι. 2. Milieux de cultures et tampons 17

Ι. 3. Appareillages 17

Ι. 4. Produits chimiques 18

II. Méthode II. 1. Revivification de la souche bactérienne 18

II. 2. Vérification de la pureté de la souche 18

a) Examen macroscopique 18

b) Examen microscopique 18

c) Test de catalase 18

II.3. Effet du stress sur la survie de la souche 18

II.3. 1. Préparation de l’inoculum 18

Π. 3. 2. Stress oxydatif 19

Π. 3. 3. Evaluation de la résistance au stress oxydatif par culture sur boite 19

Π. 3. 4. Stress osmotique 19

Π. 3. 5. Stress acide 19

Π. 3. 6. Stress thermique 20

Π. 3. 7. La tolérance au froid 20

Π. 3. 8. L’effet du stockage 20

Parti Ш. Résultats et discussions Ш. 1. Vérification de la pureté de la souche 22

a) L’aspect macroscopique 22

b) L’aspect microscopique 22

Ш. 2. La croissance de la souche STsa en présence de NaCl 23

Ш. 3. La croissance dans différentes températures 24

Ш. 4. La tolérance au stress acide 25

Ш. 5. La tolérance au stress oxydatif 26

Ш. 6. Tolérance au froid 27

Ш. 7. Effet du stockage 28

Conclusion 31

Références 33 Annexes

i

ADN : Acide Désoxyribonucléique ARN : Acide Ribonucléique ADP : Adénosine diphosphate ATP : Adénosine triphosphate ATR : Acide Tolerance Response BL : Bactérie lactique

CAT : Catalase

CIPS : Cold Induced Proteins CO2 : Dioxyde de carbone CSP : Cold Shock Proteins DO : Densité Optique H2O2 : Peroxyde d’hydrogène HCl : Chlorure d’hydrogène HSPS : Heat Shock Proteins MRS : Man-Rogosa Sharp NaCl : Chlorure de sodium

NAD : Nicotinamide adénine dinucléotide NADH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide NaOH : Hydroxyde de sodium

NH3 : Ammoniac NO : Oxyde Nitrique O2- : ion superoxyde

OH^- : Radical Hydroxyle …..

ONOO^- : Peroxyde Nitrite

PBS : Phosphate Buffer Sline pH : Potontiel d’hydrogène

QacT : Quaternary ammonium compound Transporter ROS : Reactive Oxygen Species

SOD : Superoxyde dismotase

ii

Figure Titre Page

1

Arbre concensus, basé sur l’analyse comparative des Séquences ARNr, mantrant les prancipaux groupes des Bactéries lactiques à faible %G+C et les genres Gram Positifs non reliés bifidobacterium et propronobacterium (Holzpfel et al, 2017).

5

2 Divers ferments lactiques (Antoine, 2011). 7

3

Schéma représentatif des principaux mécanismes moléculaires introduit par les bactéries lactiques afin d’epecher les dommages des macromolécules SOD (Papadimition et al, 2016)

13

4

la structure des osmoprotecteures les plus importantes (Kempf et

Bremer, 1998). 14

5 Aspect des colonies de la souche St.sa sur milieu MRS 22 6 Aspect de la souche St.sa sous microscope optique (G x ^{100) 22}

7 Croissance de la souche St.sa en présence de NaCl 23 8 Croissance de la souche St.sa à différentes températures 24 9 Croissance de St.sa à différents pH après 24h d’incubation 25 10 Croissance de la souche Streptococcus salivarius ST.sa en

présence de H2O2 après 48 h d’incubation

26

11 Croissance de la souche St.sa après exposition aux conditions de froid (4°C) pendant 24 h

27

12 Effet du stockage sur la survie de la souche de St.sa à 4°C 28

iii

N° Titre Page

Tableau 1. Les différants genres des bactéries lactiques 5

Introduction

2

Les aliments fermentés sont parmi les plus anciennes formes d’aliments transformés, ils sont produits lors de la biotransformation des matières premières par l’action des microorganismes. La grande majorité des biotransformations alimentaires reposent soit sur la fermentation de l’éthanol effectuée par la levure Saccharomyces cerevesiae, soit sur la fermentation lactique réalisée par des bactéries lactiques (Papadimetriou et al, 2016).

Les bactéries lactiques sont un groupe hétérogène de microorganismes d’importance commerciale largement utilisées dans une grande variété d’industries alimentaires (Lyu et al, 2016), elles produisent de l’acide lactique en tant que produit final de métabolisation des glucides (Holzapfel et al, 2001). Elles jouent un rôle essentiel dans le développement de certaines propriétés organoleptiques et hygiéniques des produits fermentés grâce à leurs activités métaboliques (lipolyse et protéolyse) qui servent au développement des composés aromatiques et qui contribuent également à la texture des aliments (production d’exopolysacchrides) (Van de Guchte et al, 2002 ; Papadimetriou et al, 2016).

Plusieurs genres de bactéries lactiques sont utilisés comme starter dans l’industrie laitière (fromage et yaourt), dans les légumes (choucroute et olives) et les viandes fermentées (saucisses).

Les genres les plus connus sont Lactobacillus et Lactococcus ainsi que l’espèce Streptococcus thermophilus, le seul membre des streptocoques ayant un rôle dans la production alimentaires (O’Sullivan et al, 2011).

