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Dans ce travail, nous avons réalisé une série de tests pour évaluer la résistance de la souche

Streptococcus salivarius ssp thermophilus (St.sa) aux différents stress susceptibles d’être rencontrer dans des matrices alimentaires: le stress osmotique, acide, thermique et oxydatif.

Ш. 1. Vérification de la pureté de la souche a) L’aspect macroscopique

La culture de bactéries sur milieu MRS gélosé montre de petites colonies blanchâtres, rondes à contours réguliers, lisses et légèrement bombées comme illustré par la figure (5).

Figure 5. Aspect des colonies de la souche St.sa sur milieu MRS

b) L’aspect microscopique

La coloration de Gram nous a permis de confirmer que la bactérie est Gram positif et les cellules se présentent sous forme de coques regroupées en paires ou en chainettes (Figure 6).

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Ш. 2. La croissance de la souche St.sa en présence de NaCl

La croissance de la bactérie en présence de différentes concentrations de NaCl (0.6M, 1.1M, 1.6M, 1.8M) en comparaison avec la croissance en absence de NaCl révèle une sensibilité différente de la souche au stress osmotique. Les résultats montrent que plus la concentration en NaCl augmente, plus le temps de latence est long. Comme observé dans la courbe de croissance, la durée de la phase de latence atteint pratiquement 6 h dans les conditions favorables (sans NaCl) alors qu’elle atteint 8 h en présence de 1.8M de NaCl. Cette phase correspond à la phase d’adaptation des cellules aux conditions de stress.

Une augmentation de la concentration en NaCl dans le milieu entraine aussi une diminution de la croissance bactérienne. Les valeurs de la DO600 nm décroissent proportionnellement en fonction de l’augmentation de la concentration en NaCl. Après 24 h d’incubation à 37°C, la croissance de la souche St.sa dans le milieu qui contient 0.6M, 1.1M, 1.6M et 1.8M de NaCl est réduit de 12 % à 43% par apport à la croissance dans les conditions non stressées (Figure 7).

Figure 7. Croissance de la souche St.sa en présence de NaCl.

Des travaux réalisés par Romeo et al, (2001) sur Lc. lactis ont montré que dans un milieu à 1.1M de NaCl, la croissance est réduite de 25% à 50% par rapport à une croissance à une pression osmotique normale. Ces résultats montrent que notre souche St.sa est capable de résister et de s’adapter à des niveaux élevés de NaCl. Cette adaptation est due à la capacité des bactéries lactiques à développer des systèmes de défense qui reposent essentiellement sur l’accumulation des solutés compatibles dans leur cytoplasme (Romeo al, 2001). L’osmotolérence de S. salivarius ssp

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 0 2 4 6 8 24 D O 600 n m Temps (h) control 0,6 M 1,1 M 1,6 M 1,8 M

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thermophilus est un critère important pour la sélection de la souche pour les applications technologiques notamment la technologie laitière (production du yaourt et du fromage).

Ш. 3. La croissance dans différentes températures

Pour évaluer l’effet de la température sur la croissance de la souche St.sa, quatre températures ont été testées (4°C, 28°C, 37°C et 44°C). Pour chaque température, un modèle de croissance spécifique a été observé. Les résultats sont présentés dans la figure (8).

Figure 8. Croissance de la souche ST.sa à différentes températures.

La souche St.sa montre une croissance optimale à 37°C après 24 h d’incubation, une bonne croissance est remarquée à 28°C. À 44°C, une faible croissance est remarquée par rapport à la croissance à 37°C. Cette croissance confirme que la bactérie est capable de résister à des températures élevées que sa température optimale de croissance à cause de la capacité des bactéries à développer des mécanismes de défense notamment l’induction des protéines chaperon ayant différents rôles dans la physiologie cellulaire (Serrazetti et al, 2013).

Par contre, à 4°C notre souche ne montre aucune croissance où la densité optique reste la même après 96 h d’incubation (croissance nulle). L’exposition de la bactérie à des températures basses affecte la fluidité membranaire, ce qui réduit l’efficacité des fonctions liées à la paroi. Elle affecte aussi la stabilisation des acides nucléiques et la synthèse protéique (De Angelis et Gobbetti, 2004). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 24 48 72 96 D O 60 0 n m Temps (H) 4°C 28°C 37°C 44°C

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Ces résultats indiquent que la modification de la température affecte la croissance bactérienne où on note que la DOest affecté. Ce dernier résultat est confirmé par les résultats obtenus avec la souche Lb. sakei de l’étude réalisée par Marceau et al, (2003) quiont démontré que la capacité de cette souche à croitre à différentes températures est variable, elle diminue à partir de la température optimale (30°C) à une température plus basse (4°C).

