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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique ةعماج
يحي نب قيدصلا محمد –
لجيج
Université Mohammed Seddik Benyahia - de Jijel
Mémoire de fin du cycle
En vue de l’obtention du diplôme :
Master Académique en Biologie Option : Microbiologie Appliquée
Etude de la capacité de Streptococcus salivarius à éliminer le chrome hexavalent
ةيلك ع ـــ طلا مول ـــ ةعيب حلاو ــــ ةاي
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Thème
Présenté par : Hadef Hayat Merghit Souad Meskine Hanane
Année Universitaire 2016 - 2017 Membres de Jury
Présidente : Dr. Ait Meddour Amel Examinateur : Mr. Rahmoune Yazid Encadreur : Dr. Ouled Haddar Houria
Numéro d’ordre(bibliothèque):………….
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département : Microbiologie Appliquée et Sciences Alimentaires
Remerciements :
Tout d’abord nous remercions Allah Le tout Puissant pour la santé, la volonté et la patience qu’Il nous a donné pour réaliser ce travail.
Nos vifs remerciements vont à nos familles, nos parents, nos sœurs et nos frères qui nous ont toujours soutenus et encouragés à tout moment.
Nous remercions très sincèrement notre encadreur Dr.OuledHaddarHouria, pour sa permanente disponibilité, ses conseils pertinents, ses orientations judicieuses, sa patience et diligence, ses suggestions et critiques qui ont grandement facilité ce travail.
Nous tenons à remercier également l’ensemble des membres dujury qui ont accepté d’évaluer notre travail,
Dr Ait Meddour Amel en tant que présidente de jury.
MrRahmoune Yazid d’avoir pris de son temps pour examiner et juger ce travail.
Nous voudrions remercier l’ensemble des ingénieurs de Laboratoire de Microbiologie sans oublier la responsable de laboratoire, pour leurs aides durant la période de réalisation de ce travail.
Nous disons un grand merci à tous nos collègues et nos amis, surtout notre amis FoughaliaZahia.
Enfin, nous remercions toutes les personnes qui, de près ou de loin, ont apporté leur contribution à ce travail.
Dédicace
Tout au début, je tiens remercier Allah de m’avoir donné du courage et de patience afin de réaliser ce modeste travail que je dédie à :
A la lumière des mes jours la source de mes efforts, la flamme de mon cœur, ma vie et mon bonheur :
Mon cher père et ma chère mère que j’adore.
A mes frères Bilal, Yakoub et mes belles sœurs Fatiha et Widad: pour votre soutient et encouragements, vous occupez une place particulière dans mon cœur. Je vous dédie ce travail en vous souhaitant un avenir radieux, plein de bonheur et de succès et a toute la famille Merghit et Boufninza.
Aux personnes qui m’ont toujours aidé et encouragé, qui étaient toujours à mes coté, et qui m’ont accompagnaient durant mon chemin d’études mes proches amis Meskine Hannane et Hadef Hayat.
Souad
Tout au début, je tiens remercier Allah de m’avoir donné du courage et de patience afin de réaliser ce modeste travail que je dédie à :
A la lumière des mes jours la source de mes efforts, la flamme de mon cœur, ma vie et mon bonheur :
Mon cher père et ma chère mère que j’adore.
A mes frères Yassin, Hamza et ma belle sœur Meriem : pour votre soutient et encouragements, vous occupez une place particulière dans mon cœur. Je vous dédie ce travail en vous souhaitant un avenir radieux, plein de bonheur et de succès et a toute la famille Hadef et Ayad et surtout Issam, Nassiha et Sawsan.
Aux personnes qui m’ont toujours aidé et encouragé, qui étaient toujours à mes coté, et qui m’ont accompagnaient durant mon chemin d’études mes proches amis Meskine Hannane et Merghit Souad.
Hayat
Tout au début, je tiens remercier Allah de m’avoir donné du courage et de patience afin de réaliser ce modeste travail que je dédie à :
A la lumière des mes jours la source de mes efforts, la flamme de mon cœur, ma vie et mon bonheur :
Mon cher père et ma chère mère que j’adore.
A mes frères Zouhir, Moussa, Kamel et ma belle sœur Chaima : pour votre soutient et encouragements, vous occupez une place particulière dans mon cœur. Je vous dédie ce travail en vous souhaitant un avenir radieux, plein de bonheur et de succès et a toute la famille Meskine et Ouahba.
Aux personnes qui m’ont toujours aidé et encouragé, qui étaient toujours à mes coté, et qui m’ont accompagnaient durant mon chemin d’études mes proches amis Hadef Hayet et Merghit Souad.