Au cours de la transformation et le stockage des aliments, les ferments lactiques sont soumis à divers facteurs de stress (conditions défavorables) qui peuvent agir sur la viabilité et/ou les propriétés fonctionnelles des microorganismes, ainsi que leur effet sur les propriétés des produits finaux, les plus souvent : la température, l’acidité, le stress oxydatif et le stress osmotique (Ferrando et al, 2015 ; Ferando et al, 2016). Par conséquence, les microorganismes doivent maintenir une résistance à telles conditions défavorables, tout en développant des mécanismes de défense reposant sur la modification de certains processus métaboliques et le changement de l’expression de certains gènes (Serrazanetti et al, 2013).

L’objectif de cette étude est d’évaluer la résistance de la souche Streptococcus salivarius ssp thermophilus isolée du lait vis-à-vis des conditions de stress liées à la composition des aliments dont les principaux sont le stress thermique, acide, osmotique et oxydatif, afin de l’exploiter dans les applications industrielles et technologiques.

Partie Ι :

Analyse Bibliographique

4 I. Les bactéries lactiques

Les bactéries lactiques (BL) sont un groupe hétérogène de micro-organismes, caractérisés par leur production d’acide lactique comme un produit principal du métabolisme (Dortu et Thonart, 2008) qui serve à la conservation de nombreux aliments (Antoine, 2011). D’après leurs bénéfices technologiques, certaines souches dites probiotiques sont impliquées dans nombreux fermentations de produits alimentaires notamment les produits laitière où elles sont utilisées en tant que starter dans la production alimentaire et permettent le développement de certaines caractères organoleptiques (Dortu et Thonart, 2008) et apportent des bénéfices pour la santé de l’hôte (Young Ng et al. 2015).

Ι. 1. Caractéristiques générales des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques (BL) sont des bactéries hétérotrophes et chimioorganotrophes, Gram positif, généralement asporulées, immobiles, anaérobies mais aérotolérantes et catalase négatif (klrein et al, 1998), se présentant sous formes de coques (Streptocoques) ou de bacilles (Lactobacille) (Guiraud et Rosec, 2004). Selon le type de fermentation utilisé, les BL sont dites homofermentaires ou hétérofermentaires (Carr et al, 2002). Les BL sont généralement ubiquistes, elles ont pour habitat de nombreux milieux naturels comme le lait, les végétaux, la viande, les muqueuses humaines et animales et le tractus digestif (Mechai, 2009).

Ι. 2. Classification et taxonomie des bactéries lactiques

La taxonomie actuelle des BL repose sur l’étude des espèces et des souches par des méthodes phénotypiques qui sont basées sur l’étude des caractéristiques biochimiques, enzymatiques et physiologiques des micro-organismes, et par des méthodes génomiques. Tous les genres des BL appartiennent au phylum des Firmicutes à faible teneur en bases G+C (50 %) à l’exception de genre Bifidobacterium appartient au phylum des Actinobacteria à haut pourcentage G+C (Tableau 01) (klein et al, 1998).

5 Figure 1. Arbre consensus, basé sur l’analyse comparative des séquences ARNr, montrant les principaux groupes phylogénétiques de bactéries lactiques à faible % G+C et les genres Gram positifs non reliés Bifidobacterium et Propionibacterium (Holzapfel et al, 2001).

Les BL regroupent 13 genres bactériens dont les plus étudiés sont : Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus et Bifidobacterium (Figure 1) (Bermúdez- Humarán et Langella, 2009).

Tableu 01. Les différents genres des bactéries lactiques (Leveau et Bouix, 1993).

Cellules

Fermentation ADN : GC%

Forme arrangement Streptococcus

Leuconostoc

Pediococcus

Lactobacillus

Bifidobacterium

Coque chaines

Coque chaines

Coque tétrades

Bacille chaines

Variée variée

Homolactique

Hétérolactique

Homolactique

Homolactique Hétérolactique

Acétique et lactique

34-46

36-43

34-42

32-53

55-67 GC% : pourcentage molaire de l’ADN en bases G et C.

6 Ι. 3. Les principaux genres de bactéries lactiques

Ι. 3.1. Le genre Lactobacillus

Les lactobacilles forment un groupe hétérogène de bactéries Gram positif, non sporulées, généralement immobiles, avec des aspects très varié, ils peuvent se présenter sous forme de bâtonnets longs et fins, ou très courts, incurvés ou même ovoïdes (Figure 2), parfois groupé paires ou en chaines. Ils sont ubiquistes et très répondues dans l’environnement (Maeno et al, 2016 ; Taillez, 2004), ils sont répartis dans diverses niches écologiques (tractus gastro-intestinal et génitale de l’homme et des animaux) (Charteris et al, 1996).

Généralement, les lactobacilles sont catalase négative, certaines ont une pseudo-catalase, microaérophiles ou anaérobies (Guiraud et Rosec, 2004) et la plupart se développent dans une gamme de températures comprise entre 15°C et 42°C et certains souche sont thermophile capable de se croitre à 50°C (Tailliez, 2004).

Ce genre est quantitativement le plus important des genres du groupe des bactéries lactiques qui ont un rôle essentielle dans l’alimentation humain où certains nombre de ces bactérie contribuent dans nombreuses préparation alimentaires (production de fromages, yaourts et autre aliments dérivés du lait…) (Tailliez, 2004).

Ι. 3. 2. Les Streptocoques

Ce sont des bactéries Gram positif, anaérobies facultatif, se présentent sous forme de coques généralement groupés en paire ou en chaînettes de longueur variable (figure 2), asporulés, immobile, catalase (-), ils sont très exigeants au point de vus nutritionnel et se développent bien à 37°C (Guiraud et Rosec, 2004).

