Hybridation in situ: Principes et applications

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Hybridation in situ:

Principes et applications

Marc Landry

UFR Sciences de la Vie INSERM E 358

Institut François Magendie

Université Bordeaux 2

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Définition de l’hybridation in situ

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1.Sondes d’acides nucléiques

 Nature

 Marquage

2. Echantillons utilisés 3. Hybridation

 Prétraitements

 Hybridation

 Lavages

4. Visualisation 5. Contrôles 6. Applications

 Localisation, couplage, études fonctionnelles

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Sondes ADN recombinantes

Sondes mono- ou bi-caténaires

 Insertion dans un plasmide

 Amplification par PCR

Autres marquages :

 Random priming

 PCR

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Sondes ARN recombinantes

 Marquage par incorporation de nucléotides au cours de la transcription

 Avantages Sensibilité

Stabilité des hybrides

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Sondes oligonucléotidiques

 Sondes de synthèse : 25 à 60 bases

Avantages

Facilité d’obtention

Choix de la séquence

Résistance aux RNAses

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Comparaison des différents types de sondes

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Marqueurs radioactifs

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Marqueurs non radioactifs

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Comparaison des différents marqueurs

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2. Echantillons

 Coupes histologiques

 Cultures cellulaires adhérentes et en suspension

 Organismes entiers : embryon, invertébrés

 Chromosomes (FISH)

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Prétraitements

 Perméabilisation

Déprotéinisation :

Enzymatique : Protéinase K, pronase, pepsine Chimique : HCl

Physique : Détergents (Triton, Sarcosyl, SDS) Délipidification : Chloroforme

Congélation-décongélation

 Diminution du bruit de fond

Blocage des fonctions aldéhydes libres (NaHBr)

Blocage des fonctions amines protonées (Acétylation) Préhybridation

 Dénaturation de l’ADN intracellulaire (Formamide, chaleur)

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Hybridation

Choix d’un tampon d’hybridation Tampon Phosphate ou Tris

Détergent

ADN de sperme de saumon (DTT)

Formamide Sonde

 Choix d’une température d’hybridation

Tm = 81,5°C + 16,6(logM) + 0,41(%GC) - 820/L - 0,6(%F)

Trois critères Cinétique

Stabilité

Spécificité

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Lavages

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Gal mRNA Human DRG

Autoradiographie

Sur film

 Sur lame

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Détection par des méthodes enzymatiques

Détection immunohistochimique

 Plusieurs types d’enzymes:

Phosphatase alcaline (NBT/BCIP),

Peroxydase (DAB), …

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Détection par des méthodes fluorescentes

Nécessité de protocoles d’amplification

(HNPP, Tyramide, EnVision, …)

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Détection par des méthodes à l’or

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5. Contrôles

 Compétition avec une sonde non marquée

 Hybridation avec une sonde hétérologue (sonde sens)

 Action de la RNAse A

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Localisation cellulaire

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Colocalisation cellulaire

Gal-R1 mRNA/

CGRP mRNA Rat DRG

 Caractérisation phénotypique des neurones exprimant un récepteur

 Conséquences fonctionnelles (rôle anti-nociceptif)

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Etudes physiologiques:

Inhibition transcriptionnelle

Effets de l’interféron gamma humain sur les ARNm de la chaîne alpha-1 du collagène de type I

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Etudes physiologiques :

Quantifications macroscopiques

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Etudes physiologiques:

Quantifications microscopiques

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Trafic intracellulaire

Localisation préférentielle des ARNm : synthèse localisée et adressage des protéines

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Biologie des virus

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Biologie du développement: Lignages cellulaires

C. Elegans

In situ hybridization showing the distribution of maternal cey-2RNA during early cleavages. Like other Class II maternal RNAs, the cey-2RNA is degraded in somatic lineages and maintained in the germ lineage.

In situ hybridization showing newly transcribed RNAs in the three somatic blastomeres, but not the germline blastomere, of a 4-cell embryo.

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Biologie du développement: Facteurs de transcription

Xénope

(frzb) Drosophile (Engrailed)

Souris (frzb)

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Examples of application of molecular cytogenetics.A) Fluorescence in situ hybridization (FISH) using probes for ETV6 gene at 12p13 (green) and CBFA2 (AML1) gene at 21q22 (red).These are useful probes for the detection of the t(12;21), a very common translocation in childhood ALL.B) FISH using probes for BCR at 22q11.2 (green) and ABL at 9q34 in a case of CML.Arrow shows the Philadelphia chromosome with fused signals.C) using same probes as B showing the ability to detect a fusion in the interphase nucleus on the right (arrow). D) Use of repetitive probes for X (red) and Y (green) in sex-mismatched bone marrow transplant.E) Illustration of FISH use in gene amplification using a probe for c-myc on 8q24.The probe labels the distal 8q in this case (arrow) plus an amplified area on the

homologous 8q (between arrows). F) Use of FISH to identify two marker

chromosomes (arrows) as derived from chromosome 15 (probes for 15p in green and proximal 15q in red).G) CGH profile of two chromosomes (19 and 20) from a case of melanoma showing amplification of the distal end of 20q.FISH using BTAK(STK1 5), a gene that hybridizes to 20q and is amplified in a number of cancers showing