Hanane
I
Liste des figures ...III Liste des tableaux ...IV Liste des abréviations...V
Introduction ...1
Synthèse Bibliographique I. Généralités sur le chrome hexavalent ...3
I.1. Chrome comme un polluant de l’environnement et de la chaine alimentaire ...3
I.2. Effet toxique du chrome hexavalent sur l’environnement ...4
I.2.1. Dans l’eau...4
I.2.2. Dans le sol...5
I.2.3. Dans l’atmosphère...5
I.2.4. Dans les plantes...5
I .. Toxicité du chrome hexavalent pour l’Homme ...6 3 II. Les bactéries probiotiques sont-elles capables d’éliminer le chrome hexavalent ? ...8
II.1. Généralités et historiques sur les probiotiques...8
II.2. Propriétés et effets des probiotiques ...8
II.2.1. Propriétés technologiques des probiotiques ...8
II.2.2. Propriétés thérapeutiques...9
II.3. Mode d’action des probiotiques ...10
II.3.1. Effet barrière ...10
II.3.2. Amélioration de la fonction barrière de la muqueuse intestinale...10
II.3.3. Modulation du système immunitaire...11
II.4. Streptococcus salivarius comme probiotique...11
III. Interactions bactéries lactiques-chrome hexavalent ...11
III.1. Mécanismes de résistance bactérienne au chrome hexavalent... ...12
III.1.1. Biosorption...12
III.1.2. Bioaccumulation... ...13
III.1.3. Réduction enzymatique... ...13
III.1.4. Efflux du chrome hexavalent...15
Matériel et Méthodes I. Matériel ...16
I.1. Matériel biologique...16
I.2. Milieux de culture ... ...16
I.3. Produits et réactifs chimiques...16
II
I.4 Appareillage...17
II. Méthodes ...17
II.1. Revivification de la souche...17
II.2. Préparation des solutions mères des métaux lourds...17
II.3. Etude de la tolérance de souche lactique aux métaux lourds...18
II.4. Méthode colorimétrique du dosage du chrome...18
a-Préparation de la solution acide de diphénylcarbazide (DPC) ...18
b- Etablissement de la courbe d’étalonnage du chrome ...19
c- Mode opératoire ...19
II.5. Taux de réduction du chrome...19
II.6. Effet du pourcentage de l’inoculum sur la croissance de la souche lactique en présence du Cr(VI)...19
II.7. Effet de pH sur la croissance et l’élimination du Cr(VI) par la souche lactique. ...20
II.8. Effet de l’agitation sur la croissance et l’élimination du Cr(VI) par la souche lactique...20
II.9. Bioaccumulation du Cr(VI) par la souche lactique ...20
II.91. Lyse cellulaire ...21
II.9.2.Détermination du poids sec de la biomasse...21
Résultats et Discussion I.Etude de la tolérance de souche lactique aux métaux lourds...22
II. Effet du pourcentage d’inoculum sur la croissance de la souche lactique St. salivarius ...26
III. Effet du pH sur la croissance et l’élimination du Cr(VI) par la souche lactique St. salivarius...27
II.1. Sur la croissance bactérienne...27
II.2. Sur l’élimination du chrome(VI)...28
IV. Effet de l’agitation sur la croissance et la réduction du Cr(VI) par la souche lactique St. salivarius ...29
II.1. Sur la croissance bactérienne...29
II.2. Sur l’élimination du chrome(VI)...30
V. V. Bioaccumulation du chrome (VI) par la souche lactique (St.sa) ...31
Conclusion...33
Références bibliographiques...34 Annexes...VI
III
Figure 1 : Toxicité et mutagénicité du Cr(VI) dans la cellule ………...……..………….7
Figure 2 : Croissance de la souche S. salivarius dans le bouillon MRS en présence de différentes concentrations d’inoculum à 37 C°.………27
Figure 3 : Effet du pH sur la cinétique de croissance de la souche (St.sa) en présence du Cr (VI) dans le bouillon MRS à 37°C.……….…………...………...29
Figure 4 : Pourcentage du Cr(VI) éliminé par la souche St.sa dans le bouillon MRS à différents pH……….30
Figure 5 : Croissance de la souche S. salivarius dans le bouillon MRS avec et sans agitation à 37 C°……….31 Figure 6 : Le pourcentage du Cr(VI) éliminé par S. salivarius dans le bouillon MRS avec et sans agitation à 37 C°………32 Figure 7 : Bioaccumulation du Cr par St.sa en absence et en présence de 50 mg/L du Cr dans le bouillon MRS incubé à 37°C……….………...………33
IV
Tableau I : Concentration du Cr dans certains légumes………..…4 Tableau II : Effet du Cr (VI) sur la santé de l’Homme………...……7 Tableau III : Propriétés technologiques des probiotiques………...…….9 Tableau IV : Les valeurs de la DO mesurée à 600 nm pour la culture de Streptococcus salivarius en
présence de concentrations croissantes du Cr (VI) à T0 et après 24h d’incubation à 37°C. ………23 Tableau V : Les valeurs de la DO mesurée à 600 nm pour la culture de Streptococcus salivarius en
présence de concentrations croissantes du Pb à T0 et après 24h d’incubation à
37°C………..………..24 Tableau VI : Les valeurs de la DO mesurée à 600 nm pour la culture de Streptococcus salivarius en
présence de concentration croissantes du mercure (Hg) à T0 et après 24h d’incubation à 37°C. ………25
V BL : Bactéries lactiques.
Chr A : Gène de résistance au chrome.
CMI : Concentration minimale inhibitrice.
Cr III : Chrome trivalent.
Cr V : Chrome pentavalent Cr VI : Chrome hexavalent.
DO : Densité optique.
DPC : Diphénilecarbazide GSH : Glutathione.
IL : Interleukine.
MRS : Man, Rogosa et Sharpe.
NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide.
NADHP : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate.
Pg : pictogramme.
rpm: Rotation par minute.
SM : Solution mère.
TNF: Facteur de nécrose tumorale.
LDL : Lipoprotéines de basse densité.
Introduction
1
Dans les dernières décennies et avec l’accroissement du développement économique, la quantité des métaux lourds dans les écosystèmes aquatiques et terrestres a augmenté en raison des différentes activités humaines, ceci représente un grave problème non seulement du point de vue de la santé humaine, mais aussi du plus large point de vue environnemental en raison de leur non biodégradabilité, leur accumulation dans la chaine alimentaire et leurs propriétés dangereuses et toxiques (Saha et Orvig, 2010; Bhakta et al., 2012; Dhal et al., 2013).
La contamination par le chrome hexavalent est due principalement à son utilisation dans l’industrie du cuir, des métallurgies, textile et des pigments. La forme hexavalente du chrome est hautement toxique, mutagène et cancérogène, elle traverse la membrane cellulaire et génère des intermédiaires actifs Cr(V) et /ou Cr(VI), des radicaux libres et le Cr (III) comme produit final. Ce dernier affecte la réplication de l’ADN, provoque des mutations, modifie la structure et l’activité des enzymes….etc (Viti et al., 2013).
L’exposition des aliments aux métaux lourds pourrait avoir des effets néfastes sur la santé humaine et animale même à faibles concentrations (Ibrahim et al., 2006). Plusieurs techniques sont utilisées pour prévenir et gérer ce problème, certaines sont inefficaces d’autres sont couteuses pour un usage pratique à grande échelle. Ceci a conduit les chercheurs à rechercher des solutions alternatives pour la décontamination des sites environnementaux et des humains eux-mêmes. Un certain nombre de microorganismes environnementaux ont depuis longtemps été connus pour leur capacité à lier les métaux, mais les moins appréciés sont les bactéries gastro-intestinales humaines (Monachese et al., 2012), qui sont commercialisées comme probiotiques, ces dernières ont des effets bénéfiques pour la santé des êtres vivants, car elles jouent un rôle important dans l’inhibition des organismes pathogènes, la production des substances antimicrobiennes, des acides organiques et des vitamines. De plus, elles améliorent la réponse immunitaire et préviennent l’organisme de certains maladies infectieuses (Oelschlaeger, 2010; Sccol et al., 2010).