Le genre Streptococcus comprend essentiellement des espèces pathogènes d’origine humaine ou animale ainsi que des espèces non pathogènes trouvées généralement dans le lait cru (Zotta et al, 2008). S. thermophilus est l’espèce qui appartient au groupe thermophile de bactérie lactique et qui est utilisé traditionnellement en association avec des espèces de genre Lactobacillus dans la production du yaourt et la fabrication de fromage (Papadimitriou et al, 2014).

Ι. 3. 2. Le genre Enterococcus

Les Enterocoques sont des coques homofermentaires qui se caractérisent par leur développement à 10 et à 45°C, leur aptitude à croitre en présence de 6.5 % de NaCl et à pH 9.6 ainsi que leur résistance aux facteurs de l’environnement, en particulier la température où elle résiste jusqu’à 60°C pendant 30 min (Carr et al ; 2002, Stiles et Holzapfel ; 1997).

7 Parmi les bactéries lactiques, les bactéries du genre Enterococcus jouent parfois le rôle d’un ferment dans la production de certains types de fromages et peuvent être utilisées comme indicateur de la contamination fécale des produits alimentaires (Federighi, 2005).

Ι. 3. 4. Le genre Lactococcus

Les lactococcus sont des streptocoques de groupe N dits « lactiques », non pathogènes (Federighi, 2005). Ils sont utilisés principalement comme culture de départ pour divers produits laitière (yaourt, fromage,…). Les lactocoques sont des coques Gram positif, anaérobies facultatif, non mobile et catalase (-). Les cellules de ce genre sont de forme ovoïde et regroupés en chaines.

Leurs température optimale varie de 10°C à 40°C mais ils sont incapables de se développés à 45°C.

Ils se développent généralement à 4% de NaCl et non à 6.5% ou à pH 9.6 (Carr et al, 2002).

Ι. 3. 5. Le genre Bifidobacterium

Le genre bifidobacterium est considéré comme faisant partie du groupe de bactéries lactiques grâce à leur similarité phénotypique avec les bactéries lactiques et leur propriété de production de l’acide lactique comme produit finit de la fermentation des sucres (Sullivan et al, 2011).

Ce sont des bactéries Gram positif dont l’ADN est à haut pourcentage en G + C (55%). Les Bifidobacterium se caractérisent par leur forme très irrégulière souvent en V, mais peuvent être coccoïde (Figure 2). Leurs température de croissance varient de 37 à 41°C et se développent à pH supérieur à 5 (Federighi, 2005).

Figure 2. Divers ferments lactiques (Antoine, 2011).

Streptococcus Lactobacillus Bifidobactérium

8 Ι. 4. Utilisation des bactéries lactiques dans l’industrie alimentaire

Dans l’industrie alimentaire, les bactéries lactiques sont impliquées dans la fermentation et la conservation de nombreux aliments par la production de plusieurs substances antimicrobiennes à savoir : les acides organiques (ex : acide lactique et acétique) ainsi que dans l’amélioration des caractères nutritionnelle et organoleptiques des aliments (Serrazanetti et al ; 2013, Yao et al ; 2009).

En fromagerie, divers Lactobacilles interviennent pendant l’affinge des fromages ( Lb.casei, Lb.plantarum, Lb.brevis). Lb. helveticus, Lc. lactis et Lb. bulgaricus agissent avec S. thermophilus dans les fromages à pate cuite. Dans la production de pains, les lactobacilles homo ou hétérofermentaires (Lb. plantarum, Lb. brevis et principalement Lb. sanfranciscensis) interviennent au coté des levures (Guiraud, et Rosec, 2004) et jouent un rôle essentielle dans l’amilioration de l’arôme (Serrazanetti et al, 2013).

9 Π. le stress et la réponse des bactéries lactiques

Les BL utilisées dans les procédés de fermentation alimentaires sont exposées à plusieurs conditions défavorables pendent la fabrication et le stockage. Les facteurs de stress impliqués dépendent de la méthode de conservation et des caractéristiques des aliments (Ferrando et al, 2015). Ces facteurs peuvent affecter la viabilité et/ou les propriétés fonctionnelles des micro- organismes (Ferrando al, 2016).

II. 1. Définition du stress

Le stress correspond à toute modification dans le génome, le protéome ou l'environnement qui entraîne une diminution du taux de croissance ou de la survie d'un micro-organisme, il peut être de nature physique, chimique, biologique ou environnementale (pH, température, oxygène, pression osmostique…) (Doyle, 2011).

Π. 2. Le stress thermique

Depuis longtemps, les bactéries lactiques sont utilisées dans l’élaboration des produits alimentaires où elles peuvent être soumises à des étapes de chauffage plus ou moins importantes.

Cette température peut alors être supérieure à la température optimale de croissance (Drider et Prévost, 2009). Chez les cellules bactériennes, l’augmentation de la température induit des problèmes au niveau cellulaire, elle peut provoquer la dénaturation des protéines et leur agrégation, déstabilisation des macromolécules d’ADN ou d’ARN ainsi que l’altération de la fluidité des membranes (Serrazanetti et al, 2013).

Après l’exposition à un stress, la réponse des cellules se caractérise par des changements de l’expression génétique et des activités protéiques notamment l’induction des protéines de choc thermique appelées HSPs qui agissent comme des chaperons moléculaires jouent un rôle majeur dans la conformation, la réparation des protéines et la dégradation des protéines dans les conditions physiologique normales et en réponse à un stress donné (Capozzi et al, 2009 ; Doyle, 2011). Les principaux HSP induites par un choc thermique correspondent principalement aux protéines chaperonnes (DnaK, DnaJ, GrpE, GroES et GroEL) et à différentes protéases (Clp, HtrA, FtsH) ; les chaperons GroES et GroEL sont reconnues dans de nombreuses bactéries au cours d’un stress thermique telles que Lb. helveticus, Lb. johnsonii VPL 11088, Lc. lactis et Baciillus subtillis (Haddaji et al, 2015).