La tolérance au stress thermique est un critère qui permet de sélectionner les souches lactiques qui peuvent être utilisées en biotechnologie industrielle grâce à leurs performances technologiques élevées dans des environnements alimentaires stressants, comme le cas de Lb. sakei ajouté à la viande qui exprime des gènes de choc thermique lui permettant de s’adapter aux changements des conditions de la matrice alimentaire (Serrazetti et al, 2013).

Ш. 4. La tolérance au stress acide

Pour évaluer l’effet du stress acide sur la survie de la souche St.sa, cette dernière est exposée à différentes valeurs du pH (pH 2.0, pH 3.0, pH 6.2, pH 7.0) et les résultats sont représentés dans la

figure (9).

Figure 9. Croissance de ST.sa à différents pH après 24h d’incubation.

La souche présente une sensibilité variable vis-à-vis des différentes valeurs du pH. Pendant une periode d’incubation de 4 h, aucune croissance n’est observée. Après 24 h, la souche montre une croissance optimale à pH 6.2 avec une DO 600nm de 2.67, ainsi, une bonne croissance est observée à pH 7.0 (DO600nm =2.5).

A des faibles valeurs de pH (pH 2 et pH 3), une croissance très faible est remarquée dont la

DO600nm est de 0.38 à pH 2 et de 0.5 à pH 3. D’après ces résultats, on peut dire que notre souche est

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 2 4 6 8 24 D O 60 0 n m Temps (h) pH 2 pH 3 pH 6,2 pH 7

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probablement incapable de tolérer de conditions acides ou probablement qu’elle nésséssite un temps plus long pour s’adaptater à telles conditions de stress. Donc, on constate que la variation du pH du milieu affecte la croissance des bactéries lactiques.

Ces résultats sont similaires à ceux observés par Guillouard et al, (2004), qui ont trouvé que la croissance des souches de Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus est affectée par les changements du pH lorsqu’elle sont exposés à pH 3.6 et à pH 4.75.

Ш. 5. La tolérance au stress oxydatif

Pour évaluer l’effet du stress oxydatif sur la croissance de la souche St.sa, des cultures sont réalisées avec différentes concentrations de peroxyde d’hydrogène (0.025%, 0.05% et 0.075%) sur bouillon et à 0.75%, 1.5% et 3% sur gélose MRS.

Comme illustré sur la figure (10), la souche montre une bonne croissance après 48 h d’incubation en présence de 0.025%, 0.05% et 0.075% avec une croissance de 97%, 91% et 90% respectivement (faible taux de réduction par rapport au contrôle). Pour la culture sur gélose, une faible zone d’inhibition d’un diamètre de 8 mm est apparue en présence de 3% de H2O2 cependant aucune inhibition n’est observée en présence de 0.75 % et 1.5% de H2O2. D’après les résultats obtenus, nous avons constaté que notre souche est capable de maintenir une forte résistance en présence de H2O2 dans son environnement.

Figure 10. Croissance de la souche St.sa en présence de H2O2 après 48 h d’incubation.

Contrairement à nos résultats, Fessard et al (2016), et d’après une étude réalisée sur des isolats de bactéries lactiques, Lb. plantarum DSM2601, Lb. plantarum (S17 et S29), Leuconostoc

0 0,5 1 1,5 2 2,5 contrôle 0,025 0,05 0,075 D O 6 6 0 n m H2O2 % T 0 T 48

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citreum (S9 et S13), Leuconostoc pseudomesenteroides (S5, S6, S10 et S14), Weissella cibaria

(S12 et S27), ils ont démontrés que ces souches montrent une sensibilité vis-à-vis des concentrations différentes de H2O2 (0.025%, 0.05% et 0.07%). La concentration la plus basse entraîne une diminution de 40% de la croissance des souches S12 et S27 après 48h d’incubation par apport au contrôle, alors que les autres souches ne sont pas affectées. A 0.05%, toutes les souches sont affectées avec des pourcentages différents. De plus, la concentration de 0.07% de H2O2, ne permet pas aux souches de se développer.