Les bienfaits des bactéries probiotiques attirent l’attention de les utiliser pour la détoxification des métaux lourds et par conséquent, la protection de la santé contre ces substances toxiques ingérées à partir des denrées alimentaires ou de l’eau. (Halttunen et al., 2007; Ibrahim et al., 2006). Il a été également signalé que certaines bactéries lactiques possèdent une activité antioxydante et elles sont ainsi capables de minimiser l’accumulation des espèces d’oxygène réactif (ROS) pendant l’ingestion des aliments (Balakrishnan et al., 2014;Younan et al., 2016).
L’élimination des métaux lourds par les bactéries lactiques a été étudiée chez les espèces suivantes : Lactobacillus reuteri, Lb. rhamnosus LC-705, Bifidobacterium longum et
2
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii JS pour le Pb et le Cd (Halttunen et al., 2007;
Bhakta et al., 2012; Kinoshita et al., 2013), Leuconostoc mesenteroides pour le Pb(II) (Yi et al., 2017), une capacité élevée d’élimination du cuivre Cu(II) est obtenue par L. mesenteroides et Lb.
brevis (Mrvčić et al., 2012; Mrvčić et al., 2013), de plus une meilleure biosorption pour l’arsenic a été rapportée chez Pediococcus dextrinicus et Pediococcus acidilactici (Bhakta et al., 2010), Lb.
kefir et Lb. plantarum CCFM8610 adsorbent le Cd d’une façon très efficace (Gerbino et al., 2014;
Zhai et al., 2015).
Les données sur l’élimination du chrome hexavalent par la souche Sreptococcus salivarius sont très rares. Dans ce contexte nous avons choisi de travailler avec cette souche (St.salivarius).
L’objectif principal de ce travail est porté sur l’étude de la capacité de la souche Streptococcus salivarius (St.salivarius) à éliminer le chrome hexavalent (Cr(VI)).
Dans cette optique, notre travail pratique va s’articuler autour des axes suivants :
L’étude de la tolérance de la souche lactique aux métaux lourds : le mercure (Hg), le chrome hexavalent (Cr(VI)) et le plomb (Pb).
L’étude de l’effet de la biomasse sur l’élimination du Cr (VI).
L’étude de l’effet du pH sur l’élimination du Cr(VI).
L’étude de l’effet de l’agitation sur l’élimination du Cr(VI).
Enfin la détermination du mécanisme d’élimination du Cr(VI) par la souche de Streptococcus salivarius.
Synthèse
Bibliographique
3 I. Généralités sur le chrome hexavalent :
Le mot chrome est dérivé du grec « chroma » qui signifie couleur en raison des nombreuses couleurs des composés du métal. C’est le septième élément abondant sur la Terre, on le rencontre dans l’environnement sous plusieurs états d’oxydation (de Cr2+ à Cr6+). Sous l’état d’oxydation hexavalent il est le plus toxique pour les animaux, l’Homme et les plantes (Goullé et al., 2012;
Jaishanka et al., 2014).
I.1. Chrome comme un polluant de l’environnement et de la chaine alimentaire :
Le chrome (Cr) est un élément naturel retrouvé dans l’eau et le sol. Ses principales sources sont les suivantes : les sources naturelles (les roches, le sol, l’atmosphère et les gaz volcaniques), les sources anthropiques (résidus de charbon et cendre, l’engrais), les industries telles que l’industrie de cuir, de ciment, de textile. Les formes trivalentes Cr(III) et hexavalentes Cr(VI) sont les plus stables et les plus abondantes dans l'environnement terrestre (Saha et al., 2011; Tchounwou et al., 2012;
Dhal et al., 2013; Singh et al., 2013; Hossini et al., 2016).
L'augmentation des concentrations du chrome dans l'environnement est étroitement liée à sa libération dans l’air et les eaux usées. L’activité anthropique libère principalement le Cr (VI), cette forme oxydée est très soluble dans l'eau, elle est donc mobile (Tchounwou et al., 2012;
Jaishankar et al., 2014).
Généralement, lorsqu’on administre par voie orale un aliment ou de l'eau contenant du Cr(VI) à des animaux, il est converti en Cr(III) dans l'estomac ce qui indique que les êtres vivants supérieurs peuvent tolérer un niveau relativement haut du Cr(VI). L'Organisation Mondiale de la Santé et la Communauté Européenne ont fixé la concentration limite du chrome total dans l’eau potable à 50pg/L (Costa, 2003; Gajalakshmi et al., 2012; Sazakli et al., 2014).
Dans ce contexte, il a été rapporté que la consommation de l’eau potable contenant des concentrations élevées (5 à 180mg /L) du Cr(VI) induit l’apparition de tumeurs au niveau de l'intestin grêle chez les souris (Kirmanal, 2016). Par ailleurs, l’ajout du chrome dans l'alimentation du poulet à des concentrations élevées mène à son accumulation dans les tissus de l’animal. Sa consommation par l’Homme induit la pénétration du Cr(VI) à travers les membranes cellulaires ce qui provoque des lésions rénales et des maladie du système nerveux central (Islam et al., 2017).
De plus, la contamination de l’environnement par le Cr provoque son accumulation dans les plantes, via ces dernières le Cr entre dans la chaine alimentaire et présente une menace potentielle pour la santé humaine (Li et al., 2017). La contamination des fruits et des légumes par des métaux
4
lourds peut se produire par absorption à travers les racines à partir des sols contaminés et l'irrigation par l’eau (Cherfi et al., 2014).
Le tableau 1 présente certaines concentrations du Cr dans les légumes cultivées dans des sols irrigués par des eaux usées au Pakistan.
Tableau 1. La concentration du Cr dans certains légumes (Mahmood et Malik, 2014).
Les légumes La concentration du Cr (mg/Kg (poids sec)
Pomme de terre (Solanum tuberosum L.) 1,60
Chou (Brassica oleracea capitata) 3,06
Choufleur (Brassica oleracea) 2,1
Carotte (Daucus carota L.) 1,92
Navet (Brassica rapa L.) 1,44
Brassica (Brassica campestris L.) 2,62
I.2. Effet toxique du chrome hexavalent :
Le chrome hexavalent, la forme la plus toxique, mutagène et cancérigène, et elle se propage largement au-delà du site de contamination initiale en raison de sa mobilité, de plus elle est considéré mille fois plus toxique que le Cr(III) parce qu’elle est capable de pénétrer à travers les membranes cellulaires biologiques (Viti et al., 2014; Pawełczyk et al., 2016).