10 Π. 3. Le stress du au froid

Pendant les processus industriels comme la maturation des fromages, le stockage et la réfrigération des produits fermentés, les micro-organismes sont exposés à des températures très inférieures à la température optimale de la croissance (Serrazanetti et al, 2013). Après l’exposition à des basses températures, les microorganismes subissent des perturbations physiologiques sévères telles que la réduction de la fluidité membranaire, des changements dans le niveau de super- enroulement de l’ADN et la formation des structures secondaires stables dans l’ADN et l’ARN qui altèrent la réplication, la transcription et la synthèse protéique (De Angelis et Gobbetti, 2004 ; Drider et Prévost, 2009).

Les micro-organismes sont capables de développer une réponse adaptative pendant laquelle un certain nombre de protéines appelées «cold induced proteins» (CIPs) sont synthétisés (Serrazanetti et al, 2013). Chez les lactobacilles (Lb. acidophilus et Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricus), les CIPs sont synthétisées afin de maintenir la fluidité de la membrane cytoplasmique en augmentant la proportion d’acide gras courts et/ou insaturées dans les lipides membranaire (Doyle, 2011).

On parallèle des CIPs, les bactéries vont exprimer un ensemble de protéines appelées « cold shock proteins» (CSPs) ayant un rôle dans la neutralisation des effets liées à l’abaissement de la température par l’association direct avec les molécules d’ADN ou d’ARN. Elles jouent notamment le rôle de chaperon à ARN dont, elles relancent la machinerie transcriptionnelle et traductionnelle (Drider et Prévost, 2009).

Π. 4. Le stress acide

Le stress acide est définit comme «effet biologique combiné du faible pH et des acides faibles (organiques) présents dans l’environnement » ou «l’exposition à des valeurs de pH inférieures à la plage de croissance » (Hosseini Nezhad et al, 2015). Ce phénomène est plus important pour les bactéries lactiques pendant la fermentation des aliments et des boissons (De Angelis et Gobbetti, 2004).

Les acides peuvent diffuser passivement dans la cellule, après ils se dissocient à l’intérieur du cytoplasme en protons et ions. L’accumulation des protons à l’intérieur de la cellule entraîne une diminution du pH intracellulaire ce qui affecte la force proton motrice nécessaire à de nombreux systèmes de transport membranaires. L’acidification entraîne des effets néfastes sur l’activité enzymatique et peut endommager les protéines et l’ADN de la cellule bactérienne (Drider et Prévost, 2009).

11 a) Effet d’acide lactique sur les bactéries

Les bactéries lactiques produisent au cours de la fermentation des aliments et des boissons l’acide lactique (De Angelis et Gobbetti, 2004), en créant un environnement trop acide défavorable à la survie et à la croissance des contaminants (Drider et Prévost, 2009). Le pKa de l’acide lactique est de 3.86 à 25°C. Il existe sous deux formes : la forme non dissocié CH3-HCOH-COOH (acide lactique) et la forme dissocié CH3-HCOH-COOˉ (lactate). La membrane des bactéries est perméable à la forme non dissociée et donc l’acide lactique peut se diffuser à travers la membrane cytoplasmique, le pH intracellulaire (pHi) étant plus élevé que le pH extracellulaire (pHe). L’acide lactique entrant est déprotoné en lactate qui ne diffuse pas à travers la membrane et s’accumule dans la cellule. L’accumulation des protons dans le cytoplasme provoque des altérations au niveau énergétique (altération de transport des molécules à travers la membrane), enzymatique (la dénaturation et l’agrégation des protéines de la cellule) et structural (Corrieu et Luquet, 2008).

b) Mécanisme de résistance des bactéries lactiques au stress acide

L’exposition des BL à un stress acide améliore fortement leur résistance vis-à-vis d’une contrainte acide. Cette réponse est appelée « Acide Tolerance Response » (ATR) qui entraine une induction transitoire des protéines spécifiques et des changements physiologiques qui augmentent la survie cellulaire pendant l’exposition à un pH létale (Broadbent et al, 2010). Cette ATR a été décrite chez de nombreuses bactéries lactiques comme Lb. sanfranciscensis (De Angelis et al, 2001), Lb. Acidophillus (Lorca et Font de Valdez, 2000), Lb. casei (Broadbent et al, 2010), Lb.

plantarum (Serrazanetti et al, 2013) et Lc. lactis (Sanders et al, 1999).

Des systèmes de transport enzymatiques sont induit et joue un rôle dans le contrôle du pH intracellulaire lorsque le pH atteint une valeur seuil (Capozzi et al, 2009 ; Corcoran et al, 2005) dont la F0F1-ATPase est l’enzyme la plus importante pour les bactéries fermentatives (Doyle, 2011). Cette enzyme convertit l’énergie du potentiel éléctrochimique des protons en énergie chimique par la formation d’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique (Alexandre et al, 2008).

Un autre mécanisme pour l’homéostasie du pH est la voie de l’arginine déiminase (ADI).