La capacité de Streptococcus salivarius ssp thermophilus à résister et à survivre dans les conditions du stress est probablement due à l’existence d’un mécanisme de défense qui aide les cellules à éliminer les espèces réactives d’oxygène (ROS) et de réparer les dommages causés par ces molécules (Thibessard et al, 2001).

Ш. 6. Tolérance au froid

La capacité de la souche St.sa à se développer à 37°C après l’exposition à 4°C pendant 24 h a été étudiée. La croissance de la souche St.sa n’est pas affectée par le stress froid, elle montre une croissance similaire au contrôle (DO600 nm= 2.42) après la réfrigération (DO600 nm= 2.40)

(Figure 11). Donc, on peut constater que les conditions du froid pour une courte durée (24 h) n’affectent pas la survie de la bactérie et elles peuvent inhiber sa croissance. Dès que les conditions de croissance redeviennent favorables elle montre de nouveau une croissance normale.

Nos résultats sont en accord avec une autre étude rapportée par Reale et al (2015), qui a démontré que des souches de Lb. casei ont une capacité élevée à croitre à 37°C après l’exposition à 4°C pondant 24 h.

Figure 11. Croissance de la souche St.sa après exposition au froid (4°C) pendant 24 h.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 4°C 37°C D O 6 0 0 n m Température (°C) T0 24 H

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Ш. 7. Effet du stockage

Cette étude consiste à stocker la souche St.sa à 4°C pour une longue durée (30 jours) pour évaluer l’effet du stockage sur la croissance de la bactérie. Les résultats du dénombrement par cellule de Malassez sont présentés dans la figure 12.

Figure 12. Effet du stockage sur la survie de la souche de St.sa à 4°C

D’après les résultats obtenus, on remarque qu’il y a une faible diminution dans le nombre de cellules en fonction du temps. Cette diminution passe de 2.27. 109 cellule / ml à 2.1. 109 cellule / ml. Ceci est probablement dû au fait que le milieu PBS n’est pas favorable à la croissance de la souche. Malgré cette diminution qu’on peut considérer comme faible, on peut dire que la souche montre une résistance contre ce type de stress pour une longue période, car la proportion de cette diminution est réduite par rapport au nombre initial des cellules.

Les études rapportées par Song et al, (2016) consistaient à faire stocker des souches de

Lactobacillus plantarum à 5°C pendant 60 jours. Ces chercheurs ont montré qu’une population de la souche Lactobacillus plantarum L67 présente une forte résistance au froid où le nombre de cellules après 60 jours reste stable par rapport au nombre initial. Cette résistance résulte en raison de l’expression des protéines de stress froid (CSP) (Song et al, 2016).

L’évaluation de la résistance de la bactérie à des conditions du froid particulièrement pour une longue durée permet de sélectionner les souches applicables on biotechnologie agroalimentaire notamment les procédés de stockage des aliments fermentés tels que le fromage afin de garder les propriétés nutritionnelles des aliments pour une longue durée (Hosseini Nezhad et al, 2015).

0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 1 2 3 4 L og U F C ( x 10 ) Temps (semaine)

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La connaissance de la capacité des bactéries lactiques à résister aux changements des conditions environnementales est importante pour la sélection des souches afin de l’exploiter dans les applications technologiques. Une souche de bactérie lactique Sreptococcus salivarius ssp thermophilus St.sa isolée du lait est utilisée dans notre étude.

L’étude de l’effet du stress osmotique, thermique, acide et oxydatif sur la croissance montre que la souche St.sa est affectée lors de l’exposition à ces conditions défavorables. Ces effets sur la souche diffèrent d’un paramètre à un autre. La souche peut s’adapter et développer des mécanismes de défense vis-à-vis des facteurs stressants comme dans le cas de stress osmotique et oxydatif où la souche montre une croissance importante même en présence des concentrations élevées de NaCl et de H2O2 élevées. Ainsi, dans le cas du stockage à 4°C pour une longue durée (30 jours), le nombre des cellules reste élevé après un long temps d’exposition au froid. Par contre, l’exposition de la souche St.sa à des températures basses que la température optimale de la croissance et à des conditions acides, diminue les taux de croissance, donc notre souche ne peut pas bien s’adapter à ces conditions de stress.

Enfin, Il est intéressant d’approfondir cette étude de la résistance de Streptococcus salivarius sspthermophilus à des conditions de stress on étudiant d’autres facteurs tels que: l’effet des enzymes, des matrice alimentaires… vu l’importance de ces facteurs dans les procédés agroalimentaires.

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