I.2.1. Dans l’eau :
Les quantités élevées du Cr(VI) présentes dans les systèmes aquatiques sont liées pour l’essentiel à des émissions d’origines industrielles, elles posent des sérieux problèmes pour la vie aquatique. Le Cr(VI) est également un oxydant puissant, il forme des oxydes tels que le CrO3 et le chromate (CrO4-2) (Mamais et al., 2016; Qambrani et al., 2016). Une solubilité élevée de ce métal en milieu aqueux facilite sa percolation dans les eaux souterraines, ce qui lui confère une grande mobilité dans les écosystèmes. Des mesures récentes du Cr(VI) dans une rivière au Columbia provenant des eaux souterraines étaient égale à 100µg /L au milieu de la rivière (Markad et al., 2017; Wang et al., 2017). Cette teneur très élevée peut menacer la vie des organismes aquatiques, comme les moules (Lampsilis siliquoide), les invertébrés (amphipodes Hyalella azteca) et les poissons (Besser et al., 2004; Wang et al., 2017). En effet les poissons exposés au Cr(III) et au Cr(VI) présentent des mouvements brusques, une hypersécrétion de mucus, ouvrent la bouche pour l'essoufflement, et changent de couleur (Nisha et al., 2016).
Vera-Candioti et al., (2011), ont démontré que Cnesterodon decemmaculatus, vivant en Amérique Néotropicale est sensible au Cr(VI), car ce dernier réduit sa survie et sa croissance,
5
l’exposition de cette espèce à des concentrations élevés du Cr(VI) pendant 24 heure suffisent pour provoquer une mortalité de 63% de ces poisons.
I.2.2. Dans le sol :
Le Cr(VI) est plus persistant dans le sol donc plus toxique pour le biote (Singh et al., 2013 ). Il affecte la survie, le comportement et la morphologie de plusieurs espèces vivants notamment les vers de terre (Sivakumar et Subbhuraam, 2005). L’étude de Sforzini et al., ( 2017), sur Eisenia andrei, a montré que le Cr(VI) peut induire des effets notoires tels que : l’augmentation des niveaux d’espèce oxygène réactif (ROS) intracellulaires, générant dans les cellules des conditions de stress oxydatif ce qui conduit une peroxydation des lipides membranaires et à l’endommagement de l’ADN, de plus, les lysosomes ont montré des changements importants tels qu’une forte déstabilisation de la membrane. Ainsi, la contamination au Cr(VI) modifie la structure et la diversité des communautés microbiennes du sol et réduit leurs croissance en retardant les activités enzymatiques (Mishra et Bharagava., 2016), il est mutagène pour les bactéries (Dhal et al., 2013), sous forme d’anion dichromate (CrO4-2
), il provoque l’inhibition du transport des sulfates à travers la membrane aussi bien que des dommages oxydatifs aux biomolécules chez les bactéries (Ramirez-Diaz et al., 2008).
I.2.3. Dans l’atmosphère :
Les industries en relation élevées avec le chrome et les sources de combustion ont contribué aux concentrations élevées du Cr (VI) dans l’atmosphère. Les algues épiphytes (organismes qui vivent sur les plantes) présentent une grande capacité d’accumuler les métaux lourds présents dans l’air. En revanche, le Cr(VI) provoque l’inhibition de la croissance chez Euglena (Cervantes et al., 2001), l’inhibition de la respiration et de la photosynthèse a également été rapportée pour Chlorella (Wong et Trevors, 1988).
I.2.4. Dans les plantes :
Le Cr est un élément non essentiel pour les plantes, cependant, il a également été démontré que le Cr(VI) produit plus de dommages chez les plantes à cause de sa toxicité qui provoque des retards dans la germination des graines, la chlorose, des déséquilibres nutritifs, il réduit également la photosynthèse et la formation de la biomasse. De plus, le Cr affecte les processus métaboliques par l’intermédiaire du stress oxydatif, provoque des altérations du chloroplaste et des pigments, la nécrose et finalement la mort des cultures (Davies et al., 2002; Lopez et al., 2009; Oliviera, 2012;
Lukina et al., 2016; Mishra et Bharagava, 2016; Li et al., 2017).
6 I.3. Toxicité du chrome hexavalent pour l’Homme :
L’agence de la protection de l’environnement des Etats Unis (US EPA) a identifié le Cr(VI) comme l’un des 17 substances chimiques les plus toxiques pour l’Homme, le Centre International de Recherche sur le Cancer a classé le chrome hexavalent dans le groupe 1 des substances cancérogènes (Cheung et Gu, 2007; Goullé et al., 2012).
La toxicité du Cr(VI) est liée à la facilité de sa diffusion à travers la membrane cellulaire des procaryotes et des eucaryotes et par la suite la réduction du Cr(VI) dans les cellules donne des radicaux libres qui peuvent directement causer des altérations de l'ADN ainsi que d’autres effets toxiques (Dhal et al., 2013).
Le Cr(VI) est absorbé par les canaux de transport de sulfate membranaire, sous la plupart des conditions physiologiques, le Cr(VI) existe sous forme d’anions dichromate (CrO42-
) qui possèdent une structure similaire au sulfate (SO42-
) et au phosphate (PO42-
), ce qui explique son absorption par les canaux de transport de sulfate, ceci est représenté dans la figure 1 (Cheung et Gu, 2007).
La réduction du Cr(VI) au Cr(III) est assurée par des interactions aux thiols des molécules de poids moléculaire faible comme les glutathion (GSH), aux antioxydants comme les ascorbates et aux macromolécules comme les protéines, cette réduction conduit à la formation des complexes binaires (Cr (III)-ligand) et des complexes tertiaires (ligand-Cr(III)-ligand) comme par exemple GSH-Cr(III)-GSH, la réduction peut aussi conduire à la formation des intermédiaires moins stables de courte durée de vie comme le Cr(V), le Cr(IV) et les radicaux de thiols. Le Cr(V) subit un cycle redox à un électron pour régénérer Cr(VI), cette oxydation produit une espèce d'oxygène réactive (ROS) qui se combine facilement avec des complexes ADN-protéines. Le Cr(IV) se lie avec les matériaux cellulaires et altère leurs fonctions physiologiques normales (Cheung et Gu, 2007;
Thompson et al., 2013).