Cette voie est composé de trois enzymes : arginine déiminase, ornithine carbamoyltransférase et carbamate kinase qui catalysent la réaction :

Arginine + H2O + ADP + Pi Ornithine + CO2 + NH3 + ATP

12 Cette voie permet à Lc. lactis de neutraliser son environnement par la production de NH3 et l’énergie produite (ATP) permet l’extrusion des protons cytoplasmique par l’enzyme F0F1-ATPase (Sanders et al, 1999).

Π. 5. Stress oxydatif

Le stress oxydatif et une contrainte importante dans les bactéries, provoquée par un déséquilibre entre la concentration intracellulaire des oxydants (ROS) et la protection antioxydants (Capozzi et al, 2009) qui peuvent détoxifier les réactifs intermédiaires ou réparer les dommages causés par ces molécules (Al-Dalaen et Al-Qtaitat, 2014).

a) Les espèces réactives d’oxygène

Les ROS sont des molécules produites par l’organisme vivant suite au métabolisme cellulaire normal à des concentrations faibles à modérées (Al-Dalaen et Al-Qtaitat, 2014). Parmi ces molécules, H₂O₂ (peroxyde d’hydrogène), NO (oxyde nitrique), O₂ˉ (anion oxyde), ONOOˉ (le peroxynitrite) et OHˉ (le radical hydroxyle) (Singh et al, 2004). Lorsqu’elles sont présentent en concentration élevée, les ROS peuvent provoquer des modifications défavorables au composants cellulaires tels que la fragmentation de l’ADN, la modification des protéines et la peroxydation des lipides (Singh et al, 2004 ; Lyu et al, 2016) ce qui induit a des effets nuisibles sur les fonctions métaboliques de la cellule (Capozzi et al, 2009).

b) Mécanismes de défense des BL contre le stress oxydatif

Les défenses cellulaires luttant contre les effets du stress oxydatif regroupent des mécanismes de détoxification enzymatique (superoxyde dismutase (SOD), peroxydase, catalase), d’autre non enzymatiques (glutathion, théorédoxine) (Mager et al, 2000), les plus conservé dans les BL proviennent du couplage de la NAD oxydase et de la NADH peroxydase. L’oxygène est initialement utilisé pour l’oxydation du NADH en NAD⁺ par le NAD oxydase (Papadimitriou et al, 2016). L’O·^ˉ2 produit est convertie en O2 et en H2O2 grâce à l’action catalytique des SOD, qui est ensuite décomposé par la catalase (CAT) en O2 et H2O (Figure 3), empêchant la formation d’OH·

par la réaction de Fenton :

Fe2⁺ + H₂O2 Fe^3- + HO· + HO^ˉ

Cette réaction est stimulée en présence du fer, du cuivre et d’autre ions métalliques (Lyu et al, 2016 ; Corrieu et Luquet, 2008). Ainsi, les peroxydases réduisent l’hydrogène ou les peroxydes organiques en eau et en alcool (Capozzi et al, 2009).

13 Figure 3. Schéma représentatif des principaux mécanismes moléculaires introduit par les bactéries lactiques afin d’empêcher les dommages des macromolécules Superoxyde Dismutase (Papadimitriou et al, 2016).

Π. 6. Stress osmotique

Le stress osmotique correspond à une diminution ou une augmentation de l’osmolarité de l’environnement de la bactérie qui modifie la disponibilité de l’eau pour la cellule (Csonka, 1989), engendrant un changement physiologique important de la cellule et ainsi les fonctions cellulaires (Prasad, 2003).

a) Effet du stress osmotique sur les bactéries - Choc hypo-osmotique

Une diminution de l’osmolarité externe du milieu (choc hypo-osmotique) provoque un écoulement rapide de l’eau dans la cellule à travers une membrane cytoplasmique semi-perméable (krämer, 2010). Cet écoulement d’eau augmente la pression de turgescence de la cellule bactérienne (Doyle, 2011) et induit des changements immédiats dans la structure et la concentration des composants cellulaires (krämer, 2010). Un choc hypo-osmotique entraîne généralement des changements mineurs dans le volume cellulaire (Beales, 2004).

- Choc hyper-osmotique

Une augmentation de l’osmolarité du milieu externe (choc hyper-osmotique) entraine un flux rapide de l’eau vers l’extérieure de la cellule et par conséquent, une diminution de la pression de

14 turgescence des cellules et modification de la concentration du soluté intracellulaire et le volume cellulaire (De Angelis et Gobbetti, 2004).

b) La réponse au stress osmotique

Les bactéries lactiques sont soumises à des changements dans l’activité de l’eau environnante pendant le processus de fermentation industrielle (par exemple lors de la salaison des caillés au cours de la fabrication des fromages) (Romeo et al. 2001). Dans de tells conditions les bactéries lactiques sont capables de vivre, en développant des mécanismes de protection efficace qui reposent essentiellement sur l’accumulation des solutés compatibles dans le cytoplasme ou leur rejet selon le type du stress osmotique (Piuri et al, 2003).

Les solutés compatibles sont des composés inorganiques (souvent K⁺) et des molécules organiques dénommées « osmolytes » (Figure 4) produit par la cellule afin d’équilibrer la différence entre l’osmolarité intracellulaire et extracellulaire à l’aide des canaux associer à la membrane cytoplasmique et l’activité des transporteurs membranaires (Romeo et al, 2001 ; Papadimitriou et al, 2016). Ces solutés peuvent être présentent dans la cellule à des concentrations élevés sans endommager les fonctions cellulaires (Wood, 2011).

