Figure 21 : Principe de la technique de criblage en double hybride en levure pour identifier des partenaires protéiques :

Figure 21 : Principe de la technique de criblage en double hybride en levure pour identifier des partenaires protéiques :

(A) Une cellule hôte est co-transformée avec les plasmides appât et proie. Le vecteur "proie" pPC86, où ont été insérés les ADNc de la banque à cribler (Van Wayenbergh et al., 2003), présente les séquences supplémentaires suivantes : la séquence codant le domaine d'activation transcriptionnel Gal4TA précédée d'un signal nucléaire (NLS) et le gène TRP1 permettant la croissance sur milieu carencé en tryptophane. La banque a été faite à partir de mARN extraits à partir d'embryons au stade neurula tardif. Le vecteur "appât" pPC97, où a été insérée la région centrale de XMyT1 (RCXMyT1) comprise entre les deux clusters à doigts à zinc, présente les caractéristiques suivantes : une séquence codant le domaine de liaison à l'ADN Gal4 (Gal4DBD) et le gène LEU2 permettant la croissance sur milieu carencé en leucine. Nous utilisons la région centrale de XMyT1 car c'est la région essentielle à l'activité de la protéine (Bellefroid et al, 1996). L'interaction entre RCXMyT1 et une cible de la banque d'ADNc reconstitue la protéine Gal4 fonctionnelle qui peut alors activer la transcription des gènes rapporteurs (HIS3, ADE2, LacZ). Les gènes HIS3 ET ADE2 permettent une sélection sur milieux carencés en histidine et en adénine. Le gène LacZ permet une sélection chromogénique par détection de l'activité -galactosidase. Pour cette expérience, nous utilisons un contrôle négatif réalisé à partir de la souche de levure contenant le plasmide pPC97 "vide" c'est-à-dire dépourvu de l'insert RCXMyT1. Nous utilisons également un contrôle positif d'activation réalisé à partir de la souche de levure contenant le plasmide pPC97/T PIE* codant une fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 et la partie N-terminale de PIE8 (un activateur transcriptionnel de trypanosome – Perez-Morga and Pays, 1991).

(B) Cartes des vecteurs utilisés pour la recherche de partenaires protéiques par la technique du double hybride. Les séquences caractéristiques portées par ces vecteurs sont : le promoteur du gène de l'alcool déshydrogénase de Saccharomyces cerevisiae (pADC1), un site de clonage multiple, la séquence terminatrice du gène de l'alcool déshydrogénase, une séquence initiatrice de la réplication d'ADN chez la levure (ARSH4), une séquence centromérique (CEN6), un gène de résistance à l'ampicilline (Amp

) et une origine de réplication bactérienne ( Co1E1 Ori).

Leu

pPC86 - Proie

ADNc Gal4TA

Banque ADNc ARNm embryons

stade neurula tardif (Van Wayenbergh et

al., 2003)

Interacti on

His3 Ade LacZ Gal4DBD

Gal4TA

RCXMy T1

ADNc

Levures HF7 co- transformées

pPC97 – Appât Gal4DBD

Trp

RCXMyT 1

A

B