7
Figure 1 : Toxicité et mutagénicité du Cr(VI) dans la cellule (Cheung et Gu, 2007).
Plusieurs effets toxiques du Cr(VI) sur la santé de l’Homme ont été rapportés, une partie est récapitulée dans le tableau 2.
Tableau 2. Effet du Cr(VI) sur la santé de l’Homme.
Effets Références
Irritation nasale, ulcération, irritation de la peau, perforation du tympan et carcinome pulmonaire.
(Cheung et Gu, 2007)
Accumulation dans le placenta, ce qui nuit le développement du fœtus chez les mammifères.
(Cheung et Gu, 2007)
Insuffisance hépatique et rénale. (Goullé et al., 2012)
Mutagène et cancérogène pour l’Homme et l’animal. (Dhal et al., 2013)
Malformations congénitales. (Dhal et al., 2013)
A fortes doses, il cause mort chez les animaux et les êtres humains. (Dhal et al., 2013) La cytotoxicité, génotoxicité et arrêt du cycle cellulaire des cellules de la
peau et des poumons.
Cancer des poumons.
Altère la peau, mais ne cause pas le cancer de la peau.
(Xie et al., 2015)
L’exposition au Cr(VI) réduit les fonctions de l’estomac et augmente le risque du cancer d’estomac.
(Welling et al., 2015) (Zayed et Terry, 2003)
8
II. Les bactéries probiotiques sont-elles capables d’éliminer le chrome hexavalent ? II.1. Généralités et historique sur les probiotiques :
L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et de la Food and Agriculture Organization (FAO) ont formulé la définition des probiotiques suivante « sont des microorganismes vivants qui, lorsqu’ils sont administrés en quantités adéquates, produisent un bénéfice pour la santé de l’hôte » (Neish, 2016). La majeure partie des probiotiques commercialisés et consommés appartient à la famille des bactéries lactiques (BL) (Neish, 2016). Les premières applications des probiotiques ont concerné le traitement ou la prévention de pathologies gastro-intestinales, comme par exemple les infections liées à Clostridium difficile. Maintenant, les bienfaits des probiotiques sont reconnus beaucoup plus larges comme la stimulation du système immunitaire ou l’amélioration de la barrière intestinale (Butel, 2014a).
Le premier microorganisme utilisé comme probiotique était une bactérie appelée bacille bulgare, découvert par Elie Metchnikoff, au début du XXe siècle, Metchnikoff a montré que cette bactérie empêchait la croissance des bactéries intestinales de la putréfaction, prévenait les troubles digestifs et par conséquent, aidait à prolonger la vie. Ses travaux sont considérés comme pionniers dans l’histoire des probiotiques. En 1899, le pédiatre Français Henry Tissier isole une Bifidobactérie à partir du tractus gastrointestinal des nourrissons allaités au sein, et il affirma l’effet de cette bactérie dans la diminution de la diarrhée. Plus tard, en 1917, Nissle Alfred a isolé une souche d’Escherichia coli à partir des selles d’un soldat qui n’a pas été affecté par les diarrhées causées par Shigella. Par la suite cette souche d’E. coli était utilisé dans le traitement des troubles intestinaux (Butel, 2014a; Quigley, 2016; Schultz et Burton, 2016).
II.2. Propriétés et effets des probiotiques :
Les probiotiques sont des microorganismes vivants qui ont été utilisés pendant des siècles en raison de leurs avantages pour la santé qu'ils confèrent à l'hôte. Ils ont une large et variée gamme de propriétés cliniques, technologiques et nutritionnelles, ce qui pourrait aider à comprendre l'effet probiotique (Tang et al., 2015; Behnsen et al., 2013).
II.2.1. Propriétés technologiques des probiotiques :
Les probiotiques doivent avoir certaines caractéristiques qui se reflètent dans le choix d’une souche probiotique préférable. Plusieurs aspects doivent être pris en considération, ils sont résumés dans le tableau 3.
9
Tableau 3. Propriétés technologiques des probiotiques
Propriétés Exemples des bactéries
lactiques
Références
Adhérence à la muqueuse intestinale
Lactobacillus
delbrueckii subsp.bulgaricus
(Apostolou et al., 2001)
Absence de toxicité ou de pathogénicité
Bifidobacterium (Ishibashi et Yamazaki, 2001)
Résistance à l’acide et à la bile Lb. Plantarum (El-Sheekh et al., 2016)
Possibilité de cryprotection Lb. Plantarum (Gomaa, 2016)
Propriétés organoleptiques, nutritionnelles
Lb. Plantarum (Gomaa, 2016)
Production des substances
antimicrobiennes (l’acide lactique et les bactériocines)
Lb. Rhamnosus (Nader-Macías et Juárez Tomás, 2015)
II.2.2. Propriétés thérapeutiques :
Les exigences fonctionnelles des probiotiques donnent des effets bénéfiques et confèrent un avantage pour la santé de l'hôte. Certains aspects fonctionnels des probiotiques sont discutés ci- dessous :
Agent antioxydant (diminution du stress oxydant) : Les radicaux libres ou les espèces réactives d'oxygène (ROS) sont souvent impliqués dans plusieurs troubles de la santé. Les probiotiques libèrent et favorisent la production des antioxydants tels que : le cholestérol le LDL, le H2O2 et les triglycérides (Afify et al., 2012; Wu et al., 2014; El-Sheekh et al., 2016).
Propriétés anticancéreuses : Les études sur les animaux et in vitro indiquent que les probiotiques sont capable de réduire le risque du cancer du côlon en réduisant l'incidence et le nombre de tumeurs à cause de la présence de certaines substances telles que le dextran dans la cas de Leuconostoc mesenteroides (Singh et al., 2011; Shukla et al., 2014).
Intolérance au lactose : Certaines souches de bactéries lactiques, telles que Streptococcus thermophilus peuvent atténuer les symptômes de l'intolérance au lactose en fournissant la lactase bactérienne à l'intestin et à l'estomac (Singh et al., 2011).