Lb. plantarum est incapable de synthétiser la glycine bétaïne, et l’accumulation de ce dernier dans le cytoplasme cellulaire est induite en réponse à un choc hyperosmotique. Cette réponse résulte de l’augmentation de l’activité des transporteurs de la glycine bétaïne via QacT (Quaternary ammonium compound transporter) qui ont une haute affinité pour la glycine bétaïne et la carnitine et une basse affinité pour la proline (Romeo et al, 2001 ; Papadimitriou, 2016).

Figure 4. La structure des osmoprotecteures (Kempf et Bremer, 1998).

15 Les changements osmotiques activent ainsi les systèmes osmorégulateurs de la cellule en induisant des gènes osmorégulateures tel que l’expression des gènes murF et murG de Lc. lactis impliqués dans la biosynthèse du phosphatidylglycerole (PG) (Papadimitriou, 2016). Ainsi ces bactéries modifient de manière significative la composition en acide gras de leur membrane lorsqu’elles sont soumises à un stress osmotique (Beales, 2004).

Partie II

Matériels et méthodes

17 I. Matériels

Ι. 1. La souche bactérienne

La souche utilisée dans cette étude est une Streptococcus salivarius ssp thermophilus St.sa, isolée à partir du lait. La souche a été fournie par Pr. Tayeb Idoui, laboratoire de Biotechnologie, Environnement et Santé, Université de Jijel. Le choix de cette souche repose sur des travaux précédents rapportant ses caractéristiques probiotiques et technologiques.

Ι. 2. Milieux de cultures et tampons

Les milieux et les tampons utilisés dans cette partie expérimentale sont : MRS (Man Rogosa-Sharpe) bouillon et gélose

Il est composé de : 10 g de peptone, 5 g d’extrait de levure, 10 g d’extrait de viande, 20g de glucose, 5 g d’acétate de sodium, 1 g de citrate d’ammonium, 0.1 g de sulfate de magnésium, 0.05 g de sulfate de manganèse, 2 g de phosphate di-potassique, 1 ml de tween 80, 1000 ml d’eau distillé et 15 g d’agar. Le pH final du milieu est de 6.2.

Tampon PBS (pH 7.4)

La stérilisation des milieux est effectuée par autoclave à 120°C pendant 20minutes

Ι. 3. Appareillages

L’appareillage utilisé est le suivant :

 Bain marie (Gerhardt Bonn)

 Etuve (Memmert)

 Etuve agitateur (Infors HT Ecotron)

 Autoclave (Pbi brand)

 Réfrigérateur (ENIEM)

 Spectrophotomètre (analytik jena)…

 pH mètre (Hanna)

 Centrifugeuse (specord plus)

 Balance (KERN)

 Micropipettes (DRAGON LAB)

 Plaque chauffante (BUNSEN)

 Microscope optique (Olympus)

18 Ι. 4. Produits chimiques

NaCl, HCl, NaOH, Peroxyde d’hydrogène (H2O2), réactif pour la coloration de Gram : violet de Gentiane, Lugol, Alcoole (Ethanol), Fuchine et Huile à immersion.

II. Méthode

II. 1. Revivification de la souche bactérienne

La souche bactérienne conservée dans le glycérol à -20° C a été revivifié dans le bouillon MRS (Man Rogosa Sharp) et incubée à 37 °C pendant 18 heures avant son utilisation.

II. 2. Vérification de la pureté de la souche

La purification a été réalisée par l’ensemencement de la souche par la méthode des stries sur milieu MRS solide.

a) Examen macroscopique

Les caractéristiques macroscopiques sont obtenues à partir des cultures bactériennes sur milieu gélosé, les caractères examinés sont l’aspect, la couleur et le diamètre de la colonie.

b) Examen microscopique

A partir d’une boite, on prélève une colonie bien isolée sur laquelle on effectue une coloration de Gram, une observation microscopique permet de distinguer le type de Gram, la forme, la taille et le mode de regroupement.

c) Test de catalase

La catalase est mise en évidence par émulsion d’une colonie dans une goutte d’eau oxygénée.

L’apparition de bulles de gaz signifie que l’H2O2 est dégradé en H2O et ½ O2, donc la bactérie possède la catalase

Une fois la souche purifiée, la recherche s’est orientée vers l’étude de l’effet du stress sur la survie de la souche.

II.3. L’effet du stress sur la survie de la souche Π. 3. 1. Préparation de l’inoculum

Des cultures jeunes de la souche sont préparées dans le milieu MRS avant chaque expérience.

Des prélèvements de colonies pures ont été effectués et incorporés par la suite dans 10 ml de

19 bouillon MRS. Ces milieux sont incubés à 37°C pendant 18 h et utilisés par la suite pour réaliser les différents tests.

Π. 3. 2. Stress oxydatif

Pour déterminer l’effet du H2O2 (peroxyde d’hydrogène) sur la souche St.sa, la méthode de Fessard et al, (2016) a été utilisée. La souche a été cultivée dans le bouillon MRS pendant 18 h, 1 ml de cette culture bactérienne a été utilisé pour inoculer 10 ml du bouillon MRS contenant 0.025%, 0.05%, ou 0.075% de H2O2. La densité optique a été mesurée à 660 nm avant et après une incubation à 37°C pendant 48 h.

Π. 3. 3. Evaluation de la résistance au stress oxydatif par culture sur boite

La résistance au stress oxydatif de la souche St.sa a été déterminée selon la méthode de Martarelli et al (2011). Elle consiste à inoculer 50 ml de la gélose MRS semi-solide (à 0.4 % d’agar) avec 2.5 ml d’une culture jeune. 4 ml de cette préparation est versée en surface d’une couche de gélose MRS (solide) déjà coulé dans la boite. Des disques de papier Wathman sont placés sur la gélose MRS et des volumes de 10µl de H₂O₂ à différentes concentrations (0.75%, 1.5% et 3%) sont ajoutés sur les disques. Les boites sont incubées à 37°C pendant 18 h et les diamètres des zones d’inhibition autour des disques sont mesurés.