Allergie : La consommation de probiotiques peut affecter le développement du système immunitaire. Les probiotiques peuvent être utiles pour atténuer certains symptômes d'allergies en favorisant un changement dans la microflore et dans la sécrétion de cytokines (Tang et al ., 2015).
Diarrhée : Les probiotique sont utilisés pour le traitement et /ou la prévention de la diarrhée intense. Parmi les effets des probiotiques chez les enfants, ils diminuent l'effet de la diarrhée
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et de la fièvre, et limite la diarrhée persistante (Butel, 2014a). Un certain nombre de souches spécifiques, y compris Lactobacillus rahmnosus GG, L. reuteri, espèces de bifidobactéries et autres, montrent un bénéfice important dans les cas des diarrhées (Drisko et al., 2003).
II.3. Mode d’action des probiotiques :
Les probiotiques sont des microorganismes qui sont associés aux effets bénéfiques pour les humains et les animaux (Sccol et al., 2010). Ils se composent principalement de bactéries à Gram positif qui appartiennent aux genres Lactobacillus et Bifidobacterium, mais d’autres genres bactériens peuvent être utilisés, comme des souches appartenant aux Streptocoques, Enterocoques ou encore des bactéries à Gram négatif telles qu’Escherichia coli, de même que des levures comme Saccharomyces boulardii (Butel, 2014a).
Les probiotiques jouent un rôle majeur dans le maintien de l'équilibre et de la stabilité du microbiote intestinal, principalement, en empêchant l'infection, la croissance de bactéries potentiellement nocives et en améliorant la réponse immunitaire. D’une manière générale, les probiotiques sont capables d’exercer leurs effets bénéfiques selon trois mécanismes principaux (Roy, 2011; Alexandre et al., 2014).
II.3.1. Effet barrière :
Ce mode d’action peut être lié à la modulation du microbiote de l’hôte, la résistance à la colonisation des bactéries pathogènes peut être également traduite par la synthèse de molécules antimicrobiennes telles que les bactériocines, le peroxyde d’hydrogène et l’acide lactique , la production de métabolites tels que les acides gras à courte chaine qui induisent la diminution du pH local de manière à créer un environnement défavorable aux pathogènes, ou les biosurfactants à activité antimicrobienne (O'Shea et al., 2012; Alexandre et al., 2014; Butel, 2014a).
II.3.2. Amélioration de la fonction barrière de la muqueuse intestinale :
L’amélioration de la fonction barrière est liée au renforcement des jonctions serrées, à l’augmentation du renouvellement entérocytaire, à la stimulation de la synthèse de la mucine, à la sécrétion de peptides antimicrobiens comme les β-défensines, lysozyme et à la synthèse des vitamines (Alexandre, 2014; Mizock, 2015).
II.3.3. Modulation du système immunitaire :
Ce mode d'action est très important pour la prévention et le traitement des maladies infectieuses, mais aussi pour le traitement de l'inflammation (chronique) du tractus digestif (Sccol et al., 2010).
Les probiotiques peuvent améliorer à la fois la réponse immunitaire spécifique et non spécifique
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(Singh et al., 2011), ils activent les macrophages, les lymphocytes T, en augmentant l'activité des cellules NK (Natural killer), en augmentant les niveaux de cytokines (Ashraf et al., 2014), en stimulant la production des IgA par les cellules B (Faghfoori et al., 2015). Lactobacillus helveticus MIMLh5 peut inhiber la production des interleukines pro-inflammatoires IL-6 et IL-8, la cytokine G-CSF et les facteurs de nécrose tumorale TNF-α (Guglielmetti et al., 2010).
II.4. Streptococcus salivarius comme probiotique :
Streptococcus salivarius est une bactérie aérobie de forme sphérique ou ovoïde, de diamètre de 0,8-1,0µm, ses cellules sont regroupées en chainettes courtes à très longues. Le séquençage du gêne ARNr 16S permet de classer cette bactérie dans le groupe de salivarius, de plus, les expériences sur l’hybridation ADN /ADN ont montré qu’il y a une relation étroite entre St. salivarius et St.
thermophilus et que parfois cette dernière est considérée comme une sous espèce de St. salivarius.
Les souches de St. salivarius sont isolées à partir des cavités orales humaines et animales, elles sont liées particulièrement à la langue, à la salive et aux fèces (Vos et al., 2011). Cette souche est acquise par l’enfant à partir de sa mère lors de l’allaitement dès les premiers jours après la naissance, et reste tout au long de la vie de son porteur humain (Delorme et al., 2014).
St. salivarius ssp. thermophilus est un membre éminent du microbiote oral et a un excellent potentiel d'utilisation comme probiotique ciblant la cavité buccale (Burton et al.,2006).
L’étude de Burton et al. (2006) a montré que la souche St. salivarius K12 a un potentiel de pathogénicité faible, improbable de causer des problèmes sur la santé humaine, en revanche elle a des effets positifs qui permettent de l’utiliser comme probiotique car :
Elle est capable d’inhiber la colonisation épithéliale des pathogènes tels que Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Delorme et al., 2014).
Elle est le principal producteur de bactériocines qui inhibent la croissance de Streptococcus pneumoniae et de nombreuses espèces de bactéries à Gram positif.
Elle peut interférer avec la prolifération des pathogènes et stabiliser le microbiote et les fimbria de surface, ces derniers sont impliqués dans des réactions de coagrégation avec d'autres espèces microbiennes et d’adhésion aux cellules épithéliales humaines (Masdea, et al., 2012).
III. Interactions bactéries lactiques-chrome hexavalent :
Sous sa forme hexavalente le chrome est plus toxique et cancérigène, il peut atteindre l’Homme par ingestion de l’eau ou d’aliments contaminés (par voie digestive), une fois le Cr(VI) est dans l’estomac, il est réduit en Cr(III) sous l’effet du pH acide de l’estomac (Goullé et al.,
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2012), cette réduction diminue le niveau de toxicité du Cr car le Cr(III) est moins toxique que le Cr(VI) grâce à la difficulté à traverser la membrane cellulaire, le Cr(III) est un oligo-élément essentiel qui joue un rôle important dans le métabolisme des sucres, des lipides et des protéines chez les mammifères (Lewicki et al., 2014).
Toutefois, la réduction du Cr(VI) dans l’estomac n’est pas toujours complète, une partie du Cr(VI) n’est pas réduite et sera donc absorbée par l’intestin et atteint la vois sanguine et les tissus musculaires, il peut donc causer des effets néfastes pour la santé humaine (Goullé et al., 2012).
Des études récent ont montré le rôle probable des bactéries lactiques dans la détoxification et la prévention de l’absorption des métaux par l’organisme (Gerbino et al., 2015; Sofu et al., 2015;
Sheng et al., 2016; Kumar et al., 2016; Yi et al., 2017).
Ces études ont montré que les bactéries lactiques développent des mécanismes de résistance aux métaux lourds qui se trouvent dans le milieu pour la survie, et par conséquent leur élimination ou réduction de la concentration. Cette résistance peut être due à des interactions entre la paroi des bactéries lactiques qui est chargée négativement et la charge positive des métaux. Les bactéries lactiques, en général, sont des Gram positif possédant une paroi cellulaire composée de peptidoglycane, d’acides organiques (acide teichoique et lipoteichoique), une couche de protéines S et quelques polysaccharides neutres. La charge négative de la paroi est due à la présence de groupements fonctionnels (carboxyles et phosphoryles), cette charge facilite la liaison aux cations (la plupart des métaux sont chargés positivement) (Zoghi et al., 2014).
III.2. Mécanismes de résistance bactérienne au chrome hexavalent :
Les microorganismes sont connus pour leur capacité d’éliminer la plupart des composés toxiques, en particulier les métaux lourds (Dhal et al., 2013).
Les bactéries lactiques probiotiques pourraient avoir des caractéristiques qui leur permettent d’éliminer ces métaux lourds (Ibrahim et al., 2006). L'interaction des espèces bactériennes avec les métaux lourds se fait selon différents mécanismes décrite ci-dessous :
III.2.1. Biosorption :
La biosorption ou l’adsorption passive ne nécessite pas d'énergie, elle met en jeu des cellules mortes ou vivantes. Une liaison des ions métalliques à la paroi des cellules des BL est établie. Les ions métalliques se lient à la paroi cellulaire et aux polysaccharides extracellulaires (Rao et Prabhakar, 2011; Mrvčić et al., 2012). Les métaux lourds chargés positivement à la fois sous forme particulaire ou soluble peuvent être séquestrés par une surface cellulaire chargée négativement (Gupta et Diwan, 2016).
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Une réduction extracellulaire du Cr(VI) en Cr(III) suivie de sa liaison avec les groupes fonctionnels sur la surface des cellules bactériennes peut avoir lieu. La fixation de Cr(III) à la surface cellulaire bactérienne facilite son retrait de l’environnement contaminé. Il existe des bactéries possédant des propriétés d'adsorption qui facilitent l’élimination des métaux. Ces propriétés dépendent en grande partie de la répartition des groupes fonctionnels tels que les groupes carboxyle, amine, hydroxyle, phosphate et sulfhydryle sur la surface de la paroi cellulaire des bactéries (Thatoi et al., 2014; Hansda et Kumar, 2016; Malaviya et Singh, 2016).
III.2.2. Bioaccumulation :
Les métaux lourds peuvent être accumulés dans les cellules via des systèmes de transport membranaire où ils sont d'abord liés à la surface de la paroi cellulaire bactérienne, ils sont alors portés par la paroi cellulaire, deux situations sont possibles, les métaux s’accumulent dans le cytoplasme ou participent aux processus biochimiques (Gupta et Diwan, 2016).
Il s'agit d'un processus en deux étapes : Dans la première, les ions métalliques se fixent passivement à la surface de la paroi cellulaire bactérienne (biosorption) par des processus physiques ou chimiques, puis ces ions métalliques traversent les membranes cellulaires microbiennes par des systèmes énergétiques microbiens associés au transport de magnésium et de potassium (Gavrilescu, 2004; Hansda et Kumar, 2016).
L'accumulation intracellulaire des ions métalliques dans les cellules microbiennes vivantes commence lorsque la plupart des sites disponibles pour la liaison des ions métalliques sur la paroi cellulaire sont occupés, ce mécanisme abouti une concentration cellulaire des ions métalliques nécessaires aux réactions métaboliques, sans risque possible de toxicité. La liaison des ions métalliques avec les bactéries lactiques est un processus rapide de 5 minute à 1 heure, à titre d’exemple ; l’accumulation intracellulaire du zinc chez L. mesenteroides a été rapportée (Mrvčić et al., 2012).
III.2.3. Réduction enzymatique :
Une grande diversité de microorganismes est connue pour sa capacité à utiliser des voies biochimiques pour réduire les composés toxiques à la fois par voie aérobie et anaérobie (Thatoi et al., 2014).
Dans la réduction aérobie du Cr(VI), la bactérie utilise une protéine soluble qui nécessite le NADH/NADPH comme donneur d'électrons et l’oxygène comme accepteur d'électrons (Malaviya et Singh, 2016). Ces protéines solubles sont localisées dans le cytoplasme comme démontré chez E.
coli (Thatoi et al., 2014).
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Deux étapes de réaction ont été suggérées pour être impliquées dans les réactions de réduction ; dans la première le Cr(VI) accepte un électron d'une molécule de NADH pour générer le Cr(V) en tant qu'intermédiaire (l'équation (1)), puis le Cr(V) accepte deux les électrons formant le Cr(III) (l'équation (2)) (Thatoi et al., 2014).
Cr6+ + e- Cr5+
(1) Cr5+ +2e- Cr3+
(2)
Les chromates réductases notamment : ChrR (chez Pseudomonas putida (Ackerley et al., 2004a)) et YieF (chez E.coli (Ackerley et al., 2004b)) réduisent le Cr(VI) en Cr(III) (Joutey et al., 2015).
D'autre part, la réduction anaérobie implique une réaction microbienne en l'absence d'oxygène. Dans le métabolisme anaérobie, le sulfate, le nitrate, le dioxyde de carbone ou les composés organiques peuvent remplacer l'oxygène comme accepteur d'électrons (Thatoi et al., 2014).
La réduction anaérobie par les bactéries est généralement associée à des réductases liées à la membrane comme les réductases de flavine, les cytochromes et les hydrogénases qui peuvent faire partie du système de transport d'électrons et utiliser le chromate comme un accepteur d'électrons terminal (Thatoi et al., 2014; Joutey et al., 2015).