Π. 3. 4. Stress osmotique

Une culture jeune de la souche St.sa a été utilisée pour ensemencer 25 ml du bouillon MRS contenant différentes concentrations de NaCl (0.6M, 1.1M, 1.6M, 1.8M). La croissance cellulaire a été estimée par la mesure de la densité optique par spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nm chaque 2 heures (Boublenza, 2013).

Π. 3. 5. Stress acide

L’effet du pH sur la croissance de la souche St.sa a été réalisé selon la méthode décrite par Baliarda (2003) avec quelques modifications. Des milieux de 50 ml de bouillon MRS ont été préparés. Le pH du bouillon MRS a été ajusté à différentes valeurs (2, 3, 6.2, 7). Chaque milieu est ensemencé avec 2 ml d’une culture bactérienne jeune. La DO a été mesurée à une longueur d’onde de 600 nm chaque 2 h et après 18 h d’incubation à 37°C.

20 Π. 3. 6. Stress thermique

L’évaluation de l’effet de la température sur la croissance de la souche St.sa a été effectuée comme décrit par Baliarda (2003) avec quelques modifications. Plusieurs fioles contenant 25 ml de bouillon MRS ont été préparées. Les fioles ont été ensemencées par 1 ml d’une culture bactérienne jeune. L’incubation a été réalisée à différentes température (4°C, 28°C, 37°C, 44°C). La DO à 600 nm a été mesuré chaque 24h pendant 4 jours.

Π. 3. 7. La tolérance au froid

La tolérance au froid a été évaluée par exposition de la culture bactérienne à une température de 4°C (la réfrigération) pendant 18 h, ensuite, la culture a été incubée à 37°C pendant 24 h. La DO a été mesurée à 600 nm après le traitement au froid et après l’incubation à 37°C. La capacité de croissance a été comparée avec une culture qui n’a pas été exposée à la réfrigération (Reale et al, 2014).

Π. 3. 8. L’effet du stockage

Ce test est réalisé selon la méthode décrite par Guidone et al (2013) avec une légère modification. Une culture bactérienne incubée pendant 18 h a été centrifugée à 6000 x g pendant 15 min, le culot obtenu a été lavé avec le tampon phosphate (PBS, pH 7). Le culot est resuspendu dans le PBS afin obtenir une DO de 0,3 à 600 nm. La suspension bactérienne a été stockée à 4°C pendant 30 jours et la tolérance au stress a été mesurée par dénombrement avec cellule de Malassez chaque semaine.

Partie Ш :

Résultats et discussions

22 Dans ce travail, nous avons réalisé une série de tests pour évaluer la résistance de la souche Streptococcus salivarius ssp thermophilus (St.sa) aux différents stress susceptibles d’être rencontrer dans des matrices alimentaires: le stress osmotique, acide, thermique et oxydatif.

Ш. 1. Vérification de la pureté de la souche a) L’aspect macroscopique

La culture de bactéries sur milieu MRS gélosé montre de petites colonies blanchâtres, rondes à contours réguliers, lisses et légèrement bombées comme illustré par la figure (5).

Figure 5. Aspect des colonies de la souche St.sa sur milieu MRS

b) L’aspect microscopique

La coloration de Gram nous a permis de confirmer que la bactérie est Gram positif et les cellules se présentent sous forme de coques regroupées en paires ou en chainettes (Figure 6).

Figure 6. Aspect de la souche St.sa sous microscope optique (G x 100)

23 Ш. 2. La croissance de la souche St.sa en présence de NaCl

La croissance de la bactérie en présence de différentes concentrations de NaCl (0.6M, 1.1M, 1.6M, 1.8M) en comparaison avec la croissance en absence de NaCl révèle une sensibilité différente de la souche au stress osmotique. Les résultats montrent que plus la concentration en NaCl augmente, plus le temps de latence est long. Comme observé dans la courbe de croissance, la durée de la phase de latence atteint pratiquement 6 h dans les conditions favorables (sans NaCl) alors qu’elle atteint 8 h en présence de 1.8M de NaCl. Cette phase correspond à la phase d’adaptation des cellules aux conditions de stress.

Une augmentation de la concentration en NaCl dans le milieu entraine aussi une diminution de la croissance bactérienne. Les valeurs de la DO₆₀₀ nm décroissent proportionnellement en fonction de l’augmentation de la concentration en NaCl. Après 24 h d’incubation à 37°C, la croissance de la souche St.sa dans le milieu qui contient 0.6M, 1.1M, 1.6M et 1.8M de NaCl est réduit de 12 % à 43% par apport à la croissance dans les conditions non stressées (Figure 7).

Figure 7. Croissance de la souche St.sa en présence de NaCl.

Des travaux réalisés par Romeo et al, (2001) sur Lc. lactis ont montré que dans un milieu à 1.1M de NaCl, la croissance est réduite de 25% à 50% par rapport à une croissance à une pression osmotique normale. Ces résultats montrent que notre souche St.sa est capable de résister et de s’adapter à des niveaux élevés de NaCl. Cette adaptation est due à la capacité des bactéries lactiques à développer des systèmes de défense qui reposent essentiellement sur l’accumulation des solutés compatibles dans leur cytoplasme (Romeo al, 2001). L’osmotolérence de S. salivarius ssp

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

0 2 4 6 8 24

DO 600 nm

Temps (h)

control 0,6 M 1,1 M 1,6 M 1,8 M

24 thermophilus est un critère important pour la sélection de la souche pour les applications technologiques notamment la technologie laitière (production du yaourt et du fromage).

Ш. 3. La croissance dans différentes températures

Pour évaluer l’effet de la température sur la croissance de la souche St.sa, quatre températures ont été testées (4°C, 28°C, 37°C et 44°C). Pour chaque température, un modèle de croissance spécifique a été observé. Les résultats sont présentés dans la figure (8).

Figure 8. Croissance de la souche ST.sa à différentes températures.

La souche St.sa montre une croissance optimale à 37°C après 24 h d’incubation, une bonne croissance est remarquée à 28°C. À 44°C, une faible croissance est remarquée par rapport à la croissance à 37°C. Cette croissance confirme que la bactérie est capable de résister à des températures élevées que sa température optimale de croissance à cause de la capacité des bactéries à développer des mécanismes de défense notamment l’induction des protéines chaperon ayant différents rôles dans la physiologie cellulaire (Serrazetti et al, 2013).

Par contre, à 4°C notre souche ne montre aucune croissance où la densité optique reste la même après 96 h d’incubation (croissance nulle). L’exposition de la bactérie à des températures basses affecte la fluidité membranaire, ce qui réduit l’efficacité des fonctions liées à la paroi. Elle affecte aussi la stabilisation des acides nucléiques et la synthèse protéique (De Angelis et Gobbetti, 2004).

0 0,5 1 1,5 2 2,5

0 24 48 72 96

DO600 nm

Temps (H)

4°C 28°C 37°C 44°C

25 Ces résultats indiquent que la modification de la température affecte la croissance bactérienne où on note que la DOest affecté. Ce dernier résultat est confirmé par les résultats obtenus avec la souche Lb. sakei de l’étude réalisée par Marceau et al, (2003) qui ont démontré que la capacité de cette souche à croitre à différentes températures est variable, elle diminue à partir de la température optimale (30°C) à une température plus basse (4°C).

La tolérance au stress thermique est un critère qui permet de sélectionner les souches lactiques qui peuvent être utilisées en biotechnologie industrielle grâce à leurs performances technologiques élevées dans des environnements alimentaires stressants, comme le cas de Lb. sakei ajouté à la viande qui exprime des gènes de choc thermique lui permettant de s’adapter aux changements des conditions de la matrice alimentaire (Serrazetti et al, 2013).

Ш. 4. La tolérance au stress acide

Pour évaluer l’effet du stress acide sur la survie de la souche St.sa, cette dernière est exposée à différentes valeurs du pH (pH 2.0, pH 3.0, pH 6.2, pH 7.0) et les résultats sont représentés dans la figure (9).

Figure 9. Croissance de ST.sa à différents pH après 24h d’incubation.

La souche présente une sensibilité variable vis-à-vis des différentes valeurs du pH. Pendant une periode d’incubation de 4 h, aucune croissance n’est observée. Après 24 h, la souche montre une croissance optimale à pH 6.2 avec une DO 600nm de 2.67, ainsi, une bonne croissance est observée à pH 7.0 (DO600nm =2.5).

A des faibles valeurs de pH (pH 2 et pH 3), une croissance très faible est remarquée dont la DO600nm est de 0.38 à pH 2 et de 0.5 à pH 3. D’après ces résultats, on peut dire que notre souche est

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

0 2 4 6 8 24

DO600 nm

Temps (h)

pH 2 pH 3 pH 6,2 pH 7

26 probablement incapable de tolérer de conditions acides ou probablement qu’elle nésséssite un temps plus long pour s’adaptater à telles conditions de stress. Donc, on constate que la variation du pH du milieu affecte la croissance des bactéries lactiques.

Ces résultats sont similaires à ceux observés par Guillouard et al, (2004), qui ont trouvé que la croissance des souches de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus est affectée par les changements du pH lorsqu’elle sont exposés à pH 3.6 et à pH 4.75.

Ш. 5. La tolérance au stress oxydatif

Pour évaluer l’effet du stress oxydatif sur la croissance de la souche St.sa, des cultures sont réalisées avec différentes concentrations de peroxyde d’hydrogène (0.025%, 0.05% et 0.075%) sur bouillon et à 0.75%, 1.5% et 3% sur gélose MRS.

Comme illustré sur la figure (10), la souche montre une bonne croissance après 48 h d’incubation en présence de 0.025%, 0.05% et 0.075% avec une croissance de 97%, 91% et 90%

respectivement (faible taux de réduction par rapport au contrôle). Pour la culture sur gélose, une faible zone d’inhibition d’un diamètre de 8 mm est apparue en présence de 3% de H₂O₂ cependant aucune inhibition n’est observée en présence de 0.75 % et 1.5% de H₂O_2. D’après les résultats obtenus, nous avons constaté que notre souche est capable de maintenir une forte résistance en présence de H2O2 dans son environnement.

Figure 10. Croissance de la souche St.sa en présence de H₂O₂ après 48 h d’incubation.

Contrairement à nos résultats, Fessard et al (2016), et d’après une étude réalisée sur des isolats de bactéries lactiques, Lb. plantarum DSM2601, Lb. plantarum (S17 et S29), Leuconostoc

0 0,5 1 1,5 2 2,5

contrôle 0,025 0,05 0,075

DO660nm

H2O2 %

T 0 T 48