La réduction globale du Cr(VI) et la précipitation du Cr(III) sont illustrés dans les équations (3) et (4). Dans des conditions anaérobies avec le glucose en tant que donneur d'électrons, la réduction microbienne de Cr (VI) est liée à l'équation (5).
CrO42-(aq) +8H+(aq) +3e- Cr3+(aq) +4H2O (3) Cr3+(aq) +4H2O Cr (OH)3(S) +3H+(aq) +H2O (4) C6H12O6 + 8Cr O42-(aq) +14H2O 8Cr (OH)3(S) + 10OH-(aq) +6HCO-(aq) (5)
Plusieurs oxydoréductases avec des fonctions métaboliques différentes ont été rapportées pour catalyser la réduction du Cr(VI), y compris la nitroréductase, la réductase de fer, la quinone réductase, les hydrogénases, la flavine réductase ainsi que les réductases NADH/NADPH dépendant. Les réductases solubles peuvent participer à la réduction extracellulaire ou intracellulaire du Cr(VI) alors que les réductases membranaires réduisent dans le milieu extracellulaire (Thatoi et al., 2014; Joutey et al., 2015).
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Les données sur les mécanismes de bioaccumulation et de réduction enzymatique chez les BL sont très rares voire inexistentes, ce qui nous a conduit à décrire ces mécanismes chez les bactéries saprophytes de l’environnement.
III.2.4. Efflux du chrome hexavalent :
Le Cr(VI) est très soluble (chromate, CrO4-2) et très toxique de la même façon que le sulfate, l’ion chromate peut pénétrer facilement dans les cellules des mammifères ainsi que des bactéries via les systèmes de transports du sulfate (MinYan et al., 2010).
Ce mécanisme semble très efficace et très répandu car il empêche l’accumulation d’ions toxiques dans les cellules bactériennes. Il met en jeu l’efflux des ions chromate du cytoplasme par l’intermédiaire des transporteurs membranaires, le système le mieux étudié est celui de Pseudomonas aeruginosa impliquant la protéine ChrA appartenant à la famille CHR de transporteur d’ion (Ramirez-Diaz et al., 2008). La protéine ChrA fonctionne comme une pompe chimiosmotique qui expulse le chromate à l’extérieur du cytoplasme, cette pompe est conduite par la force motrice des protons (Alvarez et al., 1999).
Certains membres du microbiote intestinal, tels que les lactobacilles utilisés dans les applications alimentaires peuvent éventuellement servir de détoxifiant pour réduire la toxicité des métaux lourds chez les humains. En effet les lactobacilles ont la capacité de se lier et séquestre les métaux lourds, en faisant face à l’arsenic et au mercure, le mécanisme de résistance résulte parfois de l’expulsion active des métaux lourds du cytosol (Van Kranenburg, 2005; Monachese et al., 2012).
Matériel et
Méthodes
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Notre travail a été réalisé au niveau de laboratoire du Microbiologie de la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université de Jijel, durant la période Avril- Juin 2017.
Ce travail avait pour objectifs de réaliser les points suivants :
Etudier la tolérance de souche lactique Sterptococcus salivarius aux trois métaux lourds (Hg, Pb et le Cr(VI)), en premier lieu, ensuite évaluer l’influence des quelques paramètres (effet de pourcentage de l’inoculum, de pH et d’agitation) sur la croissance bactérienne et l’élimination du chrome hexavalent par cette dernière. Enfin étudier le mécanisme d’élimination du chrome (VI) par St. salivarius.
Donc l’objectif principal de ce travail est l’étude de la capacité d’élimination du chrome (VI) par St. salivarius.
I. Matériel :
I.1. Matériel biologique :
Streptococcus salivarius a été utilisée pour cette étude. Cette souche a été fournie par Professeur T. Idoui du laboratoire Biotechnologie et santé de l’Université de Jijel, elle a été préalablement isolée à partir du lait de vache cru.
I.2. Les milieux de culture :
Bouillon MRS (Conda, Biokar) (Annexe 1)
Gélose MRS (Conda, Biokar) I.3. Produits chimiques et réactifs :
Bichromate de potassium (K2Cr2O7)
Nitrate de plomb ((PbNO3)2)
Chlorure de mercure (HgCl2)
Acide sulfurique (H2SO4)
1-5 diphénylcarbazide (C (NH)4 O (C6H6)2)
Alcool éthylique à 95°
Acide nitrique 1%
I.4. Appareillage :
Bec Bunzen
Autoclave (Slli AVX éléctric)
Four pasteur (Memmert)
Etuve 37°C (Memmert)
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Etuve agitateur (Infors HT Ecotron)
Centrifugeuse (Hettich EBA 20)
Spectrophotomètre optique (specord plus)
pH mètre (Hanna)
Balance électronique (Kern EMB 600-2)
Agitateur magnétique chauffant (Heidolph MR 3002)
Vortex (VWR)
Réfrigérateur (ENIEM)
II. Méthodes :
II.1. Revivification de la souche :
La revivification de la souche est effectuée avant chaque test en utilisant le bouillon MRS, la souche de St. salivarius était ensemencée dans 5ml de bouillon MRS déjà autoclavé, dans des conditions d’asepsie et incubée à 37°C/18h.
II.2. Préparation des solutions mères de métaux lourds :
Pour des concentrations égales à 1000 mg/L, nous avons fait des calculs pour déterminer la masse en gramme de chaque métal utilisé dans cette étude par la méthode suivante
SM1 : Plomb 1000 mg/L
Masse molaire du (PbNO3)2 = 538.4 g/mol Masse molaire du (Pb) = 207.2g/mol m = 1000* 538.4 / (207.2)*2 = 1.3 g
Pour préparer la solution mère à 1000 mg/L, donc 1.3 g de nitrate de plomb sont dissous dans 1L d’eau distillée (Kinoshita et al., 2013).
SM2 : Chrome 1000 mg/L
Masse molaire du (K2Cr2O7) = 294.16 g/mol Masse molaire du (Cr) = 51.99 g/mol
m = 1000 * 294.16/(51.99)*2 = 2.83 g
Pour préparer la solution mère à 1000 mg/L, 2.83g de dichromate de potassium sont dissous dans 1L d’eau distillée (Guo et al., 2010).
SM3 :Mercure1000 mg/L
Masse molaire du (HgCl2) = 271.496 g/mol Masse molaire du (Hg) = 200.59 g